MX2014007711A

MX2014007711A - Metodos para mejorar rendimiento de cultivos.

Info

Publication number: MX2014007711A
Application number: MX2014007711A
Authority: MX
Inventors: Zhicheng Shen; Xianwen Zhang; Dongfang Wang; Jianhua Gao
Original assignee: Hangzhou Ruifeng Biotechnology Ltd Inc
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-11-10
Also published as: WO2013091563A1; KR20140107356A; BR112014015360A8; US10072271B2; EP2794883A1; JP2015500651A; AU2012357243A1; US20160010100A1; CN104093840A; CA2858862A1; EP2794883A4; BR112014015360A2

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para incrementar un crecimiento o rendimiento vegetal. Las composiciones comprenden el gen de alto rendimiento (tipo earl terminal (TEL)), promotores e intensificaciones para incrementar la expresión de un gen TEL en una planta de interés. La invención reconoce que al mejorar la expresión de al menos un gen TEL en una planta se da por resultado una mejora en el rendimiento y crecimiento vegetal, dando por resultado un incremento en el rendimiento de cultivo en un campo plantado con estas plantas. Por la invención se abarca cualquier método para incrementar la expresión de un gen TEL en una planta. Una planta de interés se puede transformar con una construcción de ADN que comprende un promotor que es capaz de activar la expresión en la planta operablemente enlazado a una secuencia codificadora para un gen TEL. Opcionalmente, la construcción de ADN puede comprender al menos un intensificador que actúa para incrementar la expresión de la secuencia codificadora TEL. En otra modalidad, se puede insertar un promotor o intensificar en el genoma de la planta de interés en un sitio que incrementa la expresión de la secuencia codificadora TEL endógena en la planta.

Description

i MÉTODOS PARA MEJORAR RENDIMIENTO DE CULTIVOS Campo de la Invención

[0001] Esta invención está relacionada al campo de la biología molecular. Se proporcionan métodos para mejorar el rendimiento y crecimiento vegetal.

Antecedentes de la Invención

[0002] La creciente población mundial ha hecho de la mejora del rendimiento de cultivos un importante objetivo de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras hortícolas y de cultivo utilizan técnicas de reproducción selectivas para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, estas técnicas de reproducción selectiva tienen varias desventajas, específicamente, estas técnicas son típicamente de labor intensa y dan por resultado plantas que contienen frecuentemente componentes genéticos heterogéneos que no siempre dan por resultado que se herede el rasgo deseable las plantas de origen. El rendimiento se ha considerado un rasgo multi-génico durante muchas décadas. Se ha hecho algún progreso para mejorar el rendimiento mediante reproducción tradicional de plantas. Estos métodos comprenden cruzar individuos relacionados de forma cercana o distante para producir una nueva variedad o línea de cultivo con propiedades deseables. La biotecnología vegetal ha ayudado a mejorar el rendimiento de cultivo al desarrollar plantas que son resistentes a enfermedades y plagas. Adicionalmente, las plantas transgénicas resistentes a herbicidas han ayudado a incrementar el rendimiento de cultivos.

[0003] La domesticación de muchas plantas se ha correlacionado con incrementos dramáticos en el rendimiento. La variación más fenotipica que se presenta en las poblaciones naturales es continua y se efectúa por múltiples influencias génicas. La identificación de genes específicos responsables de las dramáticas diferencias en el rendimiento, en las plantas domesticadas, ha llegado a ser importante enfoque de la investigación agrícola. El rendimiento de semillas es un rasgo particularmente importante puesto que las semillas de muchas plantas son importantes para nutrición humana y animal. Los cultivos tal como, arroz, maíz, trigo, cañóla y soya dan cuenta de la mitad de la ingestión calórica humana total, ya sea a través del consumo directo de las semillas mismas o a través del consumo de productos cárnicos criados de semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchas clases de metabolitos usados en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de los nuevos brotes y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla comprende muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos desde las raices, hojas y tallos a la semilla en crecimiento. El endosperma, en particular, asimila los precursores metabólicos de los carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para rellenar el grano. La capacidad para incrementar el rendimiento vegetal tendría muchas aplicaciones en áreas tal como la agricultura, incluyendo en la producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura y silvicultura. El incremento del rendimiento también puede encontrar uso en la producción de algas para el uso en biorreactores (para la producción biotecnológica de sustancias tal como compuestos farmacéuticos, anticuerpos o vacunas, o para la bioconversión de desperdicios orgánicos) y otras áreas por el estilo.

[0004] Mei2 es un importante gen en la promoción de la meiosis en Schizoacccharomyces pombe. La presencia de genes tipo mei2 en plantas se reveló primero mediante la identificación y caracterización de Arabidopsis-mei2-likel (AMLl) . Se expresa AML1 en varios tejidos, incluyendo hojas, raíces, flores y silicuas. Del maíz se ha aislado un gen tipo mei2 y se llamó gen earl terminal (TE1). En la caracterización, el gen del maíz se indicó en el plastocrono e inicio de hojas en el meristemo al regular negativamente el número y posición de los sitios del inicio de hojas. Los estudios han revelado que los genes tipo mei2 están propagados en plantas donde constituyen un grupo diversificado. Un Mei2 es una proteina que contiene tres motivos de reconocimiento de ARN (RRM, por sus siglas en inglés) , y es capaz de unirse a los ARN. También en las plantas se han identificado homólogos de Mei2.

[0005] El incremento de rendimiento en cultivos es de gran importancia para la agricultura. El desarrollo de variedades vegetales de rendimiento mejorado ha sido uno de los objetivos más importantes para desarrollos de variedades vegetales de varios cultivos. Aunque se ha logrado progreso en la mejora del rendimiento de cultivos mediante reproducción tradicional, aun son altamente deseables nuevos métodos para mejorar el rendimiento de cultivos para mejorar adicionalmente el rendimiento de varios cultivos. Por lo tanto, se necesitan métodos para incrementar el rendimiento.

Breve Descripción de la Invención

[0006] Se proporcionan composiciones y métodos para incrementar el crecimiento y rendimiento vegetal. Las composiciones comprenden el gen de alto rendimiento (gen tipo earl terminal (TEL) ) , promotores e intensificadores para incrementar la expresión de un gen TEL en una planta de interés.

La invención reconoce que al mejorar la expresión de al menos un gen TEL en una planta se da por resultado una mejora en el crecimiento y rendimiento vegetal, dando por resultado en un incremento en el rendimiento de cultivo en un campo plantado con estas plantas. Cualquier método para incrementar la expresión de un gen TEL en una planta se abarca por la presente invención. Se puede transformar una planta de interés con una construcción de ADN que comprende un promotor que es capaz de activar la expresión en la planta operablemente enlazada a una secuencia codificadora del gen TEL. Opcionalmente , la construcción de ADN puede comprender al menos uno intensificador que actúe para incrementar la expresión de la secuencia codificadora de TEL. En otra modalidad, se puede insertar un promotor o intensificador en el genoma de la planta de interés en un sitio que incrementa la expresión de la secuencia codificadora endógena de TEL en la planta .

[0007] Las composiciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para secuencias para polipéptidos TEL, secuencias para promotores y/o para intensificadores , vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, y células hospedadoras que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos TEL y anticuerpos para estos polipéptidos. Las secuencias de nucleótidos se pueden usar en construcciones de ADN o casetes de expresión para la transformación y expresión en plantas de interés. Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para la expresión en una planta particular. Las composiciones también comprenden plantas transformadas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas vegetales.

[0008] De esta manera, la presente invención se refiere en general al campo de biología molecular y se refiere a un método para incrementar el rendimiento vegetal con relación a plantas de control. De manera más específica, la presente invención se refiere a un método para incrementar el rendimiento vegetal el cual comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica para el gen TEL o un homólogo del mismo. La presente invención también se refiere a plantas que tienen expresión elevada de un ácido nucleico que codifica para el gen TEL, o un homólogo del mismo, plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a plantas de control. La invención también proporciona construcciones útiles en los métodos de la invención.

[0009] En particular, se proporcionan métodos para mejorar la expresión de una secuencia codificadora TEL en una planta de interés. Esta expresión mejorada da por resultado crecimiento incrementado de la planta, producción incrementada de semillas y rendimiento incrementado. También se describen métodos y equipos para detectar los ácidos nucleicos y polipéptidos TEL en una muestra .

[0010] Se abarcan las siguientes modalidades por la presente invención :

[0011] 1. Un método para incrementar el rendimiento y/o crecimiento vegetal en una planta de interés, el método que comprende incrementar la expresión de una secuencia TEL en la planta .

[0012] 2. El método de la modalidad 1, en donde el método comprende transformar la planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en una planta operablemente enlazado a una de nucleótidos TEL en donde la secuencia TEL codifica para una proteina que comprende un aminoácido que tiene al menos una de las siguientes características : i) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4 ; ii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; iii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; iv) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; v) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) de TEL en el cual están conservados al menos 3 de los 4 residuos Asn-His-Cys-Ile en la planta; vi) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo conservado especifico de TEL fuera del C-término del dominio RRM3 y en donde al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido están conservados: Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/Glu-N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo); vii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la proteína TEL de arroz; viii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a la proteína TEL de arroz; y, ix) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz.

[0013] 3. El método de la modalidad 2, en donde la construcción de ADN comprende adicionalmente al menos un intensificador que mejora la expresión de un gen en una planta operablemente enlazado al promotor y la secuencia TEL.

[0014] 4. El método de la modalidad 3, en donde el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) .

[0015] 5. El método de cualquiera de las modalidades 1-4, en donde la secuencia TEL es una secuencia sintética.

[0016] 6. El método de cualquiera de las modalidades 2-5, en donde el promotor es un promotor TEL.

[0017] 7. El método de cualquiera de las modalidades 2-6, en donde la secuencia TEL tiene al menos 58% de identidad con SEQ ID NO: 4 y comprende al menos un motivo TEL.

[0018] 8. El método de cualquiera de las modalidades 1-7, en donde la expresión de una secuencia TEL se incrementa al menos dos veces hasta al menos 50 veces.

[0019] 9. Un cásete de expresión que comprende una construcción de ADN, la construcción que comprende un promotor que activa la expresión en una planta operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos de TEL y además operablemente enlazado a al menos un intensificador que mejora o intensifica la expresión en una planta, en donde la secuencia TEL codifica para una proteina que comprende un aminoácido que tiene al menos una de las siguientes características: i) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; ii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4 ; iii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; iv) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4 ; v) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) de TEL en la cual están conservados al menos 3 de los 4 residuos de Asn-His-Cys-Ile en la planta; vi) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo conservado especifico de TEL fuera del C-término del dominio RR 3 y en donde están conservados al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido: Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/ Glu-N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo) ; vii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; viii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; y, ix) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a la proteina TE1 de arroz.

[0020] 10. El cásete de expresión de la modalidad 9, en donde el intensificador es un intensificador 35S de CaMV.

[0021] 11. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-10, en donde la secuencia TEL es una secuencia sintética .

[0022] 12. El cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-11, en donde el promotor es un promotor TEL.

[0023] 13. Una planta transformada con el cásete de expresión de cualquiera de las modalidades 9-12.

[0024] 14. Una semilla transformada de la planta de la modalidad 13.

[0025] 15. El método de la modalidad 1, en donde la secuencia TEL es una secuencia endógena.

[0026] 16. El método de la modalidad 15, en donde la planta de interés tiene al menos un intensificador incorporado en su genoma dentro de aproximadamente 30kb del gen TEL.

[0027] 17. El método de la modalidad 16, en donde el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S de Ca V.

[0028] 18. El método de cualquiera de las modalidades 15-17, en donde la expresión de la secuencia TEL se mejora al menos dos veces hasta a al menos 50 veces.

[0029] 19. una planta transformada que exhibe expresión incrementada de una secuencia de TEL, en comparación a una planta de control.

[0030] 20. La planta transformada de la modalidad 19, en donde la planta tiene incorporada de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en una planta operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos de TEL en donde la secuencia TEL codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una de las siguientes características: i) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; ii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; iii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; iv) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4 ; v) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) de TE1 en la cual están conservados al menos 3 de los 4 residuos Asn-His-Cys-Ile en la planta; vi) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo conservado especifico de TEL fuera del C-término del dominio RRM3 y en donde al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido están conservados: Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/Glu N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo) ; vii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; viii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; y, ix) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz.

[0031] 21. La planta transformada de la modalidad 20, en donde la construcción de ADN comprende adicionalmente al menos un intensificador que mejora o intensifica la expresión de un gen en una planta operablemente enlazada a la secuencia TEL.

[0032] 22. La planta transformada de la modalidad 21, en donde el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S de CaMV.

[0033] 23. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 20-22, en donde la secuencia TEL es una secuencia sintética .

[0034] 24. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 20-23, en donde el promotor es un promotor TEL.

[0035] 25. La planta transformada de la modalidad 24, en donde el promotor TEL es homólogo a la secuencia TEL.

[0036] 26. La transformada de cualquiera de las modalidades 19-25, en donde la expresión de la secuencia TEL se incrementa al menos dos veces hasta al menos 50 veces.

[0037] 27. La planta transformada de la modalidad 19, en donde la secuencia TEL es una secuencia endógena.

[0038] 28. La planta transformada de las modalidades anteriores, en donde la planta de interés tiene al menos un intensificador incorporado en su genoma dentro de aproximadamente 30kb del gen TEL.

[0039] 29. La planta transformada de la modalidad 28, en donde el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S de CaMV.

[0040] 30. La planta transformada de cualquiera de las modalidades 27-29, en donde la expresión de la secuencia TEL se incrementa al menos dos veces hasta al menos 50 veces.

[0041] 31. Semilla transformada de la planta de cualquiera de las modalidades 19-30.

[0042] 32. La planta transgénica de cualquiera de las modalidades 19-30, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de maiz, sorgo, trigo, cruciferas, algodón, arroz, soya, cebada, girasol, azúcar de caña, coniferas, Miscanthus, césped de pradera, y colza oleaginosa.

[0043] 33. La planta de cualquiera de las modalidades 13, 14, y 20-32, en donde la planta es una monocotiledónea .

[0044] 34. La planta de cualquiera de las modalidades 13, 14, y 20-34, en donde la planta es una dicotiledónea.

Breve Descripción de las Figuras

[0045] Figura 1. Dendrograma de proteínas tipo Mei2 vegetales. Se llevaron a cabo la alineación de secuencias y la construcción del dendrograma usando un programa proporcionado por Vector NTI. La proteína tipo Mei2 de la alga verde Unicelular Ostreococcus tauri (SEQ ID NO: 44) se usó como la secuencia de raíz. AtML-2 y AtML-4 son la proteína AML de Arabidopsis thaliana; GmML-2, GmML 4 , GmML-5 , GmML-6, y GmML-7 son la proteína AML de soya (Glycine max) ; OsML-2, OsML-3 y OSML-5 (GenPept AP005651.3) son la proteína AML de arroz (Oryza sativa) . Physcomitrelia TE1 y Physcomitrella TE2 son las proteínas TEL de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 42) ; Glicina TE1 y glicina TE2 son las dos proteínas TEL de soya (SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, respectivamente) ; Ricinus TE es la proteína TEL de Ricinus communis (SEQ ID NO: 30) ; Populus TE1 es la proteína TEL de Populus trichocarpa (SEQ ID NO: 32) ; Populus TE2 es la proteína TEL de Populus canescens (SEQ ID NO: 34); Brassica TE1 es el gen TE de Brassica rapa (SEQ ID NO: 46); Arabidopsis TE1 y Arabidopsis TE2 son las dos proteínas TEL de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente); Selaginella TE1 (SEQ ID NO: 36) y Selaginella TE2 son la proteína TEL de Selaginella Moellendorffii ; Sorgo TEL es la proteina TEL de Sorghum bicolor (EES01930, SEQ ID NO: 8); Zea TEL es la proteina TEL de Zea mays (AF047852, SEQ ID NO: 6); Oryza TEL es la proteina TEL de Oryza sativa (SEQ ID NO: 2); Vitis TE1 es una proteina TEL de Vitis vinifera (XP_002271386, SEQ ID NO: 40); Brachypodium TE es TEL de Brachypodium (SEQ ID NO: 12); Triticum TE es TEL de trigo Triticum aestivum L. (SEQ ID NO: 10); Gossypium TE es un TEL de cottin Gossypium hirsutum (SEQ ID NO: 18) .

[0046] Figura 2: Alineación del motivo conservador de proteínas tipo Mei2 vegetales. OsTE : TEL de Oryza sativa (SEQ ID NO: 2); GmTELl : TEL . de Glycine max (SEQ ID NO: 14) ; GmTEL2 : TEL de Glycine max (SEQ ID NO: 16) ; AtTELl : TEL de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 22; AtTEL2 : TEL de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 24); PtaTELl: TEL de Populus trémula x Populus alba (SEQ ID NO: 32); PtaTEL2 : TEL de Populus trémula x Populus alba (SEQ ID NO: 34); VvTELl: Vitis vinifera TELl (SEQ ID NO: 40); VvTE12 : TEL de Vitis vinifera (SEQ ID NO: 38); ZmTEL: TEL de Zea mays (SEQ ID NO: 6); SbTEL: TEL de Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 8); SmTEL: TEL de Selaginella moellendorffii (SEQ ID NO: 36); RcTE: TEL de Ricinus communis (SEQ ID NO: 30); OtMei2L: gen tipo ei2 de Ostreococcus tauri (SEQ ID No: 44); A1TEL1: TEL de Arabidopsis lyrata (SEQ ID NO: 26); BrTEL: TEL de Brassica rapa (SEQ ID NO:46) ; GhTELl : TEL de Gossypium hirsutum (SEQ ID NO:18).

[0047] Figura 3: Diagrama de estructura genómica alrededor de la inserción de ADN-T del evento HAS-20. La inserción de ADN-T se localiza aproximadamente 5 kb en la dirección 3' del gen OsTEL.

[0048] Figura 4: Diagrama de ADN-T usado para transformación vegetal. El cásete de expresión del gen OsTEL nativo se compone del promotor (pOsTEL) , la secuencia codificadora de proteina y el terminador (OsTEL-ter) , y su secuencia de polinucleótido completa se muestra en SEQ ID NO: 1. En especifico, p35S representa el promotor 35S de Ca V; pUbi representa el promotor de ubiquitina de maíz; EPSPS-ter representa el gen de tolerancia al glifosato GlOevo (EPSPS) y su terminador. (A): pCambial300-35S-G10-OsTEL; (B) : pCambial300-G10-OsTEL; (C) : pCambia 1300-G10- p35S-Ostel. Las secuencias de polinucleótido de los vectores pCambial300-35s-G10 y pCambial300-G10 se muestran como SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 49, respectivamente.

[0049] Figura 5: Diagrama de ADN-T de vector pCambial300-35S- GlO-ZmTLE para transformación de maíz. El gen ZmTEL de maíz incluye el promotor (pZmTEL) , la secuencia codificadora de proteína y el terminador (ZmTEL-ter) , y su secuencia de polinucleótido completa se muestra como SEQ ID NO: 5.

[0050] Figura 6: Diagrama de estructura de ADN-T para transformación de algodón. A: pCambial300-35S-G10-GhTLEl ; B: pCambial300-35S-G10-GhTEL2. Ambos genes GhTELl y GhTEL2 incluyen los promotores (pGhTELl y pGhTEL2), la secuencia codificadora de proteina y un terminador (GhTELl-ter y GhTEL2-ter) . Las secuencias de polinucleótido completas de los casetes de expresión se muestran como SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 19, respectivamente.

[0051] Figura 7: Diagrama de estructura de ADN-T de los vectores pCambial300-35S-G10-AtTELl (A) y pCambial300-35S-G10-AtTEL2 (B) para transformación de cañóla. Los genes AtTELl y AtTEL2 de Arabidopsis thaliana incluyen ambos los promotores (pAtTELl y pAtTEL2 ) , las secuencias codificadoras de proteina y los terminadores (AtTELl-ter y AtTEL2-ter) , y sus secuencias de polinucleótido completas se muestran como SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23, respectivamente.

[0052] Figura 8: Estructura de ADN-T de vector pCambial300-35S-G10-BrTEL para transformación de cañóla. El gen BrTEL incluye el promotor (pBrTEL) , la secuencia codificadora a proteina y el terminador (BrTEL-ter) , y su secuencia de polinucleótido completa se muestra como SEQ ID NO: 45.

[0053] Figura 9: Estructura de ADN-T de vector de transformación de trigo pCambial300-35S-G10-TaTEL . El gen TaTEL de trigo incluye el promotor (pTaTEL) , la secuencia codificadora de proteina y el terminador (TaTEL-ter) , y su secuencia de polinucleótido completa se muestra como SEQ ID NO: 9.

[0054] Figura 10: Estructuras de ADN-T de vectores de transformación de soya pCambial300-35S-G10-GmTLEl (A) y pCambial300-35S-G10-GmTEL2 (B) . Los genes GmTELl y GmTEL2 de soya incluyen ambos los promotores (pGmTELl y pGmTEL2 ) , las secuencias codificadoras de proteina y los terminadores (GmTELl-ter y GmTEL2-ter) , y sus secuencias de polinucleótido completas se muestran como SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15, respectivamente.

[0055] Figura 11: Una comparación de los fenotipos del arroz transgénico (T) con el gen OsTEL-1 y la linea parental no transgénica "Xiushui 134" (CK) . En comparación a las plantas de control (CK) , las lineas transgénicas (T) mostraron altura incrementada significativa de planta (ver A) , y semillas agrandadas (ver B) y panojas (ver C) .

[0056] Figura 12: Una comparación de los fenotipos del maíz transgénico (T) con el gen ZmTEL y la linea parental no transgénica en el ejemplo 5. En comparación a las plantas de control (CK) , las lineas transgénicas (T) mostraron altura incrementada significativa de planta (ver B) , y semillas y olotes agrandados (ver A) .

Descripción Detallada de la Invención

[0057] La presente invención se refiere a métodos para incrementar la expresión de un gen TEL o secuencia codificadora en plantas o células vegetales. Al incrementar o mejorar la expresión de una secuencia TEL en la planta, la planta exhibe una mejora en el crecimiento vegetal y por lo tanto el rendimiento del cultivo. Por "secuencia TEL" se propone una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una de las siguientes características: codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 4; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) de TEL en el cual están conservados al menos 3 de los 4 residuos Asn-His-Cys-Ile en la planta; codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo conservado específico de TEL fuera del C-término del dominio RRM3 y donde al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido están conservados: Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/Glu-N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo) ; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; y, codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz.

[0058] Es decir, una secuencia TEL de la invención comprende al menos el motivo RRM3 y al menos aproximadamente 15 aminoácidos adicionales, al menos aproximadamente 20 aminoácidos adicionales, al menos aproximadamente 25 aminoácidos adicionales, al menos aproximadamente 30 aminoácidos adicionales, al menos aproximadamente 40 aminoácidos adicionales, al menos aproximadamente 50 aminoácidos adicionales, hasta la secuencia TEL de longitud completa. En una modalidad, la secuencia TEL codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos : dtrttvmirnipnkysqklllnmldnhcilsnqqieascedeaqpfssydfly lpidfnnkcnvgygfvnltspeaavrlykafhkqpwevfnsrkicqvtyarvqgldalkehfkns kfpcdsdeylpvvfspprdgklltepvpl SEQ ID NO: 62. En otras modalidades, la secuencia TEL comprende una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 62.

[0059] El RRM C-terminal (RRM3) es único en las proteínas tipo Mei2-y es el más altamente conservado de los tres RRM. RRM3 también contiene elementos conservados de secuencia en su C-término no encontrados en los otros dominios RRM. Ver Jeffares et al. (2004) Genes Dev Evol. 214 (3) : 149-58.

[0060] Un incremento en la expresión de la secuencia TEL da por resultado un incremento en el crecimiento, resistencia, vigor, y rendimiento de plantas sin reducción en el índice de recolección. Las plantas transformadas son más altas, tienen tallos o cañas más grandes, crecen más rápido, exhiben vigor de crecimiento, producen mayor biomasa, y tienen producción incrementada de semillas. Las plantas contienen raíces más grandes y más fuertes. La plantación de un campo de plantas transformadas de la invención dará por resultado rendimiento incrementado de cultivo. Por "rendimiento de cultivo" se propone la cantidad de un cultivo que se recolecta por unidad de área de tierra. El rendimiento de cultivo es la medición frecuentemente usada para un cereal, grano o legumbre y normalmente se mide en toneladas métricas por hectárea (o kilogramos por hectárea) . El rendimiento del cultivo también se refiere a la generación real de semillas de la planta. Por "crecimiento vegetal" se propone el tamaño, altura, circunferencia, resistencia, masa, número de semillas, de la planta, producidas, y similares.

[0061] Los métodos comprenden incrementar o mejorar la expresión de un gen TEL en una planta de interés. Cualquier método para incrementar la expresión de un gen TEL en una planta se abarca por la presente invención. Una planta de interés se puede transformar con una construcción de ADN que comprende un promotor que es capaz de activar la expresión en la planta operablemente enlazado a una secuencia codificadora para un gen TEL o una variante o truncamiento del mismo. Opcionalmente, la construcción de ADN puede comprender al menos un intensificador operablemente enlazado que actúa para incrementar la expresión de la secuencia codificadora. En otra modalidad, se puede insertar un promotor o intensificador en el genoma de la planta de interés en un sitio que incrementa la expresión de la secuencia codificadora TEL nativa en la planta.

[0062] Al mejorar o incrementar la expresión de una secuencia TEL en plantas, se observa un incremento en el crecimiento vegetal, producción de semillas, y rendimiento en general. Por "mejorar o incrementar la expresión de un gen TEL" se propone que la expresión como se mide por la producción de ARNm o proteina TEL se incremente al menos aproximadamente dos veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 60 veces, aproximadamente 70 veces, aproximadamente 80 veces o mayor en la planta de interés en comparación a una planta de control. Por "planta de control" se propone una planta donde no se ha alterado ni mejorado la expresión de una secuencia TEL o que no se ha transformado con una secuencia TEL adicional, es decir, una planta o célula vegetal genéticamente idéntica a la planta o célula vegetal sujeta pero que no se ha expuesto a condiciones o estímulos que inducirán la expresión del gen TEL. Es decir, la planta modificada de la invención exhibe expresión mejorada del ARNm de TEL, la proteína TEL, o ambas.

[0063] En tanto que no se une por ninguna teoría, se cree que la sobreproducción extrema de la proteína TEL puede dar por resultado plantas con fenotipos indeseables. Por lo tanto, se puede controlar la expresión mediante la selección de los promotores usados para activar la expresión de una secuencia TEL en una planta transformada. Los promotores TEL proporcionan buenos resultados al expresar el gen recombinante a niveles deseados. Como se analiza más adelante, se puede usar cualquier promotor, incluyendo promotores constitutivos fuertes. Sin embargo, en aquellos casos donde se usen promotores fuertes, se puede seleccionar una planta resultante en base al fenotipo deseado. De esta manera, los métodos de la invención comprenden la selección del fenotipo deseado de la planta transformada. Estas plantas deseadas exhibirán crecimiento y vigor incrementado, resistencia incrementada con tallos y raices más grandes o rendimiento incrementado del grano o biomasa. En tanto que se pueden seleccionar plantas transformadas deseadas con base a los fenotipos, se cree que estas plantas mostraron al menos un incremento de dos veces a 60 veces en la expresión de TEL, al menos un incremento de 10 veces a 50 veces en la expresión, o al menos un incremento de 20 veces, al menos un incremento de 30 veces, o al menos un incremento de 40 veces en la expresión.

[0064] Estas plantas deseadas se pueden cultivar y cruzar con plantas adecuadas para producir semillas que tienen el fenotipo deseado. Es decir, el gen TEL recombinante o el gen TEL endógeno cuya expresión se ha incrementado por la inserción de al menos un intensificador se puede reproducir en las plantas de interés. Estas plantas crecerán y producirán un cultivo con un rendimiento mejorado.

[0065] Por "gen TEL" o secuencia TEL "se propone una secuencia que codifica para la secuencia completa de aminoácidos de la proteina TEL o variantes o truncamientos de la proteina TEL.

Estos truncamientos comprenderán la región conservada RRM3 analizada anteriormente. Los genes TEL usados en la transformación de plantas de interés pueden ser homólogos o heterólogos a la planta. En la técnica se conocen varios genes TEL y se puede usar cualquiera en la práctica de la invención, incluyendo fragmentos y variantes de genes TEL conocidos en tanto que fragmentos y variantes retengan la actividad deseada de promover el crecimiento vegetal y de incrementar el rendimiento. Los genes TEL son un grupo de genes de plantas y hongos que comparten similitud en la secuencia de aminoácidos al Mei2 de levadura ( atanabe y Yamamoto 1994, Cell 78: 487-498). Todas las plantas tienen un gran número de genes tipo Mei2, y se pueden dividir en dos grupos en base a su similitud de secuencia (Jeffares et al 2004, Genes Dev Evol 214:149-158). Uno es el grupo AML, que es similar a la proteina AML originalmente identificada de Arabidopsis thaliana (Hirayama et al (1997) FEBS Lett 413: 16-20) .

[0066] Un segundo grupo de genes tipo Mei2 es el grupo TEL, que es similar al gen Earl Terminal (TE1) de Zea mays (Veit et al (1998) Nature 393:166-168). Si o no un gen tipo Mei2 vegetal es un gen TEL o AML se puede determinar por un análisis de la secuencia codificada de aminoácidos. Por ejemplo, la Figura 1 muestra el dendrograma de los varios genes tipo Mei2 vegetales construidos por el Vector NTI. En este dendrograma los genes tipo Mei2 vegetales se agruparon claramente en dos grupos distintos, el grupo AML y el grupo TEL. Una proteína tipo TEL contiene usualmente dos motivos de reconocimiento de ARN (RRM) en la región N-terminal y un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) en su región C-terminal. El motivo RRM3 en la C-terminal está altamente conservado entre plantas y puede jugar un papel importante para las funciones de las proteínas TEL. En comparación a las proteínas AML, una característica única de la proteína TEL es un péptido específico TEL insertado en dentro del motivo RRM3 (Figura 2) . Todas las proteínas AML están carentes de este motivo. Otra característica única de las proteínas TEL es la región conservada fuera del C-término del RRM3 (Figura 2). Esto está ausente en todas las proteínas AML. Una secuencia de aminoácidos de TEL de la invención comparte al menos aproximadamente 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o más de identidad de secuencia dentro de esta región conservada.

[0067] De esta manera, las proteínas TEL o tipo TEL de la invención incluyen aquellas que tienen al menos uno de los motivos TEL. Una proteína TEL o tipo TEL de la invención incluyen aquellas que tienen al menos aproximadamente 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4, la región conservada. Para identificar secuencias TEL que tienen la región conservada, se puede usar el motivo conservado de arroz para explotar la base de datos de secuencias NCBI, usando parámetros por defecto como se analiza más adelante. Cuando se usa la secuencia de arroz, y las secuencias TEL se alinean, las secuencias comparten aproximadamente 60% o más de identidad de secuencia. Igualmente, las proteínas TEL o tipo TEL incluyen aquellas que tienen al menos uno de los motivos TEL y tiene al menos 50%, al menos 58%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad de secuencia a una proteína TEL de la invención. Las proteínas TEL o tipo TEL incluyen aquellas que tienen al menos 60% de identidad de secuencia dentro de la región conservada y tiene al menos 50%, al menos 58%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% , al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% de identidad de secuencia a un proteína TEL de la invención.

[0068] En la presente se describen varios genes TEL y se conocen en la técnica y en cualquier planta de interés se puede usar cualquiera de estas secuencias TEL, así como variantes y truncamientos de las mismas. Como se analiza más adelante, las secuencias de la presente invención se pueden usar para aislar otros genes TEL que son útiles en la práctica de la invención. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas TEL de la presente invención incluyen las secuencias expuestas en SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 31, 33, 37, 39, 41, 43, 45, y variantes, fragmentos, y complementos de las mismas. Otras secuencias conocidas en la técnica, y útiles en la práctica de la invención, incluyen: Arabidopsis thaliana (por ejemplo, NP_189242.1, BAB01438.1, NP_176943.1, BAA22374.1, NP_568946.1, NP_174902.1, NP_196346.1, ABE65689.1, BAF02107.1, AAG51742.1 ) ; Zea mays (por ejemplo, NP_001104903.1, DAA56253.1, NP_00115141 .1, DAA40614.1, NP_001132246.1, AF 58118.1, ACN26476.1, AFW86252.1, NP_001169543.1, AFW75193.1 ) ; Vitis vinifera (por ejemplo, XP_002282117.1, XP_002271386.1, CBI17716.3, CBI16829.3, XP_003634410.1, CBI19075.3, CBI31752.3, CBI38012.3, XP_002279792.2) ; Glycine max (por ejemplo, XP_003552800.1, XP_003537555.1, XP_003532096.1, XP_003551918.1, XP_ 003522450.1, XP_003546575.1) ; Medicago truncatula (por ejemplo, XP_003601878.1, XP_003595582.1, XP_003595581.1 , AAT38998.1, XP_003602750.1, XP_003630595.1) ; Populus trichocarpa (por ejemplo, XP_002311749.1 , XP_002314579.1 , XP_00230101 .1 , XP_002328959.1, XP_002334130.1, XP_ 002297875.1); Physcomitrella patens (por ejemplo, XP_ 001778423.1, AEN71547.1, XP_001764176.1, AEN71548.1, XP_001780082.1, XP_001765627.1 ) ; Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (por ejemplo, XP_002875310.1 , XP_002887144.1, XP_002866463.1 , XP_002871262.1, XP_002893925.1 ) ; Ricinus communis (por ejemplo, XP_002515045.1 , XP_00251297 .1, XP_002513823.1, XP_002534743.1, XP_002511091.1 ) ; Selaginella moellendorffii (por ejemplo, XP_002 60552.1 , XP_0029 69195.1, XP_002969607.1, XP_002965317.1 , XP_002982799.1 ) ; Sorghum bicolor (por ejemplo, XP_002456810.1, XP_ 002462714.1, XP_002437661.1, XP_002 52169.1 ) ; Brachypodium distachyon (por ejemplo, XP_00356737 .1, XP_003576762.1, XP_003579645.1, XP_003569150.1 ) ; Oryza sativa Japónica Group (por ejemplo, NP_001045139.1, EAZ14552.1, NP_001063754.1, NP_001172988.1) ; Populus trémula x Populus alba (por ejemplo, ABR19818.1, ABR19817.1 ) ; Hordeum vulgare subsp. vulgare (por ejemplo, BAJ85875.1, AAL85701.1); Oryza sativa Indica Group (por ejemplo, A2 Y46.1, EEC84932.1); Solanum lycopersicum (por ejemplo, NP_001234547.1 ) ; Triticum aestivum (por ejemplo, AAT39003.1); Aegilops speltoides (por ejemplo, AAT39000.1); Paramecium tetraurelia strain d4-2 (por ejemplo, XP_001432620.1 , XP_001436478.1) ; Citrus unshiu (por ejemplo, AAT39004.1) Pinus taeda (por ejemplo, AAT38996.1) ; Volvox carteri f. nagariensis (por ejemplo, XP_002957664.1) ; Chlamydomonas reinhardtii (por ejemplo, XP_001700078.1) ; Ostreococcus tauri (por ejemplo, XP_003079264.1) ; Ostreococcus lucimarinus CCE9901 (por ejemplo, XP_001417970.1) ; Chlorella variabilis (por ejemplo, EFN52088.1 ) ; Picea sitchensis (por ejemplo, ABR16149.1); Naegleria gruberi (por ejemplo, XP_002670292.1) ; Tetrahymena thermophila (por ejemplo, XP_001032018.1 ) ; and Albugo laibachii (por ejemplo, CCA21771.1). Todas estas secuencias se incorporan en la presente como referencia. Por "complemento" se propone una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a una secuencia dada de nucleótidos tal que puede hibridarse a la secuencia dada de nucleótidos para formar de este modo un dúplex estable.

[0069] Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas TEL también se abarcan por la presente invención. Por "fragmento" se propone una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína TEL. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar para una porción biológicamente activa de una proteína TEL, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación o cebador PCR útil para aislar otras secuencias tipo TEL. Típicamente, los fragmentos de truncamientos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención codificarán para fragmentos de proteína que comprenden la región conservada RRM3 y retienen la actividad biológica de la proteína TEL y, por lo tanto, requieren la actividad de TEL. Por "retiene la actividad" se propone que el fragmento tendrá al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad TEL de la proteina TEL. Por "actividad TEL" se propone rendimiento o crecimiento vegetal incrementado. Los métodos para medir la actividad TEL incluyen medir los niveles de proteina o niveles de ARNm, asi como cultivar las plantas alteradas para el fenotipo de crecimiento incrementado .

[0070] Las variantes de las moléculas de ácido nucleico de TEL se pueden elaborar por varios métodos. Estas alteraciones pueden dar por resultado secuencias de ADN que codifican para proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes que aquellas codificadas por una proteína TEL de la presente invención. De esta manera, la proteína se puede alterar de varias maneras incluyendo sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos. En la técnica se conocen en general métodos para estas manipulaciones. Por ejemplo, las variantes de la secuencia aminoácidos de una proteína TEL se pueden preparar por mutaciones en el ADN. Esto también se puede lograr por una de varias formas de mutagénesis y/o en evolución directa. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán de manera sustancial la función de la proteína. Los métodos incluyen mala incorporación de bases durante la replicación de ADN, tal como rojo XL-1 (Stratagene, La Jolla, CA) ; transposición de ADN (Stemmer (1994) Proc Nati Acad Sci EUA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al (1997) Nature Biotech 15:436-438; Moore et al (1997) J. Mol Biol 272: 336-347; Zhang et al (1997) Proc Nati Acad Sci EUA 94:4504-4509; Crameri et al (1998) Nature 391:288-291, y Patentes de los Estados Unidos Nos 5,605,793 y 5,837,458); y similares. Se pueden hacer alteraciones a la secuencia de proteina mediante inserción, supresión o alteraciones introducidas por métodos moleculares, tal como PCR, mutagénesis, recombinación, y similares. Estas variantes poseerán la actividad TEL deseada. Sin embargo, se entiende que se puede mejorar la capacidad de una proteína TEL para conferir actividad TEL mediante el uso de estas técnicas en las composiciones de la invención.

[0071] Las proteínas TEL preferidas de la presente invención se abarcan por una secuencia de nucleótidos idéntica o que tiene identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias TEL listadas en la presente o contenidas dentro del listado de secuencias. Las secuencias variantes de aminoácidos o de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60% o 65% de identidad de secuencia, aproximadamente 70% o 75% de identidad de secuencia, aproximadamente 80% o 85% de identidad de secuencia, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencia en comparación a una secuencia TEL de referencia usando uno de los programas de alineación descritos en la presente usando parámetros normales se abarcan por la invención. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar de manera apropiada para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la colocación del cuadro de lectura, y similares.

[0072] Para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima. El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, por ciento de identidad = número de posiciones idénticas número total de posiciones (por ejemplo, posiciones de traslape) x 100) . En una modalidad, las dos secuencias son de la misma longitud. En otra modalidad, el por ciento de identidad se calcula a través de la totalidad de la secuencia de referencia. El por ciento de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a aquellas descritas más adelante, con o sin permitir separaciones. Al calcular el por ciento de identidad, se cuentan típicamente las correspondencias exactas .

[0073] La determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:2264, modificado en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5877. Este algoritmo se incorpora en los programas BLASTN y BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico tipo TEL de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a moléculas de proteínas TEL de la invención. Para obtener alineaciones con separación para propósitos de comparación, se puede utilizar BLAST con separación (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. De manera alternativa, se puede usar PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con separación, y PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTX y BLASTN) . También se puede realizar manualmente la alineación mediante inspección.

[0074] Se pueden usar otros algoritmos matemáticos para la comparación de secuencias, incluyendo el algoritmo ClustalW (Higgins et al (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680). ClustalW compara secuencias y alinea la totalidad de la secuencia de aminoácidos o de ADN, y de esta manera puede proporcionar datos acerca de la conservación de la secuencia completa de aminoácidos . El algoritmo ClustalW se usa en varios paquetes de software de análisis de ADN/ aminoácidos comercialmente disponibles, tal como el módulo ALIGNX de la Suite de Programas Vector NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . Después de la alineación de las secuencias de aminoácidos con ClustalW, se puede valorar el por ciento de identidad de aminoácidos. Un ejemplo no limitante de un programa de software útil para análisis de alineaciones ClustalW es GENEDOCMR. GENEDOCMR (Karl Nicholas) permite la valoración de la similitud e identidad de aminoácidos (o ADN) entre múltiples proteínas. Otro ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de yers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Este algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible en Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, EUA) . Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede usar una tabla de pesos de residuo PAM120, una penalidad de longitud de separación de 12 y una penalidad de separación de 4.

[0075] A menos que se señale de otro modo, GAP Versión 10, que usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 (3) : 443-453, se usará para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos que usa peso GAP de 50 y longitud-peso de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna . cmp; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando peso GAP de 8 y longitud-peso de 2 , y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden usar programas equivalentes. Por "programa equivalente" se propone cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene correspondencias idénticas de residuos de nucleótidos y un por ciento idéntico de identidad de secuencia en comparación a la correspondiente alineación generada por GAP Versión 10.

[0076] Como se indica, las moléculas variantes de ácido nucleico de TEL se pueden usar en la práctica de la invención. Las "variantes" de las secuencias de nucleótidos que codifican para proteina TEL incluyen aquellas secuencias que codifican para las proteínas TEL descritas en la presente pero que difieren de manera conservadora debido a la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas como se analiza anteriormente. Las variantes alélicas que se presentan de forma natural se pueden identificar con el uso de técnicas bien conocidas de biología molecular, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y técnicas de hibridación como se resume más adelante. Las secuencias variantes de nucleótidos también incluyen secuencias sintéticamente derivadas de nucleótidos que se han generado, por ejemplo, al usar mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifican para las proteínas TEL descritas en la presente invención como se analiza más adelante. Las proteínas variantes abarcadas por la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, es decir, actividad TEL.

[0077] El experto apreciará adicionalmente que se pueden introducir cambios por mutación de las secuencias de nucleótidos de la invención, conduciendo de este modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas TEL codificadas, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. De esta manera, las moléculas aisladas, variantes de ácidos nucleicos se pueden crear al introducir una o más sustituciones, adiciones, o supresiones de nucleótidos en la correspondiente secuencia de nucleótidos descrita en la presente, tal que en la proteína codificada se introduzcan unas o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. Se pueden introducir mutaciones por técnicas normales, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Estas secuencias variantes de nucleótidos también se abarcan por la presente invención.

[0078] Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más, residuos de aminoácido no esenciales, previstos. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia de tipo silvestre de una proteína TEL sin alterar la actividad biológica, en tanto que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) .

[0079] Se pueden hacer sustituciones de aminoácido en regiones no conservadas que retienen la función. En general, estas sustituciones no serán para los residuos conservados de aminoácido, o para los residuos de aminoácido que residen dentro de un motivo conservado, donde estos residuos son esenciales para la actividad de la proteina. Los ejemplos de residuos que están conservados y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteina incluyen, por ejemplo, residuos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de proteínas similares o relacionadas a las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que son idénticos en un la alineación de proteínas homologas) . Los ejemplos de residuos que están conservados, pero que permiten sustituciones conservadoras de aminoácido y aun retienen la actividad incluyen, por ejemplo, residuos que tienen solo sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en una alineación de proteínas similares o relacionadas de alto rendimiento a las secuencias de la invención (por ejemplo, residuos que tienen solo sustituciones conservadoras entre todas las proteínas contenidas en las proteínas homologas de alineación) . Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los residuos conservados. En una modalidad, no serán cambios en la secuencia de aminoácidos en los motivos conservados o en la región que circunda los motivos como se expone en la Figura 2.

[0080] De manera alternativa, se pueden hacer secuencias variantes de nucleótidos al introducir aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de la secuencia codificadora, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden examinar para la capacidad para conferir actividad TEL para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar de manera recombinante y se puede determinar la actividad de la proteína usando técnicas normales de ensayo.

[0081] Los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención, o para variantes o fragmentos de los mismos, también se abarcan. En la técnica son bien conocidos los métodos para producir anticuerpos (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente de los Estados Unidos No. 4, 196, 265) .

[0082] Además de las proteínas TEL listadas en esta solicitud, esta invención también proporciona métodos para clonar y utilizar nuevos genes TEL, otros organismos, incluyendo plantas, musgos y hongos. Por ejemplo, al usar las secuencias proporcionadas en la presente, se pueden clonar nuevos genes con métodos tal como PCR e hibridación de ácido nucleico. Los cebadores de PCR se pueden diseñar de acuerdo a las regiones conservadoras de las secuencias de ADN de los genes TEL. Además, las secuencias conservadoras de aminoácidos se pueden usar para diseñar cebadores degenerados para PCR. Se puede usar un gen parcialmente conocido de PCR para clonar un gen de longitud completa usando varios métodos conocidos, tal como Tail-PCR, 5' RACE, 3' RACE, etcétera. Ver, por ejemplo, Singer y Burke (2003) Methods Mol Biol 236:241-272; y equipos comercialmente disponibles. Como se describe más adelante, los genes proporcionados en esta invención y en otras publicaciones se pueden usar para preparar sondas para hibridar bibliotecas genómicas o de ADNc para clonar genes TEL. Una vez que se clona un gen tipo TEL, su secuencia codificada de aminoácidos se puede utilizar para determinar si es un ortólogo del gen TEL, como se ilustra en la Figura 1.

[0083] Con el rápido advenimiento de varios proyectos de secuenciación, se pueden identificar nuevos genes TEL al buscar varias bases de datos usando las secuencias de aminoácidos de TEL y/o secuencias nucleicas proporcionadas por esta invención. Estas bases de datos incluyen, pero no se limitan a bases de datos de la secuencia de genomas, ETS, y secuencias de ADNc. El método BLAST (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol.215, 403-410) es uno ampliamente usado. Por ejemplo, Jeffares et al. Identificó 15 genes vegetales tipo Mei-2 a partir de bases de datos mediante la búsqueda, y varios de los cuales se identificaron adicionalmente como miembros del grupo TEL (Jeffares et al. 2004, Dev. Genes. Evol .214 : 149-158) .

[0084] Para determinar si una proteina tipo Mei2 es una proteina del grupo TEL, se puede examinar su secuencia de aminoácidos. Las proteínas TEL de la invención tienen al menos una de las siguientes características para ser útiles para mejora de rendimiento: comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) de TEL en el cual están conservados en la planta al menos 3 de los 4 residuos Asn-His-Cys-Ile ; comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo especifico conservado de TEL fuera del C-término del dominio RRM3 y donde al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido están conservados: Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/ Glu-N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo) ; comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz; y, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia a la proteina TEL de arroz.

[0085] De esta manera, usando métodos tal como PCR, hibridación, y similares se pueden identificar secuencias TEL correspondientes, estas secuencias que tienen una identidad sustancial a las secuencias de la invención. Ver, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York) .

[0086] En un método de hibridación, toda o parte de una secuencia de nucleótidos TEL descrita en la presente se puede usar para examinar bibliotecas genómicas o de ADNc para secuencias TEL adicionales para el uso en la invención. Los métodos para la construcción de estas bibliotecas genómicas y de ADNc se conocen en general en la técnica y se describen en Sambrook y Russell, 2001, supra. Las llamadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómicos, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable, tal como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Las sondas para hibridación se pueden elaborar al marcar oligonucleótidos sintéticos con base a la secuencia conocida de nucleótidos que codifica para la proteina TEL descrita en la presente. Los cebadores degenerados diseñados con base a los nucleótidos conservados o residuos de aminoácido conservados en la secuencia de nucleótidos o secuencia codificada de aminoácidos, se pueden usar de manera adicional. La sonda comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones severas a al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, o 200 nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina TEL de la invención o un fragmento o variante de la misma. En general en la técnica se conocen los métodos para la preparación de sondas para hibridación y se describen en Sambrook y Russell, 2001, supra incorporado en la presente como referencia.

[0087] Por ejemplo, una secuencia completa de ácido nucleico de TEL descrita en la presente, o una o más porciones de la misma, se puede usar como una sonda capaz de hibridizar de manera especifica a correspondientes secuencias tipo TEL y ARN mensajeros. Para lograr la hibridación especifica bajo una variedad de condiciones, estas sondas incluyen secuencias que son únicas y son e manera preferente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas se pueden usar para amplificar las secuencias TEL correspondientes de un organismo elegido por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificadoras adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificadoras en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen examen de hibridación de bibliotecas de ADN en placa (ya sea placas o colonias, ver, por ejemplo, Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) .

[0088] La hibridación de estas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Por "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severa" se proponen condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia diana a un grado detectablemente mayor que a otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al fondo) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, las secuencias diana u objetivo que son 100% complementarias a la sonda se pueden identificar (sondeo homólogo) . De manera alternativa, se pueden ajusfar condiciones de severidad para permitir alguna mala correspondencia de secuencias de modo que se detectan menores grados de similitud (sondeo heterólogo) . En general, una sonda es menos de aproximadamente 1000 nucleotidos de longitud, de manera preferente menos de 500 nucleotidos de longitud.

[0089] Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menos de aproximadamente ion de NA 1.5 M, típicamente cerca de una concentración de ion de Na de 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor de 50 nucleótidos) . Las condiciones de severidad también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores tal como formamida. Las condiciones de severidad baja de ejemplo incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, 1% de SDS (dodecil-sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) de 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0 M, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad de ejemplo incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37°C, y un lavado en 0.1 X SSC de 60 a 65°C. Opcionalmente, los amortiguadores de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1% de SDS. La duración de la hibridación es en general menos de aproximadamente 24 horas, usualmente de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas .

[0090] La especificidad es típicamente la función de lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la concentración iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% de GC) - 0.61 (% de form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de base. La Tm es la temperatura (bajo concentración iónica definida y pH definido) a la cual 50% de una secuencia diana complementaria híbrida a una sonda perfectamente coincidente. Tm se reduce por aproximadamente 1°C para cada 1% de correspondencia; de esta manera, Tm, hibridación, y/o condiciones de lavado se puede ajusfar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede disminuir 10°C. En general, se seleccionan condiciones severas para que sean aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una concentración iónica definida y pH definido. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C menor que la temperatura de fusión térmica (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, o 10°C menor que el punto de fusión térmica (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menor que el punto de fusión térmica (Tm) . Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y la Tm deseada, los expertos en la técnica entenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado deseado de mala correspondencia da por resultado una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que se puede usar una mayor temperatura. Se encuentra una guia extensa de la hibridación de ácidos nucleicos se Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel et al., eds . (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) .

[0091] Como se señala anteriormente, un método para incrementar la expresión del gen TEL en plantas es para transformar una planta de interés con una construcción de ADN que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una secuencia TEL de la invención. Actualmente están disponibles métodos generales para introducir y expresar un gen TEL en una planta y por lo tanto cultivos. En general, la transformación de una planta de interés incluye los siguientes pasos: 1) Construir un cásete de expresión para un gen TEL; (Los polinucleótidos usados para la construcción pueden ser un fragmento genómico que contiene la secuencia codificadora, o un ADNc de longitud completa, o un fragmento de ADN sintetizado de manera artificial. Las secuencias reguladoras, tal como el promotor, intensificador y terminador, se puede enlazar de manera operable al ADN codificador para crear casetes funcionales de expresión. Usualmente, se enlaza un promotor al extremo 5' del ADN codificador, en tanto que se enlaza un terminador al extremo 3' del ADN codificador. El cásete de expresión puede comprender un fragmento de ADN de TEL genómico, que incluye el promotor nativo, la secuencia codificadora y el terminador). 2) Construir vectores de transformación con casetes de expresión de TEL; (Por ejemplo, pCAMBIA1300 o sus versiones modificadas se pueden usar para clonar casetes de expresión de TEL para la transformación mediada por Agrobacterium) . y, 3) Transformar cultivos diana y seleccionar eventos transgénicos . (El método de análisis Western se puede usar para detectar la expresión de los transgenes TEL) .

[0092] Los casetes de expresión de genes TEL endógenos nativos se pueden usar en la práctica de la invención. Este cásete de expresión contiene un promotor, una secuencia codificadora y un terminador, todo en un fragmento de ADN genómico. El promotor de un gen TEL se localiza usualmente en el extremo 5' de la secuencia codificadora y es hasta 2-3 kb en la dirección 5' del codón de inicio. El terminador usualmente está localizado el extremo 3' de la secuencia codificadora alrededor de 1.0 kb. Una secuencia de señal poliA tal como AATAAA se puede usar en el extremo del terminador.

[0093] Adicionalmente , esta invención también proporciona varios casetes nativos de expresión de TEL de varios genomas vegetales. Las secuencias de ácido nucleico de estos casetes se listan en SEQ ID NOs : 5, 7, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 29, y 45. A fin de mejorar la expresión de estos TEL en plantas transgénicas, se pueden insertar intensificadores en estos casetes de expresión en la dirección 5' o en la dirección 3' . Un intensificador comúnmente usado es el intensificador 35S del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) (Benfey et al. 1990, EMBO J. 9: 1685-1696) .

[0094] Como se indica, se puede proporcionar una secuencia TEL de la invención en una construcción de ADN o un cásete de expresión para la expresión en una planta de interés. Por "cásete de expresión vegetal" se propone una construcción de ADN que es capaz de dar resultado la expresión de una proteina a partir de un cuadro de lectura abierto en una célula vegetal. Típicamente, estos contienen un promotor y una secuencia codificadora. Frecuentemente, estas construcciones también contendrán una región 3' no traducida. Estas construcciones pueden contener un intensificador para incrementar la expresión de la secuencia codificadora de TEL en la planta.

[0095] Por "vector de transformación vegetal" se propone una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula vegetal. Esta molécula puede consistir de uno o más casetes de expresión vegetal, y se puede organizar en más de una molécula de ADN de "vector". Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación vegetal que utilizan dos vectores no contiguos de ADN para codificar todas las funciones cis y trans actuantes necesarios para la transformación de células vegetales (Hellens y ullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células hospedadoras . El "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad para incorporar, integrar y expresar secuencias heterologas de ADN o fragmentos en una célula extraña. El cásete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' operablemente enlazadas a una secuencia de la invención. Por "operablemente enlazada" se propone un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que codifica para la segunda secuencia. En general, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan están contiguas y donde es necesario para unir dos regiones codificadoras de proteína, contiguas y en el mismo cuadro de lectura. El cásete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que se va a co-transformar en el organismo. De manera alternativa, los genes adicionales se pueden proporcionar en múltiples casetes de expresión.

[0096] "Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia codificadora en la dirección 3' . El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras, transcripcionales y transduccionales (también llamadas "secuencias de control") son necesarias para la expresión de una secuencia de ADN de interés. Se pueden usar promotores constitutivos o preferidos por tejido en la práctica de la invención. Se conocen muchos promotores y se pueden usar incluyendo el promotor CaMV 35S núcleo (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol Biol 12:619-632 y Christensen et al (1992) Plant Mol Biol 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor Appl Genet 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor ALS (Patente de los Estados Unidos No. 5,659,026), el promotor de la pequeña subunidad rubisco, promotores derivados de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens tal como octopina-sintasa y nopalina-sintasa, y similares. Los promotores preferidos por tejido incluyen promotores específicos de miristemo (Ito et al. (1994) Plant Mol Biol 24: 863-878; Verma y Kumar (2005) Indian J Biotecnología 4:516-521; Shimizu et al (2009) Plant Physiol 149:841-850); promotores específicos de tejido verde tal como la fofoenolpiruvato-carboxilasa de maíz (Zea mays) (Patente de los Estados Unidos No. 5,856.177); etcétera. Todas estas referencias se incorporan en la presente como referencia.

[0097] El promotor de un gen TEL se puede usar para activar la expresión de las secuencias codificadoras de otros genes TEL en una planta de interés. Por ejemplo, el promotor del gen TEL de maíz se puede usar para activar la expresión del gen TEL de arroz en el arroz, trigo, sorgo, maíz, etcétera. Los promotores de varias plantas se proporcionan en SEQ ID NOs : 52-55. Es una cuestión bien conocida aislar la región promotora de cualquier gen que ha sido clonado.

[0098] Está bien estudiados los promotores usados para control de expresiones génicas. Ver, por ejemplo, Potenza et al. 2004, In. Vitro. Cell. Dev. Biol-Planta. 40:1-2). Todos los promotores para expresión constitutiva y expresión específica de tejido se pueden usar para activar la expresión de los genes TEL en plantas para mejora de rendimiento. Los promotores usados para dirigir la expresión de genes TEL en esta invención pueden ser varios promotores heterogéneos, tal como promotores específicos de tejido (Patente de los Estados Unidos 5,880,330), promotor especifico de la raíz ARSK1, promotor de inflorescencia floral API (Bai et al. 2008, Transgenic Res. 17:1035-1043). Estos promotores pueden proporcionar mejora de expresión específica de tejido, lo que puede dar por resultado mejoras de crecimiento específicas de tejido.

[0099] La construcción de ADN o cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia TEL para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. [00100] Como se indica, se pueden usar intensificadores en la construcción de ADN para incrementar la expresión de la secuencia codificadora de TEL. Estos intensificadores incluyen el intensificador 35S, el intensificador 35S truncado, y otros activadores de transcripción. En la construcción se pueden usar uno o más elementos intensificadores , frecuentemente se pueden usar al menos dos elementos. El intensificador puede estar 5' o 3' al promotor que activa la expresión de la secuencia TEL y operablemente enlazado a los elementos en el cásete de expresión. [00101] El cásete de expresión incluirá en la dirección 5' -3' de la transcripción, una región de inicio transcripción y traducción (es decir, un promotor) , una secuencia de ADN de la invención, y una región de terminación tranduccional y transcripcional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, al hospedador vegetal y/o a la secuencia de ADN de la invención. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o de manera alternativa una secuencia sintética. Donde el promotor es "nativo" u "homologa" al hospedador vegetal, se propone que el promotor se encuentre en la planta nativa en la cual se introduce el promotor. Donde el promotor está "exterior" o "heterólogo" a la secuencia de ADN de la invención, se propone que el promotor no sea el promotor nativo o que se presente de forma natural para secuencia de ADN operablemente enlazada de la invención . [00102] La región de terminación puede ser nativa con la región de inicio de transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN operablemente enlazada de interés, puede ser nativa con el hospedador vegetal, o se puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heterologa al promotor, la secuencia de ADN de interés, el hospedador vegetal, o cualquier combinación de estos). Los terminadores usados para los casetes de expresión TEL pueden ser los terminadores nativos de TEL, pero también pueden ser otros terminadores. Los terminadores frecuentemente usados incluyen el terminador 35S de CaMV. Otros terrainadores incluyen descritos en Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic. Acids . Res. 17:7891-7903; y Joshi et al. (1987) Nucleic. Acids. Res. 15:9627-9640. Las regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina-sintasa y nopalina-sintasa . [00103] Donde es apropiado, los genes se pueden optimizar para expresión incrementada en la célula hospedadora transformada. Es decir, los genes se pueden sintetizar usando los codones específicos preferidos de planta para expresión mejorada. En la técnica están disponibles métodos para sintetizar genes preferidos por plantas. Ver, por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nums. 5,380,831, y 5,436,391, y Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporada en la presente como referencia. A fin de mejorar la expresión, los genes TEL que se van a usar como un transgén se pueden modificar. Por ejemplo, se puede optimizar el uso de codón, se pueden suprimir intrones, y se pueden remover señales prematuras de poliA. [00104] Los métodos de la invención comprenden introducir una construcción de nucleótidos en una planta. Por "introducir" se propone presentar a la planta la construcción de nucleótidos de una manera tal que la construcción obtenga acceso ai interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no requieren que se use un método particular para introducir una construcción de nucleótidos a una planta, solo que la construcción de nucleótidos obtiene acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir construcciones de nucleótidos en plantas se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transiciente, y métodos mediados por virus. [00105] Por "planta" se propone plantas enteras., órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etcétera), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden estar diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callo, célula de cultivo en suspensión, protoplastos , células folíales, células de raíz, células de floema, polen) . [00106] "Plantas transgénicas" o "plantas transformadas" o plantas o células o tejidos "establemente transformadas" se refiere a plantas que tienen incorporadas o integradas secuencias exógenas de ácido nucleico o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Estas secuencias de ácido nucleico incluyen aquellas que son exógenas, o no están presentes en la célula vegetal no transformada, asi como aquellas que pueden ser endógenas, o estar presentes en la célula vegetal no transformada. "Heterólcgo" se refiere en general, a las secuencias de ácido nucleico que no son endógenas a la célula o parte del genoma nativo en el cual están presentes, y se han adicionado a la célula por infección, transíección, microinyección, electroporac.ión , microproyección, o similares . [00107] La transformación de células vegetales se puede lograr por una de varias técnicas conocidas en la técnica. El gen TEL de la invención se puede modificar para obtener o mejorar la expresión en células vegetales. Tí icamente, un construcción que exprese esta proteína contendrá un promotor para activar la transcripción del gen, así como una región 3' no traducida para permitir la terminación de la transcripción y la poliadenilación . [00108] Típicamente este "cásete de expresión vegetal" se insertará en un "vector de transformación vegetal".. Este vector de transformación vegetal puede estar comprendido de uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación vegetal. Por ejemplo, los vectores binarios así como los vectores con plásmidos auxiliares se usan más frecuentemente para transformación mediada por Agrobacterium, donde es bastante grande el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr la transformación eficiente, y es ventajoso separar las funciones en moléculas separadas de ADN , Los vectores binarios contienen típicamente un vector de plásmido que contiene las secuencias cis actuantes requeridas para la transferencia de AD -T (ta]. como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que se maneja para que sea capaz de la expresión en una célula vegetal,, y un "qen de interés "(un gen manejado para que sea capaz de la expresión en una célula vegetal para la cual se desea la generación de plantas transgénicas ) . También presentes en este vector de plásmido están secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias cis actuantes se arreglan de una panera para permitir la transferencia eficiente en células vegetales y expresión en la misma. Por ejemplo, el gen m rcado seleccionable y el gen TEL pueden estar localizados entre los bordes i quierdo y derecho. Frecuentemente un segundo vector de plásmido contiene los factores trans actuantes que median la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a células vegetales. Este plásmido contiene frecuentemente las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Ag obacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends en Plant Science 5:446-451). Para transformación vegetal se pueden varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etcétera) . El segundo vector de plásmldo no es necesario para transformar las plantas por otros métodos tal corno microproyección, microinyección, electroporacj.ón, polietilenglicol , etcétera. [00109] En general, los métodos de t ansformación vegetal comprenden transferir ADN heterólogo en células vegetales objetivo o diana (por ejemplo, embriones maduros o inmaduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos , etcétera) , seguido por la aplicación de la selección apropiada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar la células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Los explantes se transfieren ti icaraerite a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma rutinaria. Subsiguientemente, las células trans ormadas se diferencian en brotes después de la colocación en el medio de regeneración complementado con un nivel de umbral máximo de agente selector. Los brotes entonces se transfieren a un de de enrai zamiento selectivo para recuperar el brote enraizado o plántula enraizada. La plántula transgénica entonces crece a una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes se transfieren típicamente a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan por rutinaria. Se encuentra una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas células; están presentes tanto células transformadas como no transformadas en cualquier pieza del callo o tejido o grupo de células diana. La capacidad para aniquilar células no transformadas y para permitir que las células transformadas proliferen da por resultado cultivos vegetales transfo mados, Frecuentemente, la capacidad para remover células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas. [00110] Los protocolos de transformación asi como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocoti ledónea o dicotiledónea, que se tiene como objetivo para la transformación. Se puede realizar la generación de plantas transgénicas por uno de varios métodos, que incluyen, pero no se limitan a, microinyección (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 334), electroporaci ó (Riggs et al. (1986) Proc Nati Acad. Sci EUA 83:5602 5606, transformación mediada por Agrobacterium (Patente de de los Estado3 Unidos No. 5,56 .055 y Patente de de los Estados Unidos No. 5, 981, 840) , transferencia génica directa (Paszkowski et al. (1984) EMBO ,7. 3:2717 2722), y aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo. Patentes de ios Estados Unidos No. 4,945,050; Patente de de los Estados Unidos No. 5,879,918; Patente de de los Estados Unidos No. 5,886,244 y 5,932,782; Tomes et al. (1995) ir, Plant. Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamenta]. ethods, ed. Gamborg and Phillips ( Springer-Verlag, Berlín); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923 926); y Leel transformation (WO 00/28058) , Ver también Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet . 22:421477; Cbristou et al. (1988) Plant Physiol. 87:6">1 674 ; Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 740 (arroz); Klein, et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sci. EUA 85:4305 4309; Klein et ai.. (1988) Biotechnology 6:559 563. Ver, también, Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,240,855; 5,322,783; 4,945,050; 5,324,646; Solicitud Publicada U.S. No. 20010026941; 2002015066; y, Publicación Internacional No. WO 91/00915. [00111] Las células que se transformado se pueden cultivar hasta plantas de acuerdo con las maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas entonces se pueden cultivar, y ya sea polinizar con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y el híbrido resultante que tiene expresión constitutiva de la característica fenotipica deseada se identifica. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurarse que la expresión de la característica fenotipica deseada se mantenga de manera estable y se herede y entonces se han logrado semillas recolectadas para asegurar la expresión de la característica fenotipica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona una semilla transformada (también referida como "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma. [00112] Después de la introducción del ADN extraño heterólogo en células vegetales, se confirma la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta mediante varios métodos tal como análisis de ácidos nucleicos y proteínas asociadas con el gen integrado. Las técnicas moleculares incluyen PCR (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning:. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) , análisis de transferencia Southern de ADN genómico, análisis de transferencia Northern y transferencia Western (Sambrook y Russell, 2001, supra) . [00113] Se han desarrollado varios marcadores seleccionables para el uso con células vegetales, tal como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican para un producto comprendido en el metabolismo de los cloroplastos también se puede usar como marcadores seleccionables . Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tal como glifosato, bromoxinil o imidazolinona pueden encontrar uso particular. Estos genes se han reportado (Stalker y colaboradores (1985) J. Biol Chem 263:6310-6314 (gen de resistencia a bromoxinil-nitrilasa) , y Sathasivan et al. (1990) Nucí Acids Res 18:2188 (gen de resistencia a AHAS-imidazolinona) . En la técnica son bien conocidos los métodos para detectar la presencia de un transgén en una planta, órgano vegetal (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etcétera) , semillas, célula vegetal, propágulo, embrión o progenie del mismo. [00114] Las plantas fértiles que expresan una proteina TEL se pueden probar para la actividad TEL, y las plantas que muestran actividad óptima se seleccionan para su reproducción adicional. En la técnica están disponibles los métodos para valorar expresión mejorada de una secuencia codificadora. De esta manera, las plantas se pueden examinar y seleccionar con base al nivel de expresión de la secuencia TEL. Adicionalmente, las semillas transformadas se pueden cultivar y seleccionar con base al fenotipo preferido. [00115] Como se analiza, se abarca por la invención cualquier método para incrementar la expresión de una secuencia TEL en una planta. Otro método para mejorar el rendimiento del cultivo es para mejorar la expresión del gen TEL endógeno o secuencia codificadora en cultivos por técnicas de ingeniería genética vegetal. Es decir, en lugar de introducir una segunda secuencia codificadora de TEL mediante el uso de un cásete de expresión, se puede mejorar la expresión del gen TEL endógeno en la planta de interés. En este método, se puede insertar un intensificador (tal como el intensificador 35S CaMV) en la vecindad del gen TEL endógeno en la planta para incrementar la expresión de la secuencia endógena. El intensificador 35S se ha encontrado que es capaz de mejorar la expresión génica cuando se inserta en una región en la dirección 5' o en la dirección 3' de un gen, aun cuando el intensificador se inserte 20kb, 30kb o más del gen de interés. (Jeong et al 2006, Plant J. 45:123-132). De esta manera, se puede insertar un intensificador en el área de la secuencia TEL inmediatamente en la dirección 5' y/o en la dirección 3' del gen TEL. En otras modalidades, se puede insertar un intensificador en una región del genoma en la dirección 5' y/o en la dirección 3' del gen TEL dentro de aproximadamente 1 kb, aproximadamente 5 kb, aproximadamente lOkb, aproximadamente 15kb, aproximadamente 20 kb, 30 kb o más del gen TEL. Un experto puede determinar cuando el intensificador está removido bastante de la secuencia TEL para que no tenga efecto mejorado. En un ejemplo, el ADN-T que contiene al intensificador 35S se insertó aproximadamente 5 kb en la dirección 3' del gen TEL y mejoró significativamente la expresión de la secuencia TEL y subsiguientemente incrementó de manera sustancial el rendimiento. [00116] Se conocen métodos para la selección como objetivo especifica del sitio, de moléculas de nucleótido en el genoma e incluyen la integración basada en TALEN (Li et al (2012) Nature Biotech 30:390-392, Cermak et al. (2011) Nucleic Acids Res Epub 14 de Abril 2011; doi: 10.1093/nar/ gkr218, Bogdanove y Voytas (2011) Science 333:1843-1846, Miller et al. (2011) Nature Biotech 29:143-150, Scholze y Boch (2011) Curr Opinión in Microbiol 1447-53); recombinación especifica del sitio Cre-lox (Dale et al. (1995) Plant J 7:649-659, Lyznik et al. (2007) Transgenic Plant J 1:1-9); recombinación FLP-FRT (Li et al. (2009) Plant Physiol 151:1087-1095); integración mediada por Bxbl (Yau et al. Plant J (2011) 701:147-166); integración mediada pro salientes de zinc ( right et al. (2005) Plant J 44:693-705, Cai et al. (2009) Plant Mol Biol 69:699-709); recombinación homologa (Lieberman-Lazarovich and Levy (2011) Methods Mol Biol 701: 51-65, Puchta, H. (2002) Plant Mol Biol 48:173-182); etcétera. Todas estas referencias se incorporan en la presente como referencia. [00117] Las tecnología TALEN se ha desarrollado para la selección específica como objetivo de la secuencia en ingeniería genética. Los efectores TAL (tipo activador de transcripción) constituyen una nueva clase de proteínas de unión a ADN con especificidad predecible. Dentro de las células vegetales, los TAL se localizan en el núcleo, y se unen a promotores diana, e inducen la expresión de genes vegetales. La especificidad de unión a ADN de los TAL se determina por un dominio central de repeticiones en tándem. Scholze y Boch supra. Se puede usar la tecnología TALEN para insertar una secuencia intensificadora específicamente en la vecindad del gen TEL. Por lo tanto, usando la tecnología TALEN, se puede insertar al menos un elemento intensificador en ubicaciones deseadas en el genoma en la dirección 3' o en la dirección 5' del gen TEL. Por ejemplo, usando tecnología TAL, el intensificador 35S de CaMV se puede insertar dentro de 5 kb en la dirección 3' del gen TEL de arroz. [00118] La expresión TEL también se puede mejorar mediante el uso del efector tipo activador de transcripción (TALE) manejado por denovo . Los TALE de Xanthomonas son proteínas modulares que contienen un dominio de unión a ADN y un dominio de activación transcripcional (Boch y Bonas (2010) Annu Rev Phytopathol 48:419-436) . Los dominios de unión a ADN de los TALE se pueden manejar por denovo para hacer que se unan a una secuencia de ADN específica. Estos TALE manejados por denovo se pueden usar para activar el gen en la dirección 3' de esa secuencia específica. Este método para la mejorar la expresión génica se demostró éxitamente en plantas ( orbitzer et al (2010) , Proc Nati Acad Sci. EUA 107:21617-21622). La región promotora de los genes TEL de arroz, maíz, trigo y soya son bien conocidas y se proporcionan en esta solicitud. Se pueden modificar los TALE para unirse específicamente a un sitio en la dirección 5' cercana al sitio de inicio de transcripción. La transformación de estos TALE manejados por denovo en estas plantas mejoran la expresión de sus genes TEL, que a su vez mejorarán los rendimientos de cultivo. De esta manera, la integración mediada por TALE se puede diseñar para un gen TEL en cualquier planta de interés. La secuencia de nucleótidos de la región codificadora para el gen TEL se puede usar para secuenciar regiones de ADN ya sea en la dirección 3' o en la dirección 5' de la secuencia codificadora. Estas secuencias se pueden usar para seleccionar como objetivo intensificadores para la integración usando tecnología TALE. [00119] Se ha desarrollado tecnología de inserción específica de secuencia usando proteínas de salientes de zinc (Urnov et al. (2010) Nat. Rev. Genet . 11:636-646; Davis y Stokoe (2010) BMC Med. 08:42; Camenisch et al. (2008) Mini Rev. Med. Chem. 8:669-676) . Por lo tanto, se pueden usar métodos de salientes de zinc para la inserción específica de secuencia de intensificadores transcripcionales para mejorar la expresión de genes TEL en plantas y de esta manera en cultivos. [00120] Los métodos de la invención se pueden usar en cualquier especie vegetal, incluyendo, pero no limitado a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (maíz) , sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza oleaginosa, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuate, camote, yuca, café, coco, piña, árboles cítricos, cacao, té, banana, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendras, avenas, vegetales, ornamentales y coniferas . [00121] Las vegetales incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judías verdes, judías, guisantes, y miembros del género Curcumis tal como pepino, melón y melón. Los ornamentales incluyen, pero no se limitan a, axalea, hortensias, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemo. De manera preferente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, Miscanthus, césped de pradera, Jatropha, etcétera) y coniferas. [00122] Se proporcionan métodos para incrementar el rendimiento vegetal. Los métodos comprenden incrementar o mejorar la expresión de una secuencia codificadora de TEL en una planta lo que conduce al incremento vegetal incrementado, vigor y rendimiento vegetal incrementado. Como se define en la presente, el "rendimiento" de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa y/o semilla producida por la planta. Por "biomasa" se propone cualquier producto vegetal medido. Un incremento en la producción de la biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. Un incremento en el rendimiento puede comprender cualquier incremento estadísticamente significativo, incluyendo, pero no limitado a, al menos un incremento de 1%, al menos un incremento de 3%, al menos un incremento de 5%, al menos un incremento de 10%, al menos un de 15% incremento, al menos un incremento de 18%, al menos un incremento de 20%, al menos 30%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 100% o un incremento mayor en el rendimiento en comparación a una planta que no expresa la secuencia TEL. La producción de semillas en las plantas de interés se puede incrementar por al menos 10%, al menos 20% de incremento, al menos 30%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 100% o mayor en comparación a una planta de control. [00123] Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de ilustración y no de limitación.

Parte experimental Ejemplo 1.- Identificación del gen TEL de arroz como un gen de mejora de rendimiento (1) Caracterización molecular de un imitante de arroz por inserción de ADN-T con mayor rendimiento [00124] Una linea de arroz transgénico, nombrada HSA-20, se identificó con que tiene el rasgo agronómico inesperado pero altamente deseable de mayor rendimiento. En comparación a las plantas de la linea parental no transgénica "WYG-7", el fenotipo más notable de las plantas HSA-20 son sus semillas dramáticamente agrandadas. El peso de 1000 granos de la linea parental usada para transformación fue 26.1 g, en tanto que el peso de 1000 granos de la linea HSA-20 fue 36.5 g, que es 39.8% mayor. Las semillas HSA-20 fueron aproximadamente 20% más grandes y 7% más anchas que las semillas de las plantas de control. Las plantas HSA-20 también fueron significativamente más altas y su diámetro de tallo también fue significativamente mayor. La altura promedio de las plantas maduras HSA-20 fue de 107 cm, en comparación a 97 cm para las plantas no transgénicas . El número de semillas por panoja principal fue estadísticamente el mismo entre las plantas HSA-20 y las plantas de control. El peso promedio de panojas principales es 4.8 g en comparación a los 3.6 gramos para la linea parental no transgénica. No hubo diferencia significativa en el tiempo de partida entre HSA-20 y el control no transgénico. [00125] El análisis por transferencia Southern de la inserción de ADN-T de HSA-20 indicó que hubo un evento transgénico con una copia individual de la inserción de ADN-T . El examen de 200 plantas de una población TI segregada de HA-20 por detección por PCR mostró que 100% de las plantas con el fenotipo de semillas agrandadas fue positivo para la inserción de ADN-T, en tanto que las plantas con semillas de tamaño regular fueron todas negativas por PCR, demostrando que la inserción del ADN-T es responsable del fenotipo de alto rendimiento. (2) Caracterización del sitio de inserción de ADN-T [00126] Para caracterizar el sitio de inserción de ADN-T en HSA-20, las secuencias borde del ADN-T en el genoma de arroz se determinaron por el método TAIL-PCR (Liu y Chen, 2007, BioTechniques 43:649-656). Se encontró que el ADN-T se insertó en el brazo largo del cromosoma 1, y sus secuencias borde de cada lados fueron respectivamente SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51. [00127] Esta inserción no parece estar dentro de ningún gen conocido o teórico. Se insertó en el área entre el gen tipo EAR1 terminal (OsTEL) y un gen putativo que codifica para una proteina de dominio RabGAP/TBC. La inserción está aproximadamente 4.5 kb en la dirección 3' del gen OsTEL y 5.4 kb en la dirección 5' del gen putativo que codifica para un dominio RabGAP/TBC (Figura 3) (3) La mejora de la expresión del gen OsTEL en plantas HSA-20 [00128] Se compararon los niveles de ARNm de OsTEL y el gen putativo que codifica para un dominio RabGAP/TBC entre plantas HSA-20 y la línea parental no transgénica en plántulas de un mes usando análisis de RT-PCR. Se encontró que el ARNm de OsTEl es significativamente mayor en las plantas HSA-20 que en las plantas de control, no transgénicas , en tanto el ARNm del gen putativo que codifica para una proteína de dominio RabGAP/TBC fue aproximadamente el mismo. La expresión mejorada de OsTEL en las plantas HAS-20 fue probablemente debida al intensificador 35S de CaMV dentro del ADN-T que se insertó 4.9 kb en la dirección 3' del gen OsTEL.

Ejemplo 2. Construcción de vectores de expresión de OsTEL para transformación de arroz [00129] El vector de transformación pCambial300-35S-G10 es uno modificado de pCAMBIA1300. Específicamente, el gen de resistencia a higromicina htpll se digirió de pCAMBIAl300 por la enzima Xhol, y luego se volvió a colocar por un cásete de expresión del gen de tolerancia a glifosato GlOevo ( EPSP-sintasa ) . El cásete de expresión GlOevo está compuesto de un promotor de ubiquitina de maíz, pUbi, el gen de resistencia a glifosato GlOevo (EPSPS) y su terminador en la dirección 3' . Las secuencias de polinucleótido del vector pCambia 1300-35S-G10 y EPSPS se muestran como SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48, respectivamente. El promotor p35S en el vector pCambial300-35S-G10 proporciona un intensificador, que mejora la expresión del gen OsTEL de arroz. [00130] El gen de longitud completa de OsTEL está compuesto de una región promotora putativa, la secuencia codificadora y un terminador de putativo (mostrado en SEQ ID NO: 1) . Se obtuvo por amplificación por PCR. El promotor putativo de 1.8 kb y la región codificadora, incluyendo el terminador de aproximadamente 4.0 kb, se obtuvieron por PCR a partir de ADN genómico aislado de arroz (Oryza spp stiva. japónica) de forma separada. Los cebadores usados para PCR se listaron en la Tabla 1.

Tabla 1: Cebadores de PCR para clonación de OsTEL Cebadores secuencias sitios de Restricción pOsTEL-F: 5 ' -AAGCTTGAAACTAGTACTAGACATTACTCTTCCAATGC HindIII pOsTEL-R: 5 ' GGATCCACTTACCTACCCTACCAAGAACACCC BamHI pOsTEL- F : 5 ' ATCGCTATAGAGCATCCGAGCAAAAAACAGG pOsTEL-MR : 5 ' CCTGTTTTTTGCTCGGATGCTCTATAGCGAT OsTELCod-F: 5 ' -CAGGATCCAACAATGGAGGAAGGAGGTGGGAG BamHI OsTELter-R: 5 ' -CAGGTACCACCTCATCCTTCAACCATAAAGAAATGCT Kpnl [00131] Para eliminar el sitio BamHI dentro del promotor, se amplificaron dos fragmentos del promotor por los cebadores pOsTEL-F/pOsTEL- R y pOsTEL-R/pOsTEL-MF, respectivamente. Estos dos fragmentos entonces se combinaron como las plantillas para la siguiente ronda de PCR usando los cebadores pOsTEL-F y pOsTEL-R para obtener el promotor de longitud completa de OsTEL. Se introdujeron los sitios HindIII y BamHI en su extremo 5' y 3' , respectivamente. Este ADN de región promotora de 1.8 kb de longitud se clonó vector PEasy (Transgene Inc., Beijing), y se confirmó por secuenciación, y nombró pOsTEL. [00132] El fragmento que incluye la secuencia codificadora y el terminador putativo se obtuvo por PCR usando los cebadores OsTELcod-F y OsTELter-R. Se introdujeron los sitios BamHI y Kpnl en sus extremos 5' y 3' , respectivamente. El producto de PCR de 4.0 kb se clonó en el vector P-Easy (Transgene Inc., Beijing), y se confirmó por secuenciación, y se nombró como OsTEL-TER. [00133] La PCR se llevó a cabo usando el cebador de ADN-polimerasa de alta fidelidad star y sus reactivos de compañía de Takara (Daliang, China) . Los procedimientos y condiciones de la reacción de PCR son como sigue: Mezcla de reacción de PCR: [00134] Cebador star 1 ul Amortiguador de reacción 2X 50 ul Cebador 1 2ul Cebador 2 2ul Mezcla dNTP (10 mM cada una) 8ul ADN de genoma vegetal 100 ng H20 hasta 100 ul Programa de reacción de PCR: [00135] Paso 1: 98°C 3min Paso 2: 98°C 20s Paso 3: 20s Tm°C apropiado Paso 4: 72°C 3.5 min 35 ciclos de paso 2 a 4 Paso 5: 72°C lOmin Construcción de vector que tiene ADN-T con el gen OsTEL nativo e intensificador 35S [00136] Los dos productos de PCR clonados en el vector T-Easy se digirieron del vector por digestión con doble enzima, HindIII/BamHI y BamHI/Kpnl, respectivamente. Las dos fragmentos resultantes se clonaron de manera simultánea en pCambia 1300-35S-G10 entre sus sitios HindIII y Kpnl, generando el vector pCambial300-35S-G10-OsTEL (mostrado en la Figura 4 A) , que tiene un promotor 35S (p35S) en la en la dirección 3' del gen OsTEL. La secuencia de polinucleótido de longitud completa del gen OsTEL clonado de arroz se muestra como SEQ ID NO: 1.

Construcción de vector que tiene ADN-A con el gen OsTEL nativo pero que carece del intensificador 35S: [00137] Tanto el promotor 35S como el gen hptll se removieron del plásmido pCambial300 por digestión con EcoRI y Xhol. Entonces, el cásete de expresión de tolerancia a glifosato pUbi-EPSPS, anclado con los sitios de digestión de EcoRI y Xhol en los extremos apropiados, se ligó en ADN de pCAMBIA1300 digerido como se describe anteriormente. El vector resultante pCAMBIAl300-G10 (la secuencia se muestra como SEQ ID NO: 49) carece del promotor p35S en comparación al vector pCambial300-35S-G10 (como se describe en el primer párrafo del ejemplo 2). Se digirió pCAMBIA1300-G10 por HindIII y Kpnl, y luego se ligó al fragmento del gen OsTEL obtenido al digerir pCambial300-35S-G10-OsTEL también con HindIII y Kpnl. El vector resultante es pCAMBIA1300-G10-OsTEL. La estructura de ADN-T del este vector se muestra en la Figura 4B.

Construcción de vector usando p35S para activar la expresión de OsTEL: [00138] El promotor 35S de CaMV se modificó por PCR para tener un sitio HindIII y un sitio BamHI en su extremos 5' y 3', respectivamente. Este promotor se ligó al fragmento OsTEL-TER digerido con BamHI y Kpnl. El promotor 35S y el OsTEL-TER entonces se ligaron en pCAMBIAl300-G10 predigerido con HindIII y Kpnl, produciendo el vector de transformación pCAMBIA1300-G10-p35S-OsTEL (Figura 4C) .

Construcción de vectores de transformación para ZmTEL de maíz [00139] El gen ZmTEL nativo de maíz, incluyendo su promotor y terminador, se obtuvieron mediante amplificación por PCR. Las secuencias de los cebadores de PCR usados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Cebadores de PCR usados para amplificación por PCR del gen ZmTEL Cebadores de PCR usados para clonación de ZmTEL en maiz Cebador Secuencia ZmTE-A-F : 5 ' -GGAAGCTTGGCGCTTTTTCTGAGTGCCAATCACT' ZmTE-A-R : 5 ' -CAGGCTGGGAAGCTTGTGTGTGTTCTTGCA* ZmTE-B-F : 5 ' -TGCAAGAACACACACAAGCTTCCCAGCCTG* ZmTE-B-R : 5 ' -GTGAAAAGCATGGCCGAAGTCACTACTGCCTC ZmTE-C-F 5 ' -CTTCGGCCATGCTTTTCACAGATCCGTAGC ZmTE-C-R : 5 ' -GTGGTACCGAGGTTTGAATTACCCCCCTATTTAAGA# *La parte subrayada representa el sitio HindIII; # la parte subrayada representa el sitio Kpnl. [00140] Primero, tres fragmentos de ADN del gen ZmTEL de maiz, nombrados como ZmTEL-A, ZmTEL-B y ZmTEL-C, se amplificaron del genoma de maiz por PCR con los pares de cebadores ZmTE-AF abd ZmTE-A-R, ZmTEl-B-F y ZmTE-B-R y ZmTEl-C-F y ZmTE-C-R, respectivamente. Entonces, se creó un fragmento combinado de ZmTEL-B y ZmTEL-C por PCR usando los productos de PCR de primera redonda combinados ZmTEL-B y ZmTEL-C como la plantilla y ZmTE-B-F y ZmTE-C-R como cebadores. Este fragmento combinado se digirió por HindIII y Kpnl, y junto con el fragmento ZmTEL-A se digirió con HindIII, se ligó en el plásmido pCambial300-35S-G10 que se ha predigerido con HindIII y Kpnl. Un clon con ZmTEL-A ligado al vector en la orientación correcta se seleccionó y nombro pCambial300-35S-G10-ZmTEL (Figura 5) . La secuencia de polinucleótidos del gen ZmTEL de maíz se muestra como SEQ ID NO: 5.

Ejemplo 3. Transformación de arroz [00141] En la técnica es bien conocida la transformación de arroz mediante el método mediado por Agrobacterium. Ver, por ejemplo, Hiei et al. (1997) Plant Mol Biol 35:205-218; Hiei et al. (1994) Plant J 6:271 a 282; Nishimura et al. (2007) Nature Protocols 1:2796-2802; todo lo cual se incorporan en a presente como referencia. [00142] Los cuatro vectores construidos como se describe en el ejemplo 2 se transformaron en arroz "Xiushui 134" usando el método de transformación mediado por Agrobacterium (Lu y Gong (1998) Chínese Bulletin of Life Sciences 10:125-131 y Liu et al. (2003) Molecular Plant Breeding 1:108-115). El procedimiento se modificó ligeramente para acomodar el gen de tolerancia a glifosato como el marcador de selección. Los callos inducidos de las semillas maduras de "Xiushui 134" se usaron como el receptor. Los clones individuales de EHA4404 que contiene los vectores binarios de pCambial300-35S-G10-OsTEL, pCAMBIA1300-G10-OsTEL, pCAMBIA1300-G10-p35S- OsTEL y pCambial300-35S-G10-ZmTELl , respectivamente, se cultivaron de manera separada para infectar callos. Los callos preparados se remojaron en la suspensión de células bacterianas (00595*0.4) que contiene ???µ? de acetosiringona, y se co-cultivaron durante 30 min (con agitación ocasional). Entonces, los callos se transfirieron al medio de co-cultivo y se incubaron en la oscuridad durante 2 - 3 días a 28C. Después del co-cultivo, los callos se enjuagaron con agua estéril y luego se cultivaron en el medio selectivo con una concentración apropiada de higromicina durante dos meses a 28°C en la oscuridad (cultivados de manera sucesiva una vez a la mitad de tiempo) . Después de la selección, los callos transgénicos vigorosamente cultivados se transfirieron al medio de pre-diferenciación para una incubación de aproximadamente 10 días. Entonces, los callos pre-diferenciados se transfirieron al medio de diferenciación y se incubaron para diferenciación y brote a 30°C con un fotoperiodo de 16 h. Después de 2 ~ 3 semanas, las plántulas de regeneración resistentes se transfirieron al medio de enraizamiento que contiene 0.1 mg/L de glifosato para enraizamiento vigorización de las plántulas. Las plántulas regeneradas bien cultivadas se lavaron para remover el agar y se trasplantaron a agua en un invernadero para identificación. Los ingredientes específicos del medio mencionado en esta parte se muestran en el ANEXO I.

Ejemplo 4: Análisis de arroz transgénico para mejora de rendimiento [00143] Los vectores de ADN-T pCambial300-35S-G10-OsTEL, pCAMBIA1300-G10-OsTEL, pCAMBIA1300-G-10-P35-OsTEL, y pCambial300-35S-G10-ZmTEL se usaron para transformar arroz XS134 (O. sativa japónica) usando transformación mediada por Agrobacterium. Se obtuvieron al menos 100 eventos transgénicos independientes para cada construcción. Hubo eventos para cada construcción que mostraron uno o más de los siguientes fenotipos: mayor altura de planta, las semillas más grandes, menor número de cañas, y diámetro seco más ancho. Muchos eventos produjeron semillas cuyo peso promedio fue 30%, 40%, 50%, y aun 60% más que el peso promedio de semillas de plantas de control. La tabla 4 resume los fenotipos observados entre diferentes construcciones.

Tabla 4. Fenotipos de arroz transgénico que expresan OsTEL y ZmTEL. Línea parental para transformación de una variedad vegetal de élite de japónica "XS-134" desarrollada por Zhejiang Jiaxing Agriculture, Academy, Jiaxing, Zhejing, China.

Vector Número de eventos fenotipos creados observados pCambial300-35S-G10-OsTEL 480 410 pCAMBIA1300-G10-OsTEL 300 71 pCAMBIA1300-G10-p35S-OsTEL 200 46 pCambial300-35S-G10-ZmTEL 270 230 [00144] Los resultados demostraron que OsTEL puede mejorar el rendimiento cuando su expresión está bajo el control de varios promotores. Tanto el promotor nativo como los promotores constitutivos trabajaron. Adicionalmente , un intensificador 35S de CaMV en la dirección 3' del gen OsTEL o ZmTEL incrementan la frecuencia de los fenotipos en los eventos transgénicos. También, la expresión del gen TEL heterólogo de Zea mays en arroz puede mejorar el rendimiento del arroz así como el promotor endógeno del arroz. [00145] El evento nombrado OsX-2, transformado con pCambial300-35S-G10-OsTEL, mostró un 18.6% de incremento en comparación con las plantas de control no transgénicas bajo las mismas condiciones de plantación agrícola y densidad de plantación.

Ejemplo 5. Transformación de maíz y análisis de maíz transgénico 1) Transformación de maíz [00146] Está bien establecida la transformación de maíz mediante el método mediado con Agrobacterium (Frame et al. 2002, Plant Physiol .129 : 13-22 ) . Se uso glifosato como el agente de selección en este experimento. De forma breve, la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, que contiene la construcción de ADN-T pCambial300-35S-G10-ZmTEL y pCambial300-35S-G10-OsTEL respectivamente, se preparó para transformar embriones de maíz 8-10 días después de la fertilización (1.0-1.5mm de longitud) . Los embriones se incubaron con Agrobacterium durante 2-3 días a 22°C, y luego se movieron al medio de inducción de callo que contiene Timentina a 200 mg/L) . Después del cultivo en la oscuridad durante 10-14 días a 28°C, los callos se movieron al medio de selección que contiene glifosato 2 mM, y se continuó cultivando durante 2-3 semanas a 28°C. Después de otro cultivo de 2-3 semanas en medio de selección renovado de glifosato, los callos supervivientes se movieron al medio de regeneración, y se cultivaron durante 10-14 días y luego se movieron al medio de regeneración fresco durante otros 10-14 días. Los brotes generados entonces se movieron al medio de enraizamiento que contiene glifosato 0.1 mM. Las plántulas supervivientes se movieron a un invernadero para crecimiento y para producir semillas . 2) Análisis de maíz transgénico [00147] Se obtuvieron aproximadamente 120 eventos cada uno de pCambial300-35S-G10-ZmTEL y pCambial300-35S-G10-OsTEL.

Aproximadamente 80 eventos de ambas construcciones mostraron uno o más de los siguientes fenotipos: crecimiento más rápido y más fuerte, altura más alta de planta, espigas más grandes, y granos más grandes (Figura 12) . [00148] Eventos de TE13 y TE31, transformado con pCambial300-35S-G10-ZmTEL, mostraron 25.5% y 21.9% más peso por espiga que las plantas de maíz de control. El análisis por PCR de tiempo real de la expresión del gen ZmTEL indicó que la expresión de ZmTEL se mejoró significativamente tanto TE13 como en TE31. La cantidad de ARNm de ZmTEL tanto en TE13 como en TE31 fue aproximadamente 40 veces el nivel encontrado en las hojas de la planta de control en la etapa de floración.

Ejemplo 6. Clonación y construcción del vector de los genes TEL de diferentes especies vegetales [00149] En base al análisis de genes homólogos a TEL encontrados en la búsqueda de bases de datos de genes de diferentes plantas, se diseñaron cebadores de PCR para la clonación de los homólogos del gen TEL (mostrado en la tabla 5) . Usando los genomas de diferentes plantas como las plantillas y los cebadores apropiados, los genes TEL de longitud completa, incluyendo la región promotora, la secuencia codificadora, y el terminador, se amplificaron de manera separada a través de PCR de varias plantas. La técnica de extracción de genoma vegetal se describe anteriormente (Alien GC et al 2006, Nat . Protoc. 1:2320-2325) . Las reacciones de PCR se llevaron a cabo siguiendo procedimientos normalmente, esencialmente como se describe en el ej emplo 1.

Tabla 5: Cebadores usados para clonación de genes TEL de varias plantas Cebadores de PCR usados para la clonación de TEL en diferentes plantas Secuencia de cebador* Sitio de digestión enzimática GhTELl-F CTGCAGGACATTAGAGTTAGGACCTTATGGAACATGA PstI GhTELl-R GGTACCACGAGCTAATCTCTATCTGTTAACCAGA Kpnl GhTEL2-F AAGCTTCTAAGCACAAATTTGACTTAG HindIII GhTEL2-R GGTACCTCACCAACTAGTTGAATTAATGGTGACA Kpnl AtTELl-F GGGGTACCCCCGAAAAGAATCATACTTGTAGAACA Kpnl AtTELl-R GGGGTACCATAAGATTAAAGTTGTAGTCAACCATCACTATC Kpnl AtTEL2-F GGAAGCTTGGTCGAGACATGGTACTGAGTAAAACCCTA HindIII AtTEL2-R GGAAGCTTAACCTGAACAAGCAAAAAAACACTCACATC HindIII BrTEL-F AAGCTTGAACGATTAGGCTGTTGTAGG HindIII BrTEL-MR GGATCCGATGGAGATAGTCCGTACGACG BamHI BrTEL-MF GGATCCAAGAATGTTCACGTTCTTTAATATCCC BamHI BrTEL-R GGTACCTAAATGAATTTGTGTTGTTGGATTTGG Kpnl TaTEL-F AAGCTTGTGCAGTGAGTTGGAGAGCAACTTTGC Hindlll TaTEL-MR GAGGTCAAAGAAGTGCACTGTGGCCACG ApaLI TaTEL-MF CGTGGCCACAGTGCACTTCTTTGACCTC ApaLI TaTEL-R GGTACCCATCACCCGCATGATATATTTTCATACTACG Kpnl GmTELl -F GTCGACTTAACACCAAAACAAACATGCAGTATCT Salí GmTELl -R GTCGACCATGTTTATTACCTAAATCTCCTACATCGA Salí GmTEL2 -F AAGCTTGGAAATGGAAATCTAAGGGATAAAGCAG Hindlll GmTEL2 -R GTCGACGTGAGAATCATAATACAGCTAGGATTTCTCTA Salí * Las partes subrayadas representan los sitios de digestión enzimática.

Clonación de los genes homólogos TEL de algodón [00150] Se encontraron dos genes homólogos de TEL del genoma de Gossypium raimondii publicado en linea a través de alineación de secuencia. Se diseñaron dos pares de cebadores, GhTELl-F/GhTELl-R y GhTEL2-F/GhTEL2-R (ver tabla 5), en base a las secuencias de estos dos genes. Usando el ADN genómico de la especie de algodón local Gossypium hirsutum como plantilla, se amplificaron a través de PCR dos fragmentos de ADN de TEL de GhTELl y GhTEL2 con los pares de cebadores GhTELl-F/GhTELl-R y GhTEL2-F/GhTEL2-R, respectivamente. Los fragmentos de ADN obtenidos incluyendo promotor, la región codificadora, y el terminador, se nombraron pGhTELl-GhTELl-ter y pGhTEL2-GhTEL2-ter , respectivamente (las secuencias se muestran en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 19) . [00151] Los extremos de pGhTELl-GhTELl-ter se anclaron de manera separada con los sitios PstI y Kpnl a través de PCR. De manera similar, se adicionaron los sitios HindIII y Kpnl en los extremos de pGhTEL2-GhTEL2-ter . El fragmento pGhTELl-GhTELl-ter se cortó por digestión doblemente enzimática PstI y Kpnl y luego se clonó en el plásmido pCambia 1300-35S-G10 entre sus sitios PstI y Kpnl, generando un nuevo plásmido llamado pCambial300-35S-G10-GhTELl, la estructura de ADN-T del cual se muestra en la Figura 6 (A). De manera similar, usando HindIII y Kpnl, el fragmento pGhTEL2-GhTEL2-ter se digirió doblemente y luego clonó en los sitios HindIII y Kpnl de pCambial300-35S-G10 , generando el vector pCambial300-35S-G10-GhTEL2 con su estructura de ADN-T mostrada en la Figura 6 (B) .

Clonación de los genes TEL de Arabidopsis thaliana. [00152] Se encontraron dos genes homólogos de TEL del genoma de Arabidopsis thaliana (publicado en línea) a través de alineación de secuencias. Dos pares de cebadores, AtTELl-F & AtTELl-R y AtTEL2-F & AtTEL2-R (ver tabla 5), se diseñaron con base a las secuencias de estos dos genes. El ADN del genoma de Arabidopsis thaliana se usó como plantilla. Dos genes tipo TEL-1 de AtTELl y AtTEL2 se amplificaron a través de PCR con los pares de cebadores de AtTELl-F & AtTELl-R y AtTEL2-F & AtTEL2-R, respectivamente. Los fragmentos de ADN resultantes incluyendo el promotor, la región codificadora, y el terminador, se llamaron de manera separada como pAtTELl-AtTELl-ter y pAtTEL2-AtTEL2-ter, cuyas secuencias se muestra en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23. [00153] Los extremos pAtTELl-AtTELl-ter se anclaron ambos con el sitio Kpnl a través de PCR. El fragmento pAtTELl-AtTELl-ter se digirió con Kpnl y luego se insertó en el plásmido de pCambia 1300-35S-G10 en su sitio Kpnl. Se generó un nuevo plásmido nombrado pCambial300-35S-G10-AtTELl , la estructura del ADN-T del cual se muestra en la Figura 7 (A) . De manera similar, se adicionó un sitio HindIII en ambos extremos de pAtTEL2-AtTEL2-ter. El fragmento pAtTEL2-AtTEL2-ter digerido con HindIII se insertó en el plásmido pCambial300-35S-G10 en su sitio HindIII. El vector resultante fue pCambial300-35S-G10-AtTEL2 y su estructura de ADN-T se muestra en la Figura 7 (B) .

Clonación del gen TEL de Brassica . [00154] Se encontró un gen TEL del genoma de Brassica rapa través de la búsqueda blast de secuencia. El gen BrTEL se dividió en dos partes para clonación por PCR, una (nombrada como BrTEL-A) incluye el promotor y una región codificadora parcial, y la otra (nombrada como BrTEL-B) incluye la parte restante de la región codificadora y el terminador. Dos pares de cebadores, BrTEL-F/BrTEL-MR y BrTEL-MF/BrTEL-R (tabla 5) , se digirieron con base a las secuencias del gen BrTEL. Se amplificaron de manera separada BrTEL-A y-B BrTEL del ADN de genoma de Brassica rapa con pares de cebadores de BrTEL-F/BrTEL-MR y BrTEL-MF/BrTEL-R, respectivamente . [00155] Mediante PCR, los extremos de BrTEL-A se anclaron con un sitio HindIII y BamHI, respectivamente. Al mismo tiempo, el BrTEL-B se ancló con los sitios BamHI y Kpnl en sus extremos, respectivamente. El BrTEl-A doblemente digerido con HindIII/BamHI y BrTEL-B doblemente digerido con BamHI/Kpnl entonces se clonaron en una ligación tridireccional en el plásmido de pCambial300-35S-G10 entre los sitios HindIII y Kpnl. El vector pCambial300-35S-GlO-BrTEL se construyó y su estructura de ADN-T se muestra en la Figura 8 La secuencia completa de nucleótidos del gen BrTEL clonados se mostró como SEQ ID NO: 45.

Clonación del gen TEL de trigo [00156] Los métodos de la búsqueda del gen TEL y el diseño de los cebadores de PCR en trigo fueron los mismos como aquellos descritos anteriormente. El gen TaTEL de Triticum aestivum se dividió en dos partes para amplificación por PCR, una (nombrada como TaTEL-A) se incluye el promotor y la región codificadora parcial, y la otra (nombrada TaTEl-B) incluye la parte restante de la región codificadora y el terminador. Dos pares de cebadores, TaTEL-F/TaTEl-MR y TaTEL-MF/TaTEL-R (tabla 5) , se diseñaron para amplificar TaTEL-A y TaTEl-B, de manera separada del genoma de Triticum aestivum con los pares de cebadores de TaTEL-F/TaTEL-MR y TaTEL-MF/TaTEL-R, respectivamente. [00157] Usando PCR, los extremos de TaTEL-A se anclaron con los sitios HindIII y ApaLI, respectivamente. Al mismo tiempo, el TaTEL-B se ancló con los sitios ApaLI y Kpnl en sus extremos, respectivamente. El TaTEL-A doblemente digerido con HindIII y ApaLI y el TaTEL-B doblemente digerido con ApaLI y Kpnl entonces se clonaron en una ligación tridireccional en el plásmido pCambia 1300-35S-G10 entre los sitios HindIII y Kpnl. El vector resultante pCambial300-35S-G10-TaTEL se construyó; su estructura de ADN-T se muestra en la Figura 9. La secuencia completa de nucleótidos del gen TaTEL clonada se muestra como SEQ ID NO: 9. Clonación de los genes TEL de soya [00158] Hay dos genes TEL en el genoma de soya (Glycine max) . Los dos genes se amplificaron a partir de ADN genómico de Glycine max usando PCR con pares de cebadores de GmTELl-F/GmTELl-R, y GmTEL2-F/GmTEL2-R (ver tabla 5), respectivamente. Los fragmentos de ADN adquiridos, incluyendo sus regiones promotoras, regiones codificadoras, y terminadores , se nombraron de manera separada pGmTELl-GmTELl-ter y pGmTEL2-GmTEL2-ter, y sus secuencias completas de nucleótido se muestran en SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15. [00159] Los extremos de ambos fragmentos se anclaron con un sitio Salí a través de PCR. El fragmento pGmTELl-GmTELl-ter se digirió por Salí y luego se insertó en el plásmido pCambia 1300-35S-G10 en su sitio Salí. El vector de transformación vegetal resultante pCambial300-35S-G10-GmTELl, se construyó la estructura ADN-T del cual se muestra en la Figura 10(A). De manera similar, se adicionaron un sitio HindIII y un sitio Salí en los extremos de pGmTEL2-GmTEL2-ter, respectivamente. El fragmento HindIII/SalI digerido doblemente con pGmTEL2-GmTEL2-ter se insertó en el plásmido pCambial300-35S-G10 entre sus sitios HindIII y Salí. El vector resultante fue pCambial300-35S-G10-GmTEL2 y su estructura de ADN-T se muestra en la Figura 10 (B) . [00160] Usando procedimientos técnicos resumidos anteriormente, o procedimientos comparables conocidos en la técnica, los homólogos del gen TEL se pueden aislar y caracterizar a partir de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero no limitado a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, angiospermas y gimnospermas . Los ejemplos de las plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (maíz) , sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientas, patata, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, y colza oleaginosa, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, cártamo, cacahuate, camote, yuca, café, coco, piña, cítricos, cacao, té, plátano, manzana, pera, melocotón, aguacate, higo, guayaba, mango, oliva, papaya, anacardo, macadamia, almendras, avenas, vegetales, ornamentales y coniferas . [00161] Las vegetales incluyen, pero no se limitan a, tomates, lechuga, judias verdes, habas, guisantes, y miembros del género Curcumis tal como pepino, melón y melón de agua. Los ornamentales incluyen, pero no se limitan a, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, claveles, flor de pascua, y crisantemo. De manera preferente, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientas, patata, algodón, arroz, soya, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza oleaginosa, etcétera) . [00162] Los cultivos energéticos, incluyendo pero no limitados a césped de pradera, Arundo, Camelina, Jatropha y miscanthus.

Ejemplo 7: Análisis de secuencias de genes TEL de plantas [00163] Al buscar las bases de datos y al usar clonación a base de PCR, se obtuvieron genes tipo Mei2 putativos de varias especies vegetales. Las secuencias codificadas de aminoácidos de estos genes TEL se listan en SEQ ID NOs : 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, y 46 como se lista anteriormente, hay muchos genes LMA de varias plantas que se pueden identificar en las bases de datos. Se construyó un dendrograma por Vector NT con base a la alineación de secuencias de aminoácidos de la proteina AML seleccionada AML y las proteínas TEL (Figura 1). Hay dos distintos grupos en el dendrograma, el grupo AML, y el grupo TEL. Por lo tanto, los genes TEL y los genes AML de las plantas se pueden distinguir por análisis filogenético con base a sus secuencias de aminoácidos. [00164] Las proteínas TEL descubiertas de varias especies vegetales comparten similitud significativa entre sí. Sin embargo, la parte más conservada de las proteínas TEL de las plantas es la región RRM3 (Figura 2) . En comparación a las proteínas AML, dos de las características más sorprendentes de las proteínas TEL son la región adicional del motivo específico TEL dentro del dominio RRM3 (Figura 2) y el elemento conservado fuera del C-término de RRM3 (Figura 2) . Las proteínas AML y la proteína Mei2 de levadura no tienen ninguna de estas dos características. De manera interesante, la proteína tipo Mei2 de O. tauri contiene un motivo de secuencia TEL C-terminal conservado, en tanto que no tiene el motivo específico de TEL dentro del dominio RRM3. 0. tauri es una especie unicelular de alga verde marina, que corresponde a los Prasinophyceae, una clase de tempranamente divergente dentro del linaje de plantas verdes. Igualmente, la proteína tipo Mei2 de O. tauri representa un ancestro común tanto a las proteínas TEL como a las proteínas AML de las plantas modernas. [00165] El motivo que compone parte del RRM3 y su región con cebador a exterior C-terminal (SEQ ID NO: 4 en TEL de arroz) está altamente conservado entre diferentes proteínas TEL vegetales. La identidad de secuencia de este motivo entre diferentes proteínas TEL de diferentes especies vegetales es 68% o superior. Este motivo de TEL de arroz comparte 59% de identidad con el motivo de la proteína tipo Mei2 de 0. tauri. Sin embargo, este motivo comparte identidad de secuencia de aminoácidos de menos de 58% con cualquier motivo de cualquier proteína AML vegetal. [00166] El dominio RRM3 de la proteína Mei2 de levadura es el dominio crítico para las funciones (). De esta manera, el RRM3 de las proteínas TEL vegetales también puede jugar un papel importante en la mejora del rendimiento. Sin embargo, el RRM3 no retiene únicamente la función TEL en el estudio del arroz transgénico. De esta manera, además del dominio RRM3, la región conservada fuera del C-término de RMM3 también puede ser crítica para sus funciones biológicas.

Ejemplo 8: Generación de anticuerpos contra proteínas TEL vegetales y su uso para detección de proteína TEL [00167] El ADNc que codifica para la longitud completa de la proteína OsTEL se obtuvo por RT-PCR usando los cebadores OsTEL-f ( 5 ' GGATCCATGGAGGAAGGAGGTGGGAGTGGC ) y OsTEL-r (5' CTCGAGCTAGTCAGTGTAGCCTAGGCGCTGTAGC) . El producto de PCR se clonó en pET32b (Novagen) usando los sitios de enzimas de restricción BamHI y Xhol, dando por resultado el vector de expresión pET32b-OsTEL . La secuencia de ADNc se determinó de manera completa (SEQ ID NO: 56), y entonces el uso para la expresión en E. coli. La proteina expresada entonces se purificó y uso para inmunizar conejos por una compañía de servicios de anticuerpos en Hangzhou. Se recolectó el antisuero de los conejos inmunizados . [00168] El antisuero obtenido se usó para detectar la proteína OsTEL tanto en arroz transgénico que expresa el gen OsTEL adicional como en arroz no transgénico con solo la expresión OsTEL endógena. De manera significativa se detectó más proteína OsTEL en líneas de arroz transgénico.

Ejemplo 9: Transformación genética de Cañóla [00169] . La técnica de transformación de colza es bien conocida en la técnica. El cotiledón, hipocotilo, y el tallo de la colza se han usado todos como tejido diana para transformación por varios investigadores. Por ejemplo, Moloney et al. (1989) encontró que el extremo cortado de los pecíolos de cotiledón se transformó fácilmente usando vectores binarios de Agrobacterium. Púa et al. (1987) desarrolló un sistema de regeneración de secciones de tallo con una velocidad de transformación de hasta 10%. Moloney et al (1989) formuló la velocidad de transformación a 55% usando el pecíolo como tejido diana. [00170] El procedimiento detallado para la transformación de colza usando en la presente fue como sigue. La semilla de colza se esterilizó usando cloruro mercúrico al 0.5% durante 10 minutos, después se lavó con agua estéril 3-4 veces, y se incubó en medio MS (30 g/L de sacarosa y 6 g/L de agar) . Después de la incubación en la oscuridad durante dos días, la semilla se transfirió a una incubadora con un fotoperíodo de 16 h de luz: 8 h de oscuridad. Después de 6-8 días, el hipocotíleo de la plántula estéril se cortó como receptor para transformación genética. El hipocotíleo se transformó sobre medio MS sólido de pre-incubación (1.0 mg/L 2.4-D, 1.0 mg/L 6BA, 30 g/L de sacarosa, y 6 g/L de agar) durante 72 h en la oscuridad. El hipocotíleo pre-incubado se sumerge en una suspensión celular de Agrobacterium que contiene el plásmido de pCambial300-35S-G10-BrTEL durante 8-10 minutos, y luego se transfirió en el medio MS sólido (1.0 mg/1 de 2,4-D, 1.0 mg/L 6BA, 100 UM, 30 g/1 de sacarosa y 6 g/1 de agar) (después de que se absorbió el exceso de suspensión de Agrobacterium usando papel absorbente estéril) y se cultivó subsiguientemente durante 48 h en la oscuridad. [00171] Después de que se lava con agua estéril que contiene 500 mg/1 de cefaloglicina , el hipocotíleo co-incubado se transfirió a medio MS sólido selectivo (1.0 mg/L 2, 4-D, 1.0 mg/L 6BA, 12 mM de glifosato, 500 mg/L de cefaloglicina, 30 g / L de sacarosa, y 8 g/L de canakeo) durante al menos 14 días en luz, y luego se subcultivó en el medio MS sólido de diferenciación (2.0 mg/L de ZT, 4.0 mg/L de 6BA, 5 mg/L de AgN03, glifosato 12 mM, 500 mg/L de cefaloglicina, 30 g/L de sacarosa, y 8 g/L de canakeo) a la luz, se transfirió sucesivamente cada dos semanas hasta el crecimiento de plántulas resistentes. Las plántulas resistentes se transfirieron en el medio MS sólido de diferenciación de tallo (2.0 mg/L de ZT, 3.0 mg/L de 6BA, 5 mg/L de AgN03, glifosato 2 mM, 500 mg/L de cefaloglicina, 30 g/L de sacarosa, y 8 g/L de canakeo) y se incubó en luz. Cuando el tallo creció hasta 1 cm, se cortó y se puso en el medio de MS sólido de enraizamiento (0.2 mg/L de IBA, 30 g/L de sacarosa, y 8 g/L de canakeo) durante una incubación de 7 días hasta que crecieron las raices del tallo.

Ejemplo 10: Transformación de soya [00172] El procedimiento para obtener soyas transgénicas usadas aquí es la tecnología existente Deng et al., 1998, Plant Physiology Communications 34:381-387; Ma et al., 2008, Scientia Agricultura Sínica 41:661-668; Zhou et al., 2001, Journal of Northeast Agricultural University 32:313-319). Las soyas saludables, regordetas y maduras se seleccionaron y se desinfectaron en etanol al 80% durante 2 minutos, se limpiaron con agua libre de bacterias, y se esterilizaron en un secador relleno con cloro (generado por reacción química de 50ml de NaClO y 2 mi de HC1 concentrado) durante 4-6 horas. Las soyas estériles se sembraron en medio B5 en una encimera y se incubó a 25°C durante 5 días con una intensidad de luz de 90-150 µ mol de fotones m-2 s-1. Cuando el cotiledón se volvió verde y se agrietó la cáscara de la semilla, se recolectó el brote estéril del frijol. El brote de frijol removido de epicotileo y hipocotileo se cortó longitudinalmente cincuenta cincuenta, dando por resultado dos piezas de explante tanto con cotiledón y epicotileo. El explante se rascó en el nodo de cotiledón y epicotileo durante 7-8 cortes y se usó como el tejido diana para infección . [00173] Para el uso se cultivaron de manera separada colonias individuales de Agrobacterium que contiene el vector pCambial300-35S-G10-GmTELl y pCambial300-35S-G10-GmTEL2 , respectivamente. Los explantes preparados se remojaron en la suspensión celular de Agrobacterium durante 30 min. Entonces, los tejidos infectados se transfirieron al medio de co-cultivo 1/10 B5 después de que se removió la suspensión celular en exceso usando un papel filtro estéril limpio, y se incubó a 25°C durante 3-5 días en la oscuridad . [00174] Los tejidos co-cultivados se lavaron con el medio líquido B5 para remover el Agrobacterium, y luego se pusieron en el medio B5 sólido para una incubación de 5 días a 25°C para el brote. Los tejidos inducidos de plúmula se transfirieron al medio B5 selectivo que contiene glifosato 0.1-0.5mM y se incubó a 25°C a la luz durante 4 semanas, con el medio que se cambia cada 2 semanas. Los tejidos seleccionados de plúmula se transfirieron al medio MS sólido para cultivo de plántulas a 25°C con luz. Entonces, las plántulas transgénicas se transfirieron al medio 1/2 B5 para inducción de raíces. Finalmente, las plántulas generadas se lavaron para remover el agar y se plantaron en el invernadero para caracterización adicional.

Ejemplo 11: Mejora de la expresión del gen TEL mediante inserción de intensificadores cerca de genes endógenos [00175] En genética, un intensificador es una región corta de ADN que se puede unir con proteínas (específicamente, los factores trans-actuantes , tal como un conjunto de factores de transcripción) para mejorar los niveles de transcripción los genes (por lo tanto el nombre) en una agrupación génica. En tanto que los intensificadores usualmente son cis-actuantes , un intensificador no necesita estar particularmente cerca de los genes en los que actúa, y algunas veces no necesita estar localizado en el mismo cromosoma. (Spilianakis et al. (2005) Nature 435 (7042): 637-45. 25 doi : 10.1038/nature03574. PMID 15880101). Se puede colocar un intensificador en la dirección 5' o en la dirección 3' del gen que regula. Adicionalmente , un intensificador no necesita estar localizado cerca del sitio de inicio de transcripción para afectar la transcripción, puesto que algunos se han encontrado localizados varios cientos de miles de pares de base en la dirección 5' o en la dirección 3' del sitio de inicio. Los intensificadores no actúan en la región promotora misma, sino que se unen por proteínas activadoras. Estas proteínas activadoras interactúan con el complejo mediador, que recluta la polimerasa II y los factores de transcripción generales que entonces empiezan a transcribir los genes. También dentro de los intrones se pueden encontrar intensificadores . La orientación de un intensificador puede aún estar invertida sin afectar a su función. Adicionalmente, un intensificador se puede escindir y insertar en otra parte del cromosoma, y afectar aun la transcripción génica. [00176] La región en la dirección 3' del gen TEL de Zea mays se seleccionó para insertar un cásete de expresión que contiene un intensificador 35S doble por el método TALEN. La región seleccionada como objetivo o diana fue: Ctgtttatacaa gagccctatcaatgatggcctaaatacggagactactagatcaactaac (SEQ ID NO: 58). Otras regiones cercanas también serán suficientes para la inserción del intensificador . El cásete de expresión de un gen GlOevo (EPSPS, SEQ ID NO: 48) tiene un doble promotor 35S, que contiene dos intensificadores 35S. La GlOevo EPSP-sintasa proporciona tolerancia a glifosato como un marcador seleccionable para transformación, en tanto que el promotor 35S proporciona un elemento intensificador para mejorar la expresión del gen TEL que está localizado en una región adyacente. [00177] Para construir un vector de transformación, un fragmento de ADN compuesto del cásete de expresión GlOevo y las secuencias que flanquean cada sitio de la secuencia objetivo en el maíz se construyó (SEQ ID NO: 59) . Este fragmento tiene un sitio Xhol y un sitio Kpnl en sus extremos y se clonó en pCAMBIA1300 predigerido con las mismas dos enzimas, Xhol y Kpnl. El vector resultante se nombró pCambial300-35S-G10-Rec . [00178] La secuencia seleccionada como diana u objetivo en el genoma de maíz (SEQ ID NO: 58) está aproximadamente 3 kb en la dirección 3' del gen TEL. Con base a esta secuencia diana, se diseñaron y se sintetizaron un par de Talens diseñadores, TALEN-F y TALEN-R. Los casetes de expresión de TALEN-F y TALEN-R se construyen usando el promotor 35S de CaMV y el promotor de actina de arroz, respectivamente. Las secuencias de ADN de los casetes de expresión que contienen TALEN-L y TALEN-R se muestran en SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61, respectivamente. El fragmento de ADN del cásete TALEN-F, que tiene un sitio de restricción de HindIII y EcoRI en sus extremos, y el fragmento de ADN del cásete TALEN-R, que tiene un sitio de restricción EcoRI y Kpnl en sus extremos, se ligan en una ligación tridimensional en pCambial300-35S-G10-Rec predigerido con HindIII y Kpnl. El vector resultante pCambial300-35S-G10-Rec-TALEN-FR contiene ambos casetes de expresión de TALEN-F y TALEN-R (figura X) . [00179] Se transforma pCambial300-35S-G10-Rec-TALEN-FR en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 y se usa para transformar maíz. El medio de selección que contienen glifosato 2 mM se usa para selección de cultivo de callo. Las plantas transgénicas resultantes de maiz se examinan para eventos que se hayan insertado correctamente en el área objetivo por el método de PCR. [00180] Se pueden usar otros métodos de inserción génica dirigida conocidos en la técnica para introducir un intensificador transcripcional en la región cercana al gen TEL de una especie vegetal deseada. De esta manera, la expresión del gen endógeno se puede incrementar con respecto a los niveles endógenos normales, dando por resultado vigor vegetal mejorado y rendimiento incrementado. Estos métodos para mejorar el rendimiento se pueden usar solos o en unión con genes heterólogos para producir plantas con vigor y/o rendimiento incrementado. [00181] Se incluyen en el listado de secuencias las siguientes secuencias : [00182] La invención uso muchas técnicas de biología molecular, bioquímica y cultivo de tejido. Estas técnicas están disponibles en la técnica. Los métodos detallados de las técnicas se pueden referir en Current Protocols in Molecular Biology y Molecular Cloning (edición por Ausubel, John Wiley and Sons Pres.) : Un Manual Labortory, 3a Edición (ed por J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). [00183] Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de habilidad de aquellos expertos en la técnica a la cual corresponde esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicará de manera especifica e individual para que se incorpore como referencia. [00184] Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar el rendimiento y/o crecimiento vegetal en una planta de interés, el método está caracterizado porque comprende transformar la planta con una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en una planta operablemente enlazado a una secuencia TEL en donde la secuencia TEL codifica para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una de las siguientes características: i) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; ii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RR 3) de TEL en la cual están conservados al menos 3 de los 4 residuos de Asn-His-Cys-Ile en la planta; iii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo conservado específico de TEL fuera del C-término del dominio RRM3 y en donde están conservados al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido: Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/Glu-N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo); y, iv) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción de ADN comprende además al menos un intensificador que mejora la expresión de un gen en una planta operablemente enlazado al promotor y la secuencia TEL.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) .

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, caracterizado porque el promotor es un promotor TEL.

5. Un método para incrementar el crecimiento y/o rendimiento vegetal en una planta de interés, el método está caracterizado porque comprende incorporar en el genoma de la misma al menos un intensificador dentro de aproximadamente 30kb del gen TEL.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S de CaMV.

7. Una planta transformada que exhibe expresión incrementada de una secuencia TEL, en comparación a una planta de control, la planta está caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma una construcción de ADN que comprende un promotor que activa la expresión en una planta operablemente enlazado a una secuencia TEL en donde la secuencia TEL codifica para una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una de las siguientes características: i) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 4; ii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo de reconocimiento de ARN (RRM3) de TEL en la cual están conservados al menos 3 de los 4 residuos de Asn-His-Cys-Ile en la planta; iii) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un motivo conservado específico de TEL fuera del C-término del dominio RR 3 y en donde están conservados al menos 7 de los 10 residuos en el siguiente péptido : Lys/Arg-Phe-Pro/Ala-Cys-Asp/Glu-N-Asp/Glu-N-Tyr-Leu-Pro-Leu/Val (N representa cualquier residuo) ; y, iv) la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 58% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 1.

8. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la construcción de ADN comprende además al menos un intensificador que mejora la expresión de un gen en una planta operablemente enlazado a la secuencia TEL.

9. La planta transformada de conformidad con reivindicación 8, caracterizada porque por lo menos intensificador es un intensificador 35S de CaMV.

10. La planta transformada de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 7-9, caracterizada porque promotor es un promotor TEL.

11. Una planta transformada que exhibe expresión incrementada de una secuencia TEL, en comparación a una secuencia de control, caracterizada porque la planta tiene al menos un intensificador incorporado en su genoma dentro de aproximadamente 30kb del gen TEL.

12. La planta transformada de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el por lo menos un intensificador es un intensificador 35S de CaMV.

13. Semilla transformada, caracterizada porque es de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 7-10.

14. Semilla transformada, caracterizada porque es de la planta de la reivindicación 11 o 12.