CN116157526A - 提高c3植物的生产率 - Google Patents

Abstract

在C3植物中，光敏色素B或其变体的维管鞘组织特异性表达可以提高光合作用速率和/或引入碳再固定机制。C₃植物细胞的可遗传的基因物质被改变，使光敏色素B或其活性变体或功能片段的一个拷贝在维管鞘细胞中特异性表达。整株植物是由这些基因改变的植物细胞再生出来的。替代地，对植物细胞中的天然光敏色素基因座进行Crispr修饰，用于插入维管鞘特异性调控元件，例如启动子或增强子元件，从而使光敏色素B在再生的整株植物的维管鞘细胞中表达。经基因改变的整株植物具有与产量有关的性状，例如种子产量的增加，这是由于光合作用的增强和/或碳再固定机制的引入。

Description

提高C3植物的生产率

技术领域

本发明一般涉及植物分子生物学领域，并涉及某种基因或某些基因的组织特异性表达方法，所述基因通过增加光合作用来增强植物的产量相关性状。本发明涉及在本发明的方法中有用的表达构建体。本发明还涉及基因改变的植物，所述植物由于光合作用的增强而具有增加的产量相关性状。本发明进一步涉及这种改变的植物的部分，例如植物细胞、植物部分、植物器官、果实、种子、胚、种质和加工的植物产品。

通过引用的方式并入

本申请中引用的每项专利、公开和非专利文献通过引用的方式整体并入本文，就像每项都通过引用的方式单独并入一样。

背景技术

光敏色素B(PHYB)是一种红光/远红光受体，参与调控多种植物过程，包括发芽、去黄化、光介导的植物发育(光形态发生)、开花、对背阴的反应和叶绿体生物发生。PHYB还通过以温度依赖的方式与关键靶基因的启动子结合并随后抑制其表达来调控温度反应。PHYB可能充当在日/夜循环过程中整合温度信息的热计时器。

PHYB以两种可相互转换的形式存在：Pr(在黑暗中不活跃)和Pfr(在光下活跃)。活跃的Pfr PHYB在暴露于红光后在细胞核中积累，在那里它的功能是启动控制上述植物过程的多个调控级联。有一个PHYB的组成型活性变体，称为YHB。这种变体在拟南芥PHYB基因的276位点上含有从Y到H的单氨基酸变化。YHB执行与活性PHYB相同的调控功能，但不需要光来激活。在本申请中，提到PHYB时，术语“活性变体”是指PHYB的所有组成型活性变体，包括YHB。

由于其在多个植物过程中的调控作用，以前对PHYB或YHB的所有操作都导致了发育缺陷，这使得对该基因的表达时机或位置的操作不适合于改善作物。反复观察到的因操纵PHYB或YHB表达而产生的缺陷包括矮化、开花时间延迟、叶片变厚、块茎变小(在马铃薯中)、水利用效率下降和对干旱的敏感性增加。此外，当光合作用速率因氮投入增加而正常化时，过表达PHYB或YHB的植物的光合作用速率没有增加。

在拟南芥中发现的大多数PHYB调控过程在其他植物物种中也受PHYB调控，如发芽、去黄化、光介导的植物发育(光形态发生)、开花、对背阴的反应和叶绿体生物发生。另外，许多植物都有编码PHYB的多个直系同源物的基因。开花植物的基因组也有编码其他光敏色素如光敏色素A(PHYA)的基因，其基因产物与PHYB有拮抗关系，经常促进相反的作用，如在耐荫反应中。过表达PHYA的植物也有对植物生产率有害的作用。

以下是过表达PHYB或YHB(或其他相关光敏色素基因)导致对植物生产率产生有害作用的实例：

Wagner等人，(1991)“Overexpression of Phytochrome B induces a shorthypocotyl phenotype in transgenic Arabidopsis”Plant Cell.3(12):1275-1288。其描述了在拟南芥植株中系统性过表达天然PHYB或在拟南芥植株中系统性过表达水稻PHYB是如何改变光形态发生从而导致下胚轴缩短和植株变短的。

Thiele等人，(1999)“Heterologous Expression of Arabidopsis PhytochromeB in Transgenic Potato Influences Photosynthetic Performance and TuberDevelopment”Plant Physiology.120:73-81。其描述了PHYB在马铃薯中的过表达。发现这对植物造成了各种负面的变化。开花时间推迟，分枝增加，由于叶肉细胞增大而导致更多的叶片更小更厚，以及叶绿素降解减速。当固定率以每单位叶绿素为标准时，过表达PHYB的植物与野生型植物在二氧化碳固定方面没有区别。还发现改性植物有负面影响，如较小的块茎和块茎形成的延迟，因此在相同的生长条件下，改性植物的产量低于未改性的对照植物的产量。

Rao等人，(2011)“Overexpression of the phytochrome B gene fromArabidopsis thaliana increases plant growth and yield of cotton(Gossypiumhirsutum)”J.Zheijiang Univ.Sci.B.12:326–334。其描述了PHYB在棉花中的过表达如何使生长更快，然而它也造成了许多负面影响，如蒸腾速率翻了两番(即，使植物更容易受干旱影响，水分利用效率更低)，矮化，叶片变厚，顶端优势下降，导致分枝更多。

Halliday等人，(1997)“Expression of heterologous phytochromes A,B or Cin transgenic tobacco plants alters vegetative development and floweringtime”The Plant Journal12:1079–1090。其描述了PHYB在烟草中的过表达导致了开花延迟和矮化的负面影响。

Husaineid等人，(2007)“Overexpression of homologous phytochrome genesin tomato:exploring the limits in photoperception”J.Exp.Bot.58:615–626。其描述了在组成型双35S(CaMV)启动子的控制下，过表达PHYA、PHYB1或PHYB2的番茄品系。这导致了矮化的负面影响和更大的花青素产量。

Holefors等人，(2000)“The Arabidopsis phytochrome B gene influencesgrowth of the apple rootstock M26”Plant Cell Reports 19:1049–1056。其描述了PHYB在苹果砧木M26(Malus domestica)中的过表达。这导致了茎长减少以及芽、根和植物干重减少的负面影响。

Distefano等人，(2013)“Ectopic expression of Arabidopsis Phytochrome Bin Troya citrange affects photosynthesis and plant morphology."ScientiaHorticulturae 159:1-7。其描述了PHYB在柑橘中的过表达如何增加光合作用基因的表达和叶片的叶绿素含量，但也增加气孔密度，改变枝条角度，并降低光合作用速率。

Zheng等人，(2001)“Modification of Plant Architecture in Chrysanthemumby Ectopic Expression of the Tobacco Phytochrome B1 Gene”J.Am.Hort.Soc.Sci.126(1):19–26。其描述了烟草PHYB1基因在CaMV 35S启动子控制下在菊花(Chrysanthemum)中的异位表达。与野生型植株相比，所产生的植株表现出负面影响，如株高较矮，枝条角度较大。PHYB1的表达效果与商业生长延缓剂相当，因此作者认为应用PHYB1过表达的可能是应用外源生长延缓剂的替代方案。

Yang等人，(2013)“Deficiency of Phytochrome B alleviates chilling-induced photoinhibition in rice”Am.J.Bot.100(9):1860-1870。其描述了减少PHYB表达的突变体水稻植株如何在寒流胁迫期间和之后比野生型植物的光抑制更少，并且与野生型对照植株相比，其光合系统II效率和叶绿素含量明显更高。因此，这项工作表明，减少PHYB的表达会引起光合作用的增强。这些发现表明，作物改良应遵循减少PHYB表达而不是增加表达的策略。

Su&Lagarias(2007)“Light-Independent Phytochrome Signaling Mediated byDominant GAF Domain Tyrosine Mutants of Arabidopsis Phytochromes inTransgenic Plants.Phytochrome B-Y276H(YHB)”The Plant Cell,Vol 19:2124–2139。其描述了拟南芥PHYB蛋白的一个突变形式，称为YHB，其中276位的酪氨酸(Y)被转化为组氨酸(H)。Y276H突变体具有荧光性和光敏性。当YHB在植物中表达时，发现一系列改变的光信号传导活动与这一突变有关，导致植株变小、矮化。

US 8,735,555 B2公开了突变体光敏色素，当其被引入拟南芥时，改变了植物的光形态发生特性。描述了PHYB的Y276H突变体，该突变体在植物中是光稳定的，与缺乏该突变体的同一物种或品种相比，导致光形态发生的改变。表达突变体Y276H拟南芥光敏色素的转基因植物与缺乏突变体光敏色素的同一物种的植物相比，显示出避阴性降低，并具有改变的光形态发生，导致矮化。

Hu等人，(2019)“Regulation of monocot and dicot plant development withconstitutively active alleles of phytochrome B.”Plant Direct,4:1-19。其描述了拟南芥YHB或水稻YHB在拟南芥属、水稻、烟草、番茄和短柄草属(Brachypodium)中过表达的实验。在所有的情况下，一系列的发育变化被诱导出来，其一致地导致植物结构的改变和植物高度的降低。此外，在所有这些物种中，YHB的过表达对侧枝形成和种子产量都产生了负面影响。

US 2004/0268443 A1(Wu等人)描述了增加异源PHYA在植物如印度香米(Basmatirice)植物中的积累，以改变植物结构，从而尽量减小或克服植物的避阴生长反应。更特别的是，籼稻(elite indica rice)Pusa Basmati-1(“PBNT”)在光调控、组织特异性、水稻RbcS启动子的控制下，用拟南芥PHYA进行转化，产生了大量的独立转基因品系。第五代(“T4”代)纯合转基因品系的结果显示，与未修饰的植物相比，光照生长的植物叶片中PHYA的积累水平很高，植物结构发生改变。

US 2005/0120412 A1(Wallerstein)公开了一种长日照植物，该植物被修饰为在植物的至少一部分细胞中过表达PHYA或PHYB蛋白，从而使其花芽、开花、花、种子或果实在比类似的未修饰的长日照植物中相应的所述花芽、盆花、花、种子或果实发育所需的天数短得多的情况下发育。提供了一种表达盒，该表达盒包括在功能性启动子控制下的光敏色素编码序列。具体使用了花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。

CN 106854240 A(BIOTECHNOLOGY RES CENTER SHANDONG ACAD OF AGRICULTURALSCIENCES)公开了花生的光敏色素AhphyB的核苷酸序列和氨基酸序列。该光敏色素AhphyB被提出用于调节和控制高辐照度的避阴反应。花生的AhphyB在拟南芥中表达，测试了光照条件对下胚轴生长的影响。建议上调phyB的表达，从而可以控制花生荚果的发育，并在玉米和花生间作模式下种植高产花生品种。

WO 2005093054 A1(KANSAI TECH LICENSING ORG)公开了光敏色素分子的N末端区域如何具有细胞核内信号转导能力。融合了参与定量和核定位信号的结构域的光敏色素N末端片段的光敏性是全长光敏色素分子的光敏性的100倍或更高。这种人造光敏色素分子被用来改造植物，例如水稻，以提高光敏性，从而增加色素，延长开花期，扩大子房或扩大茎部。

WO 99/31242A1(KWS)涉及通过在植物中引入或激活光敏色素B基因而过表达光敏色素B的植物。嵌合的拟南芥phyB基因通过根癌农杆菌介导的基因转移被转化到马铃薯植物中。表达来自拟南芥的光敏色素B的转基因植物表现出矮化，顶端优势减少，叶片呈深绿色。各种表型变化似乎与光合作用输出的增加有关。在转化的植物中发现块茎的数量和产量增加。用来自马铃薯(Solarium tuberosum)的光敏色素b转化马铃薯也可以改善植物的特性，尽管它比来自拟南芥的基因改善的性状数量少。

US2007295252A1(Dasgupta)公开了从玉米中鉴定的核酸分子，如启动子、引导子和增强子，以及嵌合分子中所述调控元件的组合。所鉴定的调控元件来自果糖1-6双磷酸醛缩酶(FDA)、丙酮酸正磷酸双激酶(PPDK)或核酮糖双磷酸羧化酶活化酶(RCA)基因。调控元件分子优选能调控叶片组织中基因的转录。调控元件包括启动子、增强子、引导子，以及嵌合或杂交表达元件形式的此类调控元件的组合。描述了含有DNA构建体的转基因玉米植物和种子，该DNA构建体包括与异源DNA分子可操作地连接的启动子和调控元件，并且转基因植物据此表达出农艺学上理想的表型。

CN108913717A(UNIV HENAN)公开了基于Crispr-Cas9的水稻光敏色素PHYB基因编辑载体。该载体用于突变水稻光敏色素PHYB基因，而不会突变植物中的其他基因。在水稻中创建了四个突变的phyB突变体，然后对其进行农学上有用的性状筛选。基因编辑载体简化了创建phyB突变体的工作量，使创建突变体的过程更加可控。

Ganesan等人，(2017)“Development of transgenic crops based on photo-biotechnology”Plant Cell Environ.40:2469-2486是一篇综述性文章，主要探讨了光感受器的调节。提到了涉及PHYB调节的各种尝试(也在上面列出)，但所有的尝试都引起了植物生长和发育方面不理想的结果，并对植物生产率产生负面影响。

综上所述，尽管在操纵PHYB、YHB和PHYA在植物中的表达方面进行了许多尝试，但上述专利公开没有一个成功地改善光合作用、生长和产量。相反，它们对植物发育、植物结构和水利用效率产生了负面影响。困难在于光敏色素在所有植物中都有核心的调控作用，以前对这些基因的所有操作都导致了发育缺陷，因此对该基因的表达的时机或位置的操作不适合用于改善作物。

Leegood,R.C.(2008)“Roles of the bundle sheath cells in leaves of C₃plants”J.Exp.Bot.vol 59pp 1663–1673是一篇综述性文章，其解释了许多C₃植物叶片中叶脉周围的束鞘(bundle sheath)细胞的结构和功能。尽管很明显，束鞘细胞及其延伸部分具有许多代谢作用，例如，在碳水化合物的合成和储存，氮和硫的吸收、代谢和活化(mobilization)，以及抗氧化代谢方面的作用，但很明显，对它们在C₃植物叶片中的活动还有很多需要了解。

发明内容

本发明人发现，如果感兴趣的基因(gene of interest,GOI)，特别是PHYB，与其他植物细胞或组织相比，主要在植物的束鞘细胞中表达，那么这将导致一系列在植物生长、发育和生产率方面完全有益的性状而没有有害的性状。

相应地，本发明提供了一种提高C₃植物光合作用能力的方法，该方法包括改变植物的可遗传的基因物质，以使GOI在植物的一个或多个维管鞘(vascular sheath)细胞中表达，并且其中GOI在基因表达调控元件的控制下表达，所述基因表达调控元件在植物的维管鞘细胞中有活性。

正如本领域技术人员容易理解的那样，本发明的方法是用于提供与正常或野生型植物或任何没有经过本发明方法处理的植物相比，具有改变的基因构成的C₃植物。现在有许多方法可以改变植物的基因组，并有各种术语用来描述这些。这些术语中的每一个对于熟练的读者来说都是熟悉的，包括“基因修饰”、“基因工程化”或“基因编辑”，并且经常可互换使用。所有这些都是指相对于未修饰的对照植物而言，其基因组序列发生了改变的植物。这种改变可以通过任何转化、转染、转导或基因组工程技术将本发明的一个或多个多核苷酸插入靶标植物的基因组中而引起。这种改变也可以通过核酸酶介导的基因组编辑、引导编辑(prime editing)和/或碱基编辑引起。

在本文定义的本发明方法的实施方案中，植物细胞的基因物质优选首先被改变，然后从基因改变的细胞中再生出基因改变的整个植物。从细胞或植物组织再生植物是本领域技术人员从已有文献中熟悉的事情。

在优选的方法中，基因表达调控元件在植物的至少一些维管鞘细胞中具有特异性的活性，由此调控元件控制下的GOI在基因改变的整个植物的至少一些维管鞘细胞中特异性地表达。本文所用的术语“特异性”也可以包括“排他性”或“强烈的偏好性”的含义。

另外地或替代地，GOI是光敏色素B，或其活性变体，或功能片段，如下文所进一步定义。

可遗传的基因物质的改变可以包括将多核苷酸插入植物细胞的可遗传的基因物质中。

在一些方法中，可遗传的基因物质的改变可以包括将基因修复寡聚核苷碱基(GRON)介导的突变引入植物细胞的可遗传的基因物质的靶DNA序列中。在进一步的方法中，植物细胞可以暴露于DNA切割器和GRON。DNA切割器可以包括大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指、抗生素或Cas蛋白。

可遗传的基因物质的改变可以包括使用锌指核酸酶(ZNF)和/或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)对植物细胞的可遗传的基因物质进行位点特异性同源重组。因此，本发明提供了改变植物基因物质的方法，该植物至少在其部分区域进行C₃光合作用，该改变使得改性植物在植物的维管鞘细胞中的至少一些(可选地，全部)中表达PHYB，或活性变体如YHB，或其功能片段。这种在维管鞘细胞中的表达是对植物中至少一个PHYB基因拷贝的正常表达模式的补充。正如可以理解的那样，至少一个PHYB拷贝和伴随的表达控制元件优选保持不变，这样，与相同基因型的未修饰植物相比，修饰植物的生长和发育可以基本不变。

根据本发明的方法可以采用经典和众所周知的基因修饰技术，包括转化方法，据此可以将天然或外源PHYB基因、其活性变体或功能片段的一个或多个额外拷贝与必要的维管鞘细胞表达调控元件一起并入植物基因组中。这种并入优选是稳定的和可遗传的，以便允许将该修饰引入作物植物的特定品系中；有利地用于作物改良或育种计划的目的。另外，如上所述，可以使用CRISPR-Cas基因修饰方法，其中选择指导RNA(gRNA)将CRISPR相关蛋白(Cas)的作用靶向到所期望的基因组位点，导致同源重组(HR)事件，即在植物基因组中插入-删除所期望的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的方法可能涉及简单地通过任何数量的基因编辑方法将维管鞘表达调控元件(如启动子序列或DNA调控元件)引入基因组中现有的天然PHYB编码基因序列的上游位置。在操作本发明的这种实施方案中，引导性的方法是很方便的，例如，使用CRISPR相关蛋白(Cas)，它可以被gRNA或任何其他基因组编辑核酸酶(ZFN、TALEN和其他Cas蛋白)引导，以裂解特定的基因组区域并通过同源重组引入必要的多核苷酸作为修复DNA模板。

根据上述涉及CRISPR-Cas的本发明方法，用于转化植物材料的一个或多个多核苷酸可以包括编码Cas蛋白，可选地还有指导RNA(gRNA)的多核苷酸，其中gRNA将Cas蛋白引导到植物细胞基因组中至少一个内源PHYB基因拷贝的基因座上，据此插入调控元件，以使PHYB的一个或多个内源拷贝在再生植物的至少一些维管鞘细胞中特异性表达。

在一些实施方案中，gRNA被合成为单一的指导RNA(sgRNA)或CRISPR-RNA(crRNA)：反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)双链。在一些实施方案中，可以同时使用多个gRNA、crRNA或tracrRNA，例如，以靶向多个基因组区域。在一些实施方案中，不同类型的CRISPR-Cas系统和正交的Cas蛋白可以同时使用。

如本文所用，术语“Cas”或“Cas蛋白”或“CRISPR-Cas蛋白”或“Cas核酸酶”或“Cas部分”或“Cas结构域”是指CRISPR相关蛋白，包括其任何等同物或功能片段和来自任何生物体的任何Cas同源物、直系同源物或旁系同源物，以及天然存在的或工程化的Cas的任何突变体或变体。CRISPR-Cas蛋白可以是，例如，Cas9、Cas12a或Cas12b。CRISPR内切酶可以使用大肠杆菌表达系统产生。例如，将由T7启动子驱动的Cas基因编码到大肠杆菌是一种机制。CRISPR-Cas蛋白还可以包括Cas12c(或C2c3)、Cas12d(或CasY)、Cas12e(或CasX)、Cas13a(或C2c2)、Cas13b(或C2c6)、Cas13(c)或C2c7、Cas13d(或Casrx)，或其功能片段。

如本文所用，术语“Cas9”或“Cas9核酸酶”或“Cas9部分”或“Cas9结构域”或“Csn1”是指CRISPR相关蛋白9或其功能片段，并包括来自任何生物体的任何天然存在的Cas9，任何天然存在的Cas9等同物或其功能片段，来自任何生物体的Cas9同源物、直系同源物或旁系同源物，以及天然存在的或工程化的Cas9的任何突变体或变体。更广泛地说，Cas9是一种“RNA可编程核酸酶”或“RNA引导的核酸酶”，或更广泛地是一种“核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)”。术语Cas9并不意味着有特别的限制性，可以被称为“Cas9或等同物”。示例性的Cas9蛋白在本文中进一步描述和/或在本领域中描述，并通过引用的方式并入本文。对于在本发明的进化基础编辑中采用的特定Cas9，本公开内容不受限制。

如本文所用，术语“Cas12a”或“Cas12a核酸酶”或“Cas12a部分”或“Cas12a结构域”可与Cpfl互换使用。术语“Cas12a”也可以包括CRISPR相关蛋白12a或其功能片段，并包括来自任何生物体的任何天然存在的Cas12a、任何天然存在的Cas12a等同物或其功能片段，来自任何生物体的任何Cas同源物、直系同源物或旁系同源物，以及天然存在的或工程化的Cas12a的任何突变体或变体。这延伸到Cas12a的直系同源物，以及编码这种直系同源物或系统的多核苷酸序列和包含这种直系同源物的载体或载体系统以及包含这种直系同源物的递送系统。更广泛地说，Cas12a是一种“RNA可编程核酸酶”或“RNA引导的核酸酶”，或更广泛地是一种“核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)”。术语Cas12a并不意味着有特别的限制性，可以被称为“Cas12a或等同物”。示例性的Cas12a蛋白在本文中进一步描述和/或在本领域中描述，并通过引用的方式并入本文。

如本文所用，术语“Cas12b”或“Cas12b核酸酶”或“Cas12b部分”或“Cas12b结构域”可与C2c1或Cpf2互换使用。术语“Cas12b”也可以包括CRISPR相关蛋白12b或其功能片段，并包括来自任何生物体的任何天然存在的Cas12b、任何天然存在的Cas12b等同物或其功能片段，来自任何生物体的任何Cas同源物、直系同源物或旁系同源物，以及天然存在的或工程化的Cas12b的任何突变体或变体。这延伸到Cas12b的直系同源物，以及编码这种直系同源物或系统的多核苷酸序列和包含这种直系同源物的载体或载体系统以及包含这种直系同源物的递送系统。更广泛地说，Cas12b是一种“RNA可编程核酸酶”或“RNA引导的核酸酶”，或更广泛地是一种“核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)”。术语Cas12b并不意味着有特别的限制性，可以被称为“Cas12b或等同物”。示例性的Cas12b蛋白在本文中进一步描述和/或在本领域中描述，并通过引用的方式并入本文。

如上所述，根据本发明的方法也可以采用新出现的基因修饰技术。例如，技术可以涉及将基因修复寡核苷酸(GRON)介导的突变引入植物细胞中的靶标脱氧核糖核酸(DNA)序列中，如US 9,957,515 B2中所描述和阐述的。技术还可以涉及将GRON介导的引入植物细胞中靶DNA序列的突变与其他DNA编辑或重组技术相结合，包括但不限于使用通过锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)进行的位点特异性同源重组进行基因靶向。技术还可以包括将植物细胞暴露于DNA切割器(一种影响链断裂的部分)和GRON中。可使用的DNA切割器的非限制性实例包括大范围核酸酶、TALEN、抗生素、锌指和CRISPR或CRISPR/Cas系统。

技术可以涉及将纯化的核酸酶蛋白引入植物细胞，而不需要插入外源基因物质。这些技术可以涉及EP3008186B1中描述的技术。特别是，这些技术可以涉及提供包含待修饰的外源基因的植物细胞；提供靶向内源基因的Cas9内切酶蛋白；以及通过基因枪转化或原生质体转化用所述Cas9内切酶蛋白转染植物细胞，从而使Cas9内切酶在基因组中引入一个或多个双链DNA断裂(DSB)，以产生具有可检测的靶向基因组修饰的一个或多个植物细胞，而植物基因组中不存在任何外源Cas9基因物质，如EP3008186B1中所公开。可以通过向分离的植物原生质体递送序列特异性核酸酶来实现转染。例如，可以使用聚乙二醇(PEG)介导的转染、电穿孔、基因枪介导的转染、超声介导的转染或脂质体介导的转染将序列特异性核酸酶递送到分离的植物原生质体来实现转染。

也可以使用RNA模板。例如，本发明的另一个方面是针对CRISPR Cas蛋白-引导RNA复合物的缀合物，其中引导RNA是crRNA、双引导RNA、sgRNA或1gRNA与一个或多个作为基因编辑的供体模板的单链DNA(ssDNA)的缀合物。因此，根据上述涉及CRISPR-Cas的本发明方法，用于转化植物材料的一个或多个多核苷酸可以包括编码CRISPR-Cas蛋白的多核苷酸，可选地还包括至少一个指导RNA(gRNA)，其中gRNA将CRISPR-Cas蛋白引导到植物细胞基因组中至少一个内源性光敏色素B拷贝的基因座上，据此插入调控元件，以使光敏色素B的一个或多个拷贝在再生植物的至少一些维管鞘细胞中特异性表达。插入植物细胞基因组中的至少一个拷贝可以使用基于病毒载体的系统插入。在基因工程的背景中，任何提及插入或插入调控元件的地方都可以指任何供体、供体序列或供体多核苷酸，它们被插入植物细胞基因组中，例如使用上述系统。供体(供体序列，或供体多核苷酸)可以指多核苷酸、RNA、DNA或基因组插入物。

要递送的序列特异性核酸酶可以是纯化的核酸酶蛋白的形式，也可以是mRNA分子的形式，该mRNA分子在转染后可以翻译成蛋白质。核酸酶蛋白可以通过本领域技术人员已知的一些方法制备，使用现有的蛋白质表达载体，例如但不限于pQE或pET。合适的载体允许在各种细胞类型(大肠杆菌、昆虫、哺乳动物)中表达核酸酶蛋白并随后进行纯化。mRNA形式的核酸酶的合成也可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行，例如通过使用T7载体(pSF-T7)，该载体允许产生加帽的RNA以转染到细胞中。mRNA可以用最佳的5’非翻译区(UTR)和3’非翻译区进行修饰。UTR已被证明在通过调节定位、稳定性和翻译效率对基因表达的翻译后调控中起着关键作用(Bashirullah A,Cooperstock R,Lipshitz H(2001)Spatial and temporal control of RNA stability.PNAS 98:7025-7028)。如上所述，由于其非转基因性质，mRNA的递送是想要的；然而，mRNA是非常脆弱的分子，在植物转化过程中容易被降解。在植物mRNA转化中利用UTR可以增加mRNA分子的稳定性和定位，从而提高非转基因基因组修饰的转化效率。

在一些实施方案中，CRISPR试剂可以用携带CRISPR表达盒的DNA通过农杆菌介导的或粒子轰击介导的转化来递送。例如，在一些实施方案中，编码Cas蛋白的mRNA可以通过粒子轰击与gRNA共同递送到植物中。在其他实施方案中，Cas蛋白和gRNA可以预先组装成核糖核蛋白(RNP)并通过供体模板引入植物中。递送RNP到植物中可以通过各种方法实现。方法包括，例如，聚乙二醇(PEG)介导的细胞转染、粒子轰击、电穿孔和脂质转染。术语“供体模板”是指转基因盒或与同源区相邻的基因编辑序列，通过同源基因修复(HDR)/单链DNA重组(SSDR)与宿主位点重组并用正确的序列替换突变的DNA。如本文所用，供体模板可以被称为“供体多核苷酸”。供体多核苷酸可以是ssDNA或dsDNA或质粒/载体，并且可以通过共价接头与引导RNA或Cas蛋白进行化学缀合。供体模板可以是化学合成的，并配备有用于缀合/连接的化学功能。缀合供体模板也可以通过在DNA聚合酶存在下的体外基因合成来制备，在其5’或3’端以酶促的方式并入化学功能，例如胺和炔，以便与三磷酸核苷类似物进行化学缀合/连接。

纯化的核酸酶可以通过各种方式递送到植物细胞。要递送的序列特异性核酸酶可以是纯化的核酸酶蛋白的形式，也可以是mRNA分子的形式，该mRNA分子转染后可以翻译成蛋白质。核酸酶蛋白可以通过本领域技术人员已知的一些方法制备，使用现有的蛋白质表达载体，例如但不限于pQE或pET。合适的载体允许在各种细胞类型(大肠杆菌、昆虫、哺乳动物)中表达核酸酶蛋白并随后进行纯化。mRNA形式的核酸酶的合成也可以通过本领域技术人员已知的各种方法进行，例如通过使用T7载体(pSF-T7)，该载体允许生产加帽的RNA以转染到细胞中。mRNA可以用最佳的5’非翻译区(UTR)和3’非翻译区进行修饰。UTR已被证明在通过调节定位、稳定性和翻译效率对基因表达的翻译后调控中起着关键作用(BashirullahA,Cooperstock R,Lipshitz H(2001)Spatial and temporal control ofRNAstability.PNAS 98:7025-7028)。如上所述，由于其非转基因性质，mRNA的递送是想要的；然而，mRNA是非常脆弱的分子，在植物转化过程中容易被降解。在植物mRNA转化中利用UTR可以提高mRNA分子的稳定性和定位，从而提高非转基因基因组修饰的转化效率。

此外，基因枪颗粒递送(biolistic particle delivery)系统可用于转化植物组织。标准的PEG和/或电穿孔方法可用于原生质体转化。转化后，对植物组织/细胞进行培养，使细胞分裂、分化和再生。来自单个事件的DNA可以被分离出来并进行突变筛选。任何类型的序列特异性核酸酶都可用于执行本文提供的方法，只要它具有与TAL效应物核酸酶类似的能力。因此，它必须能够在一个或多个靶向基因位点诱导双链DNA断裂，导致该基因座或位点的一个或多个靶向突变，其中突变是通过NHEJ或其他机制错误地修复断裂而发生的(Certo M T,Gwiazda K S,Kuhar R,Sather B,Curinga G等人，(2012)Couplingendonucleases with DNAend-processing enzymes to drive gene disruption.Naturemethods 9:973-975.Christou,P.(1997)Rice transformation:bombardment.Plant MolBiol.35(1-2):197-203)。这样的序列特异性核酸酶包括但不限于ZFN、归巢内切酶如I-SceI和I-CreI、限制性内切酶和其他归巢内切酶或TALEN^TM。在具体的实施方案中，要使用的内切酶包括CRISPR相关的Cas蛋白，如Cas9(Gasiunas,G.,Barrangou,R.,Horvath,P.,Siksnys,V.(2012)Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNAcleavage for adaptive immunity in bacteria.PNAS 109(39):E2579-86)。

同样根据本发明，可以有至少一种多核苷酸，其从5’到3’包含，在植物维管鞘细胞中具有特异性活性的表达调控元件，编码PHYB、其活性变体或功能片段的核苷酸序列，和终止子；另一种多核苷酸编码基因组编辑核酸酶，以及可选地，相同的或另一种多核苷酸编码gRNA或crRNA，其将基因组编辑核酸酶蛋白引导到植物基因组中的所期望的基因座，从而在维管鞘调控元件的控制下将外源PHYB、其活性变体或功能片段插入植物基因组中的所期望的基因座。

在本发明的一些实施方案中，可以有至少一种多核苷酸，其从5’到3’包含，在植物维管鞘细胞中具有特异性活性的表达调控元件，编码PHYB、其活性变体或功能片段的核苷酸序列，从而使外源PHYB、其活性变体或功能片段插入植物基因组中。

在一些实施方案中，可以使用不采用诱导双链DNA断裂的方法来并入所需的DNA序列。例如，引导编辑(prime editing)就是这样一种方法，可用于覆盖天然核苷酸序列。正如本领域技术人员所熟悉的那样，引导编辑使用DNA缺口酶与工程化的反转录酶相偶联，以任何DNA序列靶向并覆盖特定的基因组区域。(参见，例如，Kantor,A.等人，(2020)Int.J.Mol.Sci.21:6240，其提供了CRISPR-Cas9 DNA碱基编辑和引导编辑的综述)。引导编辑器使用工程化反转录酶与缺口酶(如Cas9缺口酶)和引导编辑指导RNA(pegRNA)融合。pegRNA包含与靶标位点相匹配的序列，该序列引导缺口酶到达其靶标序列，同时还包含另外的序列，拼出所需的序列变化。引导编辑器可以扩大DNA编辑的范围，不包括所有的过渡和反转突变，以及小的插入和删除突变。可用于引导编辑的缺口酶的实例包括但不限于Cas9缺口酶或Cas12缺口酶。例如，可以采用Cas9 D10A缺口酶或Cas9 H840A缺口酶。此外，可以采用Cas9n，使用与两个不同的gRNA配对的缺口酶系统，以扩大靶标裂解的特异性识别碱基的数量，这可以提高特异性并有助于减轻脱靶现象。(参见，例如，Khatodia,S.等人(2016)Front.Plant Sci.vol 7page 506，这是另一篇综述，提供了有关CRIPSR/Cas基因组编辑工具的信息)。

引导编辑可用于覆盖内源性天然基因序列，例如天然PHYB的一个拷贝的表达调控元件，从而使所产生的改性植物在至少一些维管鞘细胞中特异性地表达PHYB。另外，引导编辑可用于进一步修饰已经引入植物基因物质中的天然或外源序列，例如通过对PHYB的编码序列进行修饰，例如使其成为活性变体，如YHB。

在一些实施方案中，这些方法可以采用Cas内切酶，其中Cas内切酶可以包括Cas多肽的修饰形式。Cas多肽的修饰形式可以包括减少Cas蛋白天然存在的核酸酶活性的氨基酸变化(例如，删除、插入或替换)。在一些情况下，Cas多肽的修饰形式没有实质性的核酸酶活性，被称为催化的“失活的Cas”或“去活化的Cas(dCas)”。失活的Cas/去活化的Cas包括，例如，去活化的Lapis Cas内切酶(Lapis dCas)。例如，在一些实施方案中，核酸酶去活化的Cas9(dCas9)被用来实现这种插入。与碱基编辑酶(胞苷或腺嘌呤脱氨酶)偶联的dCas蛋白可用于修饰RNA或DNA。在一些实施方案中，可采用直接效应物融合设计，通过将效应物蛋白或其活性结构域与dCas9进行基因融合并作为单一重组蛋白表达，可实现对靶向基因的调控(CRISPRi)或活化(CRISPRa)。例如，转录活化物结构域(VP64，p65)或抑制物结构域(KRB，SID)可以与dCas9融合，以特异性地增加或减少靶标基因的表达。在一些实施方案中，效应物结构域通过与dCas9融合或通过支架RNA(scRNA)中的RNA适配体，通过并入sgRNA-dCas9复合物的功能支架被招募。在其他实施方案中，效应物活性的时空控制是通过效应物被控制地招募到sgRNA-dCas9复合物或通过光或化学诱导的异二聚体化配偶体直接与效应物融合的分裂-dCas9的重构而获得的。

在其他实施方案中，本发明的方法可以包括碱基编辑的可能性，这允许修饰单个核苷酸。碱基编辑可以采用DNA碱基编辑器，其中有两类已被描述：胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器。DNA碱基编辑器包括两个关键部分：用于可编程DNA结合的Cas酶和用于靶向核苷酸改变的单链DNA修饰酶。在使用胞嘧啶碱基编辑器时，胞嘧啶脱氨生成尿嘧啶，尿嘧啶在DNA中作为胸苷的碱基配对。融合尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)可抑制尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)的活性，这可能会提高细胞中胞嘧啶碱基编辑的编辑效率。在腺嘌呤碱基编辑中，腺苷脱氨生成肌苷，它与DNA中的鸟苷具有相同的碱基配对偏好。总体而言，胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑可以安装所有四个过渡突变(C→T，T→C，A→G和G→A)。因此，例如，胞嘧啶脱氨酶的定点作用可以用来催化所靶向的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，然后被天然聚合酶读取为胸腺嘧啶。因此，有多种可用的选择，既可以引入维管鞘表达调控序列来作用于天然光敏色素序列，也可以根据需要将天然PHYB转换为YHB序列。本发明还提供了一种分离的DNA多核苷酸，其从5’到3’包括，在C₃植物维管鞘细胞中具有特异性活性的表达调控元件如启动子，编码PHYB、其活性变体或功能片段的核苷酸序列，以及终止子。

在本发明的实施方案中，启动子是植物维管鞘细胞特异性启动子，该启动子可以是束鞘细胞特异性启动子，也可以是内束鞘(mestome sheath)细胞特异性启动子，或者是在束鞘细胞和内束鞘细胞中都具有特异性活性的启动子。

在一些实施方案中，分离的DNA多核苷酸可以进一步包括编码转录因子的核苷酸序列，以及编码第二启动子(不是上述的维管鞘启动子)并被转录因子识别的核苷酸序列，其中第二启动子的核苷酸序列位于编码PHYB、其活性变体或功能片段的核苷酸序列的上游，并且其中维管鞘特异性启动子驱动转录因子的表达。

该DNA多核苷酸可以全部或部分合成；或者可选地全部或部分克隆。在C₃植物维管鞘细胞(无论是束鞘细胞还是内束鞘细胞(或两者))中具有特异性活性的启动子也可以在维管束(vascular bundle)的其他细胞中具有活性，其中非限制性实例包括韧皮部和/或木质部细胞。本申请中使用的术语“维管束”是指维管束的所有细胞，包括维管鞘细胞。在维管鞘细胞中具有活性的启动子也可以在其他非维管细胞类型中具有活性，其中非限制性的实例包括根细胞、表皮细胞或气孔细胞(如保卫细胞)。在维管鞘细胞中具有活性的启动子也可以在维管鞘的延伸部分中具有活性，如束鞘延伸部分和副侧脉叶肉。

在本发明范围内的还有在C₃维管鞘细胞中具有特异性活性的启动子，也就是说，这些启动子在C₃维管鞘细胞中具有活性，但在任何其他叶组织或叶细胞中没有活性，但可以在除叶片中发现的植物细胞或组织类型以外的任何数量的可能的植物细胞或组织类型中具有活性。

终止子序列是本领域技术人员所熟知的，可以选择和使用任何适当的终止子，例如在本发明的实例中，其中终止子是Nos_ter。

优选地，在本文定义的本发明的任何实施方案中，启动子是维管鞘启动子(例如，束鞘细胞启动子，或内束鞘细胞启动子，或同时在束鞘和内束鞘中表达的启动子)。这可以是由各种选定元件组成的合成启动子。例如，这样的合成启动子可以包括启动子元件上游的维管鞘细胞特异性转录因子结合元件。可以有两个或更多个转录因子结合元件，它们可以是相同的或不同的。多个这样的转录因子结合元件可用于提高维管鞘细胞中启动子的活性和/或特异性。

例如，上面提到的并包含在合成维管鞘启动子中的启动子可以选自最小ZmUbi1启动子、NOS核心启动子、CHSA核心启动子或最小35S启动子。其他最小和/或核心启动子也可以使用，这些启动子是本领域技术人员所熟知的。优选的启动子具有SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或与之具有至少80％同一性的序列。

在其他实施方案中，维管鞘特异性启动子可以来源于优先或特异性地在植物的束鞘或内束鞘(或两者)中表达的基因，因此这样的启动子是天然存在的启动子。该基因可以在其他细胞类型以及维管鞘细胞中表达，但优选不在叶片叶肉细胞中表达或在叶片叶肉细胞中表达量很低。该基因也可以在保卫细胞、维管鞘延伸部分、表皮细胞、保卫细胞或其他维管组织(如木质部和/或韧皮部)中表达；或在植物中不属于叶片组织的其他地方(如花、果实、根、茎)表达。优选地，这种天然存在的维管鞘启动子可以与在植物束鞘细胞或内束鞘细胞或两者中特异性表达(例如只在束鞘细胞中表达，而不在任何其他植物组织或细胞类型中表达)的基因相关联。

维管鞘特异性启动子可以是来自例如以下基因之一的启动子：拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYB76、三脉黄顶菊(Flaveria trinervia)GLDP、拟南芥SULTR2；2、拟南芥SCR、拟南芥SCL23、类黍尾稃草(Urochloa panicoides)、PCK1、结缕草(Zoysiajaponica)PCK和大麦(Hordeum vulgare)PHT1；1.，包括这些基因的同源物。尽管启动子是参照植物物种指定的，当然相同或类似的启动子也可以从不同的植物起源物种中找到和使用。

在一些实施方案中，维管鞘启动子可以来源于非植物生物体，例如水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus,RTBV)启动子。

维管鞘启动子可以来源于突变体群体的正向筛选，以确定驱动维管系统中基因表达的启动子。

在一些实施方案中，维管鞘的优先表达可以通过使用UTR序列来实现，该序列与PHYB的靶标编码序列、其活性变体或功能片段融合后，即使转录本的表达是由组成型启动子驱动的，也会赋予蛋白质的细胞特异性表达。这种维管鞘特异性UTR元件的实例包括来自黄顶菊(Flaveria bidentis)(Patel等人2006.J Biol Chem 281(35):25485-91)或籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)(Patel等人2004.Plant Physiology 136(3):3550-3561)的二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚单位的UTR序列，二者都使得翻译增强和优先在束鞘细胞表达。

可以在本发明的DNA多核苷酸中编码的PHYB或氨基酸序列变体可以对应于SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的氨基酸序列中的任何一个。除上述参考序列外，由表1中所列登录号确定的序列的任何一个编码序列可以代替作为一个或多个参考序列使用。就PHYB参考序列的变体而言，这些可以包括与之具有至少65％的同一性的序列；优选与之具有至少70％的同一性的序列；更优选与之具有至少80％的同一性的序列。

在本发明的示例中，使用了PHYB变体YHB SEQ ID NO:4，它由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。在本发明的进一步示例中，使用了PHYB变体YHB SEQ ID NO:12，它由SEQ IDNO:11的核苷酸序列编码。

因此，在本发明的多核苷酸中，编码PHYB的核苷酸序列是SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中的任何一个，或与任何所述序列具有至少65％的同一性的序列；优选与任何所述序列具有至少70％的同一性的序列；更优选与任何所述序列具有至少80％的同一性的序列。

在本发明的某些实施方案中，采用了PHYB的功能片段或其变体。这种功能片段具有野生型光敏色素信号传导活性，但缺乏光敏感性。换句话说，PHYB变体是小于全长氨基酸序列的，并且由于缺少光感应结构域或光感应功能的必需氨基酸而对光不敏感。优选地，本文提到的光敏色素片段仅由PAS和GAF结构域组成。

本发明包括DNA多核苷酸，其中由此编码的PHYB蛋白分子、其活性变体或功能片段是光不敏感的序列变体；换句话说，有一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入，导致该蛋白的光不敏感性，同时保留通常的PHYB信号传导活性功能。在这种变体中，连续的氨基酸变化数量可以是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的任何数量的氨基酸。可以有一些但不完全连续的氨基酸变化的数量可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。

在一些实施方案中，本发明可以包括一种质粒，该质粒包括如前所述的DNA多核苷酸、复制原点和Ti或Ri质粒的T-DNA右边界重复，以及至少一个细菌可选择标记。更常见的是该质粒还包括Ti或Ri质粒的左边界重复。

根据本发明的质粒可以进一步包括一个或多个选自以下的其他元件：增强子、植物可选择标记、多克隆位点或重组位点。

本发明还提供了一种Ti或Ri质粒，其包括如前定义的DNA多核苷酸。包含这种质粒的载体的结构、修饰、传播和产生对于本领域技术人员来说是众所周知的。

在一些实施方案中，本发明可以包括一种使用基因枪方法转化植物细胞的组合物。因此，该组合物包括包被有本文定义的DNA多核苷酸或质粒的微粒子。该微粒子可以是金属或合成材料的。例如，该微粒子可以包括钨或金。

本发明还提供了一种包含本文定义的质粒(即穿梭载体)的细菌，在本发明的一些实施方案中，该细菌是大肠杆菌。

当Ti或Ri质粒用于转化植物材料时，它可以包含在合适的细菌中，如农杆菌属；优选根癌农杆菌(A.tumefaciens)。

本发明包括任何植物或植物材料，即细胞、组织、器官、部分、种子或果实，从本文定义的本发明的任何方法中获得或可获得。

根据本发明的产品包括至少在其一部分进行C₃光合作用的植物，这些植物包括如本文定义的DNA多核苷酸，其被稳定地整合到其基因组中，并在至少一些维管鞘细胞(即束鞘细胞和/或内束鞘细胞)中表达如本文定义的PHYB或活性变体或功能片段。正如已经解释过的，可以通过基因修饰方法整合全长启动子和PHYB、活性变体或功能片段，或者通过基因编辑天然PHYB基因的表达调控区来改变其表达结构域，将这种DNA多核苷酸引入植物基因组中。这两种方法的结果都是一样的，即PHYB在维管鞘细胞中的可遗传表达。PHYB基因、其活性变体或功能片段可以在基本上所有束鞘细胞和/或内束鞘细胞中表达。

本发明进一步包括一种植物，该植物至少在其一部分进行C₃光合作用，其中该植物具有至少一个拷贝的如前文定义的PHYB基因、其活性变体或功能片段，并且与同等的未修饰的植物相比，该植物被基因修饰，其中至少一个拷贝的PHYB基因或其活性变体或功能片段的表达控制元件被修饰以导致在该植物的至少一些束鞘细胞和/或内束鞘细胞中表达。在这样的植物中，表达控制元件优选是在C₃植物维管鞘细胞中具有特异性活性的如前文定义的启动子。

至少一个PHYB基因的编码序列可以与植物中的一个或多个天然PHYB基因相同。因此，PHYB基因的至少一个天然拷贝被修饰为至少在植物的一些维管鞘细胞中表达。因此，在具有一个以上PHYB拷贝的物种中，至少一个天然PHYB基因处于未修饰的天然表达控制之下。

在修饰植物的某些实施方案中，至少一个PHYB基因与植物中的其他一个或多个PHYB基因不同。

根据本发明的植物可以是单子叶植物(单子叶植物分支)或双子叶植物(真双子叶植物分支，双子叶植物分支)；优选作物植物，例如水果、蔬菜、谷物、油料作物、豆类、生物燃料作物、纤维作物，如通常用于食品、动物饲料、生物燃料或生物质生产的植物；也包括园艺植物。

在优选的植物中，如本文定义的DNA多核苷酸被稳定地和可遗传地整合到其基因组中。

在一些实施方案中，本发明的植物在至少一些维管鞘细胞中表达的PHYB基因具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12中的任何一个的氨基酸序列，或表1中所列的序列登录号中的任何一个，或定义的活性变体，或其功能片段，其编码与任何所述序列具有至少65％的同一性的氨基酸序列；优选与任何所述序列具有至少70％的同一性的序列；更优选与任何所述序列具有至少80％的同一性的序列。在一些实施方案中，PHYB基因具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12的氨基酸序列，或表1中所列的任何序列登录号的氨基酸序列。在其他实施方案中，PHYB基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:12中的任何一个或表1中所列的任何序列登录号具有至少65％的同一性。在其他实施方案中，PHYB基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12或表1中所列的任何序列登录号具有至少70％的同一性。在其他实施方案中，PHYB基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12或表1中所列的任何序列登录号具有至少80％的同一性。在其他实施方案中，PHYB基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQID NO:12或表1中所列的任何序列登录号具有至少90％的同一性。在表达PHYB功能片段的本发明植物中，这些功能片段如前述所定义。

PHYB基因、其活性变体或功能片段可以是光不敏感的序列变体，例如通过一个或多个涉及氨基酸残基的替换、插入或缺失的突变的方式。PHYB基因、其活性变体或功能片段也可以通过核酸残基的替换、插入或缺失而改变。在一些实施方案中，如下文所述，PHYB序列是活性变体YHB的序列，编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与之具有至少65％的同一性的序列。

根据本发明的植物可以在维管鞘细胞(如束鞘细胞和/或内束鞘细胞)中存在叶绿体，这些叶绿体其可能大于在相同条件下生长相同时间的未修饰对照植物的同等细胞中的叶绿体。

根据本发明的植物可以具有比在相同条件下生长的未修饰对照植物更大的光合作用速率。

根据本发明的植物可以具有比在相同条件下生长的未修饰对照植物更高的水利用效率。

与在相同条件下生长的对照植物相比，根据本发明的植物可以具有增强的光合作用效率。

与在相同条件下生长的对照植物相比，根据本发明的植物可以具有增强的光合作用，其导致了以下一个或多个性状：增强的生长速度、减少的开花时间、更快的成熟、增强的种子产量、增加的生物质、增加的植物高度和增加的叶冠面积。

本发明还提供了一种植物部分、植物组织、植物器官、植物细胞、植物原生质体、胚、愈伤组织培养物、花粉粒或种子，其来源于或获得自本文所述的任何种类的植物。

本发明还包括从本文所述的任何植物中获得的任何加工的植物产品，其中加工的产品包括可检测的核酸序列，该序列编码(i)与在植物的至少一些维管鞘细胞中具有活性的基因表达调控元件相连的PHYB基因或其活性变体或功能片段，或(ii)至少一部分本发明的多核苷酸。这种检测可以采用本领域众所周知的技术，如PCR、qPCR，或对经加工的植物材料的适当制备的样品应用任何DNA或RNA测序技术。

综上所述，本发明人对C₃植物进行了新的改造，提高了C₃植物的光合作用能力。在使用术语“C₃”植物时，这也包括在植物生命周期的任何时候在植物的任何部分进行C₃光合作用的植物(非限制性实例包括叶鞘组织、子叶、或根、茎和种子的光合作用活性部分)。

以前通过增加光敏色素信号传导来提高植物生产率的尝试要么降低了光合作用和产量，要么实现了光合作用的提高，但只与叶绿素投入成比例(需要更多的氮投入)，并导致水利用效率和/或产量的降低。这种基因的这些应用也一再在作物中产生不希望的副作用：包括矮化、冠重组、开花延迟、块茎变小和叶片变厚。

这种C₃植物改性的总体效果是促进光合作用、植物生长和产量，而对植物形态、发育或其他农艺性状没有任何不利影响。本发明广泛适用于所有的C₃植物，可以产生30％或更高的光合作用速率、生长速率和种子产量的增加，而不会对植物的正常发育造成任何干扰。

总的来说，本发明实现了增强的光合作用、生长和产量，而对改性植物没有可观察到的负面或有害的解剖学、生理学、生物化学或发育影响。

附图说明

下面参照实施例和附图进一步描述本发明的实施方案，其中：

图1描述了简化的PHYB信号传导级联，其中包含基因的非限制性实例，这些基因在转录本和/或蛋白质水平上都受到PHYB活性的影响。PHYB的活性使几个基因从抑制中释放出来，然后促进光合作用能力的发展。基因全称：PHYB＝光敏色素B，PIF＝光敏色素相互作用因子，COP1＝组成型光形态发生1，GLK＝Golden-2样转录因子，CGA1＝细胞分裂素反应性GATA因子1，GNC＝GATA，硝酸盐可诱导，参与碳代谢，HY5＝伸长下胚轴5，HYH＝HY5-同源物。

图2描述了光敏色素B的系统发育树，包含光敏色素B基因家族的开花植物成员的非限制性实例。该树以开花植物的基部为根。代表性的物种横跨单子叶植物(水稻)，以及两个主要的双子叶植物分支，即蔷薇分支(拟南芥(Arabidopsis thaliana)和大豆(Glycinemax))和菊分支(番茄(Solanum lycopersicum))。在所有三个有代表性的双子叶植物物种中，PHYB的独立重复导致每个基因组中存在PHYB的两个同源物。

图3显示了用于通过农杆菌介导的花期浸渍在拟南芥维管束中表达YHB蛋白的基因载体的示意图。

图4显示了YHB在修饰植物和未修饰的对照植物中相对于对照基因elF-4E1的表达量。对照的bar对应的是野生型植物，标有“C12”的bar对应的是含有用于束鞘表达YHB的基因载体的拟南芥植株。误差的bar指示平均值的95％置信区间。

图5显示了含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)和对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)的叶片厚度测量结果。显示了95％的置信区间。“n.s.”指示在C12和对照植物之间没有显著差异，通过t检验确定。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图6显示了在含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(圆形)和对照植物(三角形)中以A/Ci曲线形式测量的光合作用能力。

图7显示了含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(圆形)和对照植物(三角形)的气孔导度测量结果。

图8显示了在含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)和对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)中，当光合作用发挥到最大时，水利用效率是如何提高的。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图9显示了与对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)的束鞘细胞(BSC)而不是叶肉细胞(MSC)中的叶绿体较大。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异，除此之外，“n.s.”表示比较值之间没有显著差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图10显示了对照植物和含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株之间的束鞘细胞叶绿体的比较。(A)是对照植物的束鞘细胞叶绿体的代表图像。(B)是含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的束鞘细胞叶绿体的代表图像。(C)是对照植物的束鞘细胞叶绿体和叶肉细胞叶绿体的代表图像。(D)是含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的束鞘细胞叶绿体和叶肉细胞叶绿体的代表图像。BSC＝束鞘细胞，MSC＝叶肉细胞，比例尺＝2微米。

图11显示了来自叶片材料的稳定碳同位素测量结果。与对照组拟南芥植株(标有“对照”的bar)相比，该数据与含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)中呼出的二氧化碳的再固定增加相一致。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图12显示了在含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)和对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)中，发芽后第2周和第3周之间的营养生长速率测量结果。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异，除此之外，“n.s.”表示比较值之间没有显著差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图13显示了花茎(bolt)高度的测量结果，与对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)在发芽35天后出现较高的花茎。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图14是多个正在进行正常的光形态发生的含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因和野生型拟南芥植株(“C12”)和对照拟南芥植株(“野生型”)的托盘的照片。

图15显示了含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)和对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)的抽苔(bolting)时间的测量结果。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图16是显示了含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标记为C12)和对照拟南芥植株(标记为野生型)在8周时的角果产量和地上生物质的照片。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图17是从含有用于束鞘表达YHB的基因载体的拟南芥植株(在右手管中)以及从对照植物(左手管)收集的干种子的照片。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图18显示了含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(标有“C12”的bar)和对照拟南芥植株(标有“对照”的bar)中干种子生物质的测量。测量是在两个不同的时间点进行的，一个是“早期”(发芽后6.5周干燥的种子)，一个是“晚期”(发芽后8周干燥的种子)。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。显示了对照野生型植物和一个突变体品系之间的比较，然而所有被研究的3个突变体品系在其表型上是一致的。

图19是对C₃植物中的新型的、增强的碳再固定途径提出的模型的示意图。

图20显示了在环境生长室条件下测量的含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因小麦植株(标有“C12”的bar)与对照小麦植株(标有“对照”的bar)相比的环境光合作用速率。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。

图21是显示了含有用于束鞘表达YHB的基因载体的典型转基因小麦植株(右)与对照小麦植株(左)相比的植物生长增强的照片。

图22显示了在生长七周后含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因小麦植株(标记为“C12”)与对照小麦植株(标记为“对照”)相比的代表植物生长的高度测量结果。显示了95％的置信区间。星号表示使用t检验在p<0.05时有统计学意义的差异。

图23显示了五个维管鞘启动子之间的功能保存情况，这些启动子已被证明在远缘植物属中具有功能。11个植物属之间的进化关系横跨三个主要植物分支(蔷薇分支、菊分支和单子叶植物分支)，用系统发育表示(分支长度为任意值)。对于五个启动子(SULTR2；2、GLDP、PCK、PHT1；1和RBTV)中的每一个，箭头表示起源的物种，箭头指向远缘物种，在该物种中已被证明有一致的维管鞘表达。分化时间表示由箭头连接的两个物种共享共同的祖先已经有多少亿年了。例如，黄顶菊属(Flaveria)GLDP启动子在拟南芥中驱动一致的表达，尽管这两个群体在大约1.25亿年前就已经分化了。

图24显示了已发表的实验，在这些实验中，来自不同物种的PHYB直系同源物的功能被证明在远缘植物之间是保守的。系统发育和进化距离如图23所示。粗体字表示天然PHYB表达被改变的属，例如拟南芥属(Arabidopsis)和茄属(Solanum)(番茄)中的过表达和稻属(Oryza)(水稻)中的基因敲除。箭头表示PHYB基因的起源，并指出该PHYB同源物已被过表达的植物。例如，拟南芥PHYB在拟南芥属、茄属(番茄)和芒属(Miscanthus)(银草(silvergrass))中被过表达。无论PHYB的起源物种和接受物种如何，PHYB的表达增加会导致一致的表型(叶片呈深绿色，节间较短，开花延迟)。

图25显示了横跨超过4亿年陆地植物进化的PHYB蛋白选择的氨基酸序列中功能结构域的保守性。进化分支图显示了欧洲油菜(Brassica napus)、番茄(Solanumlycopersicum)、水稻(Oryza sativa)、江南卷柏(Selaginella moellendorfii)和小立碗藓(Physcomitrella patens)之间的进化关系。在有PHYB重复拷贝的物种如欧洲油菜和番茄中，显示了PHYB的所有拷贝。典型的PHYB结构域在所有的PHYB蛋白中都是保守的，由以下结构域组成(按从N末端到C末端的顺序)：PAS_2、GAF、PHY、PAS、PAS、HisKA、HATPase_c。陆地植物进化中的三个关键事件用交叉点注释：维管植物的出现(>4亿年前(mya))、开花植物的出现(>160mya)和十字花科的出现(>40mya)。分支长度是任意的，不能反映进化距离。

图26显示了三种不同的欧洲油菜PHYB基因在16个不同栽培品种的叶片中的表达(以转录本/百万计)。

图27显示了单核苷酸两侧50个碱基对的排列，为了将欧洲油菜PHYB转化为与拟南芥YHB相当的组成型活性形式，必须改变该碱基对(突出显示)。多重序列排列下面的星号表示在所有三个全长欧洲油菜PHYB基因的拷贝中保守的核苷酸。下划线的14个碱基显示了PHYB拷贝之间的变异点，这使得单个拷贝可以成为编辑的靶标。

图28显示了两种设计，它们体现了在以下两个物种中对PHYB表达进行基因编辑的不同方法：Solyc05g053410番茄PHYB基因(顶部)和大豆Glyma.09G035500基因(底部)。PHYB基因组区域被描绘出来，并注释了天然外显子、5’和3’非翻译区(UTR)以及插入的启动子和增强子序列，这将赋予这些基因维管束表达。基因组特征根据其相对于起始密码子的位置(从0位开始)进行标记。

具体实施方式

在下面的段落中，将更详细地解释本发明的不同方面。所解释或定义的每个方面都可以与一个或多个任何其他方面结合，除非明确指出相反的情况。特别是，表示为优选或有利的任何特征可以与表示为优选或有利的一个或多个任何其他特征结合。

用于本发明的植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、重组DNA技术和生物信息学的常规技术都是本领域普通技术人员容易知道和可以得到的。具体技术在文献中得到了充分的解释。

本发明人已经产生了一个由基因表达的维管鞘特异性调节剂和叶绿体激活调节剂组成的系统，它们共同提高了光合作用和产量相关性状。本发明人已经证明该技术广泛适用于C₃植物，因为它在真双子叶植物(例如拟南芥)和单子叶植物(例如小麦)中都能发挥作用。本发明人已经证明，无论PHYB基因的物种起源如何，无论使用何种维管鞘启动子，本技术都能发挥作用。本发明的一个关键方面是PHYB、其活性变体或功能片段在维管鞘细胞(其可以包括如前述定义的维管或维管鞘延伸部分的其他细胞)而不是在叶片叶肉细胞中表达。含有该系统的转基因植物令人惊讶地、有利地不显示与YHB或PHYB过表达有关的发育缺陷。转基因植物经历了正常的光形态发生(没有矮化、顶端优势减少、开花延迟或水利用效率降低)，具有与对照植物相同的叶片厚度，并且正常开花。然而，这些植物有更高的光合作用速率，生长更快，有更高的水利用效率，更早成熟到开花期，产生更多的果实结构，并产生明显更多的种子。该效果是显著的，在温室试验中，产量增加了30％以上。

本发明人已经实现了迄今为止不可能实现的目标，即操纵PHYB在植物体中的表达，以改善光合作用、植物生长和产量中的每一个，而不破坏植物的发育。本发明人的意外发现是，通过仅在植物的维管束或其组成细胞中额外表达PHYB，可以脱离PHYB表达的破坏性方面而单独实现综合改进。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的聚合形式的氨基酸，通过肽键连接在一起。

术语“改变”、“变化”和“修饰”在本文中可互换使用。本文所用的对照植物是未被修饰的植物。因此，对照植物没有经过基因修饰以改变本文所述的本发明的多核苷酸的表达。对照植物可以是野生型(WT)植物。即使植物是转基因的，但不涉及本发明的多核苷酸，那么它也可以作为对照植物。WT或对照不需要太具体，只要它能提供一个可靠的参考，PHYB的维管鞘表达可以与修饰的植物材料进行比较。

术语“增加”、“改善”或“提高”在本文中可互换使用。

本文使用的术语“特异性”可以被视为等同于“排他性”或强烈的偏好性。

维管鞘和维管鞘细胞

在C₃植物(大多数作物)中，围绕叶脉(即维管鞘)的细胞被称为束鞘细胞。在双子叶植物中，束鞘由环绕叶脉的单层细胞组成，而在单子叶植物中，束鞘可以由单层细胞或两层同心的细胞组成(A.Fahn,Plant Anatomy Pergamon Press 1995)。当有两层细胞时，外层细胞通常被称为束鞘，内层细胞通常被称为内束鞘(A.Fahn,Plant Anatomy Pergamonpress 1995)。当有两层时，两层一起构成束鞘(A.Fahn,Plant Anatomy Pergamon press1995)。因此，束鞘是用来描述单层束鞘细胞或由外侧的束鞘层和内侧的内束鞘层组成的两层系统的术语。如在整个说明书中所用，术语“束鞘”、“束鞘细胞”、“维管鞘”或“维管鞘细胞”可以互换使用，包括所有类型的束鞘细胞层，除非上下文另有明确规定。束鞘细胞层(即单一的束鞘层，或外侧的束鞘和内侧的内束鞘)可以包含叶绿体。这些束鞘层中的叶绿体数量可能与叶肉细胞相同或比叶肉细胞更少，而在一些情况下，束鞘细胞可能没有叶绿体。此外，如果在C₃植物中存在叶绿体，那么束鞘细胞层中的叶绿体大小通常比叶肉细胞中小得多(A.Fahn,Plant Anatomy:Pergamon Press(1995))。束鞘细胞环绕着叶脉，因此它们的位置非常理想，可以确保良好的水供应，并将糖分装入叶脉，分配给生长的植物结构。

束鞘特异性表达

术语“特异性”在用于基因表达时，描述的是植物内有限的细胞类型子集内基因表达增强的生物学现象。术语“束鞘特异性表达”与“维管鞘特异性表达”是同义的，用来描述所表达的基因在束鞘细胞中的表达水平显著高于在叶片内周围的叶肉细胞中的表达水平的现象。这并不排除该基因在叶片内或植物内的其他非叶肉细胞中表达，只是在束鞘中的表达水平高，而在叶片叶肉中的表达水平低。除了维管鞘细胞外，该基因还可以在其他维管细胞类型中表达。这些细胞类型包括维管束的部分或全部细胞，如木质部和/或韧皮部及相关细胞类型。该基因也可以在非维管细胞中表达，如保卫细胞、维管鞘延伸细胞、束鞘延伸细胞、表皮细胞、侧脉叶肉细胞(其是束鞘的延伸而不是叶肉细胞的延伸)；或植物中不属于叶片组织的其他地方，如花、果实、根、茎。关键的决定因素是表达在束鞘而不是在叶肉中被激活。

用于本发明的光敏色素蛋白

前述所定义的“PHYB”(光敏色素B)是一种调节性的光感受器。如图1所示，PHYB的活性通过抑制转录抑制物(如光敏色素相互作用因子(PIF))和靶向其他蛋白质降解的蛋白质(如组成型光形态发生1，COP1)的作用来诱发调控级联(Legris等人，(2019)“Molecularmechanisms underlying phytochrome-controlled morphogenesis in plants.”Nat.Comms.10:5219)。在黑暗中，这层的抑制物蛋白通过阻止激活光合作用蛋白表达的转录因子的积累来抑制光合作用蛋白的转录，如伸长下胚轴5(HY5及其类似物HYH)、Golden-2样转录因子(GLK1及其类似物GLK2)和细胞因子响应GATA因子1(CGA1及其类似物GNC)(Wang等人，(2017)“Transcriptional control of photosynthetic capacity:conservationand divergence from Arabidopsis to rice.”New Phytol.,216:32-45)。数百个基因的转录，包括进行光合作用所需的核心机制，都归功于这三组转录因子的作用。在光照下，存在于叶肉细胞中的PHYB蛋白被激活，并将这些转录因子从抑制中释放出来。由此产生的转录级联最终导致叶绿体的发育和光合作用的激活。

来自任何植物物种的PHYB可用于本发明的实施方案，无论该PHYB蛋白、其活性变体或功能片段是在同一植物(同源表达)还是在不同植物(异源表达)中表达。

本文中所用的与PHYB有关的术语“活性变体”和/或“功能片段”是指保留PHYB信号激活功能的PHYB基因或肽序列的变体或片段。活性变体还包括编码多肽的感兴趣基因的变体，该变体的序列改变不影响所得蛋白的信号激活功能，例如在非保守残基中。

本发明还包括PHYB的功能片段和PHYB蛋白的任何变体，用于按照本发明的任何方面使用。

序列同一性和直系同源性

本文所用的术语“变体”与来自植物物种的给定PHYB蛋白或其功能片段关联使用，是指与其他植物物种不同的氨基酸序列的任何PHYB直系同源物。这种变体可以用与本文公开的任何参考核苷酸参考序列(即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11)的同一性百分比表示。关于与氨基酸参考序列如PHYB的变体SEQ ID NO:4的同一性百分比，可以按优先级增加的顺序，与该氨基酸参考序列具有至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的整体序列同一性。

下表提供了50种商业种植的植物物种中PHYB直系同源物的登录号的非详尽列表。在NCBI公开的序列数据库中发现了拟南芥PHYB基因的直系同源物。在许多物种中发现了一个以上的PHYB登录号，这表明PHYB在不同的植物谱系中发生了重复；其中许多旁系同源物是由于全基因组重复而产生的。对于每个物种，将一个有代表性的、全长的、直系同源物的氨基酸序列与拟南芥和小麦的PHYB直系同源物(分别为AT2G18790.1和Traes_4AS_1F3163292.1)进行比较，用Clustal Omega 2.1生成多序列比对定量与每个物种的同一性百分比，使用默认参数(使用HHalign，用类似mBed的聚类引导树和隐马尔可夫模型生成比对)。这些直系同源物相对于拟南芥或小麦的PHYB直系同源物的PHYB同一性百分比的中位数是约75％。有几个实例表明，给定物种的PHYB直系同源物与拟南芥和小麦的直系同源物之间的同一性低于75％。例如，Daucus carota(胡萝卜)和Solanum lycopersicum(番茄)的PHYB直系同源物与拟南芥或小麦的PHYB直系同源物具有70％以上的同一性。同样，在远缘裸子植物物种如Picea abies和sitchensis(云杉)中的PHYB直系同源物与拟南芥或小麦PHYB蛋白在氨基酸水平上只有66-68％的同一性。最近复制的PHYB旁系同源物落入表中所示的PHYB相似性范围内，但关系更远的光敏色素没有落入。例如，拟南芥PHYB[SEQ ID NO:5]、PHYD[SEQ ID NO:9]和PHYA(NCBI登录号NP_001322907.1)氨基酸的多重序列比对表明，虽然PHYB和旁系同源的PHYD具有81.98％的同一性，但PHYA与PHYB只有52.35％的同一性，与PHYD具有52.20％的同一性。

可以使用本领域已知的全局比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package,Accelrys)中的Needleman Wunsch算法来确定整体序列同一性。

更多合适的PHYB基因的实例也可以由技术人员通过直系同源物查找程序如OrthoFinder(Emms和Kelly.Genome Biology 2019.20:238)容易地确定。此类基因的功能可以如本文所描述的那样被确定，因此技术人员将能够确认在植物中表达时的功能。

图2显示了四个代表性植物物种的PHYB基因家族，横跨开花植物的三个主要分支(蔷薇分支、菊分支和单子叶植物分支)。该树以开花植物的起源为根，分支长度是任意的。光敏色素B基因在产生十字花科植物的谱系中重复，产生了旁系同源的基因对，在拟南芥中被称为光敏色素B(AT2G18790)和光敏色素D(AT4G16250)。同样，Glycine max(大豆)和Solanum lycopersicum(番茄)有两个PHYB的拷贝，它们来自独立的基因重复事件。在这些物种中，这些重复体被称为PHYB1和PHYB2。因此，O.sativa(水稻)的PHYB与拟南芥(A.thaliana)的PHYB(B和D)以及番茄(S.lycopersicum)的PHYB(1和2)同等相关。在具有多个PHYB拷贝的物种中，有证据表明两个拷贝的功能是冗余的。例如，过表达番茄PHYB1或PHYB2在番茄中产生相同的表型(Husaineid等人，(2007)“Overexpression ofhomologousphytochrome genes in tomato:exploring the limits in photoperception”J.Exp.Bot.58:615–626)。因此，如在本申请中所用，术语PHYB包括完整的PHYB基因家族，以图2所示的该基因家族的代表成员为例，并包括所有的PHYB旁系同源物，如光敏色素D。

在涉及到束鞘细胞特异性启动子时，其所有变体和直系同源物都被包括在本发明中。如果有这种启动子的参考核苷酸序列，那么这种变体和直系同源物包括与参考启动子序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的总体序列同一性的核苷酸序列。

结合本发明描述的任何多核苷酸的序列同一性程度可以不表示为与参考序列的同一性百分比，而是以与本文公开的任何参考序列[SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11]的多核苷酸杂交的方式定义。这种序列的杂交可以在严格条件下进行。所谓“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针在该条件下与靶标序列的杂交程度可检测到地高于与其他序列的杂交程度(例如，至少超过背景2倍)的条件。严格条件取决于序列，在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以确定与探针100％互补的靶标序列(同源探针法)。替代地，可以调整严格性条件，允许一些序列中存在错配，这样就可以检测到较低程度的相似性(异源探针法)。一般来说，探针的长度小于1000个核苷酸，优选长度小于500个核苷酸。

通常，严格条件将是这样一种条件，其中盐浓度小于约1.5M Na⁺离子，通常约0.01至1.0M Na⁺离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，温度对于短探针(例如10至50个核苷酸)为至少约30℃，对于长探针(例如大于50个核苷酸)为至少约60℃。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常约4至12小时。严格条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。

PHYB是一种高度保守的蛋白质，其功能在所有维管植物中都是高度保守的。这一点已通过增加天然PHYB蛋白的表达、表达来自其他植物物种的外源PHYB蛋白或敲除天然PHYB基因被反复证明。图24总结了通过基因操作改变PHYB表达的示例性实例。在拟南芥属中过表达天然PHYB或YHB(Su&Lagarias,(2007)Plant Cell.19(7):2124-2139)，在茄属(Solanum)(马铃薯)(Thiele等人，(1999)Plant Physiology.120:73-81)和芒属(Miscanthus)(柳枝稷)(Hwang等人，(2014)International Journal of Photoenergy)中表达拟南芥PHYB，在茄属(Solanum)中过表达天然番茄PHYB基因(番茄基因组中两个PHYB中的任何一个，Husaineid等人，(2007)J.Exp.Bot.58:615–626)，在拟南芥中过表达大豆属(Glycine)(大豆)PHYB(Wu等人，(2011)PLoS ONE 6(11))，或敲除稻属(Oryza)(水稻)中的光敏色素(Takano等人，(2009)PNAS.106(34):14705-14710)。即使这些丰富的实验证据包含了不同的物种和PHYB蛋白(芒属和拟南芥属在大约1.6亿年前分化)，但在这些实验中始终观察到独特的表型效应：在所有的植物物种中都观察到叶绿素(叶片颜色)、矮化(节间长度)和开花时间的一致变化，而与所表达的PHYB基因的来源物种无关。因此，来自任何植物物种的PHYB基因在任何其他植物物种中表达时，都能在该植物中提供PHYB的功能。因此，任何PHYB蛋白在任何维管植物中表达时，都可望诱发类似的机理功能。

功能片段

PHYB蛋白通常由7个容易识别的蛋白质结构域组成。这些包括三个Per-Arnt-Sim(PAS)结构域(PF08446和/或PF00989)、一个GAF结构域(PF01590)、一个PHY结构域(PF00360)、一个His激酶A磷酸化受体结构域(PF00512)和一个GHKL结构域(PF02518)。图25显示了这些特征性的PHYB功能结构域，这些功能结构域来自五个不同的陆地植物物种中发现的PHYB蛋白，即欧洲油菜、番茄、水稻、江南卷柏和小立碗藓。尽管跨越了超过4亿年的进化(从藓属(Physcomitrella)到芸苔属(Brassica))和多个基因重复的实例(例如欧洲油菜和番茄)，所有的PHYB蛋白都有相似的长度并包含相同的PAS_2、GAF、PHY、PAS、HisKA和HATase_c(/GHKL)结构域的排列。使用EBI HMMR工具对结构域进行鉴定(Potter等人，(2018)Nucleic Acids Research46:W200-W204)。

虽然这些蛋白结构域是高度保守的，但PHYB基因的截断版本也可以发挥启动PHYB信号传导的功能。例如，Oka等人(2004)“Functional Analysis of a 450–Amino Acid N-Terminal Fragment of Phytochrome B in Arabidopsis”Plant Cell.16(8):2104–2116表明，PHYB的450个氨基酸片段缺乏PHY结构域(PF00360)、His激酶A磷酸化受体结构域(PF00512)和GHKL结构域(PF02518)，当靶向到细胞核时可以启动PHYB信号转导。因此，PHYB的功能片段可以提供PHYB信号传导，并且这种功能片段包括在本发明中。

维管鞘(即维管束、束鞘和/或内束鞘)启动子

本领域技术人员很清楚许多维管束、维管鞘、束鞘或内束鞘特异性启动子。

有这样的启动子，已经从几个不同的物种中分离出来，本领域普通技术人员将预期在不同的植物物种中发挥作用；图23中说明了五个这样的实例。Engelmann等人(2008)Plant Physiology 146(4):1773–1785中描述的来自三脉黄顶菊中编码甘氨酸脱羧酶P亚单位的基因的启动子在黄顶菊中，并且也在远缘真双子叶植物物种拟南芥中驱动束鞘细胞和维管束的表达。这些物种最后的共同祖先是在约1.25亿年前，因此该启动子的活性在整个真双子叶植物中是保守的(Zeng等人New Phytol.2017May；214(3):1338-1354)。事实上，对GLDP启动子的另外的研究显示，其在物种间的交叉功能是由调控序列赋予的，该序列在整个十字花科中是保守的，包括拟南芥属、芸苔属、芥属(Capsella)和Moricandia物种在内的(Adwy等人，The Plant Journal 2015November；84(6)和Adwy等人，Plant Gene2019June；18)。同样，Kirschner等人(2018)Journal of Experimental Botany 69(20):4897–4906中描述的拟南芥中编码硫转运蛋白SULTR2；2的基因的启动子，驱动在拟南芥的束鞘和叶脉中的表达，也驱动在远缘物种黄顶菊中的表达。在进一步的实例中，来自在C₃植物的束鞘细胞中表达的基因的启动子也可以在这些植物中赋予束鞘特异性表达。来自拟南芥的MYB76基因的启动子就说明了这一点，该基因在拟南芥的维管束中表达。该基因的启动子足以驱动拟南芥中报告基因的维管束特异性表达，并在十字花科成员之间的基因组高度保守区域中被发现(

等人，biorxiv https://doi.org/10.1101/380188)，这是它与跨功能的GLDP启动子共有的特征。还有许多其他此类启动子的实例，当它们与报告基因融合时，会驱动维管束中的表达。例如，来自当被敲除后会产生网状表型的基因的启动子，在维管或束鞘(BS)细胞中提供显性(或排他性)表达(Lundquist等人，MolecularPlant.2014Jan；7(1):14-29)。另外，SCARECROW(SCR)和SCARECROW-LIKE 23(SCL23)基因的启动子都能驱动报告基因在束鞘细胞中的特异性表达(Cui等人，The Plant Journal.210478(2):319-327)。

也有文献描述了单子叶植物的束鞘细胞启动子。例如，Nomura等人(2005)PlantCell Physiology.46(5):754–61，其中显示结缕草PCK启动子可以驱动水稻束鞘中的表达。同样，类黍尾稃草PCK1启动子指导水稻和玉米中报告基因的束鞘表达(Suzuki和Burnell.Plant Science.2003 165(3):603-611)。另外，Kloti等人(1999)PlantMolecular Biology 40(2):249-266显示了水稻东格鲁杆状病毒启动子在维管束和其他维管细胞中发挥作用。这种启动子在单子叶植物(水稻)和双子叶植物(烟草)中都能发挥作用，驱动维管束中的表达，尽管这些物种在约1.6亿年前就已经分化了。Petruccelli等人2001PNAS 98(13)7635-7640。另外，Schünmann等人(2004)Plant Physiol.136(4):4205–4214显示了使用大麦Pht1；1启动子的水稻束鞘表达(见其中的图3I)。由于维管束组织是维管植物叶片普遍保守的特征，来自真双子叶植物的束鞘启动子，例如那些已经公开并发现在远缘物种如菊属和芸苔属中起作用的启动子，也将被本领域普通技术人员预期在单子叶植物中起作用，反之亦然(如上述在单子叶植物和真双子叶植物中都起作用的水稻东格鲁杆状病毒启动子的情况)。此外，本领域普通技术人员已经知道有大量的束鞘启动子，这些启动子中的任何一个(单独或组合)都适合于驱动PHYB或YHB在任何植物的维管束或束鞘细胞中表达。

重组构建体

可以使用任何合适的克隆系统。例如，Weber,E.等人(2011)PLoS ONE doi.org/10.1371/journal.pone.0016765中描述的Golden Gate模块化克隆系统。否则基因构建体可以完全从头合成，或使用其他分子生物学方法组装。

本发明的PHYB、活性变体或功能片段序列可以直接或间接地与本发明所采用的维管鞘启动子可操作地连接，用于转录和表达。

植物转化

植物的转化现在是许多物种的常规技术。有利的是，可以使用几种转化方法中的任何一种将感兴趣的基因引入植物中。所描述的从植物组织或植物细胞转化和再生植物的方法可用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA吸收的化学品、将DNA直接注入植物、粒子枪轰击、使用病毒或花粉进行转化和微注射。方法可以选自原生质体的钙/聚乙二醇法、原生质体的电穿孔、微注射到植物材料中、DNA或RNA包被的粒子轰击、感染(非整合性)病毒等。包括转基因作物植物在内的转基因植物也可以通过根癌农杆菌介导的转化产生。这种常规方法也被用来引入基因组编辑蛋白，如CRISPR Cas核酸酶、碱基编辑器和其他基因组编辑核酸酶。这些基因组编辑核酸酶可集体或单独用于编辑天然PHYB基因序列，以引入维管鞘启动子序列、维管鞘调控元件，或将天然PHYB序列转换成活性变体或功能片段。

转化方法在本领域是众所周知的。因此，根据本发明的各个方面，本发明的多核苷酸被引入植物中并作为转基因表达。该核酸序列通过称为转化的过程被引入所述植物中。术语“引入”或“转化”用于包括“转化”、“转染”、“转导”和所有导致外源多核苷酸转移到宿主植物细胞中的此类方法，而不论用于转移的方法如何。能够进行后续克隆繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚发生，都可以用本发明的基因构建体进行转化，并从中再生出整个植物。所选择的特定组织将取决于可用于和最适合于被转化的特定物种的克隆繁殖系统。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。该多核苷酸可被暂时或稳定地引入宿主细胞，并可保持非整合，例如作为质粒。替代地，它可以被整合到宿主植物基因组中。然后，所产生的转化的植物细胞可用于以本领域众所周知的方式使转化的植物再生。

为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料通常要经受选择条件，从而使转化的植物能够与未转化的植物区分开。例如，以上述方式获得的种子可以被种植，并在最初的生长阶段后，通过喷洒进行适当的选择。进一步的可能性是将种子，如果合适的话，在消毒后，使用合适的选择剂在琼脂板上生长，以便只有转化的种子能长成植物。或者，对转化的植物进行筛选，看其是否存在可选择的标记，如上述的标记。在DNA转移和再生之后，也可以对假定的转化植物进行评估，例如使用Southern分析或全基因组测序，以确定感兴趣的基因的存在、拷贝数和/或基因组组织。另外，新引入的DNA的表达水平可以用Northern和/或Western分析和/或RNA-Seq来监测，每一种都是本领域内众所周知的。

生成的转化的植物可以通过各种方式进行繁殖，例如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自交，并选择同源的第二代(或T2)转化体，然后T2植物可以通过经典的育种技术进一步繁殖。产生的转化生物体可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，所有转化的细胞都含有表达盒)；转化组织和非转化组织的移植(例如，在植物中，将转化的根茎嫁接到非转化的接穗上)。

根据本发明的改变的植物有利地提供更好的产量特性。产量特性，也称为产量性状，可以包括以下非限制性特征列表中的一个或多个：产量、生物质、种子产量、种子/谷粒大小、谷粒的淀粉含量、早期活力、绿色指数、生长速度增加、水利用效率增加、资源利用效率增加。术语“产量”一般是指具有经济价值的可测量的产品，通常与特定的作物、面积和时间段有关。单个植物部分根据其数量、大小和/或重量直接贡献于产量，或者实际产量是作物和生长时期的每平方米产量，它是通过将总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植平方米确定的。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物质(根和/或芽生物质)、生殖器官和/或繁殖体(例如种子和块茎)。因此，根据本发明，产量包括以下一项或多项，并且可以通过评估以下一项或多项来衡量：每株植物的种子产量增加、种子填充率增加、填充的种子数量增加、收获指数增加、存活率/发芽效率增加、种子/蒴果/荚果的数量或大小增加、生长增加或分枝增加(例如具有更多分枝的花序)、生物质增加、谷物填充增加、块茎生物质增加。优选地，增加产量包括增加谷物/种子/蒴果/荚果的数量、增加生物质、增加生长、增加花器官的数量、增加花枝或增加块茎。产量通常是相对于对照植物测量的。

优选地，根据本发明的植物是一种作物植物。所谓作物植物是指以商业规模种植供人类或动物消费或使用的任何植物。在优选的实施方案中，该植物是谷类、油料植物或豆类。

根据本发明的各方面，包括本文所述的转基因植物、方法和用途的植物可以是单子叶植物或真双子叶植物。

感兴趣的植物和作物品种

本文所用的术语“植物”包括任何能够进行光合作用或能够产生可以进行光合作用的结构的东西，以及其部分和子部分。进行或能够进行光合作用的常见特征包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

例如，单子叶植物可以选自棕榈科、石蒜科或禾本科。例如，该植物可以是谷类作物，例如小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦、小米、玉米，或作物，例如大蒜、洋葱、韭菜、山药、菠萝或香蕉。

真双子叶植物可以选自包括但不限于菊科、十字花科(例如欧洲油菜)、藜科、葫芦科、豆科(云实亚科、含羞草亚科或蝶形花亚科)、锦葵科、蔷薇科或茄科的科。例如，该植物可以选自荞麦、莴苣、向日葵、拟南芥、西兰花、菠菜、油菜籽、西瓜、南瓜、卷心菜、西红柿、马铃薯、甘薯、辣椒、黄瓜、西葫芦、茄子、胡萝卜、橄榄、豇豆、啤酒花、覆盆子、黑莓、蓝莓、杏仁、胡桃、烟草、棉花、木薯、花生、芝麻、橡胶、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、紫花苜蓿、豆类、大豆、蚕豆、豌豆、扁豆、花生、鹰嘴豆、杏、梨、桃、葡萄藤、甜椒、辣椒、亚麻、荠蓝、印度大麻/大麻、甜菜、藜麦、柑橘、可可、茶或咖啡品种。在一个实施方案中，该植物是油菜(油菜籽)。

还包括生物燃料和生物能源作物，例如油菜/油菜籽、黄麻、麻风树、油棕榈、亚麻籽、羽扇豆和柳树、桉树、白杨、白杨杂交种，或裸子植物，例如火炬松、挪威云杉或西加云杉。还包括用于青贮、放牧或饲料的作物(草、苜蓿、红豆草(sanfoin)、紫花苜蓿)、纤维(例如麻、棉花、亚麻)、建筑材料(例如松树、橡木、橡胶)、制浆(例如白杨)、用于化学工业的原料(例如高芥酸油菜、亚麻籽)以及用于美化环境的原料(例如高尔夫球场的草皮)、公共和私人花园的观赏植物(例如金鱼草、矮牵牛、玫瑰、天竺葵、烟草)以及家庭植物和切花(非洲紫罗兰、海棠、菊花、天竺葵、锦紫苏、吊兰、龙血树、橡胶植物)。

实施例

实施例1：用束鞘表达YHB的基因构建体转化拟南芥

用Golden Gate克隆系统组装基因构建体，得到的质粒如图3所示。LB和RB分别指转移DNA(T-DNA)的左边界和右边界。本发明人采用的多核苷酸是从LB到RB为维管束特异性启动子、PHYB变体编码序列(本例中为YHB)和适合植物的终止子序列的序列。对已公开的YHB序列总共做了6个核苷酸序列的改变，其中没有一个改变相应的氨基酸序列。对YHB基因序列进行这些改变是为了方便组装构建体的分子克隆过程。如果这项工作通过单步合成构建体可以重复，或者使用其他克隆策略，则这些改变将是不必要的。另外，虽然该质粒的构建需要加入两个细菌标记盒，但也可以合成功能相同的质粒，但不需要在T-DNA区域内(RB的左边)加入第二个细菌可选择标记盒。

如上所述，YHB编码序列[SEQ ID NO:1]中的六个核苷酸被改变，以在基因合成前去除限制性位点，但氨基酸序列[SEQ ID NO:4]没有改变。使用了DHS维管束特异性启动子。DHS启动子序列[SEQ ID NO:7]是从Knerova等人，(2018)“Asingle cis-element thatcontrols cell-type specific expression in Arabidopsis”bioRXiv首次描述的质粒中克隆出来的。二级载体包含抗除草剂(Basta)盒和维管束启动子下游的驯化的YHB基因序列。一旦组装完成，该载体通过电穿孔引入根癌农杆菌(菌株AGL-1)细胞中。在LB平板上选择携带该构建体的农杆菌菌落，并在YEB培养基上培养。

在牛津大学植物科学系繁殖的拟南芥(哥伦比亚生态型)植物在花期(大约4周大)被选中。一些个体被搁置起来，进行繁殖以产生野生型后代，作为对照植物。其余的通过花期浸渍进行转化。浸渍后，个体被分组为几批植物，将种子划分为独立的转化事件。种子用乙醇和Triton消毒，发芽前在冷室中分层3天。在土壤上发芽后，通过每隔一天施加Basta除草剂对T1植物进行转基因插入的筛选，持续一周。T1转化植物被移植到更大的花盆中，并生长以收集T2种子。T2种子在含有Basta的MS培养基上发芽，进行分离分析。单一插入品系被确定为在选择性培养基上表现出75％的存活率，表明是单一分离的等位基因。从这些植物中提取RNA以确认YHB转基因在每个品系中的表达。设计并测试引物，以确认它们特异性扩增了YHB，而不是天然拟南芥光敏色素B。根据分离和半定量PCR结果，选择了代表独立转化事件的三个品系，并在发芽后12天将每个品系的单株植物转移到土壤中。这些植物与野生型植物一起在温室中在长日照条件下生长，并定期浇水。

除非另有说明，否则随后的实施例中的所有表型分析都是在所有三个品系上进行的，其中一个转基因品系(图中注释为“C12”)与对照植物之间的比较显示在随后的图中。所有的误差条表示95％的置信区间，用t检验表示显著性(‘*’)或不显著(‘n.s.’)，P<0.05。

图4显示了转染的植物与被称为真核启动因子elF-4E1的看家基因相比如何表达YHB。

使用Multispeq V1.0设备对叶片厚度进行磁性测量。对n＝10、5.5周龄的植物确定相同的叶片(9)，在靠近叶片中心的三个点进行测量，每个重复使用中值。如图5所示，如通过t检验(p>0.05)所测量的，野生型对照和含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株之间在叶片厚度上没有可观察到的差异。因此，与以前操纵PHYB的表达的研究不同，本文描述的发明不会对叶片厚度产生负面影响。

实施例2：YHB在束鞘细胞中的表达增强了拟南芥的光合作用能力

为了证明与非转化对照相比，转基因植物的光合作用增强，使用配备有多相荧光计头的LICOR 6800设备对实施例1中产生的植物进行气体交换测量分析。所测量的是在叶片周围确定的环境二氧化碳水平下，对照植物和含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株所能固定的碳量(即它们的光合作用速率)。通过将叶片夹在气体交换室中，控制环境条件为23℃，相对湿度65％，流量设置为500μmol s^-1，风扇转速为10,000rpm，对生长在温室中的拟南芥植株进行分析。每株植物使用同一片叶片，所有植物在32至35天之间进行测量，每天上午10点至下午3点之间对转基因品系和对照植物进行混合测量。植物适应400μmol mol^-1二氧化碳和1500μmol m^-1s^-1光照(90％红光和10％蓝光的混合物)15分钟，然后将二氧化碳浓度从400μmol mol^-1逐步降低到10μmol mol^-1，然后回升到400μmol mol^-1，最后增加到最高2000μmol mol^-1。给予植物5分钟时间来适应每个新的二氧化碳浓度，然后测量碳同化。测量植物的叶片面积，以调整叶片大小的轻微差异。所得的A/Ci曲线(图6)表明，与野生型对照(n＝12)相比，转基因植物(n＝8)的光合作用显著增强，这表现为最大光合作用能力的显著增加，以及在较低的二氧化碳浓度下羧化效率的显著增加。

含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的表现一直优于对照，直到二氧化碳太低，无法促进任一基因型的光合作用。这些曲线的初始斜率显示，这些转基因植物具有更大的羧化效率，而高原期(朝向测试的二氧化碳浓度的最高值)证明这些转基因植物的最大光合作用速率也得到了提高。仅仅考虑环境中的二氧化碳水平(如田间作物会遇到的那样)，该实验显示的是这些转基因植物从周围空气中固定的碳比对照植物明显多。因此，与以前操纵PHYB的表达的研究不同，本文描述的发明显著提高了叶片水平的光合作用速率。

实施例3：YHB在束鞘细胞中的表达提高了拟南芥的水利用效率

为了证明与对照植物相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株没有显示出对水利用效率的负面影响，我们测量了气孔导度。这一点很重要，因为以前其他人试图调节PHYB/YHB的表达(例如Rao等人，(2011))，导致耗水量的大幅增加。在400μmolmol-1CO₂、65％的相对湿度、23℃的温度下测量气孔导度，流量设置为500μmol s-1，风扇转速为10000rpm。重要的是，与对照相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的气孔导度没有增加(图7)。

通过将碳同化率除以气孔导度，计算出瞬时水利用效率(单位水流量捕获的碳)。这表明，虽然光合作用速率达到了最大值(如图6所示)，但与对照组植物相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的瞬时水利用效率也显著提高(见图8)。因此，水利用效率并没有因为本发明的新型光合作用增强而受到影响。此外，当光合作用以最大速率进行时，与对照植物相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的水利用效率有所提高。因此，与以前操纵PHYB的表达的研究不同，本文描述的发明在显著提高叶片水平的光合作用速率的同时也提高了水利用效率。

实施例4：YHB在束鞘细胞中的表达增强了拟南芥束鞘细胞中的叶绿体发育，而不是叶肉细胞中的叶绿体发育

在拟南芥叶片中，叶肉细胞含有发育完全、光合作用活跃的叶绿体，而束鞘细胞含有较小的叶绿体，光合作用能力下降。为了证明与对照植物相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的束鞘细胞中的叶绿体得到了增强，对这些植物进行了共聚焦显微镜和电子显微镜分析。发芽25天后，从转基因和对照的拟南芥植株中收获同等的叶片(叶片6)(如实施例1中产生的)。剥去下层表皮，将叶片固定在甲醛中。固定后，将表皮部分放在玻片上，用共聚焦显微镜进行成像。为了将叶绿体分配给特定的细胞类型，叶绿素和木质素的自发荧光都在叶脉周围的细胞中进行成像。木质素和叶绿素的自发荧光是通过458nm和633nm激光器激发检测的，发射光谱分别在465-599nm和650-750nm之间记录。对于每个基因型的总共五片叶片，在叶脉周围采取Z型堆叠，以捕获叶肉细胞和束鞘细胞。对于每片叶片，从至少两张不同的图像中鉴定出五个叶肉细胞和五个束鞘细胞，用ImageJ计算每个细胞中五个最大的叶绿体的面积图(即平行于Z平面设置)。因此，每个基因型的平均叶绿体大小是通过测量分布在五种不同植物的25个细胞中的总共125个叶绿体来计算的。此外，通过在一天中的同一时间(上午11点)对植物进行采样，获得了透射电子显微照片。组织被染色并嵌入树脂中，然后用超微切片机钻石刀切割薄片。在西门子透射电子显微镜上拍摄图像。

如图9所示，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的束鞘细胞中的叶绿体明显大于对照植物的相同细胞中的叶绿体。在这种细胞类型中，YHB的表达诱导了叶绿体的发育，使这些叶绿体与叶肉细胞叶绿体大小相同。叶肉叶绿体的大小在含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株和对照之间没有改变。

对含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株进行电子显微镜分析，发现束鞘叶绿体在光合作用装置的大小和组织方面与叶肉细胞叶绿体相当(图10B和图10D)，而对照植物中的束鞘叶绿体与相同植物中的叶肉叶绿体相比，明显较小，光合能力较差(图10A和图10C)。因此，本发明在束鞘细胞中精确表达YHB只影响了束鞘的叶绿体，因此实施例2中所述的光合作用增强是由束鞘细胞叶绿体的光合作用激活驱动的。

实施例5：YHB在束鞘细胞中的表达增强了拟南芥中呼出的二氧化碳的再固定

虽然是光合作用细胞将CO₂固定为糖，但每一个植物细胞都在进行呼吸，消耗糖并释放出CO₂。叶脉中的细胞呼吸释放出的CO₂通常会从叶脉中扩散出来，穿过环绕的束鞘细胞，进入细胞间空间，在那里它要么被叶肉吸收，要么通过气孔从叶片中流失。由于转基因植物显示出更强的固碳能力，我们进行了测量，以了解这是否部分是由于叶脉对呼出的CO₂进行了再固定，使其回到糖中以促进更多的生长。

虽然空气中的CO₂是由碳-12和碳-13同位素的混合物组成的，但植物组织中的碳相对于碳-12来说，碳-13的特征比空气中的要少。这是因为固定空气中的碳的酶，即C₃物种的二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)，会对较重的碳-13同位素进行区分，从而导致通过干物质碳同位素分析测量的δ13C比率为负值。如果含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(实施例4)正在重新固定呼出的碳(即之前已经固定过一次的碳)，那么最终出现在叶片中的碳将受到多轮二磷酸核酮糖羧化酶介导的固定，从而进行多轮区分。因此，如果在含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因植物中发生了呼出的二氧化碳的再固定的增强，那么人们将期望在碳同位素分析中看到这种特征。具体来说，人们期望看到比对照植物的同等组织中的负值更低的δ13C。

在36天龄时(如实施例1中产生的植物)，将相当的叶片(叶片9)在液氮中急速冷冻，并在冻干机中冻干4天。每个基因型(测试两个基因型，一个转基因品系和一个对照组)的6个样品中称出约1mg的干叶粉，并进行稳定同位素分析。这表明，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的δ13C的负值明显更低，表明呼出的二氧化碳是这些植物的重要碳源(见图11)。因此，这些植物的光合作用增强的一部分可归因于呼出的CO₂的再固定的增强。这种再固定增强的程度可能因物种而异，取决于维管衍生的呼出/排出的二氧化碳的可用性。

正常的C₃植物将扩散到叶片细胞内空间的碳固定为糖。光活化的叶肉细胞中的二磷酸核酮糖羧化酶固定碳，然后以糖的形式输出到维管中。这些糖通过呼吸作用为整个植物的生长提供燃料。这释放出二氧化碳，它又从叶脉中扩散出来，绕过/穿过束鞘细胞，离开叶片。图19显示了在本发明的修饰的C₃植物中，最初的碳固定主要是由叶肉细胞进行的，但本发明植物的束鞘细胞也能做到这一点。由于现在环绕叶脉的束鞘细胞中有更多活跃的叶绿体，呼出的二氧化碳在通过束鞘扩散到细胞内空间并离开植物之前被捕获。因此，这种呼出的二氧化碳被重新固定为糖，使碳同位素比率降低，提高了碳同化效率，为扩散到叶片中的每个碳分子提供更多的生长动力。因此，本发明仅在束鞘细胞中驱动YHB的精确表达，也可以产生增强二氧化碳再固定的额外优势。

实施例6：YHB在束鞘细胞中的表达增强了拟南芥的植物生长

鉴于含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植物比对照植物具有更高的光合作用能力(实施例2-5)，确定这种净碳吸收的增加如何能促进植物的生长。在发芽后的第14天和第21天，从上面拍摄了15株植物的托盘(如实施例1中产生的)的照片。用ImageJ分析图像，计算每株植物的莲座总面积。这表明，与光合作用速率的增加相一致，本发明的转基因植物在这个时间窗口中比对照植物生长得更快(图12)。

花茎(bolt)是拟南芥的开花结构。一旦植物在营养生长期间获得足够的资源，它们就会成熟开花并将资源投入到生殖结构中。抽苔时间被测量为植物发芽后生长出高度大于3mm的花茎的天数。这表明，与野生型对照相比，在含有束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株中，抽苔时间减少了(图15)。这一点很重要，因为以前文献中描述的过表达PHYB/YHB的植物在多个物种中始终显示出相反的效果(即延迟抽苔的时间/开花时间)。延迟抽苔时间对作物生产来说是不利的，因为生长季节延长，植物失去了与季节的同步性，并受到更大的损失风险。发生这种情况是因为光活化的PHYB/YHB抑制了叶肉细胞中的开花位点T的表达，抑制了开花。在本发明中，由于PHYB/YHB在叶肉细胞中没有额外的表达，所以开花时间途径不受干扰，因此避免了这个问题。因此，本发明的植物中抽苔时间的减少是一个新的有利的性状。

除了测量上述开花(抽苔)时间外，还测量了开花结构(花茎)的大小。对于n＝12株植物中的每一株，在晚上12点用尺子测量最高的花茎。在发芽35天后，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株的花茎比对照植物的花茎要高。考虑到其他人以前在PHYB和YHB过表达方面的工作，发明人发现这些转基因植物在同一时间点非但没有被矮化，反而更高了(见图13)。除此之外，这些植物还经历了普通的光形态发生(见图14，托盘的图片)。因此，与以前操纵PHYB表达的研究不同，本文描述的发明显著改善了植物的生长，而没有出现PHYB/YHB过表达所预期的任何不良发育影响。

因此，驱动YHB在束鞘细胞中精确表达的发明导致了更快的生长、更早的开花和更大的开花结构。这些都是对农业有利的性状，因为它们意味着更短的生长季节，减少因恶劣天气或病虫害/病原体而导致作物损失的风险，并可能增加每年的收获周期，这增加了额外的价值。

实施例7：在拟南芥束鞘细胞中表达YHB提高了产量

鉴于本发明的植物，具有更高的光合作用速率，生长更快，开花更早，并产生更大的开花结构(图16)。我们研究了这些有利的性状是否会产生相应的产量增加。

图17显示了野生型植物(左)和含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株(右)在7.5周停止浇水，9周收获，9.5周对种子进行分类和称重后的典型种子收获情况。这表示产量增加了30％以上，在统计学上有意义，T检验统计量<0.0005。这表明与对照相比，在含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株中，每株植物产生的种子量如何显著增加。

以前关于PHYB/YHB在植物中过表达的实验经常报告产量的提高，但这是误导性的，由于开花的多态性延迟，不会转化为作物的收成。例如，Thiele等人(1999)在马铃薯中过表达PHYB，并产生较少但更多的块茎，导致报告的产量增加。然而，他们也澄清，这并不发生在与常规马铃薯收获相同的时间范围内；而且当与正常的马铃薯收获同时进行时，常规PHYB过表达者的产量低于对照。事实上，在上述Hu等人(2019)的文章中，YHB(来源于拟南芥或水稻)在一系列不同的物种(拟南芥属、水稻、烟草、番茄和短柄草属(Brachypodium))中被过表达，YHB的过表达始终对种子产量产生负面影响。与此截然不同的是，本发明人的转基因植物在同一时间收获时，无论在哪个阶段收割，都出人意料地显示出比对照大得多的种子产量。

最终，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的转基因拟南芥植株填充了这些角果，以产生比对照显著更多的种子(见图18)，无论种子是早收还是晚收，其产量都持续增加。这里，浇水在6.5周龄时“早”停止，或在8周龄时“晚”停止。在收获种子之前，允许植物干燥1.5周。干燥的气生生物质被收集在纸袋中，摇晃以释放种子。用细网将种子从植物碎片中分拣出来，倒入塑料管中称重。因此，光合作用的增强被成功地转化为产量的增加。

因此，与对照植物相比，本发明导致了更高的光合作用速率、更高的水利用效率、更强的二氧化碳再固定、更快的生长、更早的开花、更大的开花结构和更多的产量。

实施例8：用束鞘表达YHB的基因构建体转化小麦(Triticum aestivum)

为了证明本发明具有广泛的普遍适用性，并验证束鞘表达的YHB的作物改良潜力，设计了单子叶植物优化质粒，并在单子叶作物植物小麦品种Cadenza中进行了测试。与使用合成的束鞘启动子的实施例1不同，这里使用了结缕草(Zoysia japonica)磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶启动子(先前描述为在单子叶植物中提供束鞘特异性基因表达(Nomura等人，(2005),Plant Cell Physiol和图23)。该启动子序列[SEQ ID 10]来源于单子叶植物结缕草，而不是真双子叶植物拟南芥。该启动子序列被设计用来驱动内源性小麦光敏色素B编码序列[SEQ ID NO:11](Traes_4AS_1F3163292)的表达，该序列通过将第278位的氨基酸酪氨酸转换为组氨酸而被修饰，使其对光不敏感–也称为YHB突变。当使用Clustal 2.1进行比较，该小麦基因的编码序列与实施例1中使用的拟南芥直系同源物具有66.11％的同一性，而氨基酸序列[SEQ ID NO:12]与拟南芥直系同源物具有71.28％的相似性。

全长的启动子-基因-Nos终止子序列是完全从头合成的。该序列被整合到含有nptII选择盒的二元载体中，转移到农杆菌中，并使用标准的植物组织培养和转化方法来转化培养的小麦愈伤组织。对转化体进行筛选，以确认基因组插入成功，并通过qPCR鉴定单一插入的转基因植物。将转化体与经过愈伤组织再生、但未接受用于束鞘表达YHB的构建体的对照植物一起上盆并在生长室中生长。

实施例9：YHB在束鞘细胞中的表达提高了小麦的光合作用速率

在生长室中生长七周后，对实施例8中产生的转化体小麦植株的光合作用速率进行定量，并与对照植物进行比较。与实施例2一样，使用LICOR 6800设备来精确测量光合作用速率。环境常数如下：流量500μmol s^-1，风扇转速10,000rpm，叶片温度25℃，相对湿度65％。为了测量生长室中的环境光合作用速率，PAR(光合作用有效辐射，即，可用于光合作用的光量)被设定为350μmol m^-1s^-1(这是生长室中树冠高度的测量光强度)，二氧化碳被设定为400μmol mol^-1。对于每株植物，选择旗叶下面的叶片，并夹住距叶尖约1/3处。适应10分钟后(通过观察该适应后同化率、荧光或气孔导度没有变化来确认)，记录环境光合作用测量。在同一天的12:00-14:00之间，对4个对照和8个单株插入的小麦植株进行了筛选。图20显示了这项分析的结果。与对照相比，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的小麦植株的光合作用速率平均高出30％，t检验为p<0.05。

实施例10：YHB在束鞘细胞中的表达增强了小麦的生长速率

如实施例6所示，拟南芥维管束中光敏色素B信号传导的增强与更快生长有关，表现为在同一时间窗口内与对照相比生物质积累增加，但与植物结构的整体发育变化无关。同样，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的小麦植株在发育方面没有显示出任何变化(如矮化)，并观察到正常的开花。如图21所示，含有用于束鞘表达YHB的基因载体的典型小麦植株在生长七周后明显比对照大。

事实上，转化体(n＝8)的植株高度(以最大树冠高度衡量，从土壤表面到最高点的顶端)明显高于对照(n＝4)(图22)(t检验，p<0.05)。在这个时间点，转化体似乎已经达到全高并开始开花，而对照仍然是这个最大高度的～2/3。这种～30％的更快生长主要归因于实施例9中观察到的30％的光合作用速率的增加。因此，尽管拟南芥和单子叶植物小麦之间存在广泛的基因差异和进化距离，但本发明始终能增强光合作用，不破坏发育，并提高植物生产率。

因此，本领域普通技术人员可以结合任何已知的激活维管束表达的启动子序列(无论是文献中已知的启动子还是通过设计新的启动子)，并过表达内源性光敏色素B基因或外源性光敏色素B基因或YHB变体或其功能片段，以将本发明应用于任何需要的作物。同样，根据感兴趣的物种，可以使用各种转化方法(无论是像实施例1中的花期浸渍还是像本实施例中的愈伤组织转化)。

实施例11：对欧洲油菜(Brassica napus)进行基因编辑，以实现PHYB和/或YHB的束鞘表达

如图2和图25所示，PHYB在一些重要的农学物种中发生了重复，如欧洲油菜和大豆。事实上，我们的大多数作物都经历了最近的全基因组重复事件，并含有PHYB的多个冗余拷贝。这意味着有可能将PHYB的一个拷贝转化为维管束驱动的YHB，而另一个拷贝不受影响。这将对植物产生与通过基因修饰引入YHB相同的结果(如实施例1和8)，但不需要添加任何转基因材料，因此会产生基因编辑的植物。这有一个额外的好处，即确保天然PHYB信号传导不被移除，否则会导致植物的发育缺陷。

欧洲油菜提供了一个实例物种，其中基因组编辑可用于使用本领域普通技术人员已知的标准基因组编辑技术来实现YHB的束鞘表达。图26显示了欧洲油菜基因组中编码的三个PHYB基因(BnaA05g22950D、BnaC05g36390D和BnaC03g39830D，以下分别称为BnaA05、BnaC05和BnaC03)在该作物物种的16个不同栽培品种的叶片中的表达(RNA取自植物处于五片真叶阶段时的第二年轻叶片，Hong等人，(2019)Nat.Comms.10:2878。PHYB同源物BnaA05和BnaC05在所有品种的叶片中都有表达，并且两者在每个品种中的表达程度相同，提供了它们功能冗余的证据。这一模式的例外是Span栽培品种，其中BnaC05没有表达。然而，鉴于Span经历了正常的光合作用发育，这进一步证明了两种PHYB的作用是冗余的，即BnaA05的表达可以补偿BnaC05的表达不足。因此，有可能在不破坏正常光形态发生的情况下，为增强光合作用的目的而设计一个变体。

最初，天然PHYB基因的基因表达结构域将被改变，使其在维管束中表达。这将通过将短的启动子序列(例如SEQ ID:7)或本领域一般技术人员已知的任何维管束或束鞘启动子或束鞘增强子元件敲入天然PHYB基因(例如BnaA05)的5’上游区域来实现。前面描述的、图23中也说明的束鞘启动子在很大的系统发育距离(9-1.6亿年的分化时间)上起作用。GLDP和SULTR2；2在拟南芥属和黄顶菊属中给出了一致的表达模式，代表了蔷薇分支和菊分支之间的深度保守性，它们在大约1.25亿年前发生了分化。黄顶菊属与欧洲油菜的关系与它和拟南芥的相同，因此在黄顶菊属和拟南芥属中起作用的启动子预计在欧洲油菜中也会起作用。实施例1中使用的MYB76调控元件已被证明在拟南芥属和芸苔属之间高度保守，因为它们是密切相关的(仅在约2000万年前发生了分化)。许多启动子可供具有普通技能的人选择，以指导天然PHYB基因的表达。

根据本发明，插入维管鞘启动子的天然PHYB基因的编辑会导致PHYB在所需组织中的预期表达。稳定遗传的PHYB序列在功能上等同于实施例1和实施例8中所述的整合到拟南芥或小麦基因组中的多核苷酸。5’上游区域的任何区域都可以成为敲入这些启动子序列的合适靶点。内切酶将被引导到特定的部位以诱导双链DNA断裂，同源臂将引导启动子多核苷酸到这个区域，通过同源定向修复并入DNA。这已经在植物中被证明具有适当的效率。例如，CRISPR-Cpf1已被用于将>3000bp的DNA片段敲入水稻基因组，效率为8％(Begemann等人，(2017)Sci.Reps.7:11606)。鉴于维管束启动子元件比这个实例短得多，而较短的序列会导致较高的敲入效率，因此这种敲入将是可行的，不需要进一步的发明步骤。可以用农杆菌转化欧洲油菜(如实施例1)，并通过PCR筛选独立的转化事件，以找到启动子元件已成功并入PHYB上游的个体。这些个体的后代植物将在维管束中具有增强的PHYB表达，这可以通过基因表达分析来检测，并有望显示一些增强的叶绿体发育、光合作用速率和生产率，而不会出现与在整个植物水平上改变PHYB表达有关的发育缺陷(如由PHYB的普遍过表达导致的半矮化表型)。预计该表型将类似于本文所述的使用常规基因修饰方法引入维管束表达的PHYB。

为了进一步扩大PHYB在欧洲油菜维管中的信号传导活性，可能还需要进行第二次编辑，将维管束驱动的PHYB转化为YHB。这也可以通过基因编辑来实现，但只需要点突变，而不是双链DNA断裂。在拟南芥的PHYB中，“TAT”密码子被改为“CAT”，将第276个残基从酪氨酸转化为组氨酸，并将PHYB改变为YHB。对于BnaA05，“TAC”密码子编码等同的酪氨酸残基，通过引入单核苷酸变化，可以将其改变为“CAC”，以形成等同的变为组氨酸的修饰。图27说明了欧洲油菜PHYB编码序列的区域，其中可以进行这种单碱基对的改变[SEQ ID NO:14,15&16]。这种编辑可以由缺口酶(例如Cas9)与腺苷脱氨酶相连来实现；核酸酶创造了单链DNA的小窗口，将脱氨酶引导到DNA的特定部分，将腺嘌呤转化为鸟嘌呤。这种类型的编辑先前已在拟南芥植株和欧洲油菜原生质体中得到证实，后一物种的效率高达8.8％(Beum-ChangKang等人，(2018)Nat.Plants.4:427-431。通过靶向PHYB基因的反向链，该系统将足以诱导腺嘌呤到鸟嘌呤的转换，从而导致正向链上胸腺嘧啶到胞嘧啶的互补转换，从而将密码子从“TAC”转移到“CAC”，并由此实现由PHYB变为YHB。这种T到C的突变也可以通过引导编辑(prime editing)容易地实现(Anzalone等人(2020)Nature Biotechnology,38:824-844)，或通过本领域普通技术人员已知的技术，用CRISPR-Cas或其他基因组编辑核酸酶在正确的部位进行随机定向诱变来容易地实现。

如图27所示，尽管欧洲油菜基因组中PHYB基因的多个拷贝的核苷酸序列高度保守，但每个同源物都包含多个独特的变化，可用于将靶向碱基编辑引导到特定的基因变体，即只编辑其其表达结构域先前被编辑过的PHYB基因，从而确保YHB表达限于维管束中。转化的植物将通过PCR筛选出含有该YHB编辑的个体，可以预计，先前由第一种变化诱导的光合作用和生产率的任何提高可能会被这第二种变化进一步放大。

这里提出的两种基因组编辑都已在植物体中被证明具有高水平的效率，甚至在那些难以转化的物种中也是如此，它们需要采用除花期浸渍以外的方法，例如愈伤组织再生或粒子轰击。因此，这个欧洲油菜实例提供了一种通过基因组编辑在任何含有一个以上PHYB拷贝的物种中引入维管束表达的YHB的一般方法。此外，这种方法也可以在任何二倍体植物中进行，只要转化体被维持为含有一个未改变的PHYB等位基因拷贝和一个改变的PHYB等位基因拷贝的杂合体植物。总之，PHYB的单一拷贝是利用对该拷贝特有的核苷酸变异来进行编辑的靶标。在第一种情况下，通过将维管鞘或维管束特异性启动子敲入5’上游区域，PHYB在维管束中的表达得到增强。随后，同一基因在CDS(编码序列)中进行单核苷酸突变；编码酪氨酸残基(使天然PHYB具有能力从其光活性形式恢复)的密码子被突变为组氨酸。这就把天然PHYB转化为组成型活性的YHB，从而进一步增强了维管束中的PHYB信号传导级联。值得注意的是，即使在缺乏PHYB冗余拷贝的物种中，甚至有可能先敲入全长的PHYB拷贝，从而创造可以进一步进行基因编辑的拷贝。值得注意的是，所有这些基因编辑的方案都实现了在实施例1和实施例8中通过基因修饰方法证明的相同的最终结果。在维管鞘细胞中表达的PHYB同源物。

最后，改变PHYB表达(通过敲除或过表达)的效果在远缘物种之间是高度保守的(图24)，来源于不同的远缘物种的多个启动子使维管鞘的表达在整个维管植物的范围内被驱动(图23)。本文提供的说明性实例被理解为是示例性的，因此本领域普通技术人员可以通过上述任何一种基因工程方法在任何维管植物物种中提供这种性状。

实施例12：在任何植物物种中激活PHYB和/或YHB的束鞘表达的通用基因编辑方案

除了实施例11的全启动子敲入实例外，还可以通过只在内源性PHYB基因的启动子区域中引入小的维管鞘或维管束基序或增强子元件，将基因编辑的大小限制在几个碱基对。图28提供了这两种方法的比较，用番茄和大豆的设计进行了演示，在这些设计中，提出的基因编辑已经在前者(Solyc05g053410)和后者(Glyma.09G035500)物种中的PHYB直系同源物的基因组模型上被注释。

甘氨酸脱羧酶P亚单位(GLDP)启动子已经在菊分支的黄顶菊和蔷薇分支的拟南芥中被表征。系列缺失显示，含有V-box的GLDP1启动子区域足以驱动维管束的表达(Adwy等人，(2015)The Plant Journal.84(6):1231-1238)。因此，在番茄中，可以通过敲入紧靠此处确定的内源性PHYB基因的第一外显子上游的含GLDP1 V-box的启动子[SEQ ID NO:13]来引入PHYB的维管束表达，使用与实施例11中讨论的类似方法(如图28顶部图像所示)，即本领域普通技术人员可以使用这样的设计，将各种基因组编辑核酸酶与编码所选择的启动子序列的DNA修复模板靶向靶标基因座，并产生基因编辑的植物。

实施例1中使用的MYB76启动子也被证明可以通过小的最小增强子基序的作用来驱动组织特异性基因的表达(Dickinson等人，(2020)Nature Plants.6:1468-1479)。这样的增强子基序序列可以被引入到大豆PHYB基因的转录起始位点附近，以赋予所需的表达模式。与上面描述的番茄设计不同，这种方法将使内源性的核心启动子保持完整，如图28中的天然5’UTR的存在(底部图片)所示。核心启动子可以通过各种常见的技术来进一步表征，包括但不限于TSS-seq、CAP-seq和CHIP-seq来识别开放的色区。这种额外的表征将有助于确定RNA聚合酶结合以启动转录的确切位点，从而确保维管束增强子基序插入的确切基因组位置不会破坏这一区域(尽管也可以简单地尝试几个位置，并用转基因植物的基因表达分析确认成功)。因此，这种增强子元件插入方法可以在不破坏天然表达模式的情况下对天然PHYB基因进行编辑，并且可以在只有一个该基因拷贝的物种中对PHYB表达谱进行编辑。鉴于这些优点，可能优选的是将已知的维管束启动子(例如GLDP1 V-box)进一步缩小为最小的增强子序列，其可以通过编辑尽可能少的碱基来引入，例如使用已公开的将全长MYB76启动子缩碱为必要和足够的最小增强子基序序列(Dickinson等人，(2020)Nature Plants.6:1468-1479)的相同分子方法。随后可以可选地进行实施例11所述的将束鞘表达的PHYB转换为YHB，以进一步增强束鞘细胞的PHYB信号传导。这种单核苷酸突变也可以通过碱基编辑、引导编辑或通过CRISPR-Cas或其他基因组编辑核酸酶在正确位点的随机定向诱变，通过本领域普通技术人员已知的技术容易地实现。

遗传资源

拟南芥(哥伦比亚生态型)的种子于2018年9月从牛津大学植物科学系的温室中获得。

Golden gate克隆部分由Sylvestre Marillonnet提供(Liebnitz Institute ofPlant Biochemistry:Weber等人，(2011)PLOS ONE)。DHS维管束启动子由剑桥大学JulianHibberd实验室的Patrick Dickinson提供(

等人，(2018)bioRxiv)。

Cadenza小麦植株和小麦转化由NIAB作物转化服务提供。

核苷酸和氨基酸序列

[SEQ ID NO:1]驯化的拟南芥PHYB编码序列，含有YHB突变。

[SEQ ID NO:2]驯化的拟南芥PHYB编码序列(拟南芥_PHYB_AT2G18790.1)。

[SEQ ID NO:3]水稻PHYB编码序列(水稻_PHYB_LOC_Os03g19590.1)。

[SEQ ID NO:4]拟南芥YHB氨基酸序列。

[SEQ ID NO:5]拟南芥PHYB氨基酸序列(拟南芥_PHYB_AT2G18790.1)。

[SEQ ID NO:6]水稻PHYB氨基酸序列(水稻_PHYB_LOC_Os03g19590.1)。

[SEQ ID NO:7]来源于拟南芥的MYB76维管束启动子的核苷酸序列。这是一个合成启动子，由含有最小增强子元件的低聚物MYB76序列和35S最小核心启动子元件组成。

[SEQ ID NO:8]拟南芥光敏色素D核苷酸编码DNA序列(拟南芥_PHYD_AT4G16250.1)。

[SEQ ID NO:9]拟南芥光敏色素D氨基酸序列(拟南芥_PHYD_AT4G16250.1)。

[SEQ ID NO:10]结缕草PCK启动子序列。

[SEQ ID NO:11]含有YHB突变的小麦PHYB编码序列(来源于Traes_4AS_1F3163292)。

[SEQ ID NO:12]含有YHB突变的小麦PHYB氨基酸序列(来源于Traes_4AS_1F3163292)。

[SEQ ID NO:13]含有GLDP1 V-box启动子的DNA序列。

[SEQ ID NO:14]欧洲油菜PHYB编码序列摘录(BnaC03g39830D)。

[SEQ ID NO:15]欧洲油菜PHYB编码序列摘录(BnaA05g22950D)。

[SEQ ID NO:16]欧洲油菜PHYB编码序列摘录(BnaC05g36390D)。

在本说明书的整个描述和权利要求中，单词“包括”和“包含”以及它们的变化是指“包括但不限于”，并且它们无意(也不)排除其他部分、添加剂、成分、整数或步骤。在本说明书的整个描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数形式包含复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则本说明书应被理解为考虑到复数和单数。

与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与之不相容。本说明书(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何方式组合，但至少某些此类特征和/或步骤中的相互排斥的组合除外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明延伸到本说明书(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)所披露的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或如此披露的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。

读者应注意与本说明书同时或之前提交的与本申请有关的所有论文和文件，这些论文和文件与本说明书一起向公众开放，所有这些论文和文件的内容均通过引用的方式并入本文。

序列表

<110> 牛津大学创新有限公司

<120> 提高C3植物的生产率

<130> P276128GB

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3519

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> [YHB]驯化的

<400> 1

atggtttccg gagtcggggg tagtggcggt ggccgtggcg gtggccgtgg cggagaagaa 60

gaaccgtcgt caagtcacac tcctaataac cgaagaggag gagaacaagc tcaatcgtcg 120

ggaacgaaat ctctcagacc aagaagcaac actgaatcaa tgagcaaagc aattcaacag 180

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agtggaagtg gtgacatgat gctgatgatg ccatattag 3519

<210> 2

<211> 3519

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 2

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gaaccgtcgt caagtcacac tcctaataac cgaagaggag gagaacaagc tcaatcgtcg 120

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gcgatttctc agttacaggc tcttcctggt ggagatatta agcttttgtg tgacactgtc 780

gtggaaagtg tgagggactt gactggttat gatcgtgtta tggtttataa gtttcatgaa 840

gatgagcatg gagaagttgt agctgagagt aaacgagatg atttagagcc ttatattgga 900

ctgcattatc ctgctactga tattcctcaa gcgtcaaggt tcttgtttaa gcagaaccgt 960

gtccgaatga tagtagattg caatgccaca cctgttcttg tggtccagga cgataggcta 1020

actcagtcta tgtgcttggt tggttctact cttagggctc ctcatggttg tcactctcag 1080

tatatggcta acatgggatc tattgcgtct ttagcaatgg cggttataat caatggaaat 1140

gaagatgatg ggagcaatgt agctagtgga agaagctcga tgaggctttg gggtttggtt 1200

gtttgccatc acacttcttc tcgctgcata ccgtttccgc taaggtatgc ttgtgagttt 1260

ttgatgcagg ctttcggttt acagttaaac atggaattgc agttagcttt gcaaatgtca 1320

gagaaacgcg ttttgagaac gcagacactg ttatgtgata tgcttctgcg tgactcgcct 1380

gctggaattg ttacacagag tcccagtatc atggacttag tgaaatgtga cggtgcagca 1440

tttctttacc acgggaagta ttacccgttg ggtgttgctc ctagtgaagt tcagataaaa 1500

gatgttgtgg agtggttgct tgcgaatcat gcggattcaa ccggattaag cactgatagt 1560

ttaggcgatg cggggtatcc cggtgcagct gcgttagggg atgctgtgtg cggtatggca 1620

gttgcatata tcacaaaaag agactttctt ttttggtttc gatctcacac tgcgaaagaa 1680

atcaaatggg gaggcgctaa gcatcatccg gaggataaag atgatgggca acgaatgcat 1740

cctcgttcgt cctttcaggc ttttcttgaa gttgttaaga gccggagtca gccatgggaa 1800

actgcggaaa tggatgcgat tcactcgctc cagcttattc tgagagactc ttttaaagaa 1860

tctgaggcgg ctatgaactc taaagttgtg gatggtgtgg ttcagccatg tagggatatg 1920

gcgggggaac aggggattga tgagttaggt gcagttgcaa gagagatggt taggctcatt 1980

gagactgcaa ctgttcctat attcgctgtg gatgccggag gctgcatcaa tggatggaac 2040

gctaagattg cagagttgac aggtctctca gttgaagaag ctatggggaa gtctctggtt 2100

tctgatttaa tatacaaaga gaatgaagca actgtcaata agcttctttc tcgtgctttg 2160

agaggggacg aggaaaagaa tgtggaggtt aagctgaaaa ctttcagccc cgaactacaa 2220

gggaaagcag tttttgtggt tgtgaatgct tgttccagca aggactactt gaacaacatt 2280

gtcggcgttt gttttgttgg acaagacgtt actagtcaga aaatcgtaat ggataagttc 2340

atcaacatac aaggagatta caaggctatt gtacatagcc caaaccctct aatcccgcca 2400

atttttgctg ctgacgagaa cacgtgctgc ctggaatgga acatggcgat ggaaaagctt 2460

acgggttggt ctcgcagtga agtgattggg aaaatgattg tcggggaagt gtttgggagc 2520

tgttgcatgc taaagggtcc tgatgcttta accaagttca tgattgtatt gcataatgcg 2580

attggtggcc aagatacgga taagttccct ttcccattct ttgaccgcaa tgggaagttt 2640

gttcaggctc tattgactgc aaacaagcgg gttagcctcg agggaaaggt tattggggct 2700

ttctgtttct tgcaaatccc gagccctgag ctgcagcaag ctttagcagt ccaacggagg 2760

caggacacag agtgtttcac gaaggcaaaa gagttggctt atatttgtca ggtgataaag 2820

aatcctttga gcggtatgcg tttcgcaaac tcattgttgg aggccacaga cttgaacgag 2880

gaccagaagc agttacttga aacaagtgtt tcttgcgaga aacagatctc aaggatcgtc 2940

ggggacatgg atcttgaaag cattgaagac ggttcatttg tgctaaagag ggaagagttt 3000

ttccttggaa gtgtcataaa cgcgattgta agtcaagcga tgttcttatt aagggacaga 3060

ggtcttcagc tgatccgtga cattcccgaa gagatcaaat caatagaggt ttttggagac 3120

cagataagga ttcaacagct cctggctgag tttctgctga gtataatccg gtatgcacca 3180

tctcaagagt gggtggagat ccatttaagc caactttcaa agcaaatggc tgatggattc 3240

gccgccatcc gcacagaatt cagaatggcg tgtccaggtg aaggtctgcc tccagagcta 3300

gtccgagaca tgttccatag cagcaggtgg acaagccctg aaggtttagg tctaagcgta 3360

tgtcgaaaga ttttaaagct aatgaacggt gaggttcaat acatccgaga atcagaacgg 3420

tcctatttcc tcatcattct ggaactccct gtacctcgaa agcgaccatt gtcaactgct 3480

agtggaagtg gtgacatgat gctgatgatg ccatattag 3519

<210> 3

<211> 3516

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 3

atggcctcgg gtagccgcgc cacgcccacg cgctccccct cctccgcgcg gcccgcggcg 60

ccgcggcacc agcaccacca ctcgcagtcc tcgggcggga gcacgtcccg cgcgggaggg 120

ggtggcgggg gcgggggagg gggagggggc ggcgcggccg ccgcggagtc ggtgtccaag 180

gccgtggcgc agtacaccct ggacgcgcgc ctccacgccg tgttcgagca gtcgggcgcg 240

tcgggccgca gcttcgacta cacgcagtcg ctgcgtgcgt cgcccacccc gtcctccgag 300

cagcagatcg ccgcctacct ctcccgcatc cagcgcggcg ggcacataca gcccttcggc 360

tgcacgctcg ccgtcgccga cgactcctcc ttccgcctcc tcgcctactc cgagaacacc 420

gccgacctgc tcgacctgtc gccccaccac tccgtcccct cgctcgactc ctccgcggtg 480

cctccccccg tctcgctcgg cgcagacgcg cgcctccttt tcgccccctc gtccgccgtc 540

ctcctcgagc gcgccttcgc cgcgcgcgag atctcgctgc tcaacccgct ctggatccac 600

tccagggtct cctctaaacc cttctacgcc atcctccacc gcatcgatgt cggcgtcgtc 660

atcgacctcg agcccgcccg caccgaggat cctgcactct ccatcgctgg cgcagtccag 720

tctcagaagc tcgcggtccg tgccatctcc cgcctccagg cgcttcccgg cggtgacgtc 780

aagctccttt gcgacaccgt tgttgagtat gttagagagc tcacaggtta tgaccgcgtt 840

atggtgtaca ggttccatga ggatgagcat ggagaagtcg ttgccgagag ccggcgcaat 900

aaccttgagc cctacatcgg gttgcattat cctgctacag atatcccaca ggcatcacgc 960

ttcctgttcc ggcagaaccg tgtgcggatg attgctgatt gccatgctgc gccggtgagg 1020

gtcatccagg atcctgcact aacacagccg ctgtgcttgg ttgggtccac gctgcgttcg 1080

ccgcatggtt gccatgcgca gtatatggcg aacatgggtt ccattgcatc tcttgttatg 1140

gcagtgatca ttagtagtgg tggggatgat gatcataaca tttcacgggg cagcatcccg 1200

tcggcgatga agttgtgggg gttggtagta tgccaccaca catctccacg gtgcatccct 1260

ttcccactac ggtatgcatg cgagttcctc atgcaagcct ttgggttgca gctcaacatg 1320

gagttgcagc ttgcacacca actgtcagag aaacacattc tgcggacgca gacactgctg 1380

tgtgatatgc tactccggga ttcaccaact ggcattgtca cacaaagccc cagcatcatg 1440

gaccttgtga agtgtgatgg tgctgctctg tattaccatg ggaagtacta ccctcttggt 1500

gtcactccca cagaagttca gattaaggac atcatcgagt ggttgactat gtgccatgga 1560

gactccacag ggctcagcac agatagcctt gctgatgcag gctaccctgg tgctgctgca 1620

ctaggagatg cagtgagtgg aatggcggta gcatatatca cgccaagtga ttatttgttt 1680

tggttccggt cacacacagc taaggagata aagtggggtg gtgcaaagca tcatccagag 1740

gataaggatg atggacaacg aatgcatcca cgatcatcgt tcaaggcatt tcttgaagtt 1800

gtgaagagta ggagcttacc atgggagaat gcggagatgg atgcaataca ttccttgcag 1860

ctcatattgc gggactcttt cagagattct gcagagggca caagtaactc aaaagccata 1920

gtgaatggcc aggttcagct tggggagcta gaattacggg gaatagatga gcttagctcg 1980

gtagcaaggg agatggttcg gttgatcgag acagcaacag tacccatctt tgcagtagat 2040

actgatggat gtataaatgg ttggaatgca aaggttgctg agctgacagg cctctctgtt 2100

gaggaagcaa tgggcaaatc attggtaaat gatctcatct tcaaggaatc tgaggaaaca 2160

gtaaacaagc tactctcacg agctttaaga ggtgatgaag acaaaaatgt agagataaag 2220

ttgaagacat tcgggccaga acaatctaaa ggaccaatat tcgttattgt gaatgcttgt 2280

tctagcaggg attacactaa aaatattgtt ggtgtttgtt ttgttggcca agatgtcaca 2340

ggacaaaagg tggtcatgga taaatttatc aacatacaag gggattacaa ggctatcgta 2400

cacaacccta atcctctcat acccccaata tttgcttcag atgagaatac ttgttgttcg 2460

gagtggaaca cagcaatgga aaaactcaca ggatggtcaa gaggggaagt tgttggtaag 2520

cttctggtcg gtgaggtctt tggtaattgt tgtcgactca agggcccaga tgcattaacg 2580

aaattcatga ttgtcctaca caacgctata ggaggacagg attgtgaaaa gttccccttt 2640

tcattttttg acaagaatgg gaaatacgtg caggccttat tgactgcaaa cacgaggagc 2700

agaatggatg gtgaggccat aggagccttc tgtttcttgc agattgcaag tcctgaatta 2760

cagcaagcct ttgagattca gagacaccat gaaaagaagt gttatgcaag gatgaaggaa 2820

ttggcttaca tttaccagga aataaagaat cctctcaacg gtatccgatt tacaaactcg 2880

ttattggaga tgactgatct aaaggatgac cagaggcagt ttcttgaaac cagcactgct 2940

tgtgagaaac agatgtccaa aattgttaag gatgctagcc tccaaagtat tgaggatggc 3000

tctttggtgc ttgagaaagg tgaattttca ctaggtagtg ttatgaatgc tgttgtcagc 3060

caagtgatga tacagttgag agaaagagat ttacaactta ttcgagatat ccctgatgaa 3120

attaaagaag cctcagcata tggtgaccaa tatagaattc aacaagtttt atgtgacttt 3180

ttgctaagca tggtgaggtt tgctccagct gaaaatggct gggtggagat acaggtcaga 3240

ccaaatataa aacaaaattc tgatggaaca gacacaatgc ttttcctctt caggtttgcc 3300

tgtcctggcg aaggccttcc cccagagatt gttcaagaca tgtttagtaa ctcccgctgg 3360

acaacccaag agggtattgg cctaagcata tgcaggaaga tcctaaaatt gatgggtggc 3420

gaggtccaat atataaggga gtcggagcgg agtttcttcc atatcgtact tgagctgccc 3480

cagcctcagc aagcagcaag tagggggaca agctga 3516

<210> 4

<211> 1172

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> [YHB]驯化的

<400> 4

Met Val Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Gly Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser His Thr Pro Asn Asn Arg Arg

20 25 30

Gly Gly Glu Gln Ala Gln Ser Ser Gly Thr Lys Ser Leu Arg Pro Arg

35 40 45

Ser Asn Thr Glu Ser Met Ser Lys Ala Ile Gln Gln Tyr Thr Val Asp

50 55 60

Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln Ser Gly Glu Ser Gly Lys Ser

65 70 75 80

Phe Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Val

85 90 95

Pro Glu Gln Gln Ile Thr Ala Tyr Leu Ser Arg Ile Gln Arg Gly Gly

100 105 110

Tyr Ile Gln Pro Phe Gly Cys Met Ile Ala Val Asp Glu Ser Ser Phe

115 120 125

Arg Ile Ile Gly Tyr Ser Glu Asn Ala Arg Glu Met Leu Gly Ile Met

130 135 140

Pro Gln Ser Val Pro Thr Leu Glu Lys Pro Glu Ile Leu Ala Met Gly

145 150 155 160

Thr Asp Val Arg Ser Leu Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ile Leu Leu Glu

165 170 175

Arg Ala Phe Val Ala Arg Glu Ile Thr Leu Leu Asn Pro Val Trp Ile

180 185 190

His Ser Lys Asn Thr Gly Lys Pro Phe Tyr Ala Ile Leu His Arg Ile

195 200 205

Asp Val Gly Val Val Ile Asp Leu Glu Pro Ala Arg Thr Glu Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ala Val Gln Ser Gln Lys Leu Ala Val Arg

225 230 235 240

Ala Ile Ser Gln Leu Gln Ala Leu Pro Gly Gly Asp Ile Lys Leu Leu

245 250 255

Cys Asp Thr Val Val Glu Ser Val Arg Asp Leu Thr Gly Tyr Asp Arg

260 265 270

Val Met Val His Lys Phe His Glu Asp Glu His Gly Glu Val Val Ala

275 280 285

Glu Ser Lys Arg Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gly Leu His Tyr Pro

290 295 300

Ala Thr Asp Ile Pro Gln Ala Ser Arg Phe Leu Phe Lys Gln Asn Arg

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Val Arg Met Ile Val Asp Cys Asn Ala Thr Pro Val Leu Val Val Gln

325 330 335

Asp Asp Arg Leu Thr Gln Ser Met Cys Leu Val Gly Ser Thr Leu Arg

340 345 350

Ala Pro His Gly Cys His Ser Gln Tyr Met Ala Asn Met Gly Ser Ile

355 360 365

Ala Ser Leu Ala Met Ala Val Ile Ile Asn Gly Asn Glu Asp Asp Gly

370 375 380

Ser Asn Val Ala Ser Gly Arg Ser Ser Met Arg Leu Trp Gly Leu Val

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Val Cys His His Thr Ser Ser Arg Cys Ile Pro Phe Pro Leu Arg Tyr

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420 425 430

Leu Gln Leu Ala Leu Gln Met Ser Glu Lys Arg Val Leu Arg Thr Gln

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Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu Leu Arg Asp Ser Pro Ala Gly Ile Val

450 455 460

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465 470 475 480

Phe Leu Tyr His Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu Gly Val Ala Pro Ser Glu

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Val Gln Ile Lys Asp Val Val Glu Trp Leu Leu Ala Asn His Ala Asp

500 505 510

Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Gly

515 520 525

Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala Val Cys Gly Met Ala Val Ala Tyr Ile

530 535 540

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545 550 555 560

Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys His His Pro Glu Asp Lys Asp Asp Gly

565 570 575

Gln Arg Met His Pro Arg Ser Ser Phe Gln Ala Phe Leu Glu Val Val

580 585 590

Lys Ser Arg Ser Gln Pro Trp Glu Thr Ala Glu Met Asp Ala Ile His

595 600 605

Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg Asp Ser Phe Lys Glu Ser Glu Ala Ala

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Met Asn Ser Lys Val Val Asp Gly Val Val Gln Pro Cys Arg Asp Met

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645 650 655

Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala Thr Val Pro Ile Phe Ala Val Asp Ala

660 665 670

Gly Gly Cys Ile Asn Gly Trp Asn Ala Lys Ile Ala Glu Leu Thr Gly

675 680 685

Leu Ser Val Glu Glu Ala Met Gly Lys Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile

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Tyr Lys Glu Asn Glu Ala Thr Val Asn Lys Leu Leu Ser Arg Ala Leu

705 710 715 720

Arg Gly Asp Glu Glu Lys Asn Val Glu Val Lys Leu Lys Thr Phe Ser

725 730 735

Pro Glu Leu Gln Gly Lys Ala Val Phe Val Val Val Asn Ala Cys Ser

740 745 750

Ser Lys Asp Tyr Leu Asn Asn Ile Val Gly Val Cys Phe Val Gly Gln

755 760 765

Asp Val Thr Ser Gln Lys Ile Val Met Asp Lys Phe Ile Asn Ile Gln

770 775 780

Gly Asp Tyr Lys Ala Ile Val His Ser Pro Asn Pro Leu Ile Pro Pro

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Ile Phe Ala Ala Asp Glu Asn Thr Cys Cys Leu Glu Trp Asn Met Ala

805 810 815

Met Glu Lys Leu Thr Gly Trp Ser Arg Ser Glu Val Ile Gly Lys Met

820 825 830

Ile Val Gly Glu Val Phe Gly Ser Cys Cys Met Leu Lys Gly Pro Asp

835 840 845

Ala Leu Thr Lys Phe Met Ile Val Leu His Asn Ala Ile Gly Gly Gln

850 855 860

Asp Thr Asp Lys Phe Pro Phe Pro Phe Phe Asp Arg Asn Gly Lys Phe

865 870 875 880

Val Gln Ala Leu Leu Thr Ala Asn Lys Arg Val Ser Leu Glu Gly Lys

885 890 895

Val Ile Gly Ala Phe Cys Phe Leu Gln Ile Pro Ser Pro Glu Leu Gln

900 905 910

Gln Ala Leu Ala Val Gln Arg Arg Gln Asp Thr Glu Cys Phe Thr Lys

915 920 925

Ala Lys Glu Leu Ala Tyr Ile Cys Gln Val Ile Lys Asn Pro Leu Ser

930 935 940

Gly Met Arg Phe Ala Asn Ser Leu Leu Glu Ala Thr Asp Leu Asn Glu

945 950 955 960

Asp Gln Lys Gln Leu Leu Glu Thr Ser Val Ser Cys Glu Lys Gln Ile

965 970 975

Ser Arg Ile Val Gly Asp Met Asp Leu Glu Ser Ile Glu Asp Gly Ser

980 985 990

Phe Val Leu Lys Arg Glu Glu Phe Phe Leu Gly Ser Val Ile Asn Ala

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Ile Val Ser Gln Ala Met Phe Leu Leu Arg Asp Arg Gly Leu Gln

1010 1015 1020

Leu Ile Arg Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Ser Ile Glu Val Phe

1025 1030 1035

Gly Asp Gln Ile Arg Ile Gln Gln Leu Leu Ala Glu Phe Leu Leu

1040 1045 1050

Ser Ile Ile Arg Tyr Ala Pro Ser Gln Glu Trp Val Glu Ile His

1055 1060 1065

Leu Ser Gln Leu Ser Lys Gln Met Ala Asp Gly Phe Ala Ala Ile

1070 1075 1080

Arg Thr Glu Phe Arg Met Ala Cys Pro Gly Glu Gly Leu Pro Pro

1085 1090 1095

Glu Leu Val Arg Asp Met Phe His Ser Ser Arg Trp Thr Ser Pro

1100 1105 1110

Glu Gly Leu Gly Leu Ser Val Cys Arg Lys Ile Leu Lys Leu Met

1115 1120 1125

Asn Gly Glu Val Gln Tyr Ile Arg Glu Ser Glu Arg Ser Tyr Phe

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Leu Ile Ile Leu Glu Leu Pro Val Pro Arg Lys Arg Pro Leu Ser

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Thr Ala Ser Gly Ser Gly Asp Met Met Leu Met Met Pro Tyr

1160 1165 1170

<210> 5

<211> 1172

<212> PRT

<213> 拟南芥

<400> 5

Met Val Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Arg

1 5 10 15

Gly Gly Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser His Thr Pro Asn Asn Arg Arg

20 25 30

Gly Gly Glu Gln Ala Gln Ser Ser Gly Thr Lys Ser Leu Arg Pro Arg

35 40 45

Ser Asn Thr Glu Ser Met Ser Lys Ala Ile Gln Gln Tyr Thr Val Asp

50 55 60

Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln Ser Gly Glu Ser Gly Lys Ser

65 70 75 80

Phe Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Val

85 90 95

Pro Glu Gln Gln Ile Thr Ala Tyr Leu Ser Arg Ile Gln Arg Gly Gly

100 105 110

Tyr Ile Gln Pro Phe Gly Cys Met Ile Ala Val Asp Glu Ser Ser Phe

115 120 125

Arg Ile Ile Gly Tyr Ser Glu Asn Ala Arg Glu Met Leu Gly Ile Met

130 135 140

Pro Gln Ser Val Pro Thr Leu Glu Lys Pro Glu Ile Leu Ala Met Gly

145 150 155 160

Thr Asp Val Arg Ser Leu Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ile Leu Leu Glu

165 170 175

Arg Ala Phe Val Ala Arg Glu Ile Thr Leu Leu Asn Pro Val Trp Ile

180 185 190

His Ser Lys Asn Thr Gly Lys Pro Phe Tyr Ala Ile Leu His Arg Ile

195 200 205

Asp Val Gly Val Val Ile Asp Leu Glu Pro Ala Arg Thr Glu Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ala Val Gln Ser Gln Lys Leu Ala Val Arg

225 230 235 240

Ala Ile Ser Gln Leu Gln Ala Leu Pro Gly Gly Asp Ile Lys Leu Leu

245 250 255

Cys Asp Thr Val Val Glu Ser Val Arg Asp Leu Thr Gly Tyr Asp Arg

260 265 270

Val Met Val Tyr Lys Phe His Glu Asp Glu His Gly Glu Val Val Ala

275 280 285

Glu Ser Lys Arg Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gly Leu His Tyr Pro

290 295 300

Ala Thr Asp Ile Pro Gln Ala Ser Arg Phe Leu Phe Lys Gln Asn Arg

305 310 315 320

Val Arg Met Ile Val Asp Cys Asn Ala Thr Pro Val Leu Val Val Gln

325 330 335

Asp Asp Arg Leu Thr Gln Ser Met Cys Leu Val Gly Ser Thr Leu Arg

340 345 350

Ala Pro His Gly Cys His Ser Gln Tyr Met Ala Asn Met Gly Ser Ile

355 360 365

Ala Ser Leu Ala Met Ala Val Ile Ile Asn Gly Asn Glu Asp Asp Gly

370 375 380

Ser Asn Val Ala Ser Gly Arg Ser Ser Met Arg Leu Trp Gly Leu Val

385 390 395 400

Val Cys His His Thr Ser Ser Arg Cys Ile Pro Phe Pro Leu Arg Tyr

405 410 415

Ala Cys Glu Phe Leu Met Gln Ala Phe Gly Leu Gln Leu Asn Met Glu

420 425 430

Leu Gln Leu Ala Leu Gln Met Ser Glu Lys Arg Val Leu Arg Thr Gln

435 440 445

Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu Leu Arg Asp Ser Pro Ala Gly Ile Val

450 455 460

Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Asp Leu Val Lys Cys Asp Gly Ala Ala

465 470 475 480

Phe Leu Tyr His Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu Gly Val Ala Pro Ser Glu

485 490 495

Val Gln Ile Lys Asp Val Val Glu Trp Leu Leu Ala Asn His Ala Asp

500 505 510

Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Gly

515 520 525

Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala Val Cys Gly Met Ala Val Ala Tyr Ile

530 535 540

Thr Lys Arg Asp Phe Leu Phe Trp Phe Arg Ser His Thr Ala Lys Glu

545 550 555 560

Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys His His Pro Glu Asp Lys Asp Asp Gly

565 570 575

Gln Arg Met His Pro Arg Ser Ser Phe Gln Ala Phe Leu Glu Val Val

580 585 590

Lys Ser Arg Ser Gln Pro Trp Glu Thr Ala Glu Met Asp Ala Ile His

595 600 605

Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg Asp Ser Phe Lys Glu Ser Glu Ala Ala

610 615 620

Met Asn Ser Lys Val Val Asp Gly Val Val Gln Pro Cys Arg Asp Met

625 630 635 640

Ala Gly Glu Gln Gly Ile Asp Glu Leu Gly Ala Val Ala Arg Glu Met

645 650 655

Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala Thr Val Pro Ile Phe Ala Val Asp Ala

660 665 670

Gly Gly Cys Ile Asn Gly Trp Asn Ala Lys Ile Ala Glu Leu Thr Gly

675 680 685

Leu Ser Val Glu Glu Ala Met Gly Lys Ser Leu Val Ser Asp Leu Ile

690 695 700

Tyr Lys Glu Asn Glu Ala Thr Val Asn Lys Leu Leu Ser Arg Ala Leu

705 710 715 720

Arg Gly Asp Glu Glu Lys Asn Val Glu Val Lys Leu Lys Thr Phe Ser

725 730 735

Pro Glu Leu Gln Gly Lys Ala Val Phe Val Val Val Asn Ala Cys Ser

740 745 750

Ser Lys Asp Tyr Leu Asn Asn Ile Val Gly Val Cys Phe Val Gly Gln

755 760 765

Asp Val Thr Ser Gln Lys Ile Val Met Asp Lys Phe Ile Asn Ile Gln

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Ile Phe Ala Ala Asp Glu Asn Thr Cys Cys Leu Glu Trp Asn Met Ala

805 810 815

Met Glu Lys Leu Thr Gly Trp Ser Arg Ser Glu Val Ile Gly Lys Met

820 825 830

Ile Val Gly Glu Val Phe Gly Ser Cys Cys Met Leu Lys Gly Pro Asp

835 840 845

Ala Leu Thr Lys Phe Met Ile Val Leu His Asn Ala Ile Gly Gly Gln

850 855 860

Asp Thr Asp Lys Phe Pro Phe Pro Phe Phe Asp Arg Asn Gly Lys Phe

865 870 875 880

Val Gln Ala Leu Leu Thr Ala Asn Lys Arg Val Ser Leu Glu Gly Lys

885 890 895

Val Ile Gly Ala Phe Cys Phe Leu Gln Ile Pro Ser Pro Glu Leu Gln

900 905 910

Gln Ala Leu Ala Val Gln Arg Arg Gln Asp Thr Glu Cys Phe Thr Lys

915 920 925

Ala Lys Glu Leu Ala Tyr Ile Cys Gln Val Ile Lys Asn Pro Leu Ser

930 935 940

Gly Met Arg Phe Ala Asn Ser Leu Leu Glu Ala Thr Asp Leu Asn Glu

945 950 955 960

Asp Gln Lys Gln Leu Leu Glu Thr Ser Val Ser Cys Glu Lys Gln Ile

965 970 975

Ser Arg Ile Val Gly Asp Met Asp Leu Glu Ser Ile Glu Asp Gly Ser

980 985 990

Phe Val Leu Lys Arg Glu Glu Phe Phe Leu Gly Ser Val Ile Asn Ala

995 1000 1005

Ile Val Ser Gln Ala Met Phe Leu Leu Arg Asp Arg Gly Leu Gln

1010 1015 1020

Leu Ile Arg Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Ser Ile Glu Val Phe

1025 1030 1035

Gly Asp Gln Ile Arg Ile Gln Gln Leu Leu Ala Glu Phe Leu Leu

1040 1045 1050

Ser Ile Ile Arg Tyr Ala Pro Ser Gln Glu Trp Val Glu Ile His

1055 1060 1065

Leu Ser Gln Leu Ser Lys Gln Met Ala Asp Gly Phe Ala Ala Ile

1070 1075 1080

Arg Thr Glu Phe Arg Met Ala Cys Pro Gly Glu Gly Leu Pro Pro

1085 1090 1095

Glu Leu Val Arg Asp Met Phe His Ser Ser Arg Trp Thr Ser Pro

1100 1105 1110

Glu Gly Leu Gly Leu Ser Val Cys Arg Lys Ile Leu Lys Leu Met

1115 1120 1125

Asn Gly Glu Val Gln Tyr Ile Arg Glu Ser Glu Arg Ser Tyr Phe

1130 1135 1140

Leu Ile Ile Leu Glu Leu Pro Val Pro Arg Lys Arg Pro Leu Ser

1145 1150 1155

Thr Ala Ser Gly Ser Gly Asp Met Met Leu Met Met Pro Tyr

1160 1165 1170

<210> 6

<211> 1171

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 6

Met Ala Ser Gly Ser Arg Ala Thr Pro Thr Arg Ser Pro Ser Ser Ala

1 5 10 15

Arg Pro Ala Ala Pro Arg His Gln His His His Ser Gln Ser Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Thr Ser Arg Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Glu Ser Val Ser Lys Ala Val Ala Gln

50 55 60

Tyr Thr Leu Asp Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln Ser Gly Ala

65 70 75 80

Ser Gly Arg Ser Phe Asp Tyr Thr Gln Ser Leu Arg Ala Ser Pro Thr

85 90 95

Pro Ser Ser Glu Gln Gln Ile Ala Ala Tyr Leu Ser Arg Ile Gln Arg

100 105 110

Gly Gly His Ile Gln Pro Phe Gly Cys Thr Leu Ala Val Ala Asp Asp

115 120 125

Ser Ser Phe Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Glu Asn Thr Ala Asp Leu Leu

130 135 140

Asp Leu Ser Pro His His Ser Val Pro Ser Leu Asp Ser Ser Ala Val

145 150 155 160

Pro Pro Pro Val Ser Leu Gly Ala Asp Ala Arg Leu Leu Phe Ala Pro

165 170 175

Ser Ser Ala Val Leu Leu Glu Arg Ala Phe Ala Ala Arg Glu Ile Ser

180 185 190

Leu Leu Asn Pro Leu Trp Ile His Ser Arg Val Ser Ser Lys Pro Phe

195 200 205

Tyr Ala Ile Leu His Arg Ile Asp Val Gly Val Val Ile Asp Leu Glu

210 215 220

Pro Ala Arg Thr Glu Asp Pro Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ala Val Gln

225 230 235 240

Ser Gln Lys Leu Ala Val Arg Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ala Leu Pro

245 250 255

Gly Gly Asp Val Lys Leu Leu Cys Asp Thr Val Val Glu Tyr Val Arg

260 265 270

Glu Leu Thr Gly Tyr Asp Arg Val Met Val Tyr Arg Phe His Glu Asp

275 280 285

Glu His Gly Glu Val Val Ala Glu Ser Arg Arg Asn Asn Leu Glu Pro

290 295 300

Tyr Ile Gly Leu His Tyr Pro Ala Thr Asp Ile Pro Gln Ala Ser Arg

305 310 315 320

Phe Leu Phe Arg Gln Asn Arg Val Arg Met Ile Ala Asp Cys His Ala

325 330 335

Ala Pro Val Arg Val Ile Gln Asp Pro Ala Leu Thr Gln Pro Leu Cys

340 345 350

Leu Val Gly Ser Thr Leu Arg Ser Pro His Gly Cys His Ala Gln Tyr

355 360 365

Met Ala Asn Met Gly Ser Ile Ala Ser Leu Val Met Ala Val Ile Ile

370 375 380

Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp His Asn Ile Ser Arg Gly Ser Ile Pro

385 390 395 400

Ser Ala Met Lys Leu Trp Gly Leu Val Val Cys His His Thr Ser Pro

405 410 415

Arg Cys Ile Pro Phe Pro Leu Arg Tyr Ala Cys Glu Phe Leu Met Gln

420 425 430

Ala Phe Gly Leu Gln Leu Asn Met Glu Leu Gln Leu Ala His Gln Leu

435 440 445

Ser Glu Lys His Ile Leu Arg Thr Gln Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu

450 455 460

Leu Arg Asp Ser Pro Thr Gly Ile Val Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met

465 470 475 480

Asp Leu Val Lys Cys Asp Gly Ala Ala Leu Tyr Tyr His Gly Lys Tyr

485 490 495

Tyr Pro Leu Gly Val Thr Pro Thr Glu Val Gln Ile Lys Asp Ile Ile

500 505 510

Glu Trp Leu Thr Met Cys His Gly Asp Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp

515 520 525

Ser Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Pro Gly Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala

530 535 540

Val Ser Gly Met Ala Val Ala Tyr Ile Thr Pro Ser Asp Tyr Leu Phe

545 550 555 560

Trp Phe Arg Ser His Thr Ala Lys Glu Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys

565 570 575

His His Pro Glu Asp Lys Asp Asp Gly Gln Arg Met His Pro Arg Ser

580 585 590

Ser Phe Lys Ala Phe Leu Glu Val Val Lys Ser Arg Ser Leu Pro Trp

595 600 605

Glu Asn Ala Glu Met Asp Ala Ile His Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg

610 615 620

Asp Ser Phe Arg Asp Ser Ala Glu Gly Thr Ser Asn Ser Lys Ala Ile

625 630 635 640

Val Asn Gly Gln Val Gln Leu Gly Glu Leu Glu Leu Arg Gly Ile Asp

645 650 655

Glu Leu Ser Ser Val Ala Arg Glu Met Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala

660 665 670

Thr Val Pro Ile Phe Ala Val Asp Thr Asp Gly Cys Ile Asn Gly Trp

675 680 685

Asn Ala Lys Val Ala Glu Leu Thr Gly Leu Ser Val Glu Glu Ala Met

690 695 700

Gly Lys Ser Leu Val Asn Asp Leu Ile Phe Lys Glu Ser Glu Glu Thr

705 710 715 720

Val Asn Lys Leu Leu Ser Arg Ala Leu Arg Gly Asp Glu Asp Lys Asn

725 730 735

Val Glu Ile Lys Leu Lys Thr Phe Gly Pro Glu Gln Ser Lys Gly Pro

740 745 750

Ile Phe Val Ile Val Asn Ala Cys Ser Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Asn

755 760 765

Ile Val Gly Val Cys Phe Val Gly Gln Asp Val Thr Gly Gln Lys Val

770 775 780

Val Met Asp Lys Phe Ile Asn Ile Gln Gly Asp Tyr Lys Ala Ile Val

785 790 795 800

His Asn Pro Asn Pro Leu Ile Pro Pro Ile Phe Ala Ser Asp Glu Asn

805 810 815

Thr Cys Cys Ser Glu Trp Asn Thr Ala Met Glu Lys Leu Thr Gly Trp

820 825 830

Ser Arg Gly Glu Val Val Gly Lys Leu Leu Val Gly Glu Val Phe Gly

835 840 845

Asn Cys Cys Arg Leu Lys Gly Pro Asp Ala Leu Thr Lys Phe Met Ile

850 855 860

Val Leu His Asn Ala Ile Gly Gly Gln Asp Cys Glu Lys Phe Pro Phe

865 870 875 880

Ser Phe Phe Asp Lys Asn Gly Lys Tyr Val Gln Ala Leu Leu Thr Ala

885 890 895

Asn Thr Arg Ser Arg Met Asp Gly Glu Ala Ile Gly Ala Phe Cys Phe

900 905 910

Leu Gln Ile Ala Ser Pro Glu Leu Gln Gln Ala Phe Glu Ile Gln Arg

915 920 925

His His Glu Lys Lys Cys Tyr Ala Arg Met Lys Glu Leu Ala Tyr Ile

930 935 940

Tyr Gln Glu Ile Lys Asn Pro Leu Asn Gly Ile Arg Phe Thr Asn Ser

945 950 955 960

Leu Leu Glu Met Thr Asp Leu Lys Asp Asp Gln Arg Gln Phe Leu Glu

965 970 975

Thr Ser Thr Ala Cys Glu Lys Gln Met Ser Lys Ile Val Lys Asp Ala

980 985 990

Ser Leu Gln Ser Ile Glu Asp Gly Ser Leu Val Leu Glu Lys Gly Glu

995 1000 1005

Phe Ser Leu Gly Ser Val Met Asn Ala Val Val Ser Gln Val Met

1010 1015 1020

Ile Gln Leu Arg Glu Arg Asp Leu Gln Leu Ile Arg Asp Ile Pro

1025 1030 1035

Asp Glu Ile Lys Glu Ala Ser Ala Tyr Gly Asp Gln Tyr Arg Ile

1040 1045 1050

Gln Gln Val Leu Cys Asp Phe Leu Leu Ser Met Val Arg Phe Ala

1055 1060 1065

Pro Ala Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Gln Val Arg Pro Asn Ile

1070 1075 1080

Lys Gln Asn Ser Asp Gly Thr Asp Thr Met Leu Phe Leu Phe Arg

1085 1090 1095

Phe Ala Cys Pro Gly Glu Gly Leu Pro Pro Glu Ile Val Gln Asp

1100 1105 1110

Met Phe Ser Asn Ser Arg Trp Thr Thr Gln Glu Gly Ile Gly Leu

1115 1120 1125

Ser Ile Cys Arg Lys Ile Leu Lys Leu Met Gly Gly Glu Val Gln

1130 1135 1140

Tyr Ile Arg Glu Ser Glu Arg Ser Phe Phe His Ile Val Leu Glu

1145 1150 1155

Leu Pro Gln Pro Gln Gln Ala Ala Ser Arg Gly Thr Ser

1160 1165 1170

<210> 7

<211> 656

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 使用的维管束启动子的核苷酸序列

<400> 7

gatgataaca cctgaattta atgacaaaaa aaaaaaaaag tggatagaga ctagagggac 60

agcaaggctg tgtgacatat atgggcagat agacaaagaa gccgaaaaac gtgcaccgtc 120

caagattctg gctactatac ctaatttcct tcccgcaggg acttgacaaa tatcactatc 180

tgccattttt agttttattt tgtattggtg tcaaagaatt gaaataatga acaacggtcg 240

taaaaagatg taaatgtact gatgataaca cctgaattta atgacaaaaa aaaaaaaaag 300

tggatagaga ctagagggac agcaaggctg tgtgacatat atgggcagat agacaaagaa 360

gccgaaaaac gtgcaccgtc caagattctg gctactatac ctaatttcct tcccgcaggg 420

acttgacaaa tatcactatc tgccattttt agttttattt tgtattggtg tcaaagaatt 480

gaaataatga acaacggtcg taaaaagatg taaatgccat tctagaagct actccacgtc 540

cataagggac acatcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 600

ttcatttcat ttggagagga cgacctgcag gtcgacggat ccaaggagat ataaca 656

<210> 8

<211> 5536

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单子叶植物载体中使用的维管束启动子的核苷酸序列

<400> 8

gaccggagta tatgtttatg gaactttgtc atccatatca agataactat acttctattt 60

gttaaataat aaatttaaaa tatactgctt caattaaggg tgcacaataa aaatatacac 120

gaaaaacgcg gcaattgccg cgcagatttt ctagtacaaa ctaattacta tcacaaaagg 180

cttatttgtc atgtgtttaa tgtgtttgag atggaacagg aattagtgac aaaattactt 240

tactcttgtc cacttcacac aaattaccac tcattttgga tctcgtgaga ttaattggta 300

tgatttccta tggtgtgttc ttcgtgaaca caatagcttg caatattggg gtgcaaatag 360

gtatcatgtg gtttgttgtg ggtcatacac atctgtgtaa ctggatgatt tactacgcgt 420

tatcgcggaa atttataata atgatgataa tttattatgg taagatgaaa aaagctcaaa 480

aaaataatca taatggatga aaaaattaaa acatatgaga actatttaat aaaattcatt 540

tgagctcatt ctgatgatta atcatatttg cttaaaaatt caaagttttt tgactgcatt 600

tattaatgaa atttgaatat aatattcaat tatcatcagt agattggcca agttgcaaga 660

tctaaaactt cctagttaag attaaaaaat agtagatata acaacatctt aataaagtcg 720

aggaaggtgg agggtcagat tgagcggagg tgcatgagag gtgaggatta aatagaggat 780

agcagcgcgg gagataaaga aggagggatg aaggaagtta aatggagagg tctacaatga 840

acggccatca ttaggtagag cttcatgatc ggacggtgca aacaaaaaag atgatgtgac 900

tcgatgagaa ttcagttttg atagttagtg aatggtacaa atatatatag tacagataaa 960

tttgtgaata taagatggat tttgatcatt ccagagagtt tttgggtcag cccaaaatct 1020

aaaattagaa aaccaacatc tctacctaca attggttaat tgctatacta atttgttagt 1080

acgaggtgat tttcttcgac ttaaaaagca tttgcttaca tggatgaaga gagcgatgac 1140

atatacacac cctatatttg gaacatgtag attcacttca agtaaggaat caattaacgc 1200

aaagtcatga caaacaggat tgaaacatac aacggttgtt gtcagagaaa gagagagaga 1260

aagtagtggt cgaagaaaaa cccacaacca tgctcacaaa aagtctgaac ctaacccgca 1320

ccgtcaccgc cggatgggtc agaatgtaac cacggttagg ctccggccag ccctttaaaa 1380

gcccgacggg gctccgccga tacgcaccca tacagcttgt tccatttcat actcgtcgcg 1440

tacaccgcga cacagacaga gcacgccgtt ctcctcgtac gtacgtgcct cttccttgtg 1500

caagctcgat cgcagcgacg ccctgctgct gctgctgctc tctctccaag cgtcaatggc 1560

aggacgttag gatcgtgatc agtagggtgc taacgactct gtttccctgt cccgtttgca 1620

ggcggatcaa cgaccaccgt gccgcacgcg cgccggcgag aatggatccg attcgttctc 1680

ggacaccttc tcccgctcga gagctccttc ctggaccaca accagatgga gtgcaaccaa 1740

cagctgatag gggtgtatct cctccagccg gtggacctct tgacggctta cctgcaaggc 1800

gcacaatgtc ccgtaccaga ttgcccagtc caccagcacc aagtccagcg ttttcagcgg 1860

gcagcttctc tgacctcctg agacagtttg atccctcttt gttcaacacc tcactgtttg 1920

actcacttcc gccttttggg gctcaccata ctgaagccgc tactggtgag tgggatgagg 1980

tgcagtcagg cttaagagca gctgatgccc caccacctac gatgagggtg gcagtaactg 2040

ctgctaggcc accgagagct aaaccagctc caagacgcag agcagcacaa ccttccgatg 2100

catctcctgc tgctcaagtc gatcttcgca ctttagggta tagccagcaa caacaggaga 2160

agatcaaacc taaggtccga agtacagttg cgcaacacca tgaagccctt gttggtcatg 2220

ggttcactca tgcccacata gttgcactat cccaacatcc tgctgctctt ggaactgttg 2280

cggtgaagta ccaggacatg attgctgctt tacctgaagc aacacacgag gcaatagtcg 2340

gtgttggcaa acagtggtct ggcgctaggg ctctagaagc cctccttaca gttgcaggag 2400

aattgcgggg acctcccttg cagctcgata ccggacaatt gctgaagatt gccaaacgtg 2460

gtggtgttac ggcagtagaa gcagtgcatg cttggaggaa tgctctaact ggagcaccct 2520

tgaatctcac gccagaacaa gtggtcgcta tcgcctccca tgatggtgga aaacaagcac 2580

tagaaactgt ccaaagatta ttgcctgttc tttgtcaggc acacggactt accccacaac 2640

aagtcgttgc tatagcctcc catgatggag ggaagcaagc gttagaaaca gtgcagcggc 2700

tactccctgt attatgccag gctcatggtc taactccaca acaagtggtg gctatagcct 2760

cacacgatgg tggtaaacag gcacttgaaa ccgtccaaag actcctgccg gtcctctgcc 2820

aggcacacgg cctcaccccc gaacaagtgg tggctattgc ttcgcatgat ggaggtaagc 2880

aggctttaga gacagtccag agactactac ccgttctatg ccaggcccat ggtttgaccc 2940

cggaacaggt tgttgctatt gcgtcaaata agggcggcaa gcaagcgttg gaaaccgttc 3000

aagcattact ccctgttctc tgtcaagcac atgggctaac gcccgagcag gttgttgcaa 3060

ttgcatcaca tgatggagga aagcaggcct tagaaacggt acaggcactt ttaccagtcc 3120

tttgccaagc acacgggctt acacccgaac aagtggtcgc tattgcaagt aatataggtg 3180

gaaaacaagc actggaaacc gtgcaggcgc ttttgccggt attatgccaa gctcacggcc 3240

taactcctga acaggtggtt gcgattgcct caaatggtgg gggtaaacag gcactggaga 3300

ctgtgcagcg gcttttgcct gttttgtgtc aagctcatgg attgacacca gagcaggtgg 3360

tcgctatagc tagtaacatt ggaggtaaac aagcgcttga aaccgtgcaa cgtctgctgc 3420

cagttctatg tcaagctcat gggttgaccc cacaacaggt tgtagcgatc gcttccaata 3480

aaggaggaaa gcaagctcta gaaacggtgc agaggctcct cccggttctt tgtcaggcgc 3540

atggattgac cccggagcag gtggtcgcaa tcgccagtca tgatggaggt aagcaggcct 3600

tggaaaccgt tcaggcgtta ctcccggttc tatgccaggc gcatggcctg acccctgaac 3660

aggttgtggc gatagccagt aacggcgggg gaaagcaggc acttgaaacc gtacaacgac 3720

tcctcccagt cctttgtcaa gcccacggat tgactccaga acaagtagtt gctatagctt 3780

cgaataaggg aggaaagcag gcccttgaaa cagttcagcg tcttttgcca gtgttgtgtc 3840

aagcacacgg attgactcct gaacaggttg tcgccattgc atctaatatc ggtggtaagc 3900

aagctctcga aaccgtacag cgactcttgc ctgttctatg ccaagcgcat ggcttgacgc 3960

cggaacaggt ggtagccata gcaagcaaca taggtggcaa acaagctctt gaaacagttc 4020

aaaggttgtt acctgtgctt tgccaagccc acggtttgac ccctcaacag gtggttgcta 4080

tagcatcaca tgatggggga cggcctgctc ttgagacagt gcagcgcctg ttgcccgtgt 4140

tgtgtcaagc gcatggctta acaccggaac aggtcgtggc aattgcgtca aatattggcg 4200

gcaaacaagc gctggaaacc gttcagcgac tcttgcctgt tctgtgccaa gctcacggtc 4260

tgacgcccca acaggttgtt gccattgctt caaatggagg agggaggcca gcccttgagt 4320

cgattgtcgc acagctatct cggcccgacc ctgctttagc cgctctgaca aatgatcatc 4380

ttgtggctct cgcctgctta ggaggtcgcc cagctttaga cgcagtaaaa aagggtctac 4440

ctcatgctcc ggccttaatc aagaggacga atcgtagaat cccagaacga acgagccatc 4500

gcgtagccga tcacgctcaa gttgttaggg ttttaggttt ttttcagtgt cattcacatc 4560

cggcacaagc tttcgatgat gccatgaccc agtttggtat gtcaaggcat ggattactgc 4620

aacttttcag aagagtagga gtgacagagc tcgaagccag aagcggaact ctgccacccg 4680

ctagccaaag atgggatagg atattgcagg cgagtggaat gaagcgcgcg aaaccatctc 4740

caacaagcac tcaaaccccg gatcaagcga gtttgcacgc tttcgcagat tctctcgaac 4800

gagatttgga tgccccttct ccaatgcacg aaggtgatca aactagggcg agtagcagga 4860

agaggtctag gagtgatcgt gcagttacgg gcccctcagc acaacagtct tttgaggtca 4920

gggtgccaga acaaagggac gctttacatc tcccattgtc ttggcgtgta aaaaggccgc 4980

gaactagtat tggaggggga ttaccggacc cagggacccc cactgctgct gatctagctg 5040

cttctagtac ggtaatgcgc gagcaagacg aggatccatt tgctggggca gctgatgact 5100

tccccgcatt caacgaagaa gaattagcat ggttgatgga gttactgcca cagtaagctt 5160

gtcaagcaga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 5220

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 5280

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 5340

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 5400

tgtcatctat gttactagat cgacgctact agaattcgag ctcggaggtt atcacacttg 5460

gtaatttccc cgcatagctg aacatctata caacactcat cgcgcggaga aacgcgcaac 5520

aaattggagg cgcatt 5536

<210> 9

<211> 3495

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 9

atggtctccg gaggtggtag caaaaccagc ggtggagagg cagcttcctc aggccatcgc 60

cgaagtcgtc acaccagcgc tgcagaacaa gctcagtcgt cagcaaacaa agccctaagg 120

tcacagaatc agcagccaca aaaccacggt ggcggaacag agtccacaaa caaagctatt 180

caacagtaca ctgtcgacgc gagactccac gccgtcttcg aacaatccgg agagtcaggt 240

aagtcgtttg attactcaca gtctcttaaa acggcgccgt acgattcctc cgtaccagag 300

cagcagatca cagcttatct ctcccggatc caacgcggtg gctataccca gccttttggc 360

tgcttgatcg ccgtcgaaga atccactttc acaatcatcg gttacagtga aaatgcgcgg 420

gaaatgctag ggctcatgtc tcaatctgta ccaagcatcg aggacaaatc agaggtttta 480

acgattggta cggatttgcg atctctcttc aagtcatcga gctaccttct cctcgagcgc 540

gcgttcgtgg ctcgagagat cacgcttctg aatcctattt ggattcactc taacaacact 600

ggtaaacctt tctacgcgat tctccacagg gttgatgttg gaattttgat cgatttagag 660

ccggctcgaa ccgaagatcc ggcactttca atcgccggag cagtccaatc gcagaaactt 720

gcggtacgtg cgatttctca tttacaatcg ttgcctagcg gcgacattaa gcttctatgt 780

gacactgttg tggaaagcgt tagagatctt actggctacg accgcgttat ggtgtacaag 840

tttcatgaag atgaacatgg tgaagtcgta gccgagagta aacggaacga tttagagcct 900

tacattggtc tgcattatcc cgctactgat attcctcagg catctcggtt cttgttcaag 960

caaaaccgtg ttaggatgat agtagattgc tatgcgtcac cggttcgtgt ggttcaagac 1020

gataggctca cgcagtttat atgcttggtg ggttcgactt tgcgagctcc tcatggctgt 1080

catgctcaat acatgactaa catgggctct attgcgtcgt tagctatggc agttataata 1140

aatggaaacg aagaagatgg taatggggtt aatactggag gaagaaactc gatgaggctt 1200

tggggtttag ttgtttgcca tcacacatca gctcgttgca taccttttcc tttgaggtac 1260

gcttgtgagt ttcttatgca ggcctttggc ttacagctaa acatggagtt gcagttagcc 1320

ttgcaggtgt ctgaaaaacg cgttctgaga atgcagacac tattatgtga tatgcttcta 1380

cgtgactcac cagcggggat tgtcacgcag aggcctagta tcatggattt agtaaaatgt 1440

aatggtgcgg catttcttta ccaagggaag tattatccgt tgggtgtgac tccaactgat 1500

tctcagatta atgacattgt ggagtggttg gttgctaacc attctgattc taccgggtta 1560

agcacagata gtttaggcga tgcgggttat cctcgggcag ctgctttggg agatgctgtg 1620

tgcggtatgg cagtcgcgtg tatcacaaaa agggacttcc ttttctggtt tcggtctcat 1680

actgagaaag aaatcaaatg gggaggggct aagcaccatc ctgaggacaa agatgatggt 1740

cagcggatga atccgcgttc ttcgttccag acttttctcg aagttgttaa gagccgatgt 1800

cagccatggg aaactgctga aatggacgcc attcactcgc tccagcttat tctaagagac 1860

tctttcaaag agtctgaagc gatggactct aaagctgctg cagctggggc ggttcagcca 1920

catggagatg atatggtaca gcaagggatg caggagatag gtgcagttgc aagagagatg 1980

gttaggctca ttgagactgc gacggttcct atatttgctg tggacataga cggttgcatc 2040

aatgggtgga acgccaagat cgcagagctg accggtcttt ctgttgaaga cgctatggga 2100

aagtcgctgg ttcgcgaatt gatatacaaa gagtacaaag aaacagttga taggcttctt 2160

tcttgtgctc tcaaagggga tgaaggcaag aatgtggagg tcaagctgaa aacttttggt 2220

tccgagctac aaggaaaagc aatgtttgtg gttgtcaacg catgttcaag caaggactac 2280

ttaaacaaca tcgttggagt ctgctttgtt ggacaagatg taactggtca taaaattgtt 2340

atggacaagt tcatcaacat acaaggtgat tacaaggcca tcatccatag cccgaaccct 2400

ctgatccctc caatctttgc agcggatgag aatacgtgct gccttgagtg gaacactgca 2460

atggaaaagc tcacaggctg gcctcgcagc gaagtgattg gaaaattact tgttagggaa 2520

gtatttggga gctattgcag actaaagggt cctgatgcgt taactaagtt catgatcgtc 2580

ttgcataacg cgatcggtgg ccaagatact gataaattcc cattcccgtt ctttgatcgc 2640

aaaggggaat tcattcaggc tctcctgact ttgaacaaac gggtcagcat cgatggcaaa 2700

atcattgggg ctttctgttt tttgcagata ccgagtcccg agctgcagca agctctagaa 2760

gttcagagga ggcaggagag tgaatatttc tcaaggagga aagagttggc ttacattttc 2820

caagttataa agaatccatt gagtggattg cgtttcacaa attcattgct ggaagacatg 2880

gatttaaacg aggatcagaa gcagcttctt gaaacgagtg tttcatgtga gaagcagatc 2940

tcaaagattg taggagacat ggacgtcaaa agcatagatg acggttcatt tctgctagag 3000

agaacagagt tcttcattgg caatgtcaca aatgcagtgg taagccaagt catgttggtg 3060

gtgagagaga gaaatctcca gctgatccgt aacattccca cggaggtcaa atccatggct 3120

gtctacggtg accagataag gctccaacag gttctcgcag aatttctgct aagtattgtc 3180

cgttatgcac ccatggaagg ctcggtagag ctccatctat gcccgactct gaaccaaatg 3240

gctgacggat tctccgctgt acgtttggag ttcagaatgg cgtgtgcagg ggaaggtgtg 3300

ccgccagaga aagtgcaaga catgttccat agtagccgat ggacaagtcc agaaggatta 3360

ggactaagcg tttgcagaaa gattttgaag ctgatgaacg gaggggttca gtacataaga 3420

gaattcgaac gctcttattt cctaatcgtt atcgaactcc cggttcctct aatgatgatg 3480

atgccctctt catga 3495

<210> 10

<211> 1164

<212> PRT

<213> 拟南芥

<400> 10

Met Val Ser Gly Gly Gly Ser Lys Thr Ser Gly Gly Glu Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ser Gly His Arg Arg Ser Arg His Thr Ser Ala Ala Glu Gln Ala Gln

20 25 30

Ser Ser Ala Asn Lys Ala Leu Arg Ser Gln Asn Gln Gln Pro Gln Asn

35 40 45

His Gly Gly Gly Thr Glu Ser Thr Asn Lys Ala Ile Gln Gln Tyr Thr

50 55 60

Val Asp Ala Arg Leu His Ala Val Phe Glu Gln Ser Gly Glu Ser Gly

65 70 75 80

Lys Ser Phe Asp Tyr Ser Gln Ser Leu Lys Thr Ala Pro Tyr Asp Ser

85 90 95

Ser Val Pro Glu Gln Gln Ile Thr Ala Tyr Leu Ser Arg Ile Gln Arg

100 105 110

Gly Gly Tyr Thr Gln Pro Phe Gly Cys Leu Ile Ala Val Glu Glu Ser

115 120 125

Thr Phe Thr Ile Ile Gly Tyr Ser Glu Asn Ala Arg Glu Met Leu Gly

130 135 140

Leu Met Ser Gln Ser Val Pro Ser Ile Glu Asp Lys Ser Glu Val Leu

145 150 155 160

Thr Ile Gly Thr Asp Leu Arg Ser Leu Phe Lys Ser Ser Ser Tyr Leu

165 170 175

Leu Leu Glu Arg Ala Phe Val Ala Arg Glu Ile Thr Leu Leu Asn Pro

180 185 190

Ile Trp Ile His Ser Asn Asn Thr Gly Lys Pro Phe Tyr Ala Ile Leu

195 200 205

His Arg Val Asp Val Gly Ile Leu Ile Asp Leu Glu Pro Ala Arg Thr

210 215 220

Glu Asp Pro Ala Leu Ser Ile Ala Gly Ala Val Gln Ser Gln Lys Leu

225 230 235 240

Ala Val Arg Ala Ile Ser His Leu Gln Ser Leu Pro Ser Gly Asp Ile

245 250 255

Lys Leu Leu Cys Asp Thr Val Val Glu Ser Val Arg Asp Leu Thr Gly

260 265 270

Tyr Asp Arg Val Met Val Tyr Lys Phe His Glu Asp Glu His Gly Glu

275 280 285

Val Val Ala Glu Ser Lys Arg Asn Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gly Leu

290 295 300

His Tyr Pro Ala Thr Asp Ile Pro Gln Ala Ser Arg Phe Leu Phe Lys

305 310 315 320

Gln Asn Arg Val Arg Met Ile Val Asp Cys Tyr Ala Ser Pro Val Arg

325 330 335

Val Val Gln Asp Asp Arg Leu Thr Gln Phe Ile Cys Leu Val Gly Ser

340 345 350

Thr Leu Arg Ala Pro His Gly Cys His Ala Gln Tyr Met Thr Asn Met

355 360 365

Gly Ser Ile Ala Ser Leu Ala Met Ala Val Ile Ile Asn Gly Asn Glu

370 375 380

Glu Asp Gly Asn Gly Val Asn Thr Gly Gly Arg Asn Ser Met Arg Leu

385 390 395 400

Trp Gly Leu Val Val Cys His His Thr Ser Ala Arg Cys Ile Pro Phe

405 410 415

Pro Leu Arg Tyr Ala Cys Glu Phe Leu Met Gln Ala Phe Gly Leu Gln

420 425 430

Leu Asn Met Glu Leu Gln Leu Ala Leu Gln Val Ser Glu Lys Arg Val

435 440 445

Leu Arg Met Gln Thr Leu Leu Cys Asp Met Leu Leu Arg Asp Ser Pro

450 455 460

Ala Gly Ile Val Thr Gln Arg Pro Ser Ile Met Asp Leu Val Lys Cys

465 470 475 480

Asn Gly Ala Ala Phe Leu Tyr Gln Gly Lys Tyr Tyr Pro Leu Gly Val

485 490 495

Thr Pro Thr Asp Ser Gln Ile Asn Asp Ile Val Glu Trp Leu Val Ala

500 505 510

Asn His Ser Asp Ser Thr Gly Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala

515 520 525

Gly Tyr Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Asp Ala Val Cys Gly Met Ala

530 535 540

Val Ala Cys Ile Thr Lys Arg Asp Phe Leu Phe Trp Phe Arg Ser His

545 550 555 560

Thr Glu Lys Glu Ile Lys Trp Gly Gly Ala Lys His His Pro Glu Asp

565 570 575

Lys Asp Asp Gly Gln Arg Met Asn Pro Arg Ser Ser Phe Gln Thr Phe

580 585 590

Leu Glu Val Val Lys Ser Arg Cys Gln Pro Trp Glu Thr Ala Glu Met

595 600 605

Asp Ala Ile His Ser Leu Gln Leu Ile Leu Arg Asp Ser Phe Lys Glu

610 615 620

Ser Glu Ala Met Asp Ser Lys Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Gln Pro

625 630 635 640

His Gly Asp Asp Met Val Gln Gln Gly Met Gln Glu Ile Gly Ala Val

645 650 655

Ala Arg Glu Met Val Arg Leu Ile Glu Thr Ala Thr Val Pro Ile Phe

660 665 670

Ala Val Asp Ile Asp Gly Cys Ile Asn Gly Trp Asn Ala Lys Ile Ala

675 680 685

Glu Leu Thr Gly Leu Ser Val Glu Asp Ala Met Gly Lys Ser Leu Val

690 695 700

Arg Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Tyr Lys Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu

705 710 715 720

Ser Cys Ala Leu Lys Gly Asp Glu Gly Lys Asn Val Glu Val Lys Leu

725 730 735

Lys Thr Phe Gly Ser Glu Leu Gln Gly Lys Ala Met Phe Val Val Val

740 745 750

Asn Ala Cys Ser Ser Lys Asp Tyr Leu Asn Asn Ile Val Gly Val Cys

755 760 765

Phe Val Gly Gln Asp Val Thr Gly His Lys Ile Val Met Asp Lys Phe

770 775 780

Ile Asn Ile Gln Gly Asp Tyr Lys Ala Ile Ile His Ser Pro Asn Pro

785 790 795 800

Leu Ile Pro Pro Ile Phe Ala Ala Asp Glu Asn Thr Cys Cys Leu Glu

805 810 815

Trp Asn Thr Ala Met Glu Lys Leu Thr Gly Trp Pro Arg Ser Glu Val

820 825 830

Ile Gly Lys Leu Leu Val Arg Glu Val Phe Gly Ser Tyr Cys Arg Leu

835 840 845

Lys Gly Pro Asp Ala Leu Thr Lys Phe Met Ile Val Leu His Asn Ala

850 855 860

Ile Gly Gly Gln Asp Thr Asp Lys Phe Pro Phe Pro Phe Phe Asp Arg

865 870 875 880

Lys Gly Glu Phe Ile Gln Ala Leu Leu Thr Leu Asn Lys Arg Val Ser

885 890 895

Ile Asp Gly Lys Ile Ile Gly Ala Phe Cys Phe Leu Gln Ile Pro Ser

900 905 910

Pro Glu Leu Gln Gln Ala Leu Glu Val Gln Arg Arg Gln Glu Ser Glu

915 920 925

Tyr Phe Ser Arg Arg Lys Glu Leu Ala Tyr Ile Phe Gln Val Ile Lys

930 935 940

Asn Pro Leu Ser Gly Leu Arg Phe Thr Asn Ser Leu Leu Glu Asp Met

945 950 955 960

Asp Leu Asn Glu Asp Gln Lys Gln Leu Leu Glu Thr Ser Val Ser Cys

965 970 975

Glu Lys Gln Ile Ser Lys Ile Val Gly Asp Met Asp Val Lys Ser Ile

980 985 990

Asp Asp Gly Ser Phe Leu Leu Glu Arg Thr Glu Phe Phe Ile Gly Asn

995 1000 1005

Val Thr Asn Ala Val Val Ser Gln Val Met Leu Val Val Arg Glu

1010 1015 1020

Arg Asn Leu Gln Leu Ile Arg Asn Ile Pro Thr Glu Val Lys Ser

1025 1030 1035

Met Ala Val Tyr Gly Asp Gln Ile Arg Leu Gln Gln Val Leu Ala

1040 1045 1050

Glu Phe Leu Leu Ser Ile Val Arg Tyr Ala Pro Met Glu Gly Ser

1055 1060 1065

Val Glu Leu His Leu Cys Pro Thr Leu Asn Gln Met Ala Asp Gly

1070 1075 1080

Phe Ser Ala Val Arg Leu Glu Phe Arg Met Ala Cys Ala Gly Glu

1085 1090 1095

Gly Val Pro Pro Glu Lys Val Gln Asp Met Phe His Ser Ser Arg

1100 1105 1110

Trp Thr Ser Pro Glu Gly Leu Gly Leu Ser Val Cys Arg Lys Ile

1115 1120 1125

Leu Lys Leu Met Asn Gly Gly Val Gln Tyr Ile Arg Glu Phe Glu

1130 1135 1140

Arg Ser Tyr Phe Leu Ile Val Ile Glu Leu Pro Val Pro Leu Met

1145 1150 1155

Met Met Met Pro Ser Ser

1160

Claims (53)

1.提高C₃植物光合作用能力的方法，所述方法包括改变C₃植物的可遗传的基因物质，以使感兴趣的基因(GOI)在C₃植物的至少一个维管鞘细胞中表达，并且其中所述GOI在基因表达调控元件的控制下表达，所述基因表达调控元件在C₃植物的至少一个维管鞘细胞中具有活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述GOI编码光敏色素B、其活性变体或其功能片段。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因表达调控元件在C₃植物的至少一个维管鞘细胞中具有特异性活性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中改变可遗传的基因物质包括将至少一种多核苷酸插入所述C₃植物的细胞的可遗传的基因物质中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中改变可遗传的基因物质包括使用碱基编辑器；可选地使用引导编辑器。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中改变可遗传的基因物质包括将基因修复寡聚核苷碱基(GRON)介导的突变引入C₃植物细胞的基因物质的靶标DNA序列中；可选地将C₃植物的细胞暴露于DNA切割器和GRON。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述DNA切割器包括大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指、抗生素或Cas蛋白。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中改变可遗传的基因物质包括使用锌指核酸酶(ZNF)和/或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)对C₃植物的细胞的可遗传的基因物质进行位点特异性同源重组。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中改变可遗传的基因物质包括使用病毒载体将供体模板引入C₃植物的细胞的可遗传的基因物质。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒载体包括蛋白质表达载体；可选地，其中所述蛋白质表达载体包括pQE或pET。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中一种或更多种多核苷酸包括编码CRISPR-Cas蛋白、可选地指导RNA(gRNA)的多核苷酸和包含基因表达调控元件序列的供体多核苷酸，其中所述gRNA将CRISPR-Cas蛋白引导到C₃植物的细胞基因组中GOI的至少一个拷贝的基因座上，由此插入所述基因表达调控元件，以使所述GOI的一个或多个拷贝在从所述细胞再生的植物的至少一个维管鞘细胞中表达。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述CRISPR-Cas蛋白和所述gRNA被预组装以形成核糖核蛋白(RNP)；可选地，其中所述RNP被转染到细胞中。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述RNP通过电穿孔转染到细胞中。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述CRISPR-Cas蛋白包括Cas9、Cas12a或Cas12b。

15.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中编码CRISPR-Cas蛋白的多核苷酸通过质粒引入。

16.根据权利要求4所述的方法，其中至少一种多核苷酸包括表达调控元件、编码GOI的核苷酸序列和可选地终止子；另一种多核苷酸编码CRISPR-Cas蛋白，并且所述的另一种多核苷酸或另外的再一种多核苷酸可选地编码gRNA，所述gRNA将CRISPR-Cas蛋白引导到C₃植物基因组中的所期望的基因座，从而在维管鞘调控元件控制下将异源GOI插入到C₃植物细胞中的所期望的基因座。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种多核苷酸从5’到3’包括表达调控元件、编码光敏色素B或其活性变体或其功能片段的核苷酸序列，以及可选地，终止子。

18.根据权利要求4所述的方法，其中至少一种多核苷酸从5’到3’包括在C₃植物的至少一些维管鞘细胞中具有特异性活性的表达调控元件、编码光敏色素B或其活性变体或其功能片段的核苷酸序列，从而使光敏色素B或其活性变体或其功能片段被插入C₃植物的基因组中。

19.分离的DNA多核苷酸，其从5’到3’包括在C₃植物的至少一些维管鞘细胞中具有特异性活性的表达调控元件、编码光敏色素B或其活性变体或其功能片段的核苷酸序列，以及可选地，终止子。

20.根据权利要求19所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述调控元件包括启动子。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述启动子是束鞘细胞特异性启动子和/或内束鞘特异性启动子或在整个维管束中具有活性的启动子。

22.根据权利要求21中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述束鞘特异性启动子或内束鞘特异性启动子或在整个维管束中具有活性的启动子是合成启动子；优选包括启动子上游的束鞘或内束鞘特异性转录因子结合元件；可选地，其中存在两个或更多个转录因子结合元件。

23.根据权利要求21至22中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述束鞘特异性启动子或内束鞘特异性启动子或在整个维管束中具有活性的启动子选自最小ZmUbi1启动子、NOS核心启动子、CHSA核心启动子和最小35S启动子；优选地，其中启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:10，或SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或与之有至少80％同一性的序列。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述束鞘特异性启动子或内束鞘特异性启动子或在整个维管束中具有活性的启动子分别来源于束鞘特异性基因或内束鞘特异性基因。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述束鞘特异性基因来自植物物种；包括但不限于：拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYB76、三脉黄顶菊(Flaveria trinervia)GLDP、拟南芥SULTR2；2、拟南芥SCR、拟南芥SCRL23、结缕草(Zoysiajaponica)PCK、类黍尾稃草(Urochloa panicoides)PCK1和大麦(Hordeumvulgare)PHT1；1。

26.根据权利要求19至25中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述启动子来源于非植物生物体，例如水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子。

27.根据权利要求19至26中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中编码光敏色素B的核苷酸序列是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11中的任何一个，或与其中任何一个序列具有至少65％的同一性的序列或其功能片段；优选与其中任何一个序列具有至少70％的同一性的序列或其功能片段；更优选与其中任何一个序列具有至少80％的同一性的序列或其功能片段。

28.根据权利要求19至27中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中光敏色素B的功能片段具有光敏色素信号传导活性，但缺乏光敏感性；优选地，其中所述功能片段由PAS和GAF结构域组成。

29.根据权利要求19至28中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，其中所述光敏色素B对光不敏感；优选YHB，编码光敏色素B的核苷酸序列是SEQ ID NO:1，或与之具有至少70％的同一性的序列或其功能片段。

30.质粒，其包含根据权利要求17至29中任一项所述的DNA多核苷酸、复制原点、Ti或Ri质粒的T-DNA右边界重复；可选地另外包括Ti或Ri质粒的左边界重复，以及至少一种细菌可选择标记。

31.根据权利要求30所述的质粒，进一步包含选自以下一项或多项的元件：增强子、植物可选择标记、多克隆位点或重组位点。

32.Ti或Ri质粒，其包含根据权利要求17至29中任一项所述的DNA多核苷酸。

33.用于转化植物细胞的组合物，其包含根据权利要求19至29中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，或根据权利要求30至32中任一项所述的质粒；可选地包括包被有所述DNA多核苷酸或所述质粒的微粒子。

34.细菌，其包含根据权利要求19至29中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，或根据权利要求30至32中任一项所述的质粒；可选地，其中所述细菌是大肠杆菌。

35.细菌，其包含根据权利要求30至32中任一项所述的质粒；优选地，其中所述细菌是农杆菌属，更优选地是根癌农杆菌。

36.在其至少一部分进行C₃光合作用的植物，所述植物包含根据权利要求19至29中任一项所述的分离的DNA多核苷酸，所述DNA多核苷酸稳定地整合到其基因组中；优选可遗传地整合到其基因组中。

37.在其的至少一部分进行C₃光合作用的植物，其中所述植物具有额外的光敏色素B基因或其功能片段的至少一个额外拷贝，并且其中所述植物与基因上等同的未改变的植物相比是基因改变的，其中与未改变的植物相比，改变的植物中光敏色素B基因或其功能片段的至少一个拷贝的表达调控元件导致额外的至少一个光敏色素B基因或其功能片段在植物的至少一些束鞘细胞和/或内束鞘细胞和/或维管束中特异性表达。

38.根据权利要求37所述的植物，其中所述表达调控元件是启动子，所述启动子在C₃植物的至少一些维管鞘细胞中具有特异性活性。

39.根据权利要求37或38所述的植物，其中所述额外的至少一个光敏色素B基因的编码序列与植物中的一个或多个天然光敏色素B基因相同。

40.根据权利要求37或38所述的植物，其中所述额外的至少一个光敏色素B基因与植物中的一个或多个天然光敏色素B基因不同；可选地，其中所述光敏色素B或其活性变体或功能片段如权利要求27至30中的任一项所定义。

41.通过CRISPR-Cas蛋白基因修饰过程获得的根据权利要求37至40中任一项所述的植物。

42.根据权利要求37至41中任一项所述的植物，其中基因修饰是可遗传地稳定的。

43.根据权利要求36至42中任一项所述的植物，其为C₃植物；优选为作物植物，例如谷类作物植物、油料作物植物或豆类。

44.根据权利要求37至43中任一项所述的植物，其中所述光敏色素B具有SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:12中的任何一个的氨基酸序列，或与其中任何一个序列具有至少65％的同一性的序列或其功能片段；优选与其中任何一个序列具有至少70％的同一性的序列或其功能片段；更优选与其中任何一个序列具有至少80％的同一性的序列或其功能片段。

45.根据权利要求37至44中任一项所述的植物，其中光敏色素B的功能片段具有光敏色素信号传导活性，但缺乏光敏感性；优选地，其中所述片段由PAS和GAF结构域组成。

46.根据权利要求37至45中任一项所述的植物，其中所述光敏色素B是光不敏感的序列变体或其功能片段；优选为具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12的氨基酸序列或与其具有至少70％的同一性的序列的YHB或其功能片段。

47.根据权利要求37至46中任一项所述的植物，其中与在相同条件下生长了相同时间段的未修饰的对照植物的同等维管鞘细胞中的叶绿体相比，存在于维管鞘细胞中的叶绿体在大小或光合作用能力方面得到发育上的增强。

48.根据权利要求36至47中任一项所述的植物，其中与在相同条件下生长的未修饰的对照植物相比，光合作用得到增强。

49.根据权利要求36至48中任一项所述的植物，其中叶片的光合作用效率大于在相同条件下生长的未修饰的对照植物的一个或多个等同叶片。

50.根据权利要求36至49中任一项所述的植物，其中水利用效率大于在相同条件下生长的未修饰的对照植物中的水利用效率。

51.根据权利要求36至49中任一项所述的植物，其中与在相同条件下生长的未修饰的对照植物相比，增强的光合作用导致以下一个或多个性状：增强的生长速率、缩短的开花时间、更快的成熟、增强的种子产量、增强的生物质、增加的植物高度和增强的叶冠面积。

52.植物部分、植物组织、植物器官、植物细胞、植物原生质体、胚、愈伤组织培养物、花粉粒或种子，其来源于或获得自根据权利要求36至51中任一项所述的植物。

53.从根据权利要求36至49中任一项所述的植物或根据权利要求52所述的植物部分、植物组织、植物器官、植物细胞、植物原生质体、胚、愈伤组织培养物、花粉粒或种子获得的加工植物产品；可选地，其中所述加工产品包括可检测到的以下核酸序列：(i)位于在植物的至少一些维管鞘细胞中具有特异性活性的基因表达调控元件下游的光敏色素B或其活性片段，或(ii)根据权利要求19至29中任一项所述的多核苷酸的至少一部分。

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