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CN116134135A - 用于沉默scn9a表达的组合物和方法 - Google Patents

用于沉默scn9a表达的组合物和方法 Download PDF

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CN116134135A CN202180043529.XA CN202180043529A CN116134135A CN 116134135 A CN116134135 A CN 116134135A CN 202180043529 A CN202180043529 A CN 202180043529A CN 116134135 A CN116134135 A CN 116134135A
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Abstract

本公开涉及靶向SCN9A的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，以及使用这类dsRNA组合物改变(例如，抑制)SCN9A表达的方法。

Description

用于沉默SCN9A表达的组合物和方法
相关申请
本申请要求2020年4月7日提交的美国临时申请号63/006,328和2021年3月15日提交的美国临时申请号63/161,313的优先权。前述申请的全部内容在此引入作为参考。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并在此全文引入作为参考。于2021年4月2日创建的所述ASCII副本的名称为A2038-7235WO_SL.txt，且大小为1,514,568字节。
技术领域
本公开涉及对SCN9A基因表达的特异性抑制。
背景技术
疼痛，例如，慢性疼痛是普遍症状和残疾的主要原因。慢性疼痛可由炎性疼痛或神经病理性疼痛引起，或其可与疾病或障碍相关，例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和/或病毒感染。对疼痛的高敏感性或低敏感性也可能由疼痛相关的障碍导致，包括但不限于无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)和阵发性剧痛症(PEPD)。目前对疼痛的治疗对其靶标是非选择性的，并导致涉及中枢神经系统(CNS)的不需要的脱靶效应。需要新的疼痛治疗方法，例如慢性疼痛和疼痛相关障碍。
发明内容
本公开描述了用于调节SCN9A表达的方法和iRNA组合物。在某些实施方案中，使用SCN9A特异性iRNA降低或抑制SCN9A的表达。这种抑制可用于治疗与SCN9A表达相关的障碍，如疼痛，例如急性疼痛或慢性疼痛(例如，炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛)。
因此，本文描述了实现SCN9A的RNA转录物由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的裂解的组合物和方法，如在细胞或受试者(例如在哺乳动物，如人类受试者)中。还描述了用于治疗与SCN9A表达相关的障碍的组合物和方法，例如疼痛(例如，急性疼痛或慢性疼痛，例如，炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)和与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛)。
本文所述组合物中包含的iRNA(例如dsRNA)包括具有与SCN9A(例如人SCN9A)的mRNA转录物的至少一部分基本互补的区域(例如长度为30个核苷酸或更少，通常19-24个核苷酸的区域)的RNA链(反义链)(在本文中也称为“SCN9A特异性iRNA”)。在一些实施方案中，SCN9A mRNA转录物是人SCN9A mRNA转录物，例如，本文中的SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，本文所述的iRNA(例如dsRNA)包含具有与人SCN9A mRNA的区域基本上互补的区域的反义链。在一些实施方案中，人SCN9A mRNA具有序列NM_002977.3(SEQ ID NO:1)或NM_001365536.1(SEQ ID NO:4001)。在一些实施方案中，人SCN9A mRNA具有序列NM_002977.3(SEQ ID NO:1)。NM_002977.3的序列也通过引用整体并入本文。SEQ IDNO:1的反向互补序列在本文中作为SEQ ID NO:2提供。在一些实施方案中，人SCN9A mRNA具有序列NM_001365536.1(SEQ ID NO:4001)。NM_001365536.1的序列也通过引用整体并入本文。SEQ ID NO:4001的反向互补序列在本文中作为SEQ ID NO:4002提供。
在一些方面，本公开提供了一种用于抑制电压门控钠通道，IX型α亚基(SCN9A)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中有义链包含含有人SCN9A的编码链的一部分的至少15个连续核苷酸(具有0、1、2或3个错配)的核苷酸序列，并且该反义链包含含有人SCN9A的非编码链的相应部分的至少15个连续核苷酸(具有0、1、2或3个错配)的核苷酸序列，使得该有义链与反义链中的该至少15个连续核苷酸互补。
在一些方面，本公开提供了一种用于抑制SCN9A表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中该反义链包括含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一部分的至少15个连续核苷酸(具有0、1、2或3个错配)的核苷酸序列，使得该有义链与反义链中的该至少15个连续核苷酸互补。
在一些方面，本公开提供了一种人细胞或组织，与其他方面类似的未处理的细胞或组织相比，其包含降低的SCN9A mRNA水平或SCN9A蛋白水平，其中任选地该细胞或组织未进行遗传工程化(例如，其中该细胞或组织包含一种或多种天然产生的突变，例如SCN9A)，其中任选地该水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，人细胞或组织是人外周感觉神经元(例如背根节中的外周感觉神经元，或伤害感受神经元，例如A-δ纤维或C-型纤维)。
在一些方面中，本公开还提供了包含本文所述dsRNA剂的细胞。
在一些方面，本公开还提供了用于抑制编码SCN9A的基因的表达的药物组合物，其包含本文所述的dsRNA剂。
在一些方面中，本公开还提供了一种抑制细胞中SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)将细胞与本文所述的dsRNA剂或本文所述的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够长的时间以获得SCN9A的mRNA转录物的降解，从而抑制SCN9A在细胞中的表达。
在一些方面中，本公开还提供了一种抑制细胞中SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)将细胞与本文所述的dsRNA剂或本文所述的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够的时间以降低SCN9A mRNA、SCN9A蛋白或SCN9A mRNA和蛋白两者的水平，从而抑制细胞中SCN9A的表达。
在一些方面中，本公开还提供了一种抑制中枢神经系统(CNS)的细胞或组织中SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)将细胞或组织与结合SCN9A的dsRNA剂接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞或组织维持足够的时间以降低SCN9A mRNA、SCN9A蛋白或SCN9A mRNA和蛋白两者的水平，从而抑制细胞或组织中SCN9A的表达。
在一些方面中，本公开还提供了一种治疗被诊断有SCN9A相关障碍的受试者的方法，包括向该受试者施用治疗有效量的本文所述的dsRNA剂或本文所述的药物组合物，从而治疗该障碍。
在本文的任何方面中，例如上述组合物和方法，本文(例如下文)的任何实施方案均可适用。
在一些实施方案中，人SCN9A的编码链具有SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，人SCN9A的非编码链具有SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，人SCN9A的编码链具有SEQ ID NO:4001的序列。在一些实施方案中，人SCN9A的非编码链具有SEQ ID NO:4002的序列。
在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少15个连续核苷酸(具有0或1、2或3个错配)的核苷酸序列。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少15个连续核苷酸(具有0或1、2或3个错配)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ IDNO:2的核苷酸序列的一部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少17个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或者1、2或3个错配。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ IDNO:4002的核苷酸序列的一部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少17个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或者1、2或3个错配。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ IDNO:2的核苷酸序列的一部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少19个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或者1、2或3个错配。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ IDNO:4002的核苷酸序列的一部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少19个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或者1、2或3个错配。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ IDNO:2的核苷酸序列的一部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少21个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或者1、2或3个错配。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ IDNO:4002的核苷酸序列的一部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少21个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或者1、2或3个错配。
在一些实施方案中，有义链的部分是SEQ ID NO:4001的核苷酸581-601、760-780或8498-8518内的部分。在一些实施方案中，有义链的部分是对应于SEQ ID NO:4827、5026或4822的部分。
在一些实施方案中，有义链的部分是表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中的有义链内的部分。
在一些实施方案中，反义链的部分是表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中的反义链内的部分。
在一些实施方案中，反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的反义序列之一的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。在一些实施方案中，有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的有义序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
在一些实施方案中，反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的反义序列之一的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。在一些实施方案中，有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的有义序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
在一些实施方案中，反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的反义序列之一的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。在一些实施方案中，有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的有义序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
在一些实施方案中，反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的反义序列之一的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。在一些实施方案中，有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20的任一个中所列的有义序列的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
在一些实施方案中，dsRNA剂的有义链长度为至少23个核苷酸，例如长度23-30个核苷酸。
在一些实施方案中，有义链的部分是选自AD-1251284(UGUCGAGUACACUUUUACUGA(SEQ ID NO:4827))、AD-961334(CAACACAATUTCUUCUUAGCA(SEQ ID NO:5026))或AD-1251325(AAAACAAUCUUCCGUUUCAAA(SEQ ID NO:4822))的双链体的有义链内的部分。在一些实施方案中，该部分是表5A、13A、14A、15A和16中提供的相应化学修饰序列的一部分。
在一些实施方案中，有义链的部分是选自AD-1251284(UGUCGAGUACACUUUUACUGA(SEQ ID NO:4827))、AD-961334(CAACACAATUTCUUCUUAGCA(SEQ ID NO:5026))或AD-1251325(AAAACAAUCUUCCGUUUCAAA(SEQ ID NO:4822))的有义链的有义链。在一些实施方案中，该部分是表5A、13A、14A、15A和16中提供的相应化学修饰序列的一部分。
在一些实施方案中，反义链的部分是选自AD-1251284(UCAGTAAAAGUGUACTCGACAUU(SEQ ID NO:5093))、AD-961334(UGCUAAGAAGAAATUGUGUUGUU(SEQ ID NO:5292))或AD-1251325(UUUGAAACGGAAGAUUGUUUUCC(SEQ ID NO:5088))的双链体的反义链内的部分。在一些实施方案中，该部分是表5A、13A、14A、15A和16中提供的相应化学修饰序列的一部分。
在一些实施方案中，反义链的部分是选自AD-1251284(UCAGTAAAAGUGUACTCGACAUU(SEQ ID NO:5093))、AD-961334(UGCUAAGAAGAAATUGUGUUGUU(SEQ ID NO:5292))或AD-1251325(UUUGAAACGGAAGAUUGUUUUCC(SEQ ID NO:5088))的反义链的反义链。在一些实施方案中，该部分是表5A、13A、14A、15A和16中提供的相应化学修饰序列的一部分。
在一些实施方案中，dsRNA剂的有义链和反义链包含选自AD-1251284(SEQ ID NO:4827和5093)、AD-961334(SEQ ID NO:5026和5292)或AD-1251325(SEQ ID NO:4822和5088)的双链体的成对有义链和反义链的核苷酸序列。在一些实施方案中，有义链和反义链包含表5A、13A、14A、15A和16中提供的相应化学修饰的有义序列和反义序列。
在一些实施方案中，有义链和反义链中的至少一个与一个或多个亲脂性部分缀合。在一些实施方案中，亲脂性部分缀合至dsRNA剂的双链区中的一个或多个位置。在一些实施方案中，亲脂性部分经由接头或载体缀合。在一些实施方案中，亲脂性部分的亲脂性(通过logKow测量的)超过0。在一些实施方案中，通过双链RNAi剂的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的，双链RNAi剂的疏水性超过0.2。在一些实施方案中，血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变动试验。
在一些实施方案中，dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，有义链的不超过5个核苷酸和反义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸包含修饰。
在一些实施方案中，至少一个修饰的核苷酸选自：脱氧核苷酸、3’-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、解锁核苷酸、构象限制的核苷酸、约束的乙基核苷酸、脱碱基的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及它们的组合。在一些实施方案中，不超过5个有义链核苷酸和不超过5个反义链核苷酸包括2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、非锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)以外的修饰。
在一些实施方案中，dsRNA在有义链的两个连续核苷酸之间或在反义链的两个连续核苷酸之间包含非核苷酸间隔物(其中任选地非核苷酸间隔物包含C3-C6烷基)。
在一些实施方案中，每条链的长度不超过30个核苷酸。在一些实施方案中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。在一些实施方案中，至少一条链包含2个核苷酸的3’突出端。
在一些实施方案中，双链区的长度为15-30个核苷酸对。在一些实施方案中，双链区的长度为17-23个核苷酸对。在一些实施方案中，双链区的长度为17-25个核苷酸对。在一些实施方案中，双链区的长度为23-27个核苷酸对。在一些实施方案中，双链区的长度为19-21个核苷酸对。在一些实施方案中，双链区的长度为21-23个核苷酸对。在一些实施方案中，每条链具有19-30个核苷酸。在一些实施方案中，每条链具有19-23个核苷酸。在一些实施方案中，每条链具有21-23个核苷酸。
在一些实施方案中，该剂包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的3’末端。在一些实施方案中，该链是反义链。在一些实施方案中，该链是有义链。
在一些实施方案中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5’末端。在一些实施方案中，该链是反义链。在一些实施方案中，该链是有义链。
在一些实施方案中，一条链的5’和3’末端各自包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，该链是反义链。
在一些实施方案中，位于双链体反义链的5’-端的1位的碱基对是AU碱基对。
在一些实施方案中，有义链有总共21个核苷酸，且反义链有总共23个核苷酸。
在一些实施方案中，一个或多个亲脂性部分缀合于至少一条链上的一个或多个内部位置。在一些实施方案中，一个或多个亲脂性部分经由接头或载体缀合于至少一条链上的一个或多个内部位置。
在一些实施方案中，内部位置包括除了从至少一条链的每一端的末端两个位置之外的所有位置。在一些实施方案中，内部位置包括除了至少一条链的每一端的末端三个位置之外的所有位置。在一些实施方案中，内部位置不包括有义链的切割位点区域。在一些实施方案中，内部位置包括除从有义链的5’端开始计数的位置9-12之外的所有位置。在一些实施方案中，内部位置包括除从有义链的3’端开始计数的位置11-13之外的所有位置。在一些实施方案中，内部位置不包括反义链的切割位点区域。在一些实施方案中，内部位置包括除从反义链的5’端开始计数的位置12-14之外的所有位置。在一些实施方案中，内部位置包括除从3’端开始计数的有义链上的位置11-13和从5’端开始计数的反义链上的位置12-14之外的所有位置。
在一些实施方案中，一个或多个亲脂性部分缀合于选自从每条链的5’端开始计数的有义链上的位置4-8和13-18以及反义链上的位置6-10和15-18的一个或多个内部位置。在一些实施方案中，一个或多个亲脂性部分缀合于选自从每条链的5’端开始计数的有义链上的位置5、6、7、15和17以及反义链上的位置15和17的一个或多个内部位置。
在一些实施方案中，双链区中的位置不包括有义链的切割位点区域。
在一些实施方案中，有义链长度为21个核苷酸，反义链长度为23个核苷酸，且亲脂性部分缀合于有义链的21位、20位、15位、1位、7位、6位或2位或者反义链的16位。在一些实施方案中，亲脂性部分缀合于有义链的21位、20位、15位、1位或7位。在一些实施方案中，亲脂性部分缀合于有义链的21位、20位或15位。在一些实施方案中，亲脂性部分缀合于有义链的20位或15位。在一些实施方案中，亲脂性部分缀合于反义链的16位。在一些实施方案中，亲脂性部分缀合于从有义链的5’端开始计数的6位。
在一些实施方案中，亲脂性部分是脂族、脂环族或多脂环族化合物。在一些实施方案中，亲脂性部分选自脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。在一些实施方案中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C4-C30烃链，以及选自羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮和炔的任选官能团。在一些实施方案中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C6-C18烃链。在一些实施方案中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C16烃链。
在一些实施方案中，亲脂性部分经由替代内部位置或双链区中的一个或多个核苷酸的载体缀合。在一些实施方案中，载体是选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基的环状基团；或者是基于丝氨醇(serinol)主链或二乙醇胺主链的无环部分。
在一些实施方案中，亲脂性部分经由包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与双链iRNA剂缀合。
在一些实施方案中，亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
在一些实施方案中，亲脂性部分或靶向配体经由可生物切割的接头缀合，所述接头选自DNA，RNA，二硫化物，酰胺，半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的功能化单糖或寡糖，及其组合。
在一些实施方案中，有义链的3’端通过端帽保护，所述端帽是具有胺的环状基团，所述环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步包含靶向配体，例如靶向CNS组织或肝组织的配体。在一些实施方案中，CNS组织是脑组织或脊髓组织，例如背根神经节。
在一些实施方案中，配体与有义链缀合。在一些实施方案中，配体缀合于有义链的3’端或5’端。在一些实施方案中，配体缀合于有义链的3’端。
在一些实施方案中，配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。在一些实施方案中，靶向配体包含一个或多个GalNAc缀合物或者一个或多个GalNAc衍生物。在一些实施方案中，配体是通过单价接头或者二价、三价或四价支化接头连接的一个或多个GalNAc缀合物或者一个或多个GalNAc衍生物。在一些实施方案中，配体是
Figure BDA0004004320660000131
在一些实施方案中，dsRNA剂与配体缀合，如以下示意所示
Figure BDA0004004320660000132
其中X为O或S。在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步包含具有Sp构型的连接磷原子的在反义链3’端的第一个核苷酸间键处存在的末端手性修饰、具有Rp构型的连接磷原子的在反义链5’端的第一个核苷酸间键处存在的末端手性修饰以及具有Rp构型或Sp构型的连接磷原子的在有义链5’端的第一个核苷酸间键处存在的末端手性修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步包含具有Sp构型的连接磷原子的在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰、具有Rp构型的连接磷原子的在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰以及具有Rp或Sp构型的连接磷原子的在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步包含具有Sp构型的连接磷原子的在反义链3’端的第一、第二和第三核苷酸间键处存在的末端手性修饰、具有Rp构型的连接磷原子的在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰及具有Rp或Sp构型的连接磷原子的在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步包含具有Sp构型的连接磷原子的在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰、具有Rp构型的连接磷原子的在反义链3’端的第三核苷酸间键处存在的末端手性修饰、具有Rp构型的连接磷原子的在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰和具有Rp或Sp构型的连接磷原子的在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步包含具有Sp构型的连接磷原子的在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰、具有Rp构型的连接磷原子的在反义链5’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰和具有Rp或Sp构型的连接磷原子的在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂在反义链的5’端进一步包含磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一些实施方案中，磷酸酯模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些实施方案中，本文所述的细胞，例如人细胞，通过包括使人细胞与本文所述的dsRNA剂接触的方法产生。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含dsRNA剂和脂质制剂。
在一些实施方案(例如，本文所述方法的实施方案)中，细胞在受试者体内。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，SCN9A mRNA的水平被抑制至少50％。在一些实施方案中，SCN9A蛋白质的水平被抑制至少50％。在一些实施方案中，SCN9A的表达被抑制至少50％。在一些实施方案中，抑制SCN9A的表达将来自受试者的生物样品(例如，脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品)中的SCN9A蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，抑制SCN9A基因的表达将来自受试者的生物样品(例如，脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品)中的SCN9A mRNA水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，受试者患有或被诊断有SCN9A相关障碍。在一些实施方案中，受试者满足至少一项对于SCN9A相关障碍的诊断标准。在一些实施方案中，SCN9A相关障碍为疼痛，例如慢性疼痛，例如炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛。
在一些实施方案中，神经元细胞或组织是外周感觉神经元，例如背根节中的外周感觉神经元，或伤害感受神经元，例如A-δ纤维或C-型纤维。
在一些实施方案中，SCN9A相关障碍为疼痛，例如慢性疼痛。在一些实施方案中，慢性疼痛由以下引起或与之相关：疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤或病毒感染相关的疼痛。
在一些实施方案中，治疗包括改善障碍的至少一种体征或症状。在一些实施方案中，所述至少一种体征或症状包括对疼痛敏感性、疼痛阈值、疼痛水平、疼痛残疾水平、SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)的存在、水平或活性中的一项或多项的测量。
在一些实施方案中，高于参考水平的SCN9A水平指示受试者具有疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍。在一些实施方案中，治疗包括防止障碍的进展。在一些实施方案中，治疗包括以下一项或多项：(a)减轻疼痛；或(b)抑制或降低SCN9A的表达或活性。
在一些实施方案中，该治疗导致背根神经节中相对于SCN9A mRNA基线的至少30％平均降低。在一些实施方案中，该治疗导致背根神经节中相对于SCN9A mRNA基线的至少60％平均降低。在一些实施方案中，该治疗导致背根神经节中相对于SCN9A mRNA基线的至少90％平均降低。
在一些实施方案中，在治疗后，受试者在单剂量dsRNA后经历至少8周的敲减期，如通过脑脊液(CSF)或CNS组织(例如背根神经节)中的SCN9A蛋白评估的。在一些实施方案中，治疗导致单剂量dsRNA后至少12周的敲减期，如通过脑脊液(CSF)或CNS组织(例如背根神经节)中的SCN9A蛋白评估的。在一些实施方案中，治疗导致单剂量dsRNA后至少16周的敲减期，如通过脑脊液(CSF)或CNS组织(例如背根神经节)中的SCN9A蛋白评估的。
在一些实施例中，受试者是人。
在一些实施方案中，dsRNA剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
在一些实施方案中，dsRNA剂颅内或鞘内施用于受试者。
在一些实施方案中，dsRNA剂鞘内、脑室内或脑内施用于受试者。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括测量受试者中的SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)水平。在一些实施方案中，测量受试者中的SCN9A水平包括测量来自受试者的生物样品(例如，脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品)中的SCN9A蛋白水平。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括进行血液测试、成像测试或者CNS活检或水性脑脊液活检。
在一些实施方案中，进一步测量受试者中SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)水平的本文所述的方法在用dsRNA剂或药物组合物治疗之前进行。在一些实施方案中，在确定受试者的SCN9A水平高于参考水平时，将dsRNA剂或药物组合物施用于受试者。在一些实施方案中，在用dsRNA剂或药物组合物治疗后进行受试者中SCN9A水平的测量。
在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括用适合于治疗或预防SCN9A相关障碍的疗法治疗受试者，例如，其中该疗法包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、对乙酰氨基酚、阿片样物质或皮质类固醇、针灸、治疗性按摩、背根神经节刺激、脊髓刺激或局部疼痛缓解剂。在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用适用于治疗或预防SCN9A相关障碍的另外的药剂。在一些实施方案中，另外的药剂包括类固醇或非类固醇抗炎剂。
本文中提及的所有公开出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。
本公开的各种实施方案的细节在以下描述中阐述。本公开的其他特征、目的和优点将从说明书和附图以及权利要求书中变得清楚。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色绘制的图。应要求并支付必要费用后，专利局将提供具有彩色绘图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A描述了包括AD-795305、AD-1251249、AD-1251251、AD-1010663、AD-1251301和AD-961179的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。图1B描述了包括AD-1251317、AD-1251318、AD-1251323、AD-1251325、AD-795634、AD-1251363的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。图1C描述了包括AD-1251364、AD-1251373、AD-1251385、AD-1251391和AD-795913的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。对于每个siRNA，“F”是“2’-氟”修饰，OMe是甲氧基，GNA是指二醇核酸，“(A2p)”是指腺苷2’-磷酸，“(C2p)”是指胞苷2’-磷酸，“(G2p)”是指鸟苷2’-磷酸，“DNA”是指DNA碱基，2-C16是指靶向配体，和PS是指硫代磷酸酯键。图1A-1C按照出现顺序分别公开了SEQ ID NO:5996-6029。
图2是描述用在X轴上显示的示例性双链体(从左至右：PBS、AD-795305(亲本)、AD-1251249、AD-1251251、AD-1010663(亲本)、AD-1251301、AD-961179(亲本)、AD-1251317、AD-1251318、AD-1251323、AD-1251325、AD-795634(亲本)、AD-1251363、AD-1251364、AD-1251373、AD-1251385和AD-1251391)治疗后第14天，小鼠中相对于PBS的SCN9A信使保留百分比的图表。
图3A描述了包括AD-802471、AD-1251492、AD-961334、AD-1251279和AD-1251284的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。图3B描述了包括AD-1251334、AD-1251377、AD-1251398、AD-1251399、AD-961188和AD-1251274的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。图3A-3B按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:6030-6051。图3C描述了包括AD-796825、AD-1251411、AD-1251419、AD-797564、AD-1251428和AD-1251434的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。图3D描述了包括AD-1010661、AD-795366、AD-795634和AD-795913的示例性SCN9AsiRNA的序列和化学性。对于每个siRNA，“F”是“2’-氟”修饰，OMe是甲氧基，GNA是指二醇核酸，“(A2p)”是指腺苷2’-磷酸，“(C2p)”是指胞苷2’-磷酸，“”(U2p)”是指尿苷2’-磷酸，“(G2p)”是指鸟苷2’-磷酸，“DNA”是指DNA碱基，2-C16是指靶向配体，和PS是指硫代磷酸酯键。图3C-3D按照出现顺序分别公开了SEQ ID NO:6052-6071。
图4A-4C显示了一系列图表，其描述了相对于按筛选1和2中测试的那些(靶向ORF-1、ORF-2和3’UTR)分组的双链体有义链的靶mRNA(NM_001365536.1)中的起始位置的SCN9A信使保留百分比。图4A描述了测试的双链体在0.1nM终浓度下的SCN9A信使保留百分比。图4B描述了测试的双链体在1nM终浓度下的SCN9A信使保留百分比。图4C描述了测试的双链体在10nM终浓度下的SCN9A信使保留百分比。在图4A-4C中，筛选1包括以下双链体：AD-1010663.3、AD-1251301.1、AD-1251249.1、AD-1251251.1、AD-795305.3、AD-1251363.1、AD-1251364.1、AD-1251373.1、AD-795634.4、AD-1251385.1、AD-1251391.1、AD-1251317.1、AD-1251318.1、AD-1251323.1、AD-1251325.1和AD-961179.3；筛选2包括以下双链体：AD-1251492.1、AD-1251279.1、AD-961334.3、AD-1251284.1、AD-1251334.1、AD-1251377.1、AD-1251398.1、AD-1251399.1、AD-1251274.2、AD-96188.3、AD-1251411.1、AD-1251419.1、AD-796825.3、AD-1251428.1、AD-797564.4和AD-1251434.1。
图5是描述用在X轴上显示的示例性双链体(从左至右：PBS、AD-1251492.2*、AD-961334.2(亲本)、AD-1251279.2、PBS、AD-1251284.2*、AD-1251334.2*、AD-1251377.2*、AD-1251398.2*、AD-1251399.2*、AD-961188.2(亲本)、AD-1251274.2、PBS、AD-796825.2(亲本)、AD-1251411.2、AD-1251419.2、AD-797564.3(亲本)、AD-1251428.2和AD-1251434.2)治疗后第14天，小鼠中相对于PBS的SCN9A信使保留百分比的图表。该图表对于靶向3’UTR2(AD-1251492.2*、AD-961334.2(亲本)、AD-1251279.2)、ORF1(AD-1251284.2*、AD-1251334.2*、AD-1251377.2*、AD-1251398.2*、AD-1251399.2*、AD-9611888.2(亲本)、AD-1251274.2)和ORF2(AD-796825.2(亲本)、AD-1251411.2、AD-1251419.2、AD-797564.3(亲本)、AD-1251428.2、AD-1251434.2)的那些双链体分成亚部。
图6A描述了包括AD-1251284、AD-961334和AD-1251325的示例性SCN9A siRNA的序列和化学性。图6A按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:6072-6077。图6B描述了示例性SCN9A双链体AD-1331352、AD-1209344和AD-1331350的序列和CNS化学性。图6B按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:6078-6083。
具体实施方式
iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导序列特异性的mRNA降解。本文描述了iRNA和使用它们调节(例如，抑制)SCN9A表达的方法。本发明还提供了用于治疗与SCN9A表达相关的障碍的组合物和方法，例如疼痛，例如急性疼痛或慢性疼痛(例如炎性(伤害感受性)、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛)。
人SCN9A是约226kDa的蛋白质，且是电压门控的钠通道(Nav1.7通道)，其调节可兴奋膜的电压依赖性钠离子渗透性，并在伤害感受信号传导中发挥作用。这些通道在参与疼痛感受的背根神经节的外周感觉神经元中优先表达。SCN9A基因中的突变与疼痛超敏感性或低敏感性的倾向相关。例如，SCN9A基因的功能获得性突变可能是遗传性疼痛综合征的病因学基础，例如原发性红斑性肢痛症(PE)和阵发性剧痛症(PEPD)。此外，SCN9A基因的失能性突变导致另外方面健康的个体完全无法感知任何形式的疼痛。不希望受理论束缚，SCN9A表达水平增加可能增强疼痛敏感性；而SCN9A表达水平降低可降低疼痛敏感性，且调节背根神经节外周感觉神经元中的SCN9A表达和Nav1.7通道水平可提供有效的疼痛治疗。
以下描述公开了如何制备和使用含有iRNA的组合物来调节(例如，抑制)SCN9A的表达，以及用于治疗与SCN9A表达相关的障碍的组合物和方法。
在一些方面，本文描述了包含SCN9A iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物、使用该组合物抑制SCN9A表达的方法以及使用该药物组合物治疗与SCN9A表达相关的障碍(例如，疼痛，例如慢性疼痛和/或疼痛相关障碍)的方法。
I.定义
为方便起见，说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语和短语的含义提供如下。如果本说明书其他部分对术语的使用与其在本章节中规定的定义之间存在明显差异，应以本章节中的定义为准。
当提及数字或数值范围时，术语“约”指所提及的数字或数值范围是实验变异性内(或统计性实验误差内)的近似值，且因此该数字或数值范围可在例如所述数字或数值范围的1％至15％之间变化。
在数字或系列数字之前的术语“至少”应理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可包括的所有后续数字或整数，如从上下文中清楚看出的。例如，核酸分子中的核苷酸数目必须为整数。例如，“20-核苷酸的核酸分子的至少17个核苷酸”指17、18、19或20个核苷酸具有所指示的性质。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文使用的，“不超过”或“或更小”被理解为包括与该短语相邻的值和逻辑上较低的值或整数，从上下文逻辑来看，至零。例如，具有与靶位点的“不超过2个核苷酸”的错配的双链体具有2、1或0个错配。当“不超过”出现在系列数字或范围之前时，应理解“不超过”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文使用的，“小于”被理解为不包括与短语相邻的值，并且包括逻辑低的值或整数，从上下文的逻辑来看，至零。例如，相对于靶位点具有“少于3个核苷酸”的错配的双链体具有2、1或0个错配。当“小于”出现在系列数字或范围之前时，应理解“小于”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文使用的，“超过”被理解为不包括与短语相邻的值，并且包括逻辑上更高的值或整数，如从上下文逻辑来看，至无限。例如，与靶位点具有“超过3个核苷酸”的错配的双链体具有4、5、6个或更多个错配。当“超过”出现在系列数字或范围之前时，应理解“超过”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文中所使用的，如“最多10”中的“最多”应理解为最多和包括10，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本文提供的范围应理解为包括该范围内的所有单个整数值和所有子范围。
术语“激活”、“增强”、“上调其表达”、“提高其表达”等，就其指SCN9A基因而言，在本文指至少部分激活SCN9A基因的表达，如通过SCN9A mRNA量的提高所显示的，该mRNA可以从第一细胞或细胞组中分离或检测，该第一细胞或细胞组中SCN9A基因被转录且其被处理以使得与第二细胞或第二细胞组(其与第一细胞或细胞组基本相同，但尚未被如此处理)(对照细胞)相比SCN9A基因的表达增加。
在一些实施方案中，SCN9A基因的表达通过施用本文所述的iRNA激活至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方案中，SCN9A基因通过施用本公开中所述的iRNA被激活至少约60％、70％或80％。在一些实施方案中，SCN9A基因的表达通过施用本文所述的iRNA激活至少约85％、90％或95％或更多。在一些实施方案中，与在未处理的细胞中的表达相比，在用本文所述的iRNA处理的细胞中SCN9A基因表达增加至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。例如，在Li等，2006Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:17337-42，以及US2007/0111963和US2005/226848中描述了通过小dsRNA激活表达，其每一个都通过引用并入本文。
术语“沉默”、“抑制其表达”、“下调其表达”、“抑制其表达”等，就其指SCN9A而言，本文中指的是至少部分抑制SCN9A的表达，例如基于SCN9A mRNA表达、SCN9A蛋白表达或与SCN9A表达功能性关联的另一参数评估的。例如，与对照相比，SCN9A表达的抑制可通过从第一细胞或细胞组(其中SCN9A被转录并且其被或已经被处理以使得SCN9A的表达受到抑制)分离或检测的SCN9A mRNA的量减少而表现出来。对照可以是与第一细胞或细胞组基本相同的第二细胞或细胞组，除了但第二细胞或细胞组未被如此处理(对照细胞)。抑制程度通常以对照水平的百分比表示，例如，
Figure BDA0004004320660000221
或者，抑制程度可以通过与SCN9A表达功能上关联的参数(例如，由SCN9A基因编码的蛋白质的量)的降低来给出。与SCN9A表达功能上关联的参数的降低可以类似地表示为对照水平的百分比。原则上，可以在任何组成型或通过基因组工程表达SCN9A的细胞中以及通过任何适当的分析来确定SCN9A沉默。
例如，在某些情况下，通过施用本文公开的iRNA，SCN9A的表达被抑制至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在一些实施方案中，通过施用本文公开的iRNA，SCN9A被抑制至少约60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方案中，通过施用本文所述的iRNA，SCN9A被抑制至少约85％、90％、95％、98％、99％或更多。
术语“反义链”或“指导链”指iRNA(例如，dsRNA)的链，其包括与靶序列基本上互补的区域。
如本文所用，术语“互补区”指反义链上与本文定义的序列(例如靶序列)基本上互补的区域。当互补区与靶序列不完全互补时，错配可能在分子的内部或末端区域。在一些实施方案中，互补区包含0、1或2个错配。
如本文所用，术语“有义链”或“随从链”指iRNA的链，其包含与本文对于该术语定义的反义链区域基本上互补的区域。
如本文所用，关于dsRNA的术语“平端”或“平末端”是指在dsRNA的给定末端不存在未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸突出端。dsRNA的一个或两个末端可以是平端。在dsRNA的两个末端是平端的情况下，dsRNA可以说是平末端的。需要明确的是，“平末端”dsRNA是两个末端平端的dsRNA，即，分子的任一端都没有核苷酸突出端。最通常，这种分子在其整个长度上都是双链的。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“互补的”，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员将理解的。例如，此类条件可以是“严格条件”，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mMPIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃，持续12-16小时，然后洗涤。可以应用其他条件，如可能在生物体内遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合测试两个序列的互补性的该组条件。
iRNA内(例如，如本文所述的dsRNA内)的互补序列包括在一个或两个核苷酸序列的全长上包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。可以将这样的序列在本文中称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本上互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或者对于最多30个碱基对的双链体，其可以在杂交时形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个错配碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如，通过RISC途径抑制基因表达。然而，如果两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端，对于确定互补性，此类突出端不应被视为不匹配。例如，包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本文所述的目的，仍可称为“完全互补的”。
如本文所用，互补序列还可以包括或完全由非Watson-Crick碱基对和/或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足上述关于其杂交能力的要求即可。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U摆动或Hoogstein碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可关于dsRNA的有义链与反义链之间或iRNA剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配使用，如从其使用的上下文中理解的。
如本文所用，“与信使RNA(mRNA)的至少一部分基本互补”的多核苷酸指与感兴趣的mRNA(例如，编码SCN9A蛋白的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码SCN9A的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与SCN9A mRNA的至少一部分互补。术语“互补性”指第一核酸和第二核酸的核碱基之间配对的能力。
如本文所用，术语“互补区”指一个核苷酸序列剂与另一个序列基本上互补的区域，例如dsRNA的有义序列和相应的反义序列的区域，或者iRNA的反义链和靶序列(例如本文所定义的SCN9A核苷酸序列)的区域。当互补区与靶序列不完全互补时，错配可能位于iRNA反义链的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配处于末端区域中，例如，在iRNA剂5’或3’末端的5、4、3或2个核苷酸内。
本文中使用的“接触”包括直接接触细胞以及间接接触细胞。例如，当向受试者施用(例如，鞘内、颅内、脑内或脑室内)包含iRNA的组合物时，受试者体内的细胞可被接触。
“引入细胞中”，当涉及iRNA时，意指促进或实现摄取或吸收到细胞中。iRNA的吸收或摄取可以通过独立的扩散或主动细胞过程，或通过辅助剂或装置发生。该术语的含义不限于体外细胞；iRNA也可以“引入细胞中”，其中细胞是活生物体的一部分。在这样的情况下，引入细胞中将包括递送至生物体。例如，对于体内递送，iRNA可以注射到组织部位或全身施用。体内递送也可以通过β-葡聚糖递送系统，例如在美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国公开号2005/0281781中描述的那些，其在此通过引用整体并入。体外引入细胞中包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。进一步的方法在下文中描述或是本领域已知的。
如本文所用，“与SCN9A表达相关的障碍”、“与SCN9A表达相关的疾病”、“与SCN9A表达相关的病理过程”、“SCN9A相关障碍”、“SCN9A相关疾病”等包括其中SCN9A表达发生改变(例如，相对于参考水平(例如，非患病受试者特征的水平)降低或增加)的任何病症、障碍或疾病。在一些实施方案中，SCN9A表达降低。在一些实施方案中，SCN9A表达提高。在一些实施方案中，在来自受试者的组织样品(例如，脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品)中可检测到SCN9A表达的降低或提高。可以相对于同一个体在障碍发生前观察到的水平或相对于不具有该障碍的其他个体评估该降低或提高。降低或提高可能限于身体的特定器官、组织或区域(例如，脑或脊髓)。SCN9A相关障碍包括但不限于疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍。
本文中定义的“疼痛”包括急性疼痛和慢性疼痛。慢性疼痛包括与障碍(包括，但不限于癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染)相关的炎性(伤害感受性)和神经病理性疼痛。还包括由于遗传性疼痛综合征导致的疼痛，包括但不限于原发性红斑性肢痛症(PE)和阵发性剧痛症(PEPD)。
本文中使用的术语“双链RNA”、“dsRNA”或“siRNA”是指包含RNA分子或分子复合物的iRNA，其具有包含两条反平行且基本上互补的核酸链(其被称为相对于靶RNA具有“有义”和“反义”定向)的杂交双链体区。双链体区可以是允许所需的靶RNA特异性降解(例如，通过RISC途径)的任何长度，但通常长度范围为9-36个碱基对，例如，长度15-30个碱基对。考虑到9到36个碱基对之间的双链体，双链体可以是该范围内的任何长度，例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36以及之间的任何子范围，包括但不限于15-30个碱基对、15-26个碱基对、15-23个碱基对、15-22个碱基对、15-21个碱基对、15-20个碱基对、15-19个碱基对、15-18个碱基对、15-17个碱基对、18-30个碱基对、18-26个碱基对、18-23个碱基对、18-22个碱基对、18-21个碱基对、18-20个碱基对、19-30个碱基对、19-26个碱基对、19-23个碱基对、19-22个碱基对、19-21个碱基对、19-20个碱基对、20-30个碱基对、20-26个碱基对、20-25个碱基对、20-24个碱基对、20-23个碱基对、20-22个碱基对、20-21个碱基对、21-30个碱基对、21-26个碱基对、21-25个碱基对、21-24个碱基对、21-23个碱基对或21-22个碱基对。通过用Dicer和类似酶处理在细胞中产生的dsRNA通常长度在19-22个碱基对的范围内。dsDNA的双链体区域的一条链包含与靶RNA的区域基本上互补的序列。形成双链体结构的两条链可以来自具有至少一个自身互补区的单个RNA分子，或者可以由两个或更多个单独的RNA分子形成。当双链体区由单个分子的两条链形成时，该分子可以具有在一条链的3’-末端和形成双链体结构的相应另一链的5’-末端之间由单链核苷酸链(本文称为“发夹环”)分隔的双链体区。发夹环可以包含至少一个未配对的核苷酸；在一些实施方案中，发夹环可以包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸。当dsRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子组成时，这些分子不需要但可以共价连接。在一些实施方案中，两条链通过发夹环以外的方式共价连接，并且连接结构是接头。
在一些实施方案中，iRNA剂可以是“单链siRNA”，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。在一些实施方案中，单链RNAi剂可以结合RISC核酸内切酶Argonaute 2，其然后切割靶mRNA。单链siRNA通常为15-30个核苷酸，并任选地化学修饰。单链siRNA的设计和测试在美国专利第8,101,348号和Lima等(2012)Cell 150:883-894中描述，其全部内容在此引入作为参考。本文所述的任何反义核苷酸序列(例如，表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的序列)均可用作本文所述的单链siRNA，并任选地例如通过Lima等(2012)Cell 150:883-894中所述的方法进行化学修饰，例如，如本文所述。
在一些实施方案中，RNA干扰剂包括与靶RNA序列相互作用以指导靶RNA切割的单链RNA。不希望受到理论的束缚，引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(Sharp等，Genes Dev.2001,15:485)。Dicer，一种核糖核酸酶III样酶，将dsRNA加工成19-23个碱基对的短干扰RNA，具有特征性的两碱基3’突出端(Bernstein等，(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中，其中一个或多个解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补反义链能够指导靶识别(Nykanen等，(2001)Cell107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一个或多个核酸内切酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等，(2001)Genes Dev.15:188)。因此，在一些实施方案中，本公开涉及促进RISC复合物形成以实现靶基因的沉默的单链RNA。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常各自代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“脱氧核糖核苷酸”、“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或代理替代部分。本领域技术人员清楚地知道，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分取代而不显著改变包含带有该取代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如，但不限于，包含肌苷作为碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸来碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在本公开中所述dsRNA的核苷酸序列中被包含例如肌苷的核苷酸替代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶可分别被鸟嘌呤和尿嘧啶替代以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。包含这类替代部分的序列适用于本公开中所述的组合物和方法。
如本文所使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA剂”或者“RNAi剂”或“RNAi分子”指包含如该术语在本文中所定义的RNA的试剂，且其介导例如通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径的RNA转录物的靶向切割。在一些实施方案中，本文所述的iRNA实现SCN9A表达的抑制，例如在细胞或哺乳动物中。SCN9A表达的抑制可基于SCN9A mRNA水平的降低或SCN9A蛋白水平的降低进行评估。
术语“接头”或“连接基团”指连接化合物的两个部分的有机部分，例如共价连接化合物的两个部分。
术语“亲脂物”或“亲脂性部分”广义地指对脂质具有亲和力的任何化合物或化学部分。表征亲脂性部分的亲脂性的一种方式是通过辛醇-水分配系数logKow，其中Kow是在平衡状态下化学物质在两相体系的辛醇相中的浓度与其在水相中浓度的比率。辛醇-水分配系数是实验室测量的物质性质。但是，也可以通过使用第一性原理或经验方法计算的化学物质结构组分造成的系数进行预测(例如，参见Tetko等，J.Chem.Inf.Comput.Sci.41:1407-21(2001)，其全部内容通过引用结合于此)。它提供了该物质倾向于非水或油环性境而非水的倾向的热力学度量(即其亲水/亲油平衡)。原则上，当一种化学物质的logKow超过0时，该物质性质上是亲脂性的。亲脂性部分通常具有超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10的logKow。例如，6-氨基己醇的logKow预计约为0.7。使用同样的方法，预测胆固醇基N-(己-6-醇)氨基甲酸酯的logKow为10.7。
分子的亲脂性可以相对其携带的官能团而改变。例如，在亲脂性部分的末端添加羟基或胺基可以提高或降低亲脂性部分的分配系数(例如logKow)值。
或者，与一个或多个亲脂性部分缀合的双链RNAi剂的疏水性可以通过其蛋白结合特性来测量。例如，在某些实施方案中，双链RNAi剂的血浆蛋白结合试验中的未结合分数可被确定为与双链RNAi剂的相对疏水性正相关，其则可与双链RNAi剂的沉默活性正相关。
在一些实施方案中，所确定的血浆蛋白结合分析是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变动分析(EMSA)。例如，PCT/US2019/031170中详细说明了该结合分析的示例性方案。通过结合分析中未结合siRNA分数测量的双链RNAi剂的疏水性超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5，用于增强siRNA的体内递送。
因此，将亲脂性部分缀合于双链RNAi剂的内部位置为增强siRNA的体内递送提供了最佳的疏水性。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包含包封药物活性分子(如核酸分子，例如RNAi剂或RNAi剂从其转录的质粒)的脂质层的囊泡。例如，美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第8,158,601号和第8,058,069号中描述了LNP，其全部内容在此引入作为参考。
如本文所用，术语“调节其表达”指与对照细胞中相应基因的表达相比，用本文所述的iRNA组合物处理的细胞中基因(例如，SCN9A基因)表达的至少部分“抑制”或部分“激活”。对照细胞包括未处理的细胞，或用非靶向对照iRNA处理的细胞。
本领域技术人员将认识到，术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅包括如在自然界中表达或发现的RNA分子，而且包括RNA的类似物和衍生物(其包含如本文所述或本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物)。严格来说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，且“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸酯部分或其类似物(例如硫代磷酸酯)的核糖核苷。然而，如本文使用的术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”可以认为等同。RNA可以在核碱基结构、核糖结构或核糖-磷酸酯主链结构中被修饰，例如，如下文所述。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保留形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子还可以包含至少一个修饰的核糖核苷，包括但不限于2’-O-甲基修饰的核苷、包含5’硫代磷酸酯基团的核苷、与胆固醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷、锁定核苷、无碱基核苷、无环核苷、二醇核苷酸、2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷、2’-氨基修饰的核苷、2’-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含非天然碱基的核苷或其任意组合。可选地或者组合地，RNA分子可以包含至少两个修饰的核糖核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多，直至dsRNA分子的整个长度。对于RNA分子中这样的多个修饰核糖核苷中的每一个，修饰不必相同。在一些实施方案中，预期用于本文所述的方法和组合物中的修饰的RNA是肽核酸(PNA)，其具有形成所需双链体结构的能力并且允许或介导靶RNA的特异性降解，例如，通过RISC途径。为清楚起见，应理解术语“iRNA”不包括天然存在的双链DNA分子或含100％脱氧核苷的DNA分子。
在一些方面，修饰的核糖核苷包括脱氧核糖核苷。在这种情况下，iRNA剂可以包含一个或多个脱氧核苷，包括例如，脱氧核苷突出端，或dsRNA的双链部分内的一个或多个脱氧核苷。在某些实施方案中，RNA分子包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95％或更高百分比(但不是100％)的脱氧核糖核苷，例如，在一条或两条链中。
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指至少一个从iRNA(例如，dsRNA)的双链体结构突出的未配对核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3’端延伸到另一条链的5’端之外时，或反之亦然，则存在核苷酸突出端。dsRNA可以包含至少一个核苷酸的突出端；或者，突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、或至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包含或由核苷酸/核苷类似物组成，包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或者其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5’端、3’端或者两端。
在一些实施方案中，dsRNA的反义链在3’端和/或5’端具有1-10个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，dsRNA的有义链在3’端和/或5’端具有1-10个核苷酸的突出端。在一些实施方案中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
如本文所用，“药物组合物”包含药理学有效量的治疗剂(例如iRNA)和药学上可接受的载体。如本文所用，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简称“有效量”指有效产生预期的药理学、治疗或预防结果的药剂(例如iRNA)的量。例如，在治疗与SCN9A表达相关的障碍(例如，疼痛，例如，慢性疼痛或疼痛相关的障碍)的方法中，有效量包括有效减轻与该障碍相关的一种或多种症状的量(例如，有效(a)抑制疼痛或(b)抑制或降低SCN9A的表达或活性的量)或有效降低发生与该障碍相关的病症的风险的量。例如，如果当与疾病或障碍相关的可测量参数降低至少10％时，给定的临床治疗被认为是有效的，则用于治疗该疾病或障碍的药物的治疗有效量是使该参数至少降低10％所必需的量。例如，治疗有效量的靶向SCN9A的iRNA可以将SCN9A mRNA水平或SCN9A蛋白水平降低任何可测量的量，例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
术语“药学上可接受的载体”指用于施用治疗剂的载体。此类载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语特别地排除细胞培养基。对于口服施用的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。适宜的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和海藻酸是适宜的崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶，而如果存在的话，润滑剂通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如果需要，片剂可以用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料包衣，以延迟在胃肠道中的吸收。药物制剂中包含的药剂在下文中进一步描述。
如本文所用，术语“SNALP”指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP表示包被减少的水性内部的脂质囊泡，该水性内部包含核酸如iRNA或iRNA从其转录的质粒。例如，在美国专利申请公开号2006/0240093、2007/0135372和国际申请号WO 2009/082817中描述了SNALPs。这些申请通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，SNALP是SPLP。如本文所用，术语“SPLP”指包含包封在脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。
如本文所用，术语“包含序列的链”指包含核苷酸链的寡核苷酸，其由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述。
如本文所用，根据本文所述方法治疗的“受试者”包括人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物可以是例如啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或灵长动物(例如，猴)。在一些实施方案中，受试者是人。
“有此需要的受试者”包括患有、疑似患有或处于发生与SCN9A表达(例如过表达)相关的障碍(例如疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍)的风险中的受试者。在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有与SCN9A表达或过表达相关的障碍。在一些实施方案中，受试者具有发生与SCN9A表达或过表达相关的障碍的风险。
如本文所用，“靶序列”指在基因(例如SCN9A)的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够长以在该部分处或其附近用作iRNA指导的切割的底物。例如，靶序列的长度通常为9-36个核苷酸，例如长度15-30个核苷酸，包括其间的所有子范围。作为非限制性实例，靶序列可以是15-30个核苷酸、15-26个核苷酸、15-23个核苷酸、15-22个核苷酸、15-21个核苷酸、15-20个核苷酸、15-19个核苷酸、15-18个核苷酸、15-17个核苷酸、18-30个核苷酸、18-26个核苷酸、18-23个核苷酸、18-22个核苷酸、18-21个核苷酸、18-20个核苷酸、19-30个核苷酸、19-26个核苷酸、19-23个核苷酸、19-22个核苷酸、19-21个核苷酸、19-20个核苷酸、20-30个核苷酸、20-26个核苷酸、20-25个核苷酸、20-24个核苷酸、20-23个核苷酸、20-22个核苷酸、20-21个核苷酸、21-30个核苷酸、21-26个核苷酸、21-25个核苷酸、21-24个核苷酸、21-23个核苷酸或21-22个核苷酸。
如本文所用，短语“治疗有效量”和“预防有效量”等指在治疗、预防或控制与SCN9A表达相关的任何障碍或病理过程(例如，疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍)中提供治疗益处的量。治疗有效的具体量可以根据本领域已知的因素而变化，例如障碍或病理过程的类型、患者的病史和年龄、障碍或病理过程的阶段以及其他疗法的施用。
在本公开的上下文中，术语“治疗”、“疗法”等指预防、延迟、减轻或缓解与SCN9A表达相关的障碍有关的至少一种症状，或减缓或逆转这种障碍的进展或预期进展。例如，当用于治疗疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍时，本文所述的方法可用于降低或预防本文所述的疼痛，例如慢性疼痛的一种或多种症状，或降低相关病症的风险或严重性。因此，除非上下文另有明确说明，术语“治疗”、“疗法”等旨在包括预防，例如防止与SCN9A表达相关的障碍和/或障碍的症状。治疗也可能意味着与无治疗时的预期生存相比延长生存。
在疾病标志物或症状的上下文中，“较低”指任何降低，例如，这种水平的统计或临床显著的降低。例如，该降低可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。该降低可下降至如对于无这种障碍的个体正常的范围内可接受的水平。
如本文所用，“SCN9A”指“电压门控钠通道、IX型α亚基”基因(“SCN9A基因”)、相应的mRNA(“SCN9A mRNA”)或相应的蛋白(“SCN9A蛋白”)。人SCN9A mRNA转录物的序列可在SEQID NO:1或SEQ ID NO:4001中找到。
如果本文呈现的双链体的所述的位置与该双链体与所述的序列的比对之间存在差异，则以双链体与所述的序列的比对为准。
II.iRNA剂
本文描述了调节(例如抑制)SCN9A表达的iRNA剂。
在一些实施方案中，iRNA剂激活细胞或哺乳动物中SCN9A的表达。
在一些实施方案中，iRNA剂包括用于抑制SCN9A在细胞或受试者(例如，在哺乳动物中，例如，在人类中)中表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包括具有互补区的反义链，其与在SCN9A的表达中形成的mRNA的至少一部分互补，并且其中互补区的长度为30个核苷酸或更短，通常长度为19-24个核苷酸，并且其中dsRNA在与表达SCN9A的细胞接触时抑制SCN9A的表达，例如至少10％、20％、30％、40％或50％。
SCN9A表达的调节(例如抑制)可通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法或通过基于蛋白质的方法(例如通过Western印迹)进行测定。在细胞培养物中，例如在COS细胞、ARPE-19细胞、hTERT RPE-1细胞、HeLa细胞、原代肝细胞、HepG2细胞、原代培养细胞或来自受试者的生物样品中的SCN9A表达可以通过测量SCN9A mRNA水平(例如通过bDNA或TaqMan分析)或通过测量蛋白质水平(例如通过免疫荧光分析，例如使用Western印迹或流式细胞技术)来测定。
dsRNA通常包括两条充分互补以在dsRNA将被使用的条件下杂交以形成双链体结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)通常包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区，该靶序列来源于在SCN9A表达期间形成的mRNA序列。另一条链(有义链)通常包含与反义链互补的区域，使得两条链在适宜条件下组合时杂交并形成双链体结构。通常，双链体结构的长度在15和30个碱基对之间(含)，更通常在18和25个碱基对之间(含)，更通常在19和24个碱基对之间(含)，最通常在19和21个碱基对之间(含)。类似地，与靶序列的互补区的长度在15和30个核苷酸之间(含)，更通常在18和25个核苷酸之间(含)，更通常在19和24个核苷酸之间(含)，最通常在19和21个核苷酸之间(含)。
在一些实施方案中，dsRNA长度在15至20个核苷酸之间(含)，和在其他实施方案中，dsRNA长度在25至30个核苷酸之间(含)。正如普通技术人员将认识到的，靶向于切割的RNA的靶向区域最通常是较大RNA分子(通常mRNA分子)的一部分。在相关的情况下，mRNA靶的“部分”是mRNA靶的连续序列，其长度足以成为RNAi指导切割(即，通过RISC途径的切割)的底物。具有短至9个碱基对的双链体的dsRNA在某些情况下可以介导RNAi指导的RNA切割。大多数情况下，靶长度至少为15个核苷酸，例如，长度为15-30个核苷酸。
本领域技术人员还将认识到，双链体区是dsRNA的主要功能部分，例如9至36个，例如15-30个碱基对的双链体区。因此，在一些实施方案中，就其被加工成例如15-30个碱基对的功能性双链体(其靶向所需的RNA进行切割)而言，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通技术人员将认识到，在一些实施方案中，miRNA则是dsRNA。在一些实施方案中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在一些实施方案中，可用于靶向SCN9A表达的iRNA剂不会通过切割较大的dsRNA在靶细胞中产生。
本文所述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端。dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成，如下文进一步讨论的，例如，通过使用自动化DNA合成仪，如可以从例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc商购获得。
在一些实施方案中，SCN9A是人SCN9A。
在特定实施方案中，dsRNA包含有义链和反义链，该有义链包含选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的有义序列的有义序列或由其组成，该反义链包含选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的反义序列的反义序列或由其组成。
在一些方面，dsRNA将至少包括有义和反义核苷酸序列，其中有义链选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的序列，且相应的反义链选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的序列。
在这些方面中，两个序列之一与两个序列中的另一个互补，其中一个序列与由SCN9A表达产生的mRNA序列基本上互补。因此，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸描述为有义链，而第二寡核苷酸描述为对应的反义链。如本文其他部分所述和本领域所知的，dsRNA的互补序列也可以作为单个核酸分子的自我互补区包含，而不是在单独的寡核苷酸上。
本领域技术人员非常清楚具有20至23个，特别是21个碱基对的双链体结构的dsRNA在诱导RNA干扰方面被认为是特别有效的(Elbashir等，EMBO 2001,20:6877-6888)。然而，其他人发现更短或更长的RNA双链体结构也可能有效。
在上述实施方案中，通过表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述dsRNA可包括至少一条长度至少为19个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，具有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中序列之一在一个或两个末端仅减去几个核苷酸的较短双链体将类似地有效。
在一些实施方案中，dsRNA具有来自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20的序列之一的至少15、16、17、18、19、20个或更多个连续核苷酸的部分序列。
在一些实施方案中，dsRNA具有包含来自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的反义序列的至少15、16、17、18或19个连续核苷酸的反义序列，以及包含来自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18或19个连续核苷酸的有义序列。
在一些实施方案中，dsRNA包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的反义序列的至少15、16、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸的反义序列，以及含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的相应有义序列的至少15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸的有义序列。
在一些这样的实施方案中，虽然仅包含表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的序列的一部分，该dsRNA与包含表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的全长序列的dsRNA同等有效地抑制SCN9A表达水平。在一些实施方案中，与包含本文公开的完整序列的dsRNA相比，dsRNA对SCN9A表达水平的抑制差异不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％抑制。
在一些实施方案中，表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20的iRNA降低了细胞中的SCN9A蛋白或SCN9A mRNA水平。在一些实施方案中，细胞为啮齿动物细胞(例如，大鼠细胞)或灵长动物细胞(例如，食蟹猴细胞或人细胞)。在一些实施方案中，SCN9A蛋白或SCN9A mRNA水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，抑制人细胞中SCN9A的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20的iRNA与人SCN9A的相应部分具有少于5、4、3、2或1个错配。在一些实施方案中，抑制人细胞中SCN9A的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20的iRNA与人SCN9A的相应部分不具有错配。
基于人序列设计的iRNA可具有用于例如抑制人细胞中的SCN9A的用途，例如用于治疗目的，或用于抑制啮齿动物细胞中的SCN9A的用途，例如用于在啮齿动物模型中表征SCN9A的研究。
在一些实施方案中，本文所述的iRNA包含含有SEQ ID NO:2的一部分核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的反义链，具有0、1、2或3个错配。在一些实施方案中，本文所述的iRNA包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少15个连续核苷酸的有义链，具有0或1、2或3个错配。
人SCN9A mRNA可具有本文中提供的SEQ ID NO:1的序列。
人电压门控钠通道，IX型α亚基(SCN9A)，转录物1，mRNA
Figure BDA0004004320660000381
Figure BDA0004004320660000391
Figure BDA0004004320660000401
Figure BDA0004004320660000411
Figure BDA0004004320660000421
Figure BDA0004004320660000431
SEQ ID NO:1的反向互补序列在本文中作为SEQ ID NO:2提供：
Figure BDA0004004320660000432
Figure BDA0004004320660000441
Figure BDA0004004320660000451
Figure BDA0004004320660000461
Figure BDA0004004320660000471
Figure BDA0004004320660000481
人SCN9A mRNA可具有本文中提供的SEQ ID NO:4001的序列。人电压门控钠通道，IX型α亚基(SCN9A)，转录物变体2，mRNA
Figure BDA0004004320660000482
Figure BDA0004004320660000491
Figure BDA0004004320660000501
Figure BDA0004004320660000511
Figure BDA0004004320660000521
Figure BDA0004004320660000531
SEQ ID NO:4001的反向互补序列在本文中作为SEQ ID NO:4002提供：
Figure BDA0004004320660000532
Figure BDA0004004320660000541
Figure BDA0004004320660000551
Figure BDA0004004320660000561
Figure BDA0004004320660000571
在一些实施方案中，本文所述的iRNA包括来自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中提供的序列之一的至少15个连续核苷酸，并且可以任选地与从与SCN9A中的选定序列连续的区域获得的另外的核苷酸序列偶联。
尽管靶序列的长度通常为15-30个核苷酸，但该范围内的特定序列对于指导任何给定靶RNA的切割的适用性存在广泛差异。此处列出的各种软件包和指南为识别任何给定基因靶标的最佳靶标序列提供了指导，但是也可以采用经验方法，其中给定大小(作为非限制性实例，21个核苷酸)的“窗口”或“掩码”在字面上或形象上(包括，例如，在计算机上)放置在靶RNA序列上，以鉴定可用作靶序列的大小范围内的序列。通过将序列“窗口”在初始靶序列位置的上游或下游逐步移动一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到针对所选的任何给定靶大小鉴定出可能序列的完整集合。该过程与所鉴定序列的系统合成和测试(使用本文所述或本领域已知的测定法)相结合以鉴定那些表现最佳的序列，可以鉴定那些当用iRNA试剂靶向时介导对靶基因表达的最佳抑制的RNA序列。因此，预期抑制效率的进一步优化可以通过在给定序列的上游或下游逐渐地“步移窗口”一个核苷酸来鉴定具有相同或更好抑制特性的序列来实现。
此外，预期对于例如在表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中鉴定的任何序列，进一步优化可以通过系统地添加或去除核苷酸以产生较长或较短的序列并测试这些和通过从该点在靶RNA上向上或向下步移较长或较短的窗口所产生的序列来实现。同样，将产生新候选靶标的该途径与在本领域公知的或如本文所述的抑制测定中基于那些靶序列的iRNA有效性测试相结合可以导致抑制效率的进一步提高。再此外，可以通过例如引入本文所述或本领域已知的修饰核苷酸、突出端的添加或改变或者本领域已知和/或本文讨论的其他修饰来调整此类优化的序列以进一步优化作为表达抑制剂的分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期，增加热稳定性，增强跨膜递送，靶向特定位置或细胞类型，增加与沉默途径酶的相互作用，增加从内体的释放等)。
在一些实施方案中，本公开提供了表2B、4B、5B、6B、13B、14B或15B中未修饰或未缀合的iRNA。在一些实施方案中，本公开的RNAi剂具有如表2A、4A、5A、6A、13A、14A、15A、16、18和20中任一个所提供的核苷酸序列，但缺少表中所示的一个或多个配体或部分。配体或部分(例如亲脂性配体或部分)可包含在本申请中提供的任何位置中。
本文所述的iRNA可包含与靶序列的一个或多个错配。在一些实施方案中，本文所述的iRNA包含不超过3个错配。在一些实施方案中，当iRNA的反义链包含与靶序列的错配时，错配区域不位于互补区的中心。在一些实施方案中，当iRNA的反义链包含与靶序列的错配时，错配被限制在互补区的5’或3’端的最后5个核苷酸内。例如，对于与SCN9A的区域互补的23个核苷酸的iRNA剂RNA链，该RNA链通常在中心的13个核苷酸内不包含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可用于确定含有与靶序列错配的iRNA是否有效抑制SCN9A的表达。考虑具有错配的iRNA在抑制SCN9A表达方面的效力非常重要，尤其是如果已知SCN9A基因中的特定互补区在群体中具有多态性序列变异。
在一些实施方案中，dsRNA的至少一个末端具有1至4个(通常1或2个)核苷酸的单链核苷酸突出端。在一些实施方案中，具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其平端的对应物具有更好的抑制特性。在一些方案中，iRNA(例如dsRNA)的RNA被化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。本公开中所述的核酸可通过本领域熟知的方法进行合成和/或修饰，例如“Current protocols in nucleic acid chemistry”,Beaucage，S.L.等(Edrs.),JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA中描述的那些，在此引入作为参考。修饰包括，例如，(a)末端修饰，例如，5’末端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)，3’末端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)，(b)碱基修饰，例如，用稳定化碱基、去稳定碱基或与扩展的伴体库碱基配对的碱基、除去碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基替代，(c)糖修饰(例如，在2’位置或4’位置处，或具有无环糖)或糖的替代，以及(d)主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代。可用于本公开的RNA化合物的特定实例包括但不限于含有修饰主链或不含天然核苷间键的RNA。具有修饰主链的RNA尤其包括那些在主链中没有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提到的，也可以将在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰的RNA认为是寡核苷。在特定实施方案中，修饰的RNA在其核苷间主链中将有磷原子。
修饰的RNA主链包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯(其具有正常3’-5’键)、这些的2’-5’连接的类似物，以及具有反向极性的那些(其中相邻的核苷单元对以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
教导制备上述含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，其每一个通过引用并入本文。
其中不包含磷原子的修饰的RNA主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰和硫代甲乙酰主链；亚甲基甲乙酰和硫代甲乙酰主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他主链的那些。
教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其每一个通过引用并入本文。
在适合于或考虑用于iRNA的其他RNA模拟物中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即，主链)被新基团替代。保持碱基单元用于与适合的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已被证明具有优异杂交性质的RNA模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，PNA的糖主链用含酰胺的主链替代，特别是氨乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并直接或间接结合到主链酰胺部分的氮杂氮原子上。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其每一个通过引用并入本文。PNA化合物的其他教导可以参见例如Nielsen等，Science,1991,254,1497-1500。
本公开中所述的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯主链的PNA和具有杂原子主链的寡核苷，并且特别是上文提及的美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--，以及上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施方案中，本文所述的RNA具有上文提及的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。天然磷酸二酯主链可以表示为O-P(O)(OH)-OCH2-。
修饰的RNA还可以包含一个或多个取代的糖部分。本文所述的iRNA(例如，dsRNA)在2’位处可以包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的适宜修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1到约10。在其他实施方案中，dsRNA在2’位处可以包含以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善iRNA药代动力学性质的基团或用于改善iRNA的药效学性质的基团以及具有类似性质的其他取代基。在一些实施方案中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一种示例性修饰是2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE，和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即，2’-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2。
在其他实施方案中，iRNA剂包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)无环核苷酸(或核苷)。在某些实施方案中，有义链或反义链或者有义链和反义链两者包含每条链少于五个无环核苷酸(例如，每条链四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。该一个或多个无环核苷酸可以存在于例如iRNA剂的有义链或反义链或者两条链的双链区中；在有义链或反义链或者两条链的5’末端、3’末端、5’末端和3’末端两者处。在一些实施方案中，一个或多个无环核苷酸存在于有义链或反义链或者这两者的位置1至8。在一些实施方案中，一个或多个无环核苷酸存在于反义链中，在反义链5’末端的位置4至10(例如，位置6-8)处。在一些实施方案中，一个或多个无环核苷酸存在于iRNA剂的一个或两个3’末端突出端处。
如本文所用，术语“无环核苷酸”或“无环核苷”指具有无环糖(例如，无环核糖)的任何核苷酸或核苷。示例性无环核苷酸或核苷可以包括核碱基，例如，天然存在的或修饰的核碱基(例如，如本文所述的核碱基)。在某些实施方案中，任何核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)之间的键独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施方案中，核糖环的C2-C3碳之间的键不存在，例如，无环2’-3’-断-核苷酸单体。在其他实施方案中，C1-C2、C3-C4或C4-C5之间的键不存在(例如，1’-2’、3’-4’或4’-5’-断核苷酸单体)。在US 8,314,227中公开了示例性无环核苷酸，其全部内容通过引用并入本文。例如，无环核苷酸可以包括US 8,314,227的附图1-2中单体D-J的任何一个。在一些实施方案中，无环核苷酸包括以下单体：
Figure BDA0004004320660000631
其中“碱基”是核碱基，例如，天然存在的或修饰的核碱基(例如，如本文所述的核碱基)。
在某些实施方案中，可以对无环核苷酸进行修饰或衍生化，例如，通过将无环核苷酸与另一部分，例如，配体(例如，GalNAc、胆固醇配体)、烷基、多胺、糖、多肽等偶联。
在其他实施方案中，iRNA剂包含一个或多个无环核苷酸和一个或多个LNA(例如，本文所述的LNA)。例如，一个或多个无环核苷酸和/或一个或多个LNA可以存在于有义链、反义链或者这两者中。在一条链中无环核苷酸的数量可以与相反链中LNA的数量相同或不同。在某些实施方案中，有义链和/或反义链包含少于五个位于双链区或3’-突出端的LNA(例如，四个、三个、两个或一个LNA)。在其他实施方案中，一个或两个LNA位于双链区或有义链的3’-突出端。可选地，或组合地，有义链和/或反义链在双链区或3’-突出端包含少于五个无环核苷酸(例如，四个、三个、两个或一个无环核苷酸)。在一些实施方案中，iRNA剂的有义链包含在有义链的3’突出端的一个或两个LNA，在iRNA剂的反义链(例如，反义链5’末端的位置4至10处(例如，位置6-8)处)的双链区中的一个或两个无环核苷酸。
在其他实施方案中，在iRNA剂中包含一个或多个无环核苷酸(单独或在一个或多个LNA之外)导致iRNA分子的以下一种或多种(或全部)：(i)降低脱靶效应；(ii)在RNAi中减少随从链的参与；(iii)提高指导链对其靶mRNA的特异性；(iv)降低微RNA的脱靶效应；(v)增加稳定性；或(vi)增加对降解的抗性。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-5氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰也可以在iRNA的RNA上的其他位置进行，特别是在3’末端核苷酸上或在2’-5’连接的dsRNA中糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。iRNA还可以具有糖模拟物如环丁基部分来代替呋喃戊糖。教导制备此类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633和5,700,920，其中某些是本申请人所共同拥有的，并且其每一个通过引用并入本文。
iRNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
其他修饰的核碱基包括在美国专利号3,687,808中公开的那些，在ModifiedNucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编著，Wiley-VCH,2008中公开的那些；在The Concise Encyclopedia of Polymer Science andEngineering,858-859页,Kroschwitz,J.L编著，John Wiley&Sons,1990中公开的那些，Englisch等，Angewandte Chemie,国际版，1991,30,613中公开的那些，以及Sanghvi,Y S.，第15章，dsRNA Research and Applications,第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.，编著，CRC Press,1993中公开的那些。这些修饰的核碱基中的某些对于增加本公开中所述的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)以及是示例性碱基取代，甚至更特别地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备某些上述修饰核碱基以及其他修饰核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其每一个通过引用并入本文，以及美国专利号5,750,692，也通过引用并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)双环糖部分。“双环糖”是由两个原子的桥连修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，该糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成双环环系统。在某些实施方案中，桥连接糖环的4’-碳和2’-碳。因此，在一些实施方案中，本公开的药剂可以包括一个或多个锁定核酸(LNA)(在本文中也称为“锁定核苷酸”)。在一些实施方案中，锁定核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含连接例如2’和4’碳的额外桥。该结构将核糖有效“锁定”在3’-内结构构象中。已显示向siRNA添加锁定核酸提高血清中的siRNA稳定性、提高热稳定性并减少脱靶效应(Elmen,J.等，(2005)Nucleic AcidsResearch 33(1):439-447；Mook,OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller,A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
用于本公开的多核苷酸的双环核苷的例子包括但不限于在4’和2’核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本公开的反义多核苷酸剂包括一个或多个包含4’-2’桥的双环核苷。这种4’-2’桥连双环核苷的例子包括但不限于4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(也称为“受限乙基”或“cEt”)和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(及其类似物；参见例如美国专利第7,399,845号)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其类似物；参见例如美国专利第8,278,283号)；4′-CH2-N(OCH3)-2′(及其类似物；参见例如美国专利第8,278,425号)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见例如，美国公开号2004/0171570)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R是H、C1-C12烷基或保护基(例如参见美国专利第7,427,672号)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见例如Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4′-CH2-C(＝CH2)-2′(及其类似物；参见例如美国专利第8,278,426号)。前述每一个的内容对于其中提供的方法均通过引用结合于此。教导制备锁定核酸的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；7,399,845和8,314,227，其每一个的全部内容通过引用并入本文。示例性LNA包括但不限于2’,4’-C亚甲基双环核苷酸(参见例如，Wengel等，国际PCT 5公开号WO00/66604和WO 99/14226)。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
本公开的RNAi剂也可以被修饰以包括一个或多个约束的乙基核苷酸。如本文所用，“约束的乙基核苷酸”或“cEt”是包含双环糖部分的锁定核酸，该双环糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。在一些实施方案中，约束的乙基核苷酸为S构象，本文中称为“S-cEt”。
本公开的RNAi剂还可包括一个或多个“构象限制的核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2’碳和C4’碳或核糖的C3碳和-C5’碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定在稳定的构象中，且提高与mRNA的杂交亲和力。接头的长度足以将氧置于对于稳定性和亲和力的最佳位置，从而导致较少的核糖环的折皱。
教导制备上述某些CRN的代表性公开包括但不限于US 2013/0190383；和WO 2013/036868，其各自的内容对于其中提供的方法均通过引用结合于此。
在一些实施方案中，本公开的RNAi剂包含一个或多个为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是解锁的无环核酸，其中糖的任何键已被移除，从而形成解锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA还包括在C1’-C4’之间的键被移除的单体(即，在C1’和C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2’-C3’键(即C2’碳和C3’碳之间的共价碳-碳键)已被移除(参见Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter等,Mol.Biosyst.,2009,10,1039)。
教导UNA制备的代表性美国公开包括但不限于US8,314,227；和美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，其各自的内容对于其中提供的方法通过引用结合于此。
在其他实施方案中，iRNA剂包含一个或多个(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)G-夹钳(G-clamp)核苷酸。G-夹钳核苷酸是修饰的胞嘧啶类似物，其中修饰赋予氢键合双链体内互补鸟嘌呤的Watson-Crick和Hoogsteen面两者的能力，参见例如，Lin和Matteucci,1998,J.Am.Chem.Soc.,120,8531-8532。当与互补寡核苷酸杂交时，寡核苷酸内的单个G-夹钳类似物取代可导致显著增强的螺旋热稳定性和错配辨别。在iRNA分子中包含此类核苷酸可导致对核酸靶标、互补序列或模板链的亲和性和特异性增强。
对RNA分子末端的潜在稳定化修饰可以包括N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2’-O-脱氧胸腺嘧啶(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3”-磷酸酯、反向碱基dT(idT)等。这种修饰的公开可以参见PCT公开号WO 2011/005861。
本公开的RNAi剂的其他修饰包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物，例如RNAi剂的反义链上的5’末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物在例如US 2012/0157511中公开，其内容对于其中提供的方法通过引用结合于此。
iRNA基序
在本公开的某些方面，本公开的双链RNAi剂包括具有化学修饰的试剂，如在例如WO 2013/075035中公开的，其内容对于其中提供的方法通过引用结合于此。如本文和WO2013/075035中所示，通过将一个或多个三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序引入RNAi剂的有义链或反义链中，特别是在切割位点处或其附近，可以获得优异的结果。在一些实施方案中，RNAi剂的有义链和反义链可以另外被完全修饰。这些基序的引入中断了有义链或反义链的修饰模式(如果存在)。RNAi剂可以任选地与亲脂性部分或配体(例如，C16部分或配体)缀合，例如在有义链上。RNAi剂可以任选地用(S)-二醇核酸(GNA)修饰进行修饰，例如在反义链的一个或多个残基上。产生的RNAi剂表现出优异的基因沉默活性。
在一些实施方案中，有义链序列可以以式(I)表示：
5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3’(I)
其中：
i和j各自独立地为0或1；
p和q各自独立地为0-6；
每个Na独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每条序列包含至少两个不同地修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；和
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。在一些实施方案中，YYY均是2’-F修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。
在一些实施方案中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或其附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，从5’端的第一核苷酸开始计数；或者任选地，从双链体区内从5’端的第一配对核苷酸开始计数。
在一些实施方案中，i是1和j是0，或i是0和j是1，或者i和j两者是1。因此，有义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’(Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’(Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’(Id)。
当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链由式(Id)表示时，每个Nb独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
每个X、Y和Z可以是相同的或彼此不同的。
在其他实施方案中，i是0和j是0，和有义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq 3’(Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5’nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3’(II)
其中：
k和l各自独立地为0或1；
p’和q’各自独立地为0-6；
每个Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np’和nq’独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同修饰；
和
X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上的三个相同修饰。
在一些实施方案中，Na’和/或Nb’包含交替模式的修饰。
Y’Y’Y’基序出现在有反义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区时，Y’Y’Y’基序可以出现在有反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，从5’端的第一核苷酸开始计数；或者任选地，从双链体区内的5’端的第一配对核苷酸开始计数。在一些实施方案中，Y’Y’Y’基序出现在位置11、12、13处。
在一些实施方案中，Y’Y’Y’基序全部是2’-Ome修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，k是1和l是0，或者k是0和l是1，或者k和l两者是1。
因此，反义链可以由下式表示：
5’nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3’(IIb)；
5’nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3’(IIc)；或
5’nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3’(IId)。
当反义链由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IId)表示时，每个Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方案中，k是0和l是0，且反义链可以由下式表示：
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’(Ia)。
当反义链由式(IIa)表示时，每个Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
每个X’、Y’和Z’可以是相同的或彼此不同的。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地被LNA、HNA、CeNA、GNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基或2’-氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地被2’-O-甲基或2’-氟修饰。特别地，每个X、Y、Z、X’、Y’和Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟修饰。
在一些实施方案中，当双链体区为21nt时，RNAi剂的有义链可以包含出现在链的9、10和11位的YYY基序，从5’端的第一核苷酸开始计数，或者任选地，从5’端开始双链体区内的第一配对核苷酸开始计数；和Y表示2’-F修饰。有义链可以另外包含XXX基序或ZZZ基序作为双链体区相对端的翼修饰；以及XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一些实施方案中，反义链可以具有出现在链的11、12、13位的Y’Y’Y’基序，从5’端的第一核苷酸开始计数，或者任选地，从5’端双链体区内的第一配对核苷酸开始计数；以及Y’表示2’-O-甲基修饰。反义链可以另外包含X’X’X’基序或Z’Z’Z’基序作为双链体区相对端的翼修饰；以及X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中任一个表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中任一个表示的反义链形成双链体。
因此，在本公开的方法中使用的某些RNAi剂可以包含有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：
有义链：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
反义链：3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’5’
(III)
其中，
i、j、k和l各自独立地为0或1；
p、p’、q和q’各自独立地为0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每条序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
Nb和Nb’各自独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个np’、np、nq’和nq(其每一个可以独立地存在或不存在)表示突出端核苷酸；和
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。
在一些实施方案中，i是0和j是0；或者i是1和j是0；或者i是0和j是1；或者i和j两者是0；或者i和j两者是1。在一些实施方案中，k是0和l是0；或者k是1和l是0；k是0和l是1；或者k和l两者是0；或者k和l两者是1。
形成RNAi双链体的有义链和反义链的示例性组合包括以下式：
5’np-Na-Y Y Y-Na-nq 3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’nq’5’
(IIIa)
5’np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
3’np-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’5’
(IIIb)
5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3’
3’np-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-nq’5’
(IIIc)
5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
3’np-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’5’
(IIId)
当RNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIc)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIId)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’、Nb和Nb’独立地包含交替模式的修饰。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的每个X、Y和Z可以是相同的或彼此不同的。
当RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示时，至少一个Y核苷酸可以与一个Y’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个Y核苷酸与相应Y’核苷酸形成碱基对；或者所有三个Y核苷酸全部与相应Y’核苷酸形成碱基对。
当RNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，至少一个Z核苷酸可以与一个Z’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个Z核苷酸与相应Z’核苷酸形成碱基对；或者所有三个Z核苷酸全部与相应Z’核苷酸形成碱基对。
当RNAi剂由式(IIIc)或(IIId)表示时，至少一个X核苷酸可以与一个X’核苷酸形成碱基对。或者，至少两个X核苷酸与相应X’核苷酸形成碱基对；或者所有三个X核苷酸全部与相应X’核苷酸形成碱基对。
在一些实施方案中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。
在一些实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰。在一些实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，以及np’>0和至少一个np’通过硫代磷酸酯键连接至相邻核苷酸。在一些实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0和至少一个np’通过硫代磷酸酯键连接至相邻核苷酸，以及有义链与通过二价或三价分支接头附接的一个或多个部分或配体(例如，一个或多个亲脂性部分，任选地一个或多个C16部分，或一个或多个GalNAc部分)缀合。在一些实施方案中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0和至少一个np’通过硫代磷酸酯键连接至相邻核苷酸，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，以及有义链与通过二价或三价分支接头附接的一个或多个部分或配体(例如，一个或多个亲脂性部分，任选地一个或多个C16部分，或一个或多个GalNAc部分)缀合。
在一些实施方案中，当RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0和至少一个np’通过硫代磷酸酯键连接至相邻核苷酸，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，以及有义链与通过二价或三价分支接头附接的一个或多个部分或配体(例如，一个或多个亲脂性部分，任选地一个或多个C16部分)缀合。
在一些实施方案中，RNAi剂是包含至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中双链体是通过接头连接的。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同基因；或者每个双链体可以在两个不同靶位点处靶向相同基因。
在一些实施方案中，RNAi剂是包含三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中双链体是通过接头连接的。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同基因；或者每个双链体可以在两个不同靶位点处靶向相同基因。
在一些实施方案中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两个RNAi剂在5’末端彼此连接，以及一个或两个3’末端任选地缀合至配体。每个RNAi剂可以靶向相同基因或两个不同基因；或者每个RNAi剂可以在两个不同靶位点处靶向相同基因。
各个公开出版物描述了可用于本公开方法的多聚RNAi剂。这类公开出版物包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520；及US7858769，其各自的内容对于其中提供的方法通过引用结合于此。在某些实施方案中，本公开的RNAi剂可包括GalNAc配体。
如下文更详细描述的，包含一个或多个碳水化合物部分与RNAi剂的缀合的RNAi剂可以优化RNAi剂的一个或多个性质。在许多情况下，碳水化合物部分将附接于RNAi剂的修饰亚单元。例如，dsRNA剂的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可被另一部分取代，例如，碳水化合物配体与其附接的非碳水化合物(优选环状)载体。其中亚单元的核糖被如此取代的核糖核苷酸亚单元在本文中被称为核糖取代修饰亚单元(RRMS)。环状载体可以是碳环环体系，即所有环原子是碳原子，或者是杂环环体系，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载体可以是单环环体系，或者可以包含两个或更多个环，例如稠合环。环状载体可以是完全饱和的环体系，或其也可以包含一个或多个双键。
配体可以通过载体附接到多核苷酸上。载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选两个“主链附接点”，和(ii)至少一个“系链附接点”。本文中使用的“主链附接点”指可用于且适合于将载体并入到核糖核酸的主链，例如磷酸酯或修饰的磷酸酯(例如含硫的)主链中的官能团，例如羟基，或通常键。在一些实施方案中，“系链附接点”(TAP)指连接所选择部分的环状载体的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)。该部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，所选择的部分通过插入的系链连接至环状载体。因此，环状载体通常包括官能团，例如氨基，或通常提供键，其适合于将另一化学实体(例如组成环的配体)并入或系链。
RNAi剂可以通过载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或无环基团。在一些实施方案中，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基。在一些实施方案中，无环基团选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些特定实施方案中，用于本公开方法的RNAi剂是选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个列出的RNAi剂组的RNAi剂。这些RNAi剂可进一步包含配体。配体可在3’端、5’端或两端附接于有义链、反义链或两条链。例如，配体可以与有义链缀合，特别是有义链的3’端。
iRNA缀合物
本文公开的iRNA剂可以是缀合物形式。缀合物可以附接在iRNA分子中的任何适宜位置，例如，在有义链或反义链的3’端或5’端。缀合物任选地通过接头附接。
在一些实施方案中，本文所述的iRNA剂与一个或多个配体、部分或缀合物化学连接，其可以例如通过影响(例如，增强)iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取赋予功能性。此类部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(beryl-S-tritylthiol)(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.,1992,20:533-538)、脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J,1991,10:1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.,1990,259:327-330；Svinarchuk等，Biochimie,1993,75:49-54)、磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.,1990,18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237)或十八烷基胺或己氨基-羰氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937)。
在一些实施方案中，配体改变其所掺入的iRNA剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方案中，例如，如与不存在配体的种类相比，配体提供了对于所选靶标的增强的亲和性，例如，分子、细胞或细胞类型、隔室(例如，细胞或器官隔室)、组织、器官或身体区域。典型的配体不会参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸是聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
脂质还可以包含与指定细胞类型(如肾细胞)结合的靶向基团，例如，细胞或组织靶向剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素或者RGD肽或RGD肽模拟物。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O-(十六烷基)甘油、香叶氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪和肽缀合物(例如，触角肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如，糖蛋白或肽，例如，对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如，结合指定细胞类型(如神经元)的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。其还可以包括非肽类物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是，例如，脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是物质，例如，药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如，通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来增加iRNA剂摄取进入细胞。药物可以是，例如，紫杉醇、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、茉莉花内酯(japlakinolide)、拉春库磷A、鬼笔环肽、swinholide A、indanocine或myoservin。
在一些实施方案中，附接至如本文所述的iRNA的配体用作药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适用于本公开作为配体(例如，作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(例如，血清蛋白)的适体也适合用作本文所述实施方案中的PK调节配体。
本公开的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用携带侧接反应性官能团的寡核苷酸来合成，如源自连接分子附接到寡核苷酸上的那些(如下所述)。这种反应性寡核苷酸可以直接与市售配体、合成的带有多种保护基团中任一种的配体或具有与其附接的连接部分的配体反应。
在本公开的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这种合成的设备由多家供应商销售，包括，例如，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)。可以附加地或替代地使用本领域已知用于此类合成的任何其他方式。还已知使用类似技术制备其他寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
在本公开的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体，或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体，或已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合物前体，或带有非核苷配体的构建块在合适的DNA合成仪上组装。
当使用已经带有连接部分的核苷酸-缀合物前体时，序列特异性连接的核苷的合成通常完成，然后配体分子与连接部分反应以形成配体-缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成仪使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺以及可商购和常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺合成。
A.亲脂性部分
在某些实施方案中，亲脂性部分为脂族、环状(例如脂环族)或多环(例如脂多环)化合物，例如类固醇(例如固醇))或者直链或支化的脂族烃。亲脂性部分通常可包含烃链，其可以是环状或非环状的。烃链可包含各种取代基或一个或多个杂原子，例如氧或氮原子。这些亲脂性脂族部分包括但不限于饱和或不饱和的C4-C30烃(例如，C6-C18烃)、饱和或不饱和的脂肪酸、蜡(例如，脂肪酸和脂肪二酰胺的一元醇酯)、萜烯(例如，C10萜烯、C15倍半萜、C20二萜、C30三萜和C40四萜)和其他脂多环烃。例如，亲脂性部分可包含C4-C30烃链(例如，C4-C30烷基或烯基)。在一些实施方案中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C6-C18烃链(例如线性C6-C18烷基或烯基)。在一些实施方案中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C16烃链(例如线性C16烷基或烯基)。
亲脂性部分可以通过本领域已知的任何方法附接到RNAi剂上，包括通过亲脂性部分中早已存在的或引入RNAi剂中的功能组群，例如羟基(例如，-CO-CH2-OH)。亲脂性部分中早已存在的或引入RNAi剂中的官能团包括但不限于羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔。
RNAi剂与亲脂性部分的缀合可通过例如在羟基和烷基R-、烷酰基RCO-或取代的氨基甲酰基RNHCO-之间形成醚或羧酸或氨基甲酰酯键来发生。烷基R可以是环状的(例如环己基)或非环状的(例如直链或支链的；且是饱和或不饱和的)。烷基R可以是丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基等。
在一些实施方案中，亲脂性部分通过接头(包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物(例如叠氮-炔环加成的三唑)或氨基甲酸酯的接头)与双链RNAi剂缀合。
在其它实施方案中，亲脂性部分是类固醇，例如固醇。类固醇是含有全氢-1,2-环戊烷多氢菲(cyclopentanophenanthrene)环体系的多环化合物。类固醇包括但不限于胆汁酸(例如，胆酸、去氧胆酸和去氢胆酸)、可的松、地高辛、睾酮、胆固醇和阳离子类固醇，例如可的松。“胆固醇衍生物”指由胆固醇衍生的化合物，例如通过取代、添加或去除取代基。
在其它实施方案中，亲脂性部分是芳族部分。在这种情况中，术语“芳族”广义地指单和多芳族烃。芳族基团包括但不限于包含一至三个芳族环的C6-C14芳基部分，其可以任选被取代；包含与烷基共价连接的芳基的“芳烷基”或“芳基烷基”，其任一个可以独立地任选被取代或未取代；和“杂芳基”基团。如本文所用，术语“杂芳基”指具有5至14个环原子，优选5、6、9或10个环原子；具有6个、10个或14个在环状阵列中共享的π电子，并且除碳原子外，具有1至约3个选自氮(N)、氧(O)和硫(S)的杂原子的基团。
如本文所用，“取代的”烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基是具有1至约4个、优选1至约3个、更优选1或2个非氢取代基的基团。合适的取代基包括但不限于卤素、羟基、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰基氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟烷基、链烷磺酰基、芳烃磺酰基、链烷磺酰氨基、芳烃磺酰氨基、芳烷基磺酰氨基、烷基羰基、酰氧基、氰基和脲基。
在一些实施方案中，亲脂性部分是芳烷基，例如2-芳基丙酰基部分。芳烷基的结构特征选择为使得亲脂性部分在体内结合至少一种蛋白质。在某些实施方案中，芳烷基的结构特征选择为使得亲脂性部分与血清、血管或细胞蛋白结合。在某些实施方案中，芳烷基的结构特征促进与白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、α-2-巨球蛋白或α-1-糖蛋白的结合。
在某些实施方案中，配体是萘普生或萘普生的结构衍生物。萘普生的合成程序可在美国专利第3,904,682号和美国专利第4,009,197号中找到，其整体在此引入作为参考。萘普生的化学名称为(S)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸，且其结构为
Figure BDA0004004320660000821
在某些实施方案中，配体为布洛芬或布洛芬的结构衍生物。布洛芬的合成程序可在US3,228,831中找到，其对于其中提供的方法通过引用并入本文。布洛芬的结构为
Figure BDA0004004320660000822
另外的示例性芳烷基在US 7,626,014中说明，其对于其中提供的方法在此引入作为参考。
在其它实施方案中，合适的亲脂性部分包括脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、布洛芬、萘普生、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
在某些实施方案中，可以在双链RNAi剂中掺入超过一个亲脂性部分，特别是当亲脂性部分具有低亲脂性或疏水性时。在一些实施方案中，两个或更多个亲脂性部分被掺入到双链RNAi剂的相同链中。在一些实施方案中，双链RNAi剂的每一链具有一个或多个掺入的亲脂性部分。在一些实施方案中，两个或更多个亲脂性部分被掺入到双链RNAi剂的相同位置(即相同的核碱基、相同的糖部分或相同的核苷间连接)。这可以通过例如连续地使两个或更多个亲脂性部分通过载体缀合，或通过经由支化接头使两个或更多个亲脂性部分缀合，或通过经由一个或多个接头使两个或更多个亲脂性部分缀合一个或多个连接亲脂性部分的接头来实现。
亲脂性部分可以通过直接附接到RNAi剂的核糖糖上而与RNAi剂缀合。或者，亲脂性部分可以通过接头或载体与双链RNAi剂缀合。
在某些实施方案中，亲脂性部分可以通过一个或多个接头(系链)与RNAi剂缀合。
在一些实施方案中，亲脂性部分通过包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物(例如叠氮-炔环加成的三唑)或氨基甲酸酯的接头与双链RNAi剂缀合。
B.脂质缀合物
在一些实施方案中，配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子通常可以结合血清蛋白，如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物血管分布到靶组织。例如，靶组织可以是中枢神经系统(CNS)，例如，脑和/或脊髓，例如，背根神经节。其他可以结合HAS的分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如，HSA的结合。
基于脂质的配体可用于调节例如控制(例如，抑制)缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA结合更强的脂质或基于脂质的配体将不太可能靶向肾脏，因此较少可能从体内清除。与HSA结合较弱的脂质或基于脂质的配体可用于将缀合物靶向肾脏。
在一些实施方案中，基于脂质的配体结合HSA。例如，配体可以以足够的亲和力结合HSA，从而增强缀合物向非肾组织的分布。然而，亲和力通常不会强到无法逆转HSA配体结合。
在一些实施方案中，基于脂质的配体弱结合或根本不结合HSA，从而增强了缀合物向肾脏的分布。靶向肾细胞的其他部分也可替代或在基于脂质的配体之外使用。
在其它实施方案中，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分(例如，维生素)。这些特别可用于治疗以不希望的细胞增殖为特征的障碍，例如，恶性或非恶性类型的细胞增殖，例如，癌细胞。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或者被癌细胞摄取的其他维生素或营养素。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
细胞渗透剂
在其它实施方案中，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一些实施方案中，所述药剂是两亲性的。示例性药剂是肽，如tat或触角蛋白。如果药剂是肽，则可以对其进行修饰，包括肽模拟物、转化体、非肽或假肽连接以及使用D-氨基酸。螺旋剂通常是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的连接可以影响iRNA的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树枝状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性的含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:3699)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:3700))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带包括肽、寡核苷酸和蛋白的大极性分子穿过细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:3701))和果蝇触角蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:3702))的序列能够用作递送肽。肽或肽模拟物可由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等，Nature,354:82-84,1991)。通常，通过并入的单体单元系链到dsRNA剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分长度范围可以是从约5个氨基酸到约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或指导构象特性。可以使用下文所述的任何结构修饰。
用于本公开的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如，糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含有RGD的肽和肽模拟物可以包含D-氨基酸，以及合成的RGD模拟物。除了RGD以外，可以使用靶向整联蛋白配体的其他部分。在一些实施方案中，该配体的缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可以用于靶向特定细胞类型，例如，肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann等，Cancer Res.,62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进dsRNA剂靶向多种其他组织的肿瘤，包括肺、肾脏、脾脏或肝脏(Aoki等，Cancer Gene Therapy 8:783-787,2001)。通常，RGD肽将促进iRNA剂靶向肾脏。RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如，糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以将iRNA剂递送到表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner等，Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如，微生物细胞，如细菌或真菌细胞或哺乳动物细胞，如人细胞。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或indolicidin)。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其衍生自HIV-1gp41和SV40大T抗原的NLS的融合肽结构域(Simeoni等，Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
碳水化合物缀合物和配体
在本公开的组合物和方法的一些实施方案中，iRNA寡核苷酸还包含碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA有利于核酸的体内递送，以及适用于体内治疗用途的组合物，如本文所述。如本文所用，“碳水化合物”是指一种化合物，其本身是由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元组成的碳水化合物(可以是直链、支链或环状的)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子键合；或者具有作为其一部分的碳水化合物部分的化合物(其可以是直链的、支链的或环状的)，所述碳水化合物部分由一个或多个各自具有至少六个碳原子的单糖单元组成，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子键合。代表性碳水化合物包括糖类(单糖、二糖、三糖和含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)和多糖，如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定的单糖包括C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)的糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法包括C16配体。在示例性实施方案中，本公开的C16配体具有以下结构(在下文中例举了尿嘧啶碱基，但是对于呈现任何碱基(C、G、A等)或具有本文所述的任何其他修饰的核苷酸，也考虑了C16配体的连接，条件是保留2’核糖连接)并连接在如此修饰的残基内核糖的2’位置：
Figure BDA0004004320660000871
化学式：C25H43N2O8P
精确质量：530.2757
分子量：530.5913
如上所示，C16配体修饰的残基在如此修饰的示例性残基(此处为尿嘧啶)的2’核糖位置呈现直链烷基。
在示例性实施方案中，本公开的C16配体可根据以下结构与核糖核苷酸残基缀合：具有本文所述的任何其他修饰，前提是保留2’-核糖连接并连接在如此修饰的残基内的核糖的2’-位置：
Figure BDA0004004320660000872
其中*表示与相邻核苷酸的键，和B是核碱基或核碱基类似物，例如，其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在一些实施方案中，本公开的RNAi剂的碳水化合物缀合物进一步包含一个或多个如上所述的另外的配体，例如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。
适用于本公开的另外的碳水化合物缀合物(和接头)包括WO 2014/179620和WO2014/179627中所描述的那些，其各自的全部内容通过引用结合于此。
在某些实施方案中，本公开的组合物和方法包括如本文所述的RNAi剂的5’-乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性实施方案中，本公开的5’-乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸具有下式的结构：
Figure BDA0004004320660000881
其中X为O或S；
R是氢、羟基、甲氧基、氟或C1-20烷氧基(例如甲氧基或正十六烷基氧基)；
R5’是＝C(H)-P(O)(OH)2且C5’碳和R5’之间的双键处于E或Z定向(例如E定向)；并且B是核碱基或修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。本发明公开的乙烯膦酸酯可以连接到本公开的dsRNA的反义链或有义链上。在某些实施方案中，本公开的乙烯基膦酸酯连接于dsRNA的反义链，任选地dsRNA的反义链的5’端。
本公开的组合物和方法也考虑了乙烯基磷酸酯修饰。示例性的乙烯基磷酸酯结构为：
Figure BDA0004004320660000882
例如，包括前述结构，其中R5’为＝C(H)-OP(O)(OH)2，并且C5’碳和R5’之间的双键处于E或Z定向(例如，E定向)。
在一些实施方案中，碳水化合物缀合物包含单糖。在一些实施方案中，单糖是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc缀合物，其包含一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物，描述在例如美国专利号8,106,022中，其全部内容通过引用并入本申请。在一些实施方式中，GalNAc缀合物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施方式中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝细胞，例如，通过充当肝脏细胞(例如，肝细胞)的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物包含一个或多个GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头附接，例如，二价或三价分支接头。在一些实施方式中，GalNAc缀合物缀合至有义链的3’端。在一些实施方式中，GalNAc缀合物通过接头(例如，如本文所述的接头)缀合至iRNA剂(例如，有义链的3’端)。
在一些实施方式中，GalNAc缀合物是
Figure BDA0004004320660000891
在一些实施方式中，如下述示意所示，RNAi剂通过接头附接至碳水化合物缀合物，其中X是O或S：
Figure BDA0004004320660000892
在一些实施方式中，RNAi剂如表1中定义的并如下所示缀合至L96：
Figure BDA0004004320660000901
在一些实施方式中，在本公开的组合物和方法中使用的碳水化合物缀合物选自以下：
Figure BDA0004004320660000902
Figure BDA0004004320660000911
Figure BDA0004004320660000921
Figure BDA0004004320660000931
Figure BDA0004004320660000941
在本文所述的实施方式中使用的另一个代表性碳水化合物缀合物包括但不限于，
Figure BDA0004004320660000942
当X或Y之一是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物还包含一个或多个如上文所述的另外的配体，例如但不限于PK调节剂和/或细胞渗透肽。
在一些实施方案中，本公开的iRNA通过接头缀合至碳水化合物。本公开的组合物和方法的具有接头的iRNA碳水化合物缀合物的非限制性实例包括但不限于，
Figure BDA0004004320660000951
Figure BDA0004004320660000961
当X或Y之一是寡核苷酸时，另一个是氢。
E.热去稳定修饰
在某些实施方案中，可以通过在反义链的种子区(即，在反义链5’端的2-9位)引入热去稳定修饰来优化dsRNA分子，以减少或抑制脱靶基因沉默。已发现，具有在反义链的前9个核苷酸位置(从5’端开始计数)内包含至少一个双链体热去稳定修饰的反义链的dsRNA具有降低的脱靶基因沉默活性。因此，在一些实施方案中，反义链包含在反义链5’区前9个核苷酸位置内的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体热去稳定修饰。在一些实施方案中，双链体的一个或多个热去稳定修饰位于反义链5’端的2-9位，或4-8位。在一些进一步的实施方案中，双链体的热去稳定修饰位于反义链5’端的6、7或8位。在另外一些进一步的实施方案中，双链体的热去稳定修饰位于反义链5’端的7位。术语“热去稳定的修饰”包括将导致dsRNA具有较低的总体解链温度(Tm)的修饰(优选Tm比没有这类修饰的dsRNA的Tm低一、二、三或四度)。在一些实施方案中，双链体的热去稳定修饰位于反义链5’端的2、3、4、5或9位。
热去稳定的修饰可包括但不限于无碱基修饰；与相对链中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2’-脱氧修饰或无环核苷酸，例如解锁核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)。
示例性的无碱基修饰包括但不限于以下：
Figure BDA0004004320660000971
其中R＝H、Me、Et或OMe；R’＝H、Me、Et或OMe；R"＝H、Me、Et或OMe
Figure BDA0004004320660000972
其中B是修饰或未修饰的核碱基。
示例性的糖修饰包括但不限于以下：
Figure BDA0004004320660000973
R＝H、OH、O-烷基R＝H、OH、O-烷基
Figure BDA0004004320660000974
其中B是修饰或未修饰的核碱基。
在一些实施方案中，双链体的热去稳定修饰选自：
Figure BDA0004004320660000981
其中B是修饰或未修饰的核碱基，且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
术语“无环核苷酸”指具有无环核糖的任何核苷酸，例如，其中核糖碳之间的任何键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’或C1’-O4’)不存在，或者核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施方案中，无环核苷酸是
Figure BDA0004004320660000982
Figure BDA0004004320660000983
其中B是修饰或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；并且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。术语“UNA”指解锁的无环核酸，其中糖的任何键已被移除，从而形成解锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA还包括C1’-C4’之间的键被去除的单体(即，C1’碳和C4’碳之间的碳-氧-碳共价键)。在另一个实例中，糖的C2’-C3’键(即C2’碳和C3’碳之间的碳-碳共价键)被去除(参见Mikhailov等，TetrahedronLetters,26(17):2059(1985)和Fluiter等，Mol.Biosyst.,10:1039(2009)，其全部内容通过引用结合于此)。无环衍生物提供了更大的主链灵活性而不影响Watson-Crick配对。无环核苷酸可以通过2’-5’或3’-5’键连接。
术语“GNA”指二醇核酸，其是类似于DNA或RNA但其“主链”组成不同在于由通过磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成的聚合物：
Figure BDA0004004320660000991
双链体的热去稳定修饰可以是dsRNA双链体内的热去稳定核苷酸和相对链中的相对核苷酸之间的错配(即非互补碱基对)。示例性错配碱基对包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其他错配碱基配对也适用于本发明。核苷酸之间可能发生天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸的错配，即来自相应核苷酸的核碱基之间可能发生错配碱基配对，而与核苷酸的核糖上的修饰无关。在某些实施方案中，dsRNA分子在错配配对中包含至少一个核碱基，其为2’-脱氧核碱基；例如，2’-脱氧核碱基在有义链中。
在一些实施方案中，反义链种子区中的双链体热去稳定修饰包括与靶mRNA上的互补碱基的W-C H键合受损的核苷酸，例如：
Figure BDA0004004320660001001
在WO 2011/133876中详细描述了无碱基核苷酸、无环核苷酸修饰(包括UNA和GNA)和错配修饰的更多实例，其全文引入本文中作为参考。
热去稳定的修饰还可以包括与相对的碱基形成氢键的能力降低或消除的通用碱基，以及磷酸酯修饰。
在一些实施方案中，双链体的热去稳定修饰包括具有非典型碱基的核苷酸，例如但不限于具有受损或完全丧失与相反链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰。如WO2010/0011895中所述，这些核碱基修饰已评估了dsRNA双链体中心区的去稳定，其在此全文引入作为参考。示例性的核碱基修饰是：
Figure BDA0004004320660001002
在一些实施方案中，反义链种子区中双链体的热去稳定修饰包括一个或多个与靶mRNA上的碱基互补的α-核苷酸，例如：
Figure BDA0004004320660001011
其中R是H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体的热稳定性的示例性磷酸酯修饰是：
Figure BDA0004004320660001012
R＝烷基
R基团的烷基可以是C1-C6烷基。R基团的特定烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基和己基。
如本领域技术人员将认识到的，鉴于核碱基的功能性作用是定义本公开的RNAi剂的特异性，尽管核碱基的修饰可以以本文所述的各种方式进行，例如，以将去稳定的修饰引入本公开的RNAi剂中，例如，为了相对于脱靶效应增强中靶效应的目的，本公开的RNAi剂上可用的且通常存在的修饰的范围对于非核碱基修饰(例如，对聚核糖核苷酸的糖基或磷酸酯主链的修饰)往往大得多。这类修饰在本公开的其他章节中更详细地描述，并且明确预期用于本公开的RNAi剂，其具有天然核碱基或如上文或本文其他地方所述的修饰的核碱基。
除了包含热去稳定修饰的反义链外，dsRNA也可以包含一个或多个稳定化修饰。例如，dsRNA可包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。非限制地，稳定化修饰可全部存在于一条链中。在一些实施方案中，有义链和反义链均包含至少两个稳定化修饰。稳定化修饰可以存在于有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，稳定化修饰可以存在于有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个稳定化修饰可以在有义链或反义链上以交替模式存在；或者有义链或反义链包含交替模式的稳定化修饰。有义链上的稳定化修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上的稳定化修饰的交替模式可以相对于反义链上的稳定化修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施方案中，反义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。非限制地，反义链中的稳定化修饰可以存在于任何位置。
在一些实施方案中，反义链包含从5’端起在2、6、8、9、14和16位的稳定化修饰。在一些其他实施方案中，反义链包含从5’端起在2、6、14和16位的稳定化修饰。在其他一些实施方案中，反义链包含从5’端起第2、14和16位的稳定化修饰。
在一些实施方案中，反义链包含至少一个与去稳定修饰相邻的稳定化修饰。例如，稳定化修饰可以是去稳定修饰的5’端或3’端的核苷酸，即去稳定化修饰位置的-1或+1位。在一些实施方案中，反义链在去稳定化修饰的5’端和3’端的每一个处，即去稳定化修饰位置的-1和+1位，包含稳定化修饰。
在一些实施方案中，反义链在去稳定化修饰的3’端，即去稳定化修饰位置的+1和+2位，包含至少两个稳定化修饰。
在一些实施方案中，有义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。非限制地，有义链中的稳定化修饰可存在于任何位置。在一些实施方案中，有义链包含从5’端起7、10和11位的稳定化修饰。在一些其他实施方案中，有义链包含从5’端起7、9、10和11位的稳定化修饰。在一些实施方案中，有义链包含与从反义链的5’端计数反义链的11、12和15位相对或互补的位置处的稳定化修饰。在一些其他实施方案中，有义链包含在与从反义链的5’端计数的反义链的11、12、13和15位相对或互补的位置处的稳定化修饰。在一些实施方案中，有义链包含两个、三个或四个稳定化修饰的区块。
在一些实施方案中，有义链在与反义链中双链体热去稳定修饰相对或互补的位置不包含稳定化修饰。
示例性热稳定化修饰包括但不限于2’-氟修饰。其他热稳定化修饰包括但不限于LNA。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA包含至少四个(例如，四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。非限制地，2’-氟核苷酸可全部存在于一条链中。在一些实施方案中，有义链和反义链均包含至少两个2’-氟核苷酸。2’-氟修饰可以存在于有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，2’-氟修饰可以存在于有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个2’-氟修饰可以以交替模式存在于有义链或反义链上；或者有义链或反义链两者包含交替模式的2’-氟修饰。有义链上2’-氟修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，且有义链上2’-氟修饰的交替模式可以相对于反义链上2’-氟修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施方案中，反义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。非限制地，反义链中的2’-氟修饰可以存在于任何位置。在一些实施方案中，反义链包含位于5’端起的2、6、8、9、14和16位的2’-氟核苷酸。在一些其他实施方案中，反义链包含5’端起的2、6、14和16位的2’-氟核苷酸。在其他一些实施方案中，反义链包含5’端起的2、14和16位的2’-氟核苷酸。
在一些实施方案中，反义链包含至少一个与去稳定化修饰相邻的2’-氟核苷酸。例如，2’-氟核苷酸可以是去稳定化修饰的5’端或3’端处的核苷酸，即去稳定化修饰位置的-1或+1位。在一些实施方案中，反义链在去稳定化修饰的5’端和3’端的每一个处(即，去稳定化修饰位置的-1和+1位)包含2’-氟核苷酸。
在一些实施方案中，反义链在去稳定化修饰的3’端，即在去稳定化修饰位置的+1和+2位处，包含至少两个2’-氟核苷酸。
在一些实施方案中，有义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。非限制地，有义链中的2’-氟修饰可以存在于任何位置。在一些实施方案中，反义链包含5’端的7、10和11位的2’-氟核苷酸。在一些其他实施方案中，有义链包含5’端的7、9、10和11位的2’-氟核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含与从反义链的5’端计数的反义链的11、12和15位相对或互补的位置处的2’-氟核苷酸。在一些其他实施方案中，有义链包含与从反义链的5’端计数的反义链的11、12、13和15位相对或互补的位置处的2’-氟核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含两个、三个或四个2’-氟核苷酸的区块。
在一些实施方案中，有义链不包含位于与反义链中双链体的热去稳定修饰相对或互补位置处的2’-氟核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中反义链包含至少一个热去稳定的核苷酸，其中该至少一个热去稳定的核苷酸存在于反义链的种子区(即，在反义链5’端的2-9位)，其中dsRNA的一端是钝端的，而另一端包含2nt的突出端，并且其中dsRNA任选地进一步具有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)以下特征：(i)反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)有义链与配体缀合；(iv)有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；和(vii)dsRNA包含位于反义链5’端的钝端。在一些实施方案中，2nt突出端位于反义链的3’端。
在一些实施方案中，dsRNA分子的有义链和反义链中的每一个核苷酸可被修饰。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，其可包括非连接的磷酸酯氧中的一个或两个或者连接的磷酸酯氧中的一个或多个的一个或多个改变；核糖成分的改变，例如核糖上的2’羟基的改变；用“脱磷”接头大批替代磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替代；以及核糖-磷酸酯主链的替代或修饰。
由于核酸是亚单元的聚合物，许多修饰存在于核酸内重复的位置处，例如碱基或磷酸酯部分或磷酸酯部分的非连接O的修饰。在一些情况下，修饰将存在于核酸中的所有受试位置处，但在许多情况下不存在。举例来说，修饰可能仅存在于3’或5’末端位置，可能仅存在于末端区域，例如，在末端核苷酸上的位置或链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可存在于双链区、单链区或两者中。修饰可能仅存在于核糖核酸RNA的双链区中，或可以仅存在于RNA的单链区中。例如，在非连接O位置的硫代磷酸酯修饰可以仅存在于一个或两个末端，可能仅存在于末端区域，例如，在链的末端核苷酸或最后2、3、4、5或10个核苷酸中的位置处，或可以存在于双链和单链区，特别是在末端处。一个或多个5’端可以磷酸化。
例如，为了增强稳定性，可能在突出端中包含特定的碱基，或在单链突出端(例如5’或3’突出端或两者中)包含修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可能希望在突出端中包含嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3’或5’突出端中的全部或部分碱基可以被修饰，例如，用本文所述的修饰。修饰可包括，例如，在核糖的2’位使用本领域已知的修饰，例如，使用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。
在一些实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧或2’-氟进行修饰。链可以包含多于一个修饰。在一些实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地用2’-O-甲基或2’-氟修饰。应当理解，这些修饰是反义链中存在的至少一个双链体的热去稳定修饰之外的。
有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2’-去氧、2’-O-甲基或2’-氟修饰、无环核苷酸或其他。在一些实施方案中，有义链和反义链各自包含两种不同地修饰的核苷酸，其选自2’-O-甲基或2’-去氧。在一些实施方案中，有义链和反义链的每个残基独立地用2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)核苷酸、2’-O-二甲胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)核苷酸、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)核苷酸或2’-ara-F核苷酸修饰。同样，应当理解，这些修饰是反义链中存在的至少一个双链体的热去稳定修饰之外的。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子包含交替模式的修饰，特别是在B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、B4’区中。这里使用的术语“交替基序”或“交替模式”指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰存在于一条链的交替核苷酸上。交替的核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每隔三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自代表对核苷酸的一种类型的修饰，则交替的基序可以是“ABABABABABAB……”、“AABBAABBAABB……”、“AABAABAABAAB……”、“AAABAAABAAAB……”、“AAABBBAAABBB”或“ABCABCABCABC……”等。
交替基序中包含的修饰类型可以相同或不同。例如，如果A、B、C、D各自代表核苷酸上的一种类型的修饰，则交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以相同，但是有义链或反义链各自可以选自交替基序内的几种修饰可能性，例如“ABABAB……”、“ACACAC……”、“BDBDBD……”或“CDCDCD……”等。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子包含有义链上的交替基序相对于反义链上的交替基序的修饰模式偏移的修饰模式。该偏移可以使得有义链的核苷酸的修饰组对应于反义链的核苷酸的不同修饰的组，反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5’-3’以“ABABAB”开始，而反义链中的交替基序可以在双链体区域内从链的3’-5’以“BABABA”开始。作为另一个例子，有义链中的交替基序可以从链的5’-3’以“AABBAABB”开始，且反义链中的交替基序可以在双链体区域内从链的3’-5’以“BBAABBAA”开始，使得有义链和反义链之间的修饰模式存在完全或部分偏移。
本公开的dsRNA分子可进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以在链的任何位置处存在于有义链或反义链或两者的任何核苷酸上。例如，在有义链或反义链上的每一个核苷酸上可存在核苷酸间键修饰；每一个核苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式存在；或者有义链或反义链包含交替模式的两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上的核苷酸间键修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施方案中，dsRNA分子在突出端区域中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区域包含两个核苷酸，该两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。也可以进行核苷酸间键修饰以将突出端核苷酸与双链体区内的末端配对核苷酸链接。例如，至少2个、3个、4个或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在连接突出端核苷酸与紧接突出端核苷酸的配对核苷酸的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。例如，在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，且第三个是紧接突出端核苷酸的配对核苷酸。优选地，这三个末端核苷酸可以位于反义链的3’端。
在一些实施方案中，dsRNA分子的有义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键分开的2-10个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的1-10个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述有义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的反义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间键分开的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键分开的三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个磷酸酯核苷酸间键分开的四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个磷酸酯核苷酸间键分开的五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸酯核苷酸间键分开的六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3、4、5、6、7或8个磷酸酯核苷酸间键分开的七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3、4、5或6个磷酸酯核苷酸间键分开的八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或者包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，dsRNA分子的反义链包含通过1、2、3或4个磷酸酯核苷酸间键分开的九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个区块，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链或反义链末端位置的1-10位内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过在有义链或反义链的一端或两端的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键连接。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链或反义链各自的双链体内部区域的1-10位内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过在从有义链5’端计数的双链体区的8-16位的硫代磷酸酯甲基膦酸酯的核苷酸间键连接；dsRNA分子可任选地在末端位置的1-10位内进一步包含一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含有义链(从5’端计数)的1-5位内的1-5个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的1-5个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链(从5’端计数)的1和2位的1-5个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的1-5个。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含有义链(从5’端计数)的1-5位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含有义链(从5’端计数)的1-5位内两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1-5位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和18-23位内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和20和21位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和20和21位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，和21和22位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21和22位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和22和23位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子进一步包含在有义链(从5’端计数)的1位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和21位的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(从5’端计数)的1和2位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和23和23位的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中，本公开的化合物包含主链手性中心的模式。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少5个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少6个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少7个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少8个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少9个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少10个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少11个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少12个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少13个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少14个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少15个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少16个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少17个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少18个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少19个Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过8个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过7个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过6个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过5个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过4个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过3个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过2个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过1个Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过8个非手性(作为非限制性例子，磷酸二酯)的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过3个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过2个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含不超过1个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少10个Sp构型的核苷酸间键，以及不超过8个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少11个Sp构型的核苷酸间键，以及不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少12个Sp构型的核苷酸间键，以及不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少13个Sp构型的核苷酸间键，以及不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少14个Sp构型的核苷酸间键，以及不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，主链手性中心的常见模式包含至少15个Sp构型的核苷酸间键，以及不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中，Sp构型的核苷酸间键是任选地连续的或不连续的。在一些实施方案中，Rp构型的核苷酸间键是任选地连续的或不连续的。在一些实施方案中，非手性的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。
在一些实施方案中，本公开的化合物包含作为立体化学区块的区块。在一些实施方案中，区块是Rp区块，其中区块的每个核苷酸间键是Rp。在一些实施方案中，5’-区块是Rp区块。在一些实施方案中，3’-区块是Rp区块。在一些实施方案中，区块是Sp区块，其中该区块中的每个核苷酸间键是Sp。在一些实施方案中，5’-区块是Sp区块。在一些实施方案中，3’-区块是Sp区块。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸同时包含Rp和Sp区块。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个Rp区块，但不包含Sp区块。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个Sp区块，但不包含Rp区块。在一些实施方案中，提供的寡核苷酸包含一个或多个PO区块，其中每个核苷酸间键是天然磷酸酯键。
在一些实施方案中，本公开的化合物包含作为Sp区块的5’-区块，其中每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方案中，5’-区块是Sp区块，其中每个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方案中，5’-区块是Sp区块，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方案中，5’-区块包含4个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，5’-区块包含5个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，5’-区块包含6个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，5’-区块包含7个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，3’-区块是Sp区块，其中每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方案中，3’-区块是Sp区块，其中每个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方案中，3’-区块是Sp区块，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方案中，3’-区块包含4个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，3’-区块包含5个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，3’-区块包含6个或更多个核苷单元。在一些实施方案中，3’-区块包含7个或更多个核苷单元。
在一些实施方案中，本公开的化合物在区域或寡核苷酸中包含一种类型的核苷，其后是特定类型的核苷酸间键，例如天然磷酸酯连接、修饰的核苷酸间键、Rp手性核苷酸间键、Sp手性核苷酸间键等。在一些实施方案中，A之后是Sp。在一些实施方案中，A之后是Rp。在一些实施方案中，A之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方案中，U之后是Sp。在一些实施方案中，U之后是Rp。在一些实施方案中，U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方案中，C之后是Sp。在一些实施方案中，C之后是Rp。在一些实施方案中，C之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方案中，G之后是Sp。在一些实施方案中，G之后是Rp。在一些实施方案中，G之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方案中，C和U之后是Sp。在一些实施方案中，C和U之后是Rp。在一些实施方案中，C和U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方案中，A和G之后是Sp。在一些实施方案中，A和G之后是Rp。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子包含双链体内与靶标的错配，或其组合。错配可存在于突出端区域或双链体区域中。碱基对可基于其促进解离或解链的倾向分级(例如，基于特定配对的结合或解离的自由能，最简单的方法是基于单个对来检查碱基对，尽管也可使用下一个相邻或类似的分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优先于G:C；和I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范配对或规范配对以外的配对(如本文其他地方所述)优于规范配对(A:T，A:U，G:C)；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子包含自反义链5’端起的双链区内前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，其可独立地选自：A:U、G:U、I:C和错配对(例如非规范或规范配对之外的配对或者包含通用碱基的配对)，以促进双链体5’端处反义链的解离。
在一些实施方案中，反义链中5’端起双链区内1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。或者，反义链5’端起的双链区内前1、2或3个碱基对中至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5’端起的双链区内的第一碱基对是AU碱基对。
据发现在单链或双链寡核苷酸的任何位置向二核苷酸的磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)键的3’端引入4’-修饰或5’-修饰的核苷酸可对核苷酸间键施加空间效应，从而针对核酸酶对其提供保护或稳定。
在一些实施方案中，在单链或双链siRNA的任何位置处，在二核苷酸的3’端引入5’-修饰的核苷。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3’端处引入5’烷基化的核苷。核糖5’位的烷基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性的5’-烷基化核苷是5’-甲基核苷。5’-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中，在单链或双链siRNA的任何位置处，在二核苷酸的3’端引入4’-修饰的核苷。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3’端引入4’-烷基化的核苷。核糖4’位的烷基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性的4’-烷基化核苷是4’-甲基核苷。4’-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。或者，可以在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3’端引入4’-O-烷基化的核苷。核糖的4’-O-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4’-O-烷基化核苷是4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置引入5’-烷基化的核苷，并且这种修饰维持或提高dsRNA的效力。5’-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的5’-烷基化核苷是5’-甲基核苷。5’-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置引入4’-烷基化的核苷，并且这种修饰维持或提高dsRNA的效力。4’-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4’-烷基化核苷是4’-甲基核苷。4’-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中，4’-O-烷基化的核苷在dsRNA的有义链或反义链的任何位置引入，并且这种修饰维持或提高dsRNA的效力。5’-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4’-O-烷基化核苷是4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子可包含2’-5’键(具有2’-H、2’-OH和2’-OMe且具有P＝O或P＝S)。例如，2’-5’键修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可在有义链的5’端使用以避免通过RISC的有义链激活。
在其它实施方案中，本公开的dsRNA分子可包含L-糖(例如，具有2’-H、2’-OH和2’-OMe的L-核糖、L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可用于有义链的5’端以避免通过RISC的有义链激活。
各种公开出版物描述了均可与本公开的dsRNA一起使用的多聚siRNA。这类公开出版物包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，其整体并入本文中。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA分子被5’磷酸化或在5’起始末端包含磷酰基类似物。5’-磷酸修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些修饰。合适的修饰包括：5’-单磷酸((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)和任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)，5’-硫逐磷酸酯((HO)2(O)P-S-5’)；氧/硫取代的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何额外组合(例如5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯等))、5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’，(HO)(NH2)(O)P-O-5’)，5’-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等。例如，RP(OH)(O)-O-5’-，5’-烯基膦酸酯(即乙烯基、取代的乙烯基)、(OH)2(O)P-5’-CH2-)，5’-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)，乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-)。在一个实施例中，该修饰可置于dsRNA分子的反义链中。
接头
在一些实施方案中，本文所述的缀合物或配体可用各种可切割或不可切割的接头连接至iRNA寡核苷酸。
接头通常包含直接键或原子(如氧或硫)、单元(如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH)或原子的链，比如但不限于，取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳烷基、杂芳烯基、杂芳炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳烷基、烷基杂芳烯基、烷基杂芳炔基、烯基杂芳烷基、烯基杂芳烯基、烯基杂芳炔基、炔基杂芳烷基、炔基杂芳烯基、炔基杂芳炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基中断或终止；其中R8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一些实施方案中，接头是约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子、7-17、8-17、6-16、7-16或8-16个原子。
在一些实施方案中，本公开的dsRNA与二价或三价分支接头缀合，所述接头选自式(XXXI)-(XXXIV)的任何一个所示的结构：
Figure BDA0004004320660001191
Figure BDA0004004320660001201
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出现时独立地表示0-20，且其中重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出现时各自独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出现时独立地为不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被一个或多个O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中断或终止；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时各自独立地为不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、
Figure BDA0004004320660001202
Figure BDA0004004320660001203
或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即，每次出现时各自独立地为单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；和Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别适用于与RNAi剂一起使用以抑制靶基因表达，如式(XXXV)的那些：
Figure BDA0004004320660001211
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
缀合GalNAc衍生物的适宜的二价和三价分支接头基团的实例包括但不限于以上如式II、VII、XI、X和XIII所述的结构。
可切割的连接基团是在细胞外足够稳定的连接基团，但在进入靶细胞时被切割以释放接头将其保持在一起的两个部分。在一些实施方案中，在靶细胞中或在第一参考条件下(例如，可以对其进行选择以模拟或表示细胞内条件)比在受试者的血液中或在第二参考条件下(例如，可以对其进行选择以模拟或代表血液或血清中存在的条件)，可切割的连接基团切割快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或者至少约100倍。
可切割的连接基团对切割剂敏感，例如，pH、氧化还原电位或存在降解分子。在通常情况下，切割剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性存在。此类降解剂的实例包括：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或诸如硫醇的还原剂，其可以通过还原降解氧化还原可切割的连接基团；酯酶；可产生酸性环境的内体或试剂，例如，导致pH值为5或更低的那些；可以通过作为广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶起作用而水解或降解酸可切割连接基团的酶。
可切割的连接基团(如二硫键)可能对pH敏感。人血清的pH是7.4，而细胞内平均pH略低，范围为约7.1-7.3。内体具有更酸性的pH，在5.5-6.0范围内，且溶酶体具有甚至更高的酸性pH，在5.0左右。一些接头将具有可切割的连接基团，该连接基团在合适的pH下切割，从而从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到所需的细胞区室中。
接头可以包含特定酶可切割的可切割连接基团。并入接头中的可切割连接基团的类型可能取决于待靶向的细胞。
一般地，可通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适用性。还需要测试候选可切割连接基团在血液中或在与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定第一和第二条件之间对切割的相对敏感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，选择第二条件以指示在其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的切割。评价可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评价并通过在整个动物中进行进一步评价来确认可能是有用的。在一些实施方案中，与血液或血清(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)相比，在细胞中(或在选择以模拟细胞内条件的体外条件下)有用的候选化合物的切割至少快约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。
可氧化还原切割的连接基团
在一些实施方案中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。可还原切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为确定候选可切割连接基团是否是适宜的“可还原切割连接基团”，或者例如是否适合与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所述的方法。例如，候选物可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或使用本领域公知试剂的其他还原剂一起孵育来评价，这模拟了在细胞例如靶细胞中观察到的切割速率。还可以在选择为模拟血液或血清条件的条件下评价候选物。在一个条件下，候选化合物在血液中最多切割约10％。在其他实施方案中，与血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中相比，在细胞(或在选择以模拟细胞内条件的体外条件下)中的有用候选化合物的降解至少快约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。候选化合物的切割速率可以在选择模拟细胞内介质的条件下使用标准酶动力学测定来确定，并与选择模拟细胞外介质的条件进行比较。
基于磷酸酯的可切割连接基团
在一些实施方案中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。切割细胞中磷酸酯基团的试剂的实例是酶，如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk在每次出现时可以独立地是C1-C20烷基、C1-C20卤代烷基、C6-C10芳基或C7-C12芳烷基。在一些实施方案中，基于磷酸酯的连接基团是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。在一些实施方案中，基于磷酸酯的连接基团是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上述方法类似的方法对这些候选物进行评价。
酸可切割的连接基团
在一些实施方案中，可切割接头是酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下切割的连接基团。在一些实施方案中，在pH约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中或通过可用作广义酸的试剂如酶来切割酸可切割连接基团。在细胞中，特定的低pH细胞器，如内体和溶酶体，可以为酸可切割连接基团提供切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。在一些实施方案中，与酯的氧(烷氧基)附接的碳是芳基、取代的烷基或叔烷基如二甲基戊基或叔丁基。这些候选物可以使用与上述方法类似的方法进行评价。
基于酯的可切割连接基团
在一些实施方案中，可切割接头包含基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团被细胞中的酶如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选物可以使用与上述方法类似的方法进行评价。
基于肽的可切割连接基团
在一些实施方案中，可切割接头包含基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团被细胞中的酶如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的一种特殊类型的酰胺键。基于肽的可切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可以使用与上述方法类似的方法进行评价。教导制备RNA缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022,其每一个的全部内容通过引用并入本文。
没有必要对给定化合物中的所有位置进行统一修饰，而实际上可以将超过一种上述修饰引入单个化合物中或甚至在iRNA内的单一核苷处。本公开还包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本公开背景下，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，例如，dsRNA，其包含两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元组成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常包含至少一个区域，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。可以将iRNA的另外的区域用作能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。例如，RNase H是细胞核酸内切酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活导致RNA靶的切割，从而大大提高了iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交于相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时，通常可以使用更短的iRNA获得相当的结果。RNA靶的切割可以通过凝胶电泳进行常规检测，且如果需要，可以通过本领域已知的相关核酸杂交技术进行检测。
在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。很多非配体分子与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(Kubo,T.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61；Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.,1992,20:533)、脂肪链，例如，十二烷基二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.,1991,10:111；Kabanov等，FEBSLett.,1990,259:327；Svinarchuk等，Biochimie,1993,75:49)、磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵，1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651；Shea等，Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)或十八胺或己氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案包括合成在序列的一个或多个位置带有氨基接头的RNA。然后，使用合适的偶联剂或活化剂使氨基与被缀合的分子反应。缀合反应可以在RNA仍与固相支持物结合的情况下进行，或可以在RNA切割后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常提供纯的缀合物。
iRNA的递送
可以以多种不同方式实现向有需要的受试者递送iRNA。可以通过向受试者施用包含iRNA(例如，dsRNA)的组合物直接进行体内递送。或者，递送可以通过施用一种或多种编码和指导iRNA表达的载体来间接进行。这些替代方案将在下面进一步讨论。
直接递送
一般地，任何递送核酸分子的方法可以适应用于iRNA(参见例如，Akhtar S.和Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144和WO94/02595，其全部内容通过引用并入本文)。然而，为了在体内成功递送iRNA分子，需要考虑三个重要因素：(1)所递送分子的生物稳定性，(2)防止非特异性作用，和(3)所递送分子在靶组织中的累积。iRNA的非特异性作用可以通过局部施用最小化，例如，通过直接注射或植入制剂到组织(作为非限制性实例，脊髓)中或局部施用制剂。对治疗部位的局部施用使药剂的局部浓度最大化，限制药剂暴露于否则可能受到药剂伤害或可能降解药剂的全身组织，并允许施用较低总剂量的iRNA分子。几项研究表明，当局部施用iRNA时，基因产物成功敲低。例如，在年龄相关的黄斑变性实验模型中，通过在食蟹猴中的玻璃体内注射(Tolentino,MJ.等，(2004)Retina24:132-138)和在小鼠中的视网膜下注射(Reich,SJ.等，(2003)Mol.Vis.9:210-216)来眼内递送VEGF dsRNA显示防止新生血管形成。此外，在小鼠中直接瘤内注射dsRNA减小肿瘤体积(Pille,J.等，(2005)Mol.Ther.11:267-274)并可延长荷瘤小鼠的生存期(Kim,WJ.等，(2006)Mol.Ther.14:343-350；Li,S.等，(2007)Mol.Ther.15:515-523)。RNA干扰还显示成功通过直接注射局部递送至CNS(Dorn,G.等，(2004)Nucleic Acids 32:e49；Tan,PH.等，(2005)Gene Ther.12:59-66；Makimura,H.等，(2002)BMC Neurosci.3:18；Shishkina,GT.等，(2004)Neuroscience 129:521-528；Thakker,ER.等，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275；Akaneya,Y.等，(2005)J.Neurophysiol.93:594-602)和通过鼻内施用递送至肺(Howard,KA.等，(2006)Mol.Ther.14:476-484；Zhang,X.等，(2004)J.Biol.Chem.279:10677-10684；Bitko,V.等，(2005)Nat.Med.11:50-55)。为了全身性施用iRNA以治疗疾病，可以修饰RNA或者替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都可以防止体内核酸内切酶和核酸外切酶快速降解dsRNA。
RNA的修饰或药物载体还可以允许iRNA组合物靶向靶组织并避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可以通过与其他基团的化学缀合来修饰，例如，如本文所述的脂质或碳水化合物基团。此类缀合物可用于将iRNA靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝细胞。例如，GalNAc缀合物或脂质(例如，LNP)制剂可用于将iRNA靶向特定细胞，例如，肝脏细胞，例如，肝细胞。
iRNA分子也可以通过与亲脂基团(如胆固醇)化学缀合来修饰，以增强细胞吸收并防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身注射至小鼠体内并导致肝脏和空肠中的apoB mRNA敲低(Soutschek,J.等，(2004)Nature 432:173-178)。在前列腺癌小鼠模型中，iRNA与适体的缀合已证明抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(McNamara,JO.等，(2006)Nat.Biotechnol.24:1005-1015)。在替代实施方案中，iRNA可以使用药物递送系统递送，如纳米颗粒、树枝状大分子、聚合物、脂质体或阳离子递送系统。带正电荷的阳离子递送系统促进iRNA分子(带负电荷)的结合，并且还增强带负电荷的细胞膜处的相互作用，以允许细胞有效摄取iRNA。阳离子脂质、树枝状大分子或聚合物可以与iRNA结合，或诱导形成包裹iRNA的囊泡或胶束(参见例如，Kim SH.等，(2008)Journal of Controlled Release129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止iRNA的降解。用于制备和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,DR.等，(2003)J.Mol.Biol 327:761-766；Verma,UN.等，(2003)Clin.CancerRes.9:1291-1300；Arnold,AS等，(2007)J.Hypertens.25:197-205，其全部内容通过引用并入本文)。用于全身递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,DR.等，(2003)，同上；Verma,UN.等，(2003)，同上)、Oligofectamine，“solid nucleic acidlipid particles”(Zimmermann,TS.等，(2006)Nature 441:111-114)、心磷脂(Chien,PY.等，(2005)Cancer Gene Ther.12:321-328；Pal,A.等，(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet ME.等，(2008)Pharm.Res.Aug 16网络公开发表；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)和聚酰胺胺(Tomalia,DA.等，(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67；Yoo,H.等，(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方案中，iRNA与环糊精形成复合物用于全身施用。iRNA和环糊精的施用方法和药物组合物可以参见美国专利号7,427,605，其全部内容通过引用并入本文。
编码iRNA的载体
在一些实施方案中，靶向SCN9A的iRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单元表达(参见，例如，Couture,A等，TIG.(1996)12:5-10；Skillern,A.等，国际PCT公开号WO 00/22113,Conrad,国际PCT公开号WO 00/22114以及Conrad，美国专利号6,054,299)。表达可以是瞬时的(约数小时至数周)或持续的(数周至数月或者更长时间)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合的或非整合的载体。转基因还可以构建以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。
iRNA的一个或多个单独链可以从表达载体上的启动子转录。在要表达两条单独的链以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独的表达载体共同引入(例如，通过转染或感染)到靶细胞中。或者，dsRNA的每条单独的链可以由均位于同一表达质粒上的启动子转录。在一些实施方案中，dsRNA表达为由接头多核苷酸序列连接的反向重复，使得dsRNA具有茎和环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞(例如，与脊椎动物细胞)相容的表达载体可用于产生用于表达如本文所述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体在本领域是众所周知的，并且可以从很多商业来源获得。通常，此类载体含有方便的限制性位点，以用于插入所需的核酸区段。iRNA表达载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至来自患者的外植靶细胞然后再引入患者中，或者通过允许引入所需靶细胞中的任何其他方式。
iRNA表达质粒可以作为与阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或非阳离子脂质基载体(例如，Transit-TKOTM)的复合物转染到靶细胞中。本公开还设想在一周或更长时间内针对靶RNA的不同区域进行iRNA介导的敲低的多重脂质转染。可以使用各种已知方法监测将载体成功引入宿主细胞中。例如，瞬时转染可以使用报告基因发出信号，如荧光标志物，如绿色荧光蛋白(GFP)。使用为转染细胞提供对特定环境因素(例如，抗生素和药物)的抗性(例如，潮霉素B抗性)的标记，可以确保细胞的体外稳定转染。
可与本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼小鼠白血病病毒等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘病毒，例如，牛痘病毒或禽痘病毒，例如，金丝雀痘或鸡痘；和(j)辅助依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同载体整合或不整合到细胞基因组中。如有需要，构建体可以包含用于转染的病毒序列。或者，构建体可以引入能够进行附加型复制的载体中，例如，EPV和EBV载体。用于iRNA重组表达的构建体通常需要调控元件，例如，启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。下文进一步描述了对于载体和构建体要考虑的其他方面。
可用于递送iRNA的载体将包含足以在所需靶细胞或组织中表达iRNA的调控元件(启动子、增强子等)。可以选择调控元件以提供组成型或调控的/诱导型表达。
可以精确调控iRNA的表达，例如，通过使用对某些生理调节剂(例如，循环葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调控序列(Docherty等，1994,FASEB J.8:20-24)。适合于控制细胞或哺乳动物中dsRNA表达的此类可诱导表达系统包括，例如，通过蜕皮激素、雌激素、孕酮、四环素、二聚化的化学诱导剂和异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行的调控。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择合适的调控/启动子序列。
在特定实施方案中，可以使用包含编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller等，Meth.Enzymol.217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体包含用于正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中所必需的成分。将编码iRNA的核酸序列克隆到一种或多种载体中，这将有助于将核酸递送到患者体内。关于逆转录病毒载体的更多细节可以参见，例如，Boesen等，Biotherapy 6:291-302(1994)，其描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送至造血干细胞，以使得干细胞对化疗更具有抗性。说明在基因疗法中使用逆转录病毒载体的其他参考文献有：Clowes等，J.Clin.Invest.93:644-651(1994)；Kiem等，Blood 83:1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg,Human GeneTherapy 4:129-141(1993)；以及Grossman和Wilson,Curr.Opin.in Genetics andDevel.3:110-114(1993)。考虑使用的慢病毒载体包括，例如，在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述的基于HIV的载体，其通过引用并入本文。
还考虑将腺病毒用于iRNA的递送。腺病毒是特别有吸引力的媒介，例如用于将基因递送到呼吸道上皮。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在其中引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶点是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。Kozarsky和Wilson,Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503(1993)综述了基于腺病毒的基因疗法。Bout等，Human Gene Therapy 5:3-10(1994)证明了使用腺病毒载体将基因转移到恒河猴的呼吸道上皮。在基因疗法中使用腺病毒的其他情况可以参见Rosenfeld等，Science 252:431-434(1991)；Rosenfeld等，Cell 68:143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91:225-234(1993)；PCT公开WO94/12649；和Wang等，Gene Therapy 2:775-783(1995)。用于表达本公开所述的iRNA的适宜AV载体，构建重组AV载体的方法以及将载体递送到靶细胞中的方法描述在Xia H等，(2002)Nat.Biotech.20:1006-1010中。
还考虑使用腺相关病毒(AAV)载体(Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一些实施方案中，iRNA可以从重组AAV载体表达为两个独立的互补单链RNA分子，该载体具有例如U6或H1 RNA启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子。用于表达本公开所述的dsRNA的适宜AAV载体，构建重复AV载体的方法以及将载体递送到靶细胞中的方法描述在Samulski R等，(1987)J.Virol.61:3096-3101；Fisher K J等，(1996)J.Virol.,70:520-532；Samulski R等，(1989)J.Virol.63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO93/24641中，其全部公开内容通过引用并入本文。
另一种典型的病毒载体是痘病毒，如牛痘病毒，例如减毒牛痘如修饰的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC，禽痘如鸡痘或金丝雀痘。
在适当情况下，病毒载体的嗜性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原对载体进行假型化，或通过替换不同的病毒衣壳蛋白来修饰。例如，慢病毒载体可以用来自水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白进行假型化。通过改造载体以表达不同的衣壳蛋白血清型，可以使AAV载体靶向不同的细胞；参见，例如，Rabinowitz J E等，(2002)J Virol 76:791-801，其全部公开内容通过引用并入本文。
载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的载体，或者可以包括其中嵌入了基因递送媒介的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体可以由重组细胞完整地产生时，例如，逆转录病毒载体，药物制剂可以包含一种或多种产生基因递送系统的细胞。
III.含有iRNA的药物组合物
在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含如本文所述的iRNA和药学上可接受的载体。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与SCN9A的表达或活性相关的疾病或障碍(例如，疼痛，例如，慢性疼痛或疼痛相关障碍)。这类药物组合物基于递送方式进行配制。在一些实施方案中，组合物可被配制用于局部递送，例如通过CNS递送(例如，鞘内、颅内、脑内、脑室内、硬膜外或神经节内注射途径，任选地通过输注到脑或脊髓中，例如通过连续泵输注)。在另一个实例中，组合物可配制通过肠胃外递送(例如，通过静脉内(IV)递送、肌肉内(IM)递送或皮下递送(subQ))系统性施用。在一些实施方案中，本文提供的组合物(例如，包含GalNAc缀合物或LNP制剂的组合物)被配制用于静脉内递送。
本文所述的药物组合物以足以抑制SCN9A表达的剂量施用。一般地，iRNA的合适剂量为每天每千克接受者体重0.01至200.0毫克，通常为每天每千克体重1至50毫克。例如，dsRNA可以每单一剂量0.05mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg施用。
在一些实施方案中，重复剂量方案可包括定期(例如每月至每六个月一次)施用治疗量的RNAi剂。在某些实施方案中，RNAi剂大致每季度施用一次(即约每三个月一次)至每年约两次。
在初始治疗方案(例如，负荷剂量)后，可以较低频率施用治疗。
在其它实施方案中，药物组合物可以每天施用一次，或者iRNA可以在全天以适当的间隔作为两个、三个或更多个亚剂量或甚至使用连续输注施用，或者通过控释制剂递送。在这种情况下，每个亚剂量中所含的iRNA必须相应地更小，以达到每日总剂量。剂量单位也可以复合以在几天内递送，例如，使用在几天内提供iRNA持续释放的常规持续释放制剂。持续释放制剂在本领域中是众所周知的并且对于在特定部位递送药剂特别有用，如可以与本公开的药剂一起使用。在该实施方式中，剂量单位包含相应的多个日剂量。
单一剂量对SCN9A水平的影响可长时间持续，使得后续剂量以不超过3、4或5天间隔，或不超过1、2、3、4、12、24或36周间隔施用。
本领域技术人员将认识到，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或障碍的严重程度、此前的治疗、受试者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。可以使用常规方法或基于使用合适动物模型的体内测试来估计本公开所涵盖的个体iRNA的有效剂量和体内半衰期。
合适的动物模型，例如小鼠或食蟹猴，例如含有表达人SCN9A的转基因的动物，可用于确定SCN9A siRNA的治疗有效剂量和/或有效剂量方案施用。
在一些实施方案中，本文所述的iRNA化合物可以以靶向特定组织的方式递送，例如CNS(例如，任选地脑或脊髓组织，例如，皮质、小脑、背根神经节、黑质、小脑齿状核、苍白球、纹状体、脑干、丘脑、丘脑底核、红核和脑桥核、脑神经核和前角；和脊髓颈椎、腰椎或胸椎的Clarke柱)。
本公开还包括包含本文所述的iRNA化合物的药物组合物和制剂。本公开的药物组合物可以多种方式施用，这取决于是希望局部还是或全身治疗，以及取决于待治疗的区域。施用可以是区域(例如通过鞘内、脑室内、颅内、硬膜外或神经节内注射)、局部(例如，颊部和舌下施用)、口服、玻璃体内、经皮、气道(气雾剂)、经鼻、直肠或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注；皮下，例如通过植入的装置；或颅内，例如通过脑实质内、鞘内或脑室内施用。
在一些实施方案中，施用通过浓注。在一些实施方案中，施用通过长效注射。长效注射可在延长时间内以持续方式释放RNAi剂。因此，长效注射可减少获得所需效果(例如，对SCN9A的所需抑制或者治疗或预防效果)需要的给药频率。
在一些实施方案中，施用是通过泵。该泵可以是外部泵或手术植入泵。在其他实施方案中，泵是输注泵。输注泵可用于颅内、静脉内或硬膜外输注。在某些实施方案中，泵是将RNAi剂递送至CNS的外科植入泵。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末剂。传统的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或希望的。涂层避孕套、手套等也可能是有用的。适当的局部制剂包括其中本公开所述的iRNA与局部递送剂混合的那些制剂，所述局部递送剂例如是脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。适当的脂质和脂质体包括中性的(例如，二油酰基磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰基磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开所述的iRNA可以包封于脂质体内，或可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体。或者，iRNA可以和脂质特别是阳离子脂质复合。适当的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学可接受盐。局部制剂详细描述在美国专利号6,747,014中，其通过引用并入本文。
脂质体制剂
除了已被研究并用于药物制剂中的微乳液外，还存在许多组织化的表面活性剂结构。它们包括单层、胶束、双层和囊泡。囊泡例如脂质体因为其特异性和其在药物递送方面提供的作用持续时间，因而吸引了巨大兴趣。如本公开所使用，术语“脂质体”指的是由以一个或多个球状双层排列的两性脂质组成的囊泡。
脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性的材料形成的膜和水性内部。水性部分包含待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够融合至细胞壁的优势。尽管不能与细胞壁同样有效地融合，但非阳离子脂质体在体内被巨噬细胞摄取。
为了透过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下通过一系列细孔，每个孔的直径小于50nm。因此，需要使用高度可变形并能通过这种细孔的脂质体。
脂质体的其他优点包括：由天然磷脂获得的脂质体是生物相容且可生物降解的；脂质体可以结合宽范围的水和脂质可溶解的药物；脂质体可以保护其内区室中包封的药物免受代谢和降解(Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第1卷,p.245)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
脂质体可用于转移和递送活性成分到作用部位。因为脂质体膜结构上类似于生物膜，当脂质体应用于组织时，脂质体开始与细胞膜融合，且随着脂质体和细胞融合的进行，脂质体内容物注入细胞中，活性剂可以在其中起作用。
脂质体制剂作为许多药物的递送方式已经成为广泛研究的焦点。越来越多的证据表明，对于局部施用，脂质体存在着优于其他制剂的多种优点。这些优点包括与施用药物的高度系统吸收有关的副作用减少、施用药物在所需靶点的积聚增加以及能够将广泛多样药物(包括亲水性和疏水性药物)施用于皮肤中。
几个报告详述了脂质体将包括高分子量DNA的药剂递送到皮肤中的能力。包括止痛剂、抗体、激素和高分子量DNA的化合物已经施用于皮肤。大多数应用导致靶向上表层。
脂质体分成两个主要类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定复合物。带正电荷的DNA/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并内化于内体中。由于内体中的酸性pH，脂质体破裂，从而释放其内容物到细胞质中(Wang等，Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
pH敏感的或带负电荷的脂质体诱捕DNA而不是与其复合。因为DNA和脂质两者所带的电荷相似，因此发生排斥而不是复合物形成。然而，一些DNA在这些脂质体的水性内部被诱捕。pH敏感的脂质体用于递送编码胸苷激酶基因的DNA到培养物的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等，Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
脂质体组合物的一种主要类型包括天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如，中性脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)组成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油组成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)例如大豆PC和卵PC组成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
几项研究评价了脂质体药物制剂向皮肤的局部递送。将包含干扰素的脂质体应用到豚鼠皮肤导致皮肤疱疹溃疡的减少，而经由其他方式(例如，作为溶液或作为乳剂)递送干扰素无效(Weiner等，Journal of Drug Targeting,1992,2,405-410)。此外，另外的研究测试了作为脂质体制剂的部分施用的干扰素对于使用含水体系施用干扰素的功效，并得出结论脂质体制剂优于水性施用(du Plessis等，Antiviral Research,1992,18,259-265)。
还检测了非离子脂质体系统(特别是含有非离子型表面活性剂和胆固醇的系统)以测定其在将药物递送至皮肤中的用途。含有NovasomeTMI(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)和NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)的非离子脂质体制剂用于递送环孢菌素-A到小鼠皮肤的真皮中。结果显示这种非离子脂质体系统有效促进环孢菌素-A沉积到皮肤不同层中(Hu等，S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。
脂质体也包括“空间稳定的”脂质体，如本文使用的指的是含有一种或多种特化脂质的脂质体的术语，当该脂质掺入脂质体中时，相对于缺乏这种特定脂质的脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定脂质体的例子是这样的脂质体：其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂，例如单唾液酰神经节苷脂GM1，或(B)由一种或多种亲水性聚合物衍生化，例如聚乙二醇(PEG)部分。不希望被任何特定理论束缚，本领域认为，至少对于包含神经节苷脂、鞘磷脂或PEG-衍生化脂质的空间稳定脂质体，这些空间稳定脂质体的提高的循环半衰期是由于向网状内皮系统(RES)细胞中的摄取减少(Allen等，FEBSLetters,1987,223,42；Wu等，Cancer Research,1993,53,3765)。
含有一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)报导了单唾液酰神经节苷脂GM1、硫酸半乳糖脑苷脂和磷酯酰肌醇提高脂质体的血液半衰期的能力。这些发现也由Gabizon等详细说明(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)。美国专利号4,837,028和WO 88/04924(均属于Allen等)公开了含有(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷酯的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等)公开了含有鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等)公开了含有1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
含有由一种或多种亲水性聚合物衍生的脂质的许多脂质体及其制备方法是本领域已知的。Sunamoto等(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)描述了含有非离子型去污剂2C1215G的脂质体，该去污剂含有PEG部分。Illum等(FEBS Lett.,1984,167,79)注意到聚苯乙烯颗粒用聚合二醇的亲水性包衣导致血液半衰期的显著提高。Sears描述了通过连接聚亚烷基二醇(例如，PEG)的羧基而修饰的合成磷脂(美国专利号4,426,330和4,534,899)。Klibanov等(FEBS Lett.,1990,268,235)描述的实验证明了含有用PEG或PEG硬脂酸酯衍生的磷酯酰乙醇胺(PE)的脂质体具有显著提高的血循环半衰期。Blume等(Biochimica etBiophysica Acta,1990,1029,91)将这类观察扩展到其他PEG-衍生磷脂，例如由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和PEG的组合形成的DSPE-PEG。在其外表面上具有共价结合的PEG部分的脂质体在欧洲专利号EP 0 445 131 B1和Fisher的WO 90/04384中描述。含有1-20摩尔百分比的用PEG衍生的PE的脂质体组合物及其使用方法由Woodle等(美国专利号5,013,556和5,356,633)和Martin等(美国专利号5,213,804和欧洲专利号EP 0 496 813 B1)描述。含有多种其他脂质-聚合物缀合物的脂质体在WO 91/05545和美国专利号5,225,212(两者均属于Martin等)以及WO94/20073(Zalipsky等)中描述。含有PEG修饰的神经酰胺脂质的脂质体在WO 96/10391(Choi等)中描述。美国专利号5,540,935(Miyazaki等)和美国专利号5,556,948(Tagawa等)描述了含有PEG的脂质体，其表面上可用官能部分进一步衍生化。
含有核酸的多种脂质体是本领域已知的。Thierry等的WO 96/40062公开了用于在脂质体中包封高分子量核酸的方法。Tagawa等的美国专利号5,264,221公开了蛋白键合的脂质体，并声称这种脂质体的内容物可以包含dsRNA。Rahman等的美国专利号5,665,710描述了在脂质体中包封寡脱氧核糖核苷酸的某些方法。Love等的WO 97/04787公开了含有靶向raf基因的dsRNA的脂质体。
传递体是又一种类型的脂质体，且是高度可变形的脂质集合体，其是药物递送媒介的有吸引力的候选者。传递体可以描述为脂质小滴，其是如此高度可变形的使得其能够容易地穿透小于所述小滴的小孔。传递体可适应于其使用的环境，例如，其是自优化(适应皮肤中小孔的形状)、自修复、频繁到达其靶标而无片段化以及通常自装载。为制备传递体，有可能将表面边缘活化剂，通常表面活性剂，添加到标准的脂质体组合物中。传递体用于递送血清白蛋白到皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送显示为与含有血清白蛋白的溶液的皮下注射一样有效。
表面活性剂在制剂例如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中具有广泛应用。分类和分级许多不同种类的表面活性剂(天然和合成的)的性质的最常用的方法是使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基团(又名“头部”)的性质提供用于分类制剂中使用的不同表面活性剂的最有用的方式(Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果表面活性剂分子未离子化，其被归类为非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂在药物和化妆品产品中有着广泛应用，且可在很宽的pH值范围内使用。通常，取决于其结构，其HLB值为2到约18。非离子型表面活性剂包括非离子酯例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子的烷醇酰胺和醚例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段共聚物也包括在这一种类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子型表面活性剂种类中最常用的成员。
如果当表面活性剂分子溶解或分散在水中时其携带负电荷，该表面活性剂归类为阴离子型。阴离子表面活性剂包括羧酸酯，例如皂、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸的酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸酯例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基丁二酸酯，以及磷酸酯。阴离子表面活性剂种类的最重要成员是烷基硫酸酯和皂。
如果当表面活性剂分子溶解或分散在水中时其携带正电荷，该表面活性剂被归类为阳离子型。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这一种类的最常用的成员。
如果表面活性剂分子能够携带正或负电荷，该表面活性剂被归类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
药物产品、制剂以及乳剂中表面活性剂的使用已有综述(Rieger,PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
核酸脂质颗粒
在一些实施方案中，本公开中所述的SCN9A dsRNA被完全包封在脂质制剂中，例如以形成SPLP、pSPLP、SNALP或其他核酸-脂质颗粒。SNALP和SPLP通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质和阻止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP对于全身应用极其有用，因为其在静脉(i.v.)注射后显示延长的循环寿命并聚集在远端部位(例如，在物理上与施用部位分离的部位)。SPLP包括“pSPLP”，其包括PCT公开号WO 00/03683中所列的包封的缩合剂-核酸复合物。通常本公开的颗粒的平均直径为约50nm到约150nm，更通常为约60nm到约130nm，更通常为约70nm到约110nm，最通常为约70nm到约90nm，且基本上无毒。另外，当存在于本公开的核酸-脂质颗粒中时，核酸在水性溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法描述在例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；和PCT公开号WO 96/40964中。
在一些实施方案中，脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如，脂质与dsRNA比率)为约1∶1到约50∶1、约1∶1到约25∶1、约3∶1到约15∶1、约4∶1到约10∶1、约5∶1到约9∶1或约6∶1到约9∶1。
阳离子脂质例如可以是N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯)四氢-3aH-环戊并[d][1,3]二氧戊环-5-胺(ALN100)、4-(二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(MC3)、1,1’-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约20mol％到约50mol％或约40mol％。
在一些实施方案中，化合物2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可用于制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述在2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，其以引用方式合并于此。
在一些实施方案中，脂质-siRNA颗粒包含40％的2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环∶10％ DSPC∶40％胆固醇∶10％PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，粒径为63.0±20nm，且siRNA/脂质比率为0.027。
非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷酯酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的约5mol％到约90mol％、约10mol％、或约58mol％(如果包括胆固醇的话)。
抑制颗粒聚集的缀合脂质例如可以是聚乙二醇(PEG)-脂质，包括但不限于：PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物例如可以是PEG-二月桂基氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂基氧基丙基(Ci8)。抑制颗粒聚集的缀合脂质可以占存在于颗粒中的总脂质的0mol％到约20mol％或约2mol％。
在一些实施方式中，核酸-脂质颗粒还包含胆固醇，例如是存在于颗粒中的总脂质的约10mol％到约60mol％或约48mol％。
在一些实施方式中，iRNA在脂质纳米颗粒(LNP)中配制。
LNP01
在一些实施方案中，可用类脂质(lipidoid)ND98·4HCl(MW 1487)(参见于3/26/2008提交的美国专利申请号12/056,230，其通过引用并入本文)、胆固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-神经酰胺C16(Avanti Polar Lipids)制备脂质-siRNA纳米颗粒(例如，LNP01颗粒)。各自在乙醇中的原液可以如下制备：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。然后例如以42∶48∶10的摩尔比混合ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16原液。合并的脂质溶液可以与水性dsRNA(例如，在醋酸钠pH 5中)混合，使得最终乙醇浓度约为35-45％且最终醋酸钠浓度约为100-300mM。在混合时，脂质-dsRNA纳米颗粒通常自发形成。取决于所需的粒径分布，所得的纳米颗粒混合物可以使用例如热熔挤出机例如Lipex挤出机(Northern Lipids,Inc)通过聚碳酸酯膜(例如，100nm截止值)挤出。在一些情况下，挤出步骤可以省略。除去乙醇和同时的缓冲液交换可以通过例如透析或切向流过滤完成。缓冲液可以例如用pH约7，例如，pH约6.9、pH约7.0、pH约7.1、pH约7.2、pH约7.3或pH约7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)交换。
Figure BDA0004004320660001441
LNP01制剂例如描述在国际申请公开号WO 2008/042973中，其通过引用并入本文。
在下表中提供了另外的示例性脂质-dsRNA制剂。
表7：示例性脂质制剂
Figure BDA0004004320660001442
Figure BDA0004004320660001451
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-二二肉豆蔻酰基甘油(C14-PEG或PEG-C14)(PEG平均分子量2000)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(PEG平均分子量2000)
PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻氧基丙胺(PEG平均分子量2000)
在2009年04月15日提交的国际公开号WO2009/127060中描述了包含SNALP(l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的制剂，其通过引用并入本文。
例如，在以下中描述了包含XTC的制剂：2009年01月29日提交的美国临时申请系列号61/148,366；2009年03月02日提交的美国临时申请系列号61/156,851；2009年06月10日提交的美国临时申请系列号61/185,712；2009年07月24日提交的美国临时申请系列号61/228,373；2009年09月03日提交的美国临时申请系列号61/239,686，以及2010年01月29日提交的国际申请号PCT/US2010/022614，其通过引用并入本文。
例如，在以下中描述了包含MC3的制剂：2009年09月22日提交的美国临时申请系列号61/244,834，2009年06月10日提交的美国临时申请系列号61/185,800，以及2010年06月10日提交的国际申请号PCT/US10/28224，其通过引用并入本文。
例如，在2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US09/63933中描述了包含ALNY-100的制剂，其通过引用并入本文。
在2009年05月05日提交的美国临时申请系列号61/175,770和2010年05月05日提交的国际申请号PCT/US10/33777中描述了包含C12-200的制剂，其通过引用并入本文。
阳离子脂质的合成
可通过已知的有机合成技术制备用于本公开所述的核酸-脂质颗粒中的任何化合物，例如，阳离子脂质等。除非另有说明，否则所有取代基的定义如下。
“烷基”指含有1-24个碳原子的直链或支链、非环状或环状饱和脂族烃。代表性的饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和的环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上文所定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”是指如上文定义的任何烷基或烯基，其在相邻碳之间另外包含至少一个三键。代表性的直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
“酰基”是指任何烷基、烯基或炔基，其中连接点处的碳如下定义被氧代基团取代。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基基团。
“杂环”是指饱和、不饱和或芳族的5至7元单环或7至10元双环的杂环，且其包含1或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，和氮杂原子可以任选地被季铵化，包括其中任何上述杂环稠合至苯环的双环。杂环可以通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
术语“任选取代的烷基”、“任选取代的烯基”、“任选取代的炔基”、“任选取代的酰基”和“任选取代的杂环”是指，当被取代时，至少一个氢原子被取代基替代。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被替代。在这方面，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同的且独立地为氢、烷基或杂环，并且每个所述烷基和杂环取代基可以进一步被以下一个或多个取代：氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”指氟、氯、溴和碘。
在一些实施方式中，本公开所述的方法可能需要使用保护基团。保护基方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS,Green,T.W.等，Wiley-Interscience,New York City,1999)。简言之，本公开的背景中的保护基团是降低或消除官能团不希望的反应性的任何基团。可以将保护基团添加到官能团以掩盖其在某些反应期间的反应性，然后将其移除以展示原始官能团。在一些实施方式中，使用“醇保护基团”。“醇保护基团”是降低或消除醇官能团不希望的反应性的任何基团。可以使用本领域熟知的技术添加和除去保护基团。
式A的合成
在一些实施方案中，使用式A的阳离子脂质配制本公开中所述的核酸-脂质颗粒：
Figure BDA0004004320660001481
其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每个可以任选地被取代，以及R3和R4独立地是低级烷基或者R3和R4可以在一起以形成任选取代的杂环环。在一些实施方式中，阳离子脂质是XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)。在通常情况下，上述式A的脂质可以通过以下反应路线1或2制备，其中所有取代基如上文所定义，除非另有说明。
路线1
Figure BDA0004004320660001491
脂质A可以根据路线1制备，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每个可以任选地被取代，以及R3和R4独立地是低级烷基或者R3和R4可以在一起形成任选取代的杂环的环。酮1和溴化物2可以购买或根据本领域普通技术人员公知的方法制备。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化为相应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧根、磷酸根、硫酸根等的阴离子抗衡离子。
路线2
Figure BDA0004004320660001492
或者，酮1原料可以根据路线2制备。格氏试剂6和氰化物7可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备。6和7的反应产生酮1。酮1向相应的式A的脂质的转化如路线1中所述。
MC3的合成
如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N,N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。溶液用稀盐酸洗涤，然后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。有机部分用无水硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上除去溶剂。使用1-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度将残留物通过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并除去溶剂，得到无色油状物(0.54g)。
ALNY-100的合成
使用下述路线3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：
Figure BDA0004004320660001501
515的合成：
向双颈RBF(1L)中搅拌的LiAlH4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水THF中的悬浮液，在0℃氮气氛下缓慢加入514(10g，0.04926mol)在70mL THF中的溶液。完全加入后，将反应混合物升温至室温，然后加热回流4h。通过TLC监测反应进展。反应完成(通过TLC)后，将混合物冷却至0℃，并小心加入饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温下搅拌4h并滤出。残留物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合，并用400ml二噁烷和26mL浓盐酸稀释，在室温下搅拌20分钟。在真空下汽提挥发物以提供作为白色固体的515的盐酸盐。收率：7.12g。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝9.34(宽峰，2H)、5.68(s,2H)、3.74(m,1H)、2.66-2.60(m,2H)、2.50-2.45(m,5H)。
516的合成：
向化合物515在250mL双颈RBF中的100mL无水DCM中的搅拌溶液中加入NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在50mL无水DCM中缓慢加入N-(苄氧基-羰基氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，使反应混合物升温至室温。反应完成后(2-3小时，通过TLC)，混合物依次用1N HCl溶液(1x100mL)和饱和NaHCO3溶液(1x50mL)洗涤。然后将有机层用无水Na2SO4干燥，并蒸发溶剂以得到粗物质，将其通过硅胶柱色谱纯化得到516，为粘性物质。收率：11g(89％)。1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ＝7.36-7.27(m,5H)、5.69(s,2H)、5.12(s,2H)、4.96(br.,1H)2.74(s,3H)、2.60(m,2H)、2.30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。
517A和517B的合成：
将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶于单颈500mL RBF中的220mL丙酮和水(10:1)溶液中，并向其中加入N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，然后在室温下加入4.2mL7.6％ OsO4(0.275g，0.00108mol)的叔丁醇溶液。反应完成后(～3h)，混合物通过加入固体Na2SO3淬灭，所得混合物在室温下搅拌1.5h。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并用水(2x100mL)洗涤，然后用饱和NaHCO3(1x50mL)溶液、水(1x30mL)和最后用盐水(1x50mL)洗涤。有机相用an.Na2SO4干燥并真空除去溶剂。粗物质的硅胶柱色谱纯化得到非对映异构体的混合物，其通过制备型HPLC分离。收率：-6g粗品。
517A-峰1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO，400MHz):δ＝7.39-7.31(m，5H)，5.04(s，2H)，4.78-4.73(m，1H)，4.48-4.47(d，2H)，3.94-3.93(m，2H)，2.71(s，3H)，1.72-1.67(m，4H)。LC-MS[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过X-射线证实立体化学。
518的合成：
使用与化合物505合成所描述的相似程序，得到化合物518(1.2g，41％)，为无色油状物。1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ＝7.35-7.33(m，4H)，7.30-7.27(m，1H)，5.37-5.27(m，8H)，5.12(s，2H)，4.75(m,1H)，4.58-4.57(m,2H)，2.78-2.74(m,7H)，2.06-2.00(m,8H)，1.96-1.91(m，2H)，1.62(m，4H)，1.48(m，2H)，1.37-1.25(br m，36H)，0.87(m，6H)。HPLC-98.65％。
化合物519合成的一般程序：
将化合物518(1eq)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加到LAH在THF(1M，2eq)中的冰冷溶液中。添加完成后，将混合物在40℃下加热0.5小时，然后再次在冰浴上冷却。混合物用饱和Na2SO4水溶液小心水解，然后通过硅藻土过滤并缩减成油状物。柱色谱得到纯的519(1.3g，68％)，其为无色油状物。13C NMR＝130.2、130.1(x2)、127.9(x3)、112.3、79.3、64.4、44.7、38.3、35.4、31.5、29.9(x2)、29.7、29.6(x2)、29.5(x3)、29.3(x2)、27.2(x3)、25.6、24.5、23.3、226、14.1；电喷雾MS(+ve)：C44H80NO2的分子量(M+H)+计算值654.6，实测值654.6。
通过标准或无挤出方法制备的制剂可以类似方式表征。例如，制剂通常以肉眼观察进行表征。其应该是发白的半透明的溶液，没有聚集或沉淀。脂质-纳米颗粒的粒径和粒度分布可以例如使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，USA)通过光散射测量。颗粒大小应该约为20-300nm，如40-100nm。粒度分布应该是单峰的。制剂中dsRNA总浓度以及诱捕的部分使用染料排除试验来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料例如Ribogreen(Molecular Probes)在存在或不存在制剂干扰表面活性剂例如0.5％ Triton-X100的情况下孵育。制剂中的总dsRNA可根据从包含表面活性剂的样品发出的信号相对于标准曲线进行确定。诱捕的部分通过从总dsRNA含量中减去“游离”dsRNA含量(根据当不存在表面活性剂时的信号测定)来确定。诱捕dsRNA的百分比通常＞85％。对于SNALP制剂，粒径至少为30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm以及至少120nm。适当的范围通常为约至少50nm到约至少110nm、约至少60nm到约至少100nm或约至少80nm到约至少90nm。
用于口服施用的组合物和制剂包含粉末或颗粒、微颗粒、纳米颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、扁囊剂、片剂或小片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。在一些实施方式中，口服制剂是其中本公开所述的dsRNA与一种或多种渗透增强剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的制剂。适当的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。适当的胆汁酸/盐包含鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、谷氨胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸(glycholic acid)、甘脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠和甘二氢夫西地酸钠。适当的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、油酸单甘油酯、甘油二月桂酸酯、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学可接受盐(例如，钠盐)。在一些实施方式中，使用渗透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐组合。一种示例性的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧化乙烯-9-月桂基醚、聚氧化乙烯-20-十六烷基醚。本公开所述的dsRNA可以以颗粒形式口服递送，所述颗粒形式包括喷雾干燥的颗粒，或者复合以形成微粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚环氧乙烷(polyoxethane)、聚烷基腈基丙烯酸酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基腈基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺、支链淀粉、纤维素和淀粉。适当的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，对-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-羟乙酸)(PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。用于dsRNA的口服制剂及其制备详细描述在美国专利6,887,906、美国申请公开号20030027780和美国专利号6,747,014中，其每一个通过引用并入本文。
用于胃肠外、脑实质内(到脑中)、鞘内、玻璃体内、脑室内或肝内施用的组合物和制剂可包括无菌水性溶液，其也可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本公开的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含脂质体的制剂。这些组合物可由多种组分产生，所述组分包括但不限于预形成液体、自乳化固体和自乳化半固体。
可以方便地以单元剂型存在的本公开所述药物制剂可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分和药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过均匀和紧密地使活性成分和液体载体或细分的固体载体或两者结合，然后如有必要，使产物成形来制备制剂。
本公开所述组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种，例如但不限于：片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。组合物也可以在水性、非水性或混合介质中配制成悬浮液。水性悬浮液还可以包含增加该悬浮液粘性的物质，例如包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液也可以包含稳定剂。
另外的制剂
乳液
本公开的组合物可以制备和配制成乳液。乳液通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的小滴形式分散在另一种液体中的非均相体系(参见例如，Ansel’s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199；Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.245；Block,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2卷，p.335；Higuchi等，Remington’s Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是含有紧密混合并互相分散的两种不混溶液相的两相系统。通常，乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)种类。当水相作为细小液滴精细分离并分散到大体积油相中时，所得组合物称为油包水(w/o)乳液。或者，当油相作为细小液滴精细分离并分散到大体积水相中时，所得组合物称为水包油(o/w)乳液。乳液可以包含除分散相之外的另外的组分，且活性药物可以作为在水性相、油性相中的溶液存在或它本身作为单独的相存在。药物赋形剂例如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是由超过两个相组成的多重乳液，例如，油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况。这种复杂制剂通常提供简单二元乳液没有的某些优点。o/w乳液的单个油滴围绕小的水滴的多重乳液组成w/o/w乳液。同样地，油连续相中稳定的水滴中包围的油滴的体系提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散相或非连续相良好分散在外相或连续相中并通过乳化剂或制剂的粘性的方式维持在该形式中。乳液的任一相可以是半固体或固体，如乳液类型的软膏基质和乳膏就是这样。稳定乳液的其他方式需要使用可以掺入乳液的任一相中的乳化剂。乳化剂可以大体分为四个类别：合成的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(参见例如，Ansel’sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199)。
合成表面活性剂，又名表面活性试剂，在乳液制剂中具有广泛的适用性并在文献中综述(参见例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.285；Idson,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第1卷，p.199)。表面活性剂通常是两性的并包含亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率称为亲水/亲油平衡(HLB)，且其是分类以及在制备制剂时选择表面活性剂的重要工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的种类：非离子、阴离子、阳离子和两性的(参见例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.285)。
用于乳液制剂的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯树胶。吸收基质具有亲水性，使得其可以吸收水以形成w/o乳液，仍然保持其半固体稠度，例如无水羊毛脂和亲水性矿脂。精细分散的固体也可用作良好的乳化剂，特别是与表面活性剂结合和在粘性制剂中。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、不溶胀的粘土如皂土、坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱土、胶体硅酸铝和胶体镁铝硅酸盐、颜料和非极性固体如碳或三硬脂酸甘油酯。
广泛多样的非乳化材料也包括在乳液制剂中，并有助于乳液的性质。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.335；Idson，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。
亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成聚合物，例如多糖(例如，阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成聚合物(例如，卡波姆、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些在水中分散或溶胀以形成胶体溶液，其通过形成围绕分散相小滴的强界面膜和通过增加外相粘性来使乳液稳定。
因为乳液通常包含多种可能容易支持微生物生长的成分例如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂，这些制剂通常加入防腐剂。乳液制剂中包含的常用防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、杀藻铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也加入抗氧化剂到乳液制剂中以防止制剂退化。所用抗氧化剂可以是自由基清除剂例如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯，或还原剂例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂协同剂例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
乳液制剂经由皮肤、口和非肠道途径应用及其制备方法在文献中综述(参见例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Idson，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。口服递送的乳液制剂广泛使用，因为其易于配制以及从吸收和生物利用率角度的效率(参见例如，Ansel’s Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Rosoff，Pharmaceutical DosageForms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245；Idson，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。矿物油基轻泻剂、油溶的维生素和高脂肪营养制剂是通常作为o/w乳液口服施用的材料。
在本公开的一些实施方案中，iRNA和核酸的组合物配制成微乳液。微乳液可定义为水、油和两性物质的系统，其是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Rosoff，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245)。通常微乳液是如下制备的体系：首先将油分散在水性表面活性剂溶液中，然后添加足够量的第四组分，通常中等链长度的醇，以形成透明系统。因此，微乳液也被描述为通过表面活性分子的界面膜稳定的两种不混溶液体的热力学稳定的、各向同性的透明分散体(Leung和Shah，Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems，Rosoff，M.编辑，1989，VCH Publishers，New York，第185-215页)。通常微乳液通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三到五种组分的组合来制备。该微乳液是油包水(w/o)类型还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的性质以及表面活性剂分子的极性头部和烃尾部的结构和几何包装(Schott，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.271)。
利用相位图的现象学方法已被广泛研究并对本领域技术人员提供如何配制微乳液的全面知识(参见例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Rosoff，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.245；Block，PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编著)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.335)。与传统乳液相比，微乳液具有在自发形成的热力学稳定的小滴的制剂中增溶水不溶性药物的优点。
用于制备微乳液的表面活性剂包括但不限于：离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油烯基醚、聚甘油脂肪酸酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，其单独或与助表面活性剂组合。助表面活性剂，通常是短链醇例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，用于通过渗透入表面活性剂膜并因此由于在表面活性剂分子间产生空隙体积而生成无序膜来增加界面流动性。然而，微乳液可以在不使用助表面活性剂的情况下制备，且无醇自乳化微乳液体系是本领域已知的。通常水相可以是但不限于：水、药物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于：例如Captex300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化甘油酯、饱和的聚二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅油的材料。
从药物增溶和提高药物吸收观点而言，微乳液是特别感兴趣的。已经提出脂质基微乳液(o/w和w/o两者)来提高药物(包括肽)的口服生物利用率(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等，PharmaceuticalResearch，1994，11，1385-1390；Ritschel，Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.，1993，13，205)。微乳液提供以下优点：改善的药物溶解、保护药物免于酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流体性和渗透性的变化而可能提高药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、改善的临床效能和降低的毒性(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等，Pharmaceutical Research，1994，11，1385；Ho等，J.Pharm.Sci.，1996，85，138-143)。通常当其组分在环境温度下会合到一起时，微乳液可以自发形成。当配制热不稳定的药物、肽或iRNA时，这可能是特别有利的。微乳液在化妆品和药物应用两者的有效成分透皮递送中也是有效的。预期本发明微乳液组合物和制剂将促进提高iRNA和核酸从胃肠道的系统性吸收，以及提高iRNA和核酸的局部细胞摄入。
本公开的微乳液也可以包含其他组分和添加剂例如失水山梨醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和渗透增强剂以提高制剂的性能并提高本发明dsRNA和核酸的吸收。用于本发明微乳液的渗透增强剂可以分类为属于五大类别之一--表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，1991，p.92)。这些分类的每一种已经在上文论述。
渗透增强剂
在一些实施方案中，本发明使用各种渗透增强剂来实现核酸特别是iRNA有效递送至动物皮肤。大多数药物以离子化和非离子化形式存在于溶液中。然而，通常仅脂溶性或亲脂性药物容易跨过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理需要跨过的膜，则甚至非亲脂性药物也可以跨过细胞膜。除帮助非亲脂性药物跨细胞膜扩散之外，渗透增强剂也提高亲脂性药物的渗透性。
渗透增强剂可以分类为属于五大类之一--表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如，Malmsten，M.Surfactants and polymers in drugdelivery，Informa Health Care，New York，NY，2002；Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。上述的每一类渗透增强剂更详细描述如下。
表面活性剂：关于本发明，表面活性剂(或“表面活性试剂”)是当溶解在水性溶液中时降低溶液的表面张力或水溶液与另一液体之间的界面张力，从而提高iRNA通过粘膜吸收的化学实体。除胆盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂包括例如，月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见例如，Malmsten，M.Surfactants and polymersin drug delivery，Informa Health Care，New York，NY，2002；Lee等，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)；和全氟化学乳液，如FC-43(Takahashi等，J.Pharm.Pharmacol.，1988，40，252)。
脂肪酸：用作渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物例如包括油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基、异丙基和叔丁基酯)及其单-和二-甘油酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如，Touitou，E.等，Enhancement in Drug Delivery，CRC Press，Danvers，MA，2006；Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1990，7，1-33；ElHariri等，J.Pharm.Pharmacol.，1992，44，651-654)。
胆盐：胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的扩散和吸收(参见例如，Malmsten、M.Surfactants and polymers in drug delivery，Informa Health Care，NewYork，NY，2002；Brunton，第38章，Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第8版，Hardman等编著，McGraw-Hill，New York，1996，pp.934-935)。各种天然胆盐及其合成衍生物可用作渗透增强剂。因此术语“胆盐”包括任何天然存在的胆汁组分及其任何合成衍生物。适当的胆盐例如包括胆酸(其药学可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、谷氨胆酸(谷氨胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠(STDHF)、甘二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery，Informa Health Care，New York,NY,2002；Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92页；Swinyard，第39章，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro编辑，MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1990，第782-783页；Muranishi,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto等，J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita等，J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
螯合剂：根据本发明使用的螯合剂可以定义为通过与其形成络合物将金属离子从溶液中除去，从而提高iRNA通过黏膜的吸收的化合物。当在本公开中用作渗透增强剂时，螯合剂具有同时作为DNase抑制剂的额外优点，因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化，因此被螯合剂抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。适当的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如，Katdare,A.等，Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92页；Muranishi,CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur等，J.ControlRel.,1990,14,43-51)。
非螯合非表面活性剂：如本文所使用，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为显示微不足道的作为螯合剂或作为表面活性剂的活性，但仍然提高iRNA通过消化粘膜吸收的化合物(参见例如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems,1990,7,1-33)。这类渗透增强剂例如包括不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems,1991，第92页)；和非甾体抗炎剂例如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashita等，J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
在细胞水平上增强iRNA摄取的药剂也可以添加到本公开的药物和其他组合物中。例如，还已知阳离子脂质，如lipofectin(Junichi等，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，如聚赖氨酸(Lollo等，PCT申请WO 97/30731)增强细胞摄取dsRNA。可商购的转染试剂的实例包括例如LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、FreeStyleTMMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM2000CD(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2转染试剂(Roche；Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOTAP脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOSPER脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse,Switzerland)或Fugene(Grenzacherstrasse,Switzerland)、
Figure BDA0004004320660001631
试剂(Promega；Madison,WI)、TransFastTM转染试剂(Promega；Madison,WI)、TfxTM-20试剂(Promega；Madison,WI)、TfxTM-50试剂(Promega；Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille,France)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille,France)、TransPassaD1转染试剂(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invivogen；San Diego,CA,USA)、PerFectin转染试剂(Genlantis；SanDiego,CA,USA)、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER转染试剂(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis；San Diego,CA,USA)、Cytofectin转染试剂(Genlantis；San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis；San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM转染试剂(Genlantis；San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-BridgeInternational；Mountain View,CA,USA)或HiFectTM(B-Bridge International,MountainView,CA,USA)等。
其他试剂可用于增强所施用核酸的渗透，包括二醇类，如乙二醇和丙二醇，吡咯类，如2-吡咯，氮酮类和萜类，如柠檬烯和薄荷酮。
载体
本公开的某些组合物也在制剂中含有载体化合物。如本文所使用，“载体化合物”可以指核酸或其类似物，其是惰性的(即，本身不具有生物活性)，但被例如通过降解生物活性核酸或促进其从循环中去除而降低核酸的生物利用的体内过程识别为核酸。核酸和载体化合物的共同施用(通常后者物质过量)可导致肝脏、肾脏或其他循环外贮库中回收的核酸量明显减少，这推测是由于载体化合物和核酸之间对共同受体的竞争。例如，当与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4’-异硫氰基-二苯乙烯-2,2’-二磺酸共施用时，部分硫代磷酸酯dsRNA在肝组织中的回收可减少(Miyao等，DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura等，DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
赋形剂
与载体化合物相反，药用载体或赋型剂可包含例如用于将一种或多种核酸递送到动物的药学可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药理学惰性媒介。赋形剂可以是液体或固体，并考虑计划施用的方式进行选择，使得当与核酸和给定的药物组合物的其他组分组合时，提供所需体积、稠度等。典型的药用载体包括但不限于：粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖及其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟基乙酸钠等)；和湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
也可以使用与核酸没有有害反应的适于非肠胃外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂来配制本公开组合物。适当的药学可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于核酸的局部施用的制剂可以包含无菌和非无菌的水溶液、常用溶剂例如醇中的非水溶液，或核酸在液体或固体油基质中的溶液。该溶液也可以包含缓冲剂、稀释剂及其他适当添加剂。可以使用与核酸没有有害反应的适于非肠胃外施用的药学可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
其它组分
本公开组合物可以另外包含通常在药物组合物中存在的其他辅助组分，例如以其本领域公认的使用水平。因此，例如，该组合物可以包含另外的相容的药学活性物质例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含可用于物理配制本公开组合物的各种剂型的另外的材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加这样的材料时，其应当不会不适当地干扰本公开组合物的组分的生物活性。该制剂可以灭菌，并且如有必要，与不会不利地与制剂的核酸相互作用的助剂混合，所述助剂例如是润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
水性悬浮液可以包含增加悬浮液粘性的物质，例如包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
在一些实施方案中，本公开所述的药物组合物包括(a)一种或多种iRNA化合物和(b)一种或多种通过非RNAi机制发挥作用的生物制剂。这种生物制剂的例子包括干扰SCN9A和至少一种SCN9A结合伴体的相互作用的药剂。
这些化合物的毒性和治疗功效可以通过例如用于测定LD50(50％的群体死亡的剂量)和ED50(50％的群体治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中的标准药学过程来测定。毒性与治疗效果的剂量比是治疗指数，且其可以比率LD50/ED50来表示。显示高治疗指数的化合物是典型的。
由细胞培养试验和动物研究获得的数据可被用于制定供人使用的剂量范围。本公开所述的组合物的剂量通常在包含ED50但几乎没有或没有毒性的循环浓度的范围内。根据使用的剂型和使用的施用途径，剂量可以在该范围内变化。对于本公开所述方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养试验估计。可以在动物模型中制定剂量以达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者，适当时，达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到降低的多肽浓度)，该范围包含在细胞培养中测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地确定人类中的有用剂量。血浆中水平例如可以通过高效液相色谱法测定。
除以上讨论的施用外，本公开所述的iRNA可以与有效治疗与SCN9A表达相关的疾病或障碍(例如，疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍)的其他已知药剂组合施用。在任何情况下，施用医师可以根据使用本领域已知或本文描述的标准功效测定观察到的结果来调整iRNA施用的剂量和时机。
治疗与SCN9A表达相关的障碍的方法
本公开涉及靶向SCN9A的iRNA用于抑制SCN9A表达和/或治疗与SCN9A表达相关的疾病、障碍或病理过程(例如，疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍)的用途。
在一些方面，提供了一种治疗与SCN9A表达相关的障碍的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文公开的iRNA(例如dsRNA)。在一些实施方案中，iRNA抑制(降低)SCN9A表达。
在一些实施方案中，受试者是用作与SCN9A表达相关的障碍的模型的动物，例如疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关的障碍，例如炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛。
慢性疼痛和疼痛相关障碍
在一些实施方案中，与SCN9A表达相关的障碍为疼痛，例如慢性疼痛或与疼痛相关的障碍，例如疼痛超敏反应或低敏感性。可使用本文所述方法治疗的疼痛相关障碍的非限制性例子包括炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛不敏感性、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛。在一些实施方案中，疼痛相关障碍是遗传性疼痛相关障碍，例如PE和PEPD。
疼痛相关障碍的临床和病理特征包括但不限于灼痛、皮肤泛红、潮红、四肢发热、关节痛、剧烈疼痛(例如下半身、上体(例如眼睛或下巴的疼痛)或四肢(例如手和脚)的剧烈疼痛期)、无法感知疼痛、疲劳和/或失眠。
在一些实施方案中，患有疼痛(例如慢性疼痛或疼痛相关障碍)的受试者小于18岁。在一些实施方案中，患有疼痛(例如，慢性疼痛或疼痛相关障碍)的受试者是成人。在一些实施方案中，受试者具有或被确定为具有相对于参考水平的升高的SCN9A mRNA或蛋白水平(例如，高于参考水平的SCN9A水平)。
在一些实施方案中，使用对来自受试者的样品(例如，水性脑脊髓液(CSF)样品)的分析来诊断疼痛(例如，慢性疼痛或疼痛相关障碍)。在一些实施方案中，使用选自以下一种或多种的方法分析样品：荧光原位杂交(FISH)、免疫组织化学、SCN9A免疫分析、电子显微术、激光显微切割和质谱分析。在一些实施方案中，使用任何合适的诊断测试或技术(例如SCN9A突变测试、疼痛敏感性测量、疼痛阈值测量、疼痛水平测量和/或疼痛残疾水平测量)来诊断疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍(Dansie和Turk 2013 Br J Anaesth 111(1):19-25).
组合疗法
在一些实施方式中，本文公开的iRNA(例如，dsRNA)与第二疗法(例如，一种或多种附加疗法)组合施用，所述第二疗法已知有效治疗与SCN9A表达相关的障碍(例如，疼痛，例如慢性疼痛或疼痛相关障碍)或此类障碍的症状。iRNA可以在第二疗法之前、之后或同时施用。在一些实施方式中，iRNA在第二疗法之前施用。在一些实施方式中，iRNA在第二疗法之后施用。在一些实施方式中，iRNA与第二疗法同时施用。
第二疗法可以是另外的治疗剂。iRNA和另外的治疗剂可以在同一组合物中组合施用，或者另外的治疗剂可以作为单独组合物的部分施用。
在一些实施方式中，第二疗法是有效治疗病症或病症的症状的非iRNA治疗剂。
在一些实施方案中，iRNA结合疗法施用。
示例性组合疗法包括但不限于非甾体抗炎药(NSAIDs)、对乙酰氨基酚、阿片样物质或皮质类固醇、针灸、治疗性按摩、背根神经节刺激、脊髓刺激或局部止痛剂。
施用剂量、途径和时机
可以向受试者(例如，人受试者，例如，患者)施用治疗量的iRNA。治疗量可以是例如0.05-50mg/kg。例如，治疗量可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0或2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsRNA。
在一些实施方案中，iRNA配制用于递送至靶器官，例如脑或脊髓。
在一些实施方案中，iRNA配制为脂质制剂，例如本文所述的LNP制剂。在一些这样的实施方案中，治疗量为0.05-5mg/kg，例如0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0mg/kg dsRNA。在一些实施方案中，通过静脉施用脂质制剂，例如LNP制剂。在一些实施方案中，iRNA(例如，dsRNA)被配制为LNP制剂，并以0.1至1mg/kg的剂量施用(例如，静脉内、鞘内、脑内、颅内或脑室内施用)。
在一些实施方案中，在一段时间内(例如5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟时间段)通过静脉输注施用iRNA。
在一些实施方案中，iRNA为本文所述的亲脂性缀合物(例如，C16缀合物)的形式。在一些这样的实施方案中，治疗量为0.5-50mg，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsRNA。在一些实施方案中，亲脂性缀合物(例如，C16缀合物)皮下施用。在一些实施方案中，iRNA(例如dsRNA)为亲脂结合物的形式，并以1至10mg/kg的剂量施用(例如，皮下施用)。在一些实施方案中，iRNA为例如本文所述的GalNAc缀合物的形式。在一些这样的实施方案中，治疗量为0.5-50mg，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/kg dsRNA。在一些实施方案中，例如GalNAc缀合物皮下施用。
在一些实施方案中，施用例如常规地重复，如每天、每两周(即，每两个星期)，持续一个月、两个月、三个月、四个月、六个月或更长时间。在初始治疗方案后，治疗可以以较低频率施用。例如，在每两周施用三个月后，施用可以每月重复一次，持续六个月或更长。
在一些实施方案中，iRNA剂以两个或更多个剂量施用。在一些实施方案中，后续剂量的数量或量取决于预期效果的实现，例如(a)减轻疼痛；(b)抑制或降低SCN9A的表达或活性或者实现治疗或预防效果，例如减少或预防与障碍相关的一种或多种症状。
在一些实施方式中，按照时间表施用iRNA剂。例如，iRNA剂可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次或每周五次施用。在一些实施方式中，时间表包括规律间隔的施用，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周或每月一次。在一些实施方式中，iRNA剂以达到所需效果所需的频率施用。
在一些实施方式中，时间表涉及间隔很近的施用，然后是更长的时间段(在此期间不施用药剂)。例如，时间表可以包括在相对较短的时间内(例如，大约每6小时、大约每12小时、大约每24小时、大约每48小时或大约每72小时)施用的一组初始剂量，然后是其中不施用iRNA剂的更长时间段(例如，约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周)。在一些实施方式中，iRNA剂最初每小时施用，后来以更长的间隔施用(例如，每天、每周、每两周或每月)。在一些实施方式中，iRNA剂最初每天施用，后来以更长间隔施用(例如，每周、每两周或每月)。在某些实施方式中，该更长的时间间隔随着时间而增加，或者是根据所期望的效果的实现来确定的。
在施用全剂量iRNA之前，可以向患者施用较小剂量，如5％输注剂量，并监测不良反应，如过敏反应或者升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，可以监测患者的不良作用。
调节SCN9A表达的方法
在一些方面，本公开提供了一种用于，例如，在细胞、组织或受试者中调节(例如，抑制或激活)SCN9A表达的方法。在一些实施方案中，细胞或组织是离体的、体外的或体内的。在一些实施方案中，细胞或组织在中枢神经系统(例如，脑或脊髓组织，例如，皮质、小脑、背根神经节、黑质、小脑齿状核、苍白球、纹状体、脑干、丘脑、丘脑底核、红核和脑桥核、脑神经核和前角；和脊髓颈椎、腰椎或胸椎的Clarke柱)中。在一些实施方案中，细胞或组织在受试者(例如，哺乳动物，例如，人)体内。在一些实施方案中，受试者(例如，人)处于与如本文所述的SCN9A表达相关的障碍的风险中，或被诊断有与SCN9A表达相关的障碍。
在一些实施方案中，该方法包括使细胞与本文所述的iRNA接触，其量有效降低细胞中SCN9A的表达。在一些实施方案中，使细胞与RNAi剂接触包括使细胞在体外与RNAi剂接触或使细胞在体内与RNAi剂接触。在一些实施方案中，通过实施该方法的个体将RNAi剂与细胞物理接触，或RNAi剂可以处于允许或导致其随后与细胞接触的情况中。在体外接触细胞可通过例如将细胞与RNAi剂一起孵育来完成。在体内接触细胞可以通过例如将RNAi剂注射到细胞所在的组织中或其附近，或通过将RNAi剂注射到另一区域(例如CNS组织)中来完成。例如，RNAi剂可包含配体或与配体偶联，例如下文所述的和例如PCT/US2019/031170(其通过引用整体并入本文)(包括其中描述亲脂性部分的段落)中进一步详述的一个或多个亲脂性部分，其在目标部位指导或以其他方式稳定RNAi剂。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以在体外与RNAi剂接触，且然后移植到受试者体内。
SCN9A表达可以基于SCN9A mRNA、SCN9A蛋白的表达水平或与SCN9A的表达水平在功能上相关的另一个参数的水平来评估。在一些实施方式中，SCN9A的表达被抑制至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方式中，iRNA具有0.001-0.01nM、0.001-0.10nM、0.001-1.0nM、0.001-10nM、0.01-0.05nM、0.01-0.50nM、0.02-0.60nM、0.01-1.0nM、0.01-1.5nM、0.01-10nM范围内的IC50。IC50值可以相对于适当的对照值标准化，例如，非靶向iRNA的IC50。
在一些实施方案中，该方法包括向细胞或组织中引入本文所述的iRNA，并维持细胞或组织足够长的时间以获得SCN9A的基因转录物的降解，从而抑制SCN9A在细胞或组织中的表达。
在一些实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用本文所述的组合物，例如包含结合SCN9A的iRNA的组合物，使得降低靶SCN9A的表达，例如延长的持续时间，例如至少两天、三天、四天或更长时间，例如一周、两周、三周或四周，或更长时间。在一些实施方案中，在首次施用后1小时、2小时、4小时、8小时、12小时或24小时内可检测到SCN9A表达的降低。
在一些实施方案中，该方法包括将本文所述的组合物施用于哺乳动物，使得与未治疗的动物相比，靶SCN9A的表达增加例如至少10％。在一些实施方案中，SCN9A的激活在延长的持续时间内发生，例如至少两天、三天、四天或更长，例如一周、两周、三周、四周或更长。不希望受理论的约束，iRNA可以通过稳定SCN9A mRNA转录物、与基因组中的启动子相互作用或抑制SCN9A表达的抑制剂来激活SCN9A表达。
可用于本公开中所述方法和组合物的iRNA特异性靶向SCN9A的RNA(初级或加工的)。使用iRNA抑制SCN9A表达的组合物和方法可如本文其他地方所述制备和进行。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含iRNA的组合物，其中所述iRNA包含与待治疗的受试者(例如哺乳动物，例如人)的SCN9A的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。该组合物可通过本领域已知的任何适当方式施用，包括但不限于颅内、鞘内、脑室内、局部和静脉内施用。
在某些实施方案中，组合物例如使用口服、腹膜内或胃肠外途径施用，包括颅内(例如脑室内、脑实质内、颅内和鞘内)、静脉内、肌内、玻璃体内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、鼻内或直肠。在其他实施方案中，组合物局部施用(例如，颊部和舌下施用)。在其他实施方案中，组合物通过静脉输注或注射施用。在某些实施方案中，组合物通过鞘内注射施用。在某些实施方案中，组合物通过脑室内注射施用。在某些实施方案中，组合物通过颅内注射施用。在某些实施方案中，组合物通过硬膜外注射施用。在某些实施方案中，组合物通过神经节内注射施用。
在某些实施方案中，组合物通过静脉输注或注射施用。在一些这样的实施方案中，组合物包含用于静脉输注的脂质配制的siRNA(例如，LNP制剂，例如LNP11制剂)。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语和本发明所属领域的技术人员通常所理解的具有相同意义。虽然本文描述的方法和材料的类似或等效物可用于实施或测试本发明的iRNA和方法，但适当的方法和材料描述如下。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献以引用方式全部合并于此。如果冲突，以本说明书包括定义为准。在此呈现的双链体的所述位置与双链体与所述序列的比对之间存在差异的情况中，以双链体与所述序列的比对为准。另外，材料、方法和实例仅为示例性的，而非限制性的。
具体实施方案
1.一种用于抑制电压门控钠通道，IX型α亚单位(SCN9A)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中该dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中有义链包含含有人SCN9A的编码链的一部分的至少15个连续核苷酸(具有0、1、2或3个错配)的核苷酸序列，和反义链包含含有人SCN9A的非编码链的相应部分的至少15个连续核苷酸(具有0、1、2或3个错配)的核苷酸序列，使得有义链与反义链中的该至少15个连续核苷酸互补。
2.如实施方案1的dsRNA剂，其中人SCN9A的编码链包含序列SEQ ID NO:1。
3.如实施方案1或2的dsRNA剂，其中人SCN9A的非编码链包含SEQ ID NO:2的序列。
4如实施方案1的dsRNA剂，其中人SCN9A的编码链包含序列SEQ ID NO:4001。
5.如实施方案1或4的dsRNA剂，其中人SCN9A的非编码链包含SEQ ID NO:4002的序列。
6.一种用于抑制SCN9A表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中该dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中该反义链包含含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一部分的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少15个连续核苷酸互补。
7.如实施方案6的dsRNA剂，其中有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、或1、2或3个错配。
8.一种用于抑制SCN9A表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中该dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中该反义链包含含有SEQ ID NO:4002的核苷酸序列的一部分的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少15个连续核苷酸互补。
9.如实施方案8的dsRNA剂，其中有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、或1、2或3个错配。
10.如前述任一实施方案的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少17个连续核苷酸互补。
11.如实施方案10的dsRNA剂，其中有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或1、2或3个错配。
12.如前述任一实施方案的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ ID NO:4002的核苷酸序列的一部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少17个连续核苷酸互补。
13.如实施方案12的dsRNA剂，其中有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或1、2或3个错配。
14.如前述任一实施方案的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少19个连续核苷酸互补。
15.如实施方案14的dsRNA剂，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
16.如前述任一实施方案的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ ID NO:4002的核苷酸序列的一部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少19个连续核苷酸互补。
17.如实施方案16的dsRNA剂，其中所述有义链包含SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
18.如前述任一实施方案的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的一部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少21个连续核苷酸互补。
19.如实施方案18的dsRNA剂，其中有义链包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的相应部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或1、2或3个错配。
20.如前述任一实施方案的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含有义链和反义链，其中反义链包含含有SEQ ID NO:4002的核苷酸序列的一部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，使得有义链与反义链中的该至少21个连续核苷酸互补。
21.如实施方案20的dsRNA剂，其中有义链包含含有SEQ ID NO:4001的核苷酸序列的相应部分的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0或1、2或3个错配。
22.如实施方案1-21中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是SEQ IDNO:4001的核苷酸581-601、760-780或8498-8518内的部分。
23.如实施方案1-22中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是选自以下的双链体的有义链内的部分：AD-1251284(UGUCGAGUACACUUUUACUGA(SEQ ID NO:4827))、AD-961334(CAACACAATUTCUUCUUAGCA(SEQ ID NO:5026))或AD-1251325(AAAACAAUCUUCCGUUUCAAA(SEQ ID NO:4822))。
24.如实施方案1-23中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是选自以下的有义链的有义链：AD-1251284(UGUCGAGUACACUUUUACUGA(SEQ ID NO:4827))、AD-961334(CAACACAATUTCUUCUUAGCA(SEQ ID NO:5026))或AD-1251325(AAAACAAUCUUCCGUUUCAAA(SEQID NO:4822))。
25.如实施方案1-24中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链的部分是选自以下的双链体的反义链内的部分：AD-1251284(UCAGTAAAAGUGUACTCGACAUU(SEQ ID NO:5093))、AD-961334(UGCUAAGAAGAAATUGUGUUGUU(SEQ ID NO:5292))或AD-1251325(UUUGAAACGGAAGAUUGUUUUCC(SEQ ID NO:5088))。
26.如实施方案1-25中任一项的dsRNA剂，其中所述反义链的部分是选自以下的反义链的反义链：AD-1251284(UCAGTAAAAGUGUACTCGACAUU(SEQ ID NO:5093))、AD-961334(UGCUAAGAAGAAATUGUGUUGUU(SEQ ID NO:5292))或AD-1251325(UUUGAAACGGAAGAUUGUUUUCC(SEQ ID NO:5088))。
27.如实施方案1-26中任一项的dsRNA剂，其中有义链和反义链包含选自以下的双链体的配对有义链和反义链的核苷酸序列：AD-1251284(SEQ ID NO:4827和5093)、AD-961334(SEQ ID NO:5026和5292)或AD-1251325(SEQ ID NO:4822和5088)。
28.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个的有义链内的部分。
29.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中反义链的部分是表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个的反义链内的部分。
30.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中所述反义链包含含有与表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的反义序列之一的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
31.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的有义序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
32.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中所述反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的反义序列之一的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
33.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的有义序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
34.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中所述反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的反义序列之一的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
35.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的有义序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
36.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中所述反义链包含含有表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的反义序列之一的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
37.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中有义链包含含有与反义链对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的有义序列的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
38.一种用于抑制SCN9A表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中反义链包含表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的反义序列的核苷酸序列，和有义链包含与该反义序列对应的表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18或20中任一个所列的有义序列的核苷酸序列。
39.如实施方案38的dsRNA剂，其中反义链包含表5A中所列的反义序列的核苷酸序列，并且有义链包含对应于该反义序列的表5A中所列的有义序列的核苷酸序列。
40.如实施方案38的dsRNA剂，其中反义链包含表13A中所列的反义序列的核苷酸序列，并且有义链包含对应于反义序列的表13A中所列的有义序列的核苷酸序列。
41.如实施方案38的dsRNA剂，其中反义链包含表14A中所列的反义序列的核苷酸序列，并且有义链包含对应于反义序列的表14A中所列的有义序列的核苷酸序列。
42.如实施方案38的dsRNA剂，其中反义链包含表15A中所列的反义序列的核苷酸序列，并且有义链包含对应于反义序列的表15A中所列的有义序列的核苷酸序列。
43.如实施方案38的dsRNA剂，其中反义链包含表16中所列的反义序列的核苷酸序列，并且有义链包含对应于反义序列的表16中所列的有义序列的核苷酸序列。
44.如实施方案38中任一项的dsRNA剂，其中dsRNA剂为AD-1251284、AD-961334、AD-1251325、AD-1331352、AD-1209344或AD-1331350。
45.如实施方案38-44中任一项的dsRNA剂，其中：
(i)有义链包含SEQ ID NO:4029的序列和所有修饰，和反义链包含SEQ ID NO:4295的序列和所有修饰；
(ii)有义链包含SEQ ID NO:4228的序列和所有修饰，和反义链包含SEQ ID NO:4494的序列和所有修饰；
(iii)有义链包含SEQ ID NO:5339的序列和所有修饰，和反义链包含SEQ ID NO:5355的序列和所有修饰；
(iv)有义链包含SEQ ID NO:5800的序列和所有修饰，和反义链包含SEQ ID NO:5801的序列和所有修饰；
(v)有义链包含SEQ ID NO:5526的序列和所有修饰，和反义链包含SEQ ID NO:5681的序列和所有修饰；或
(vi)有义链包含SEQ ID NO:5542的序列和所有修饰，和反义链包含SEQ ID NO:5697的序列和所有修饰。
46.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中有义链的长度为至少23个核苷酸，例如长度23-30个核苷酸。
47.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中有义链和反义链中的至少一个与一个或多个亲脂性部分缀合。
48.如实施方案47的dsRNA剂，其中亲脂性部分缀合于dsRNA剂的双链区中的一个或多个位置。
49.如实施方案47或48的dsRNA剂，其中亲脂性部分通过接头或载体缀合。
50.如实施方案47-49中任一项的dsRNA剂，其中亲脂性部分的亲脂性通过logKow测量为超过0。
51.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中通过双链RNAi剂的血浆蛋白结合试验中的未结合分数测量的，双链RNAi剂的疏水性超过0.2。
52.如实施方案51的dsRNA剂，其中所述血浆蛋白结合试验是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变动试验。
53.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。
54.如实施方案53的dsRNA剂，其中不超过5个有义链核苷酸和不超过5个反义链核苷酸是未修饰的核苷酸。
55.如实施方案53的dsRNA剂，其中有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸包含修饰。
56.如实施方案53-55中任一项的dsRNA剂，其中修饰的核苷酸中的至少一个选自由脱氧核苷酸、3’-末端脱氧胸苷(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、解锁的核苷酸、构象限制的核苷酸、约束的乙基核苷酸、脱碱基的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及它们的组合。
57.如实施方案53-42中任一项的dsRNA剂，其中不超过5个有义链核苷酸和不超过5个反义链核苷酸包括除2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、解锁的核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)之外的修饰。
58.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其包含有义链的两个连续核苷酸之间或反义链的两个连续核苷酸之间的非核苷酸间隔物(其中任选地非核苷酸间隔物包含C3-C6烷基)。
59.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中每条链的长度不超过30个核苷酸。
60.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。
61.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
62.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中双链区长度为15-30个核苷酸对。
63.如实施方案62的dsRNA剂，其中双链区长度为17-23个核苷酸对。
64.如实施方案62的dsRNA剂，其中双链区长度为17-25个核苷酸对。
65.如实施方案62的dsRNA剂，其中双链区长度为23-27个核苷酸对。
66.如实施方案62的dsRNA剂，其中双链区长度为19-21个核苷酸对。
67.如实施方案62的dsRNA剂，其中双链区长度为21-23个核苷酸对。
68.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中每条链具有19-30个核苷酸。
69.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中每条链具有19-23个核苷酸。
70.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中每条链具有21-23个核苷酸。
71.如前述实施方案中任一的dsRNA剂，其中该剂包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
72.如实施方案71的dsRNA剂，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的3’末端。
73.如实施方案72的dsRNA剂，其中所述链是反义链。
74.如实施方案72的dsRNA剂，其中所述链是有义链。
75.如实施方案71的dsRNA剂，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5’末端。
76.如实施方案75的dsRNA剂，其中所述链是反义链。
77.如实施方案75的dsRNA剂，其中所述链是有义链。
78.如实施方案71的dsRNA剂，其中一条链的5’末端和3’末端各包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
79.如实施方案78的dsRNA剂，其中所述链是反义链。
80.如前述实施方案中任一项的dsRNA剂，其中位于双链体的反义链的5’-端的1位的碱基对是AU碱基对。
81.如实施方案78的dsRNA剂，其中有义链具有总共21个核苷酸，和反义链具有总共23个核苷酸。
82.如实施方案47-81中任一项的dsRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分缀合于至少一条链上的一个或多个内部位置。
83.如实施方案82的dsRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分通过接头或载体缀合于至少一条链上的一个或多个内部位置。
84.如实施方案83的dsRNA剂，其中内部位置包括除了至少一条链的每端的末端两个位置之外的所有位置。
85.如实施方案83的dsRNA剂，其中内部位置包括除了至少一条链的每端的末端三个位置之外的所有位置。
86.如实施方案83-85中任一项的dsRNA剂，其中内部位置不包括有义链的切割位点区域。
87.如实施方案86的dsRNA剂，其中内部位置包括除从有义链的5’端计数的位置9-12之外的所有位置。
88.如实施方案86的dsRNA剂，其中内部位置包括除从有义链的3’端计数的位置11-13之外的所有位置。
89.如实施方案83-85中任一项的dsRNA剂，其中内部位置不包括反义链的切割位点区域。
90.如实施方案89的dsRNA剂，其中内部位置包括除从反义链的5’端计数的位置12-14以外的所有位置。
91.如实施方案83-85中任一项的dsRNA剂，其中内部位置包括除有义链上从3’端开始的位置11-13和反义链上从5’端计数的位置12-14之外的所有位置。
92.如实施方案47-91中任一项的dsRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分缀合于一个或多个内部位置，所述内部位置选自有义链上的位置4-8和13-18以及反义链上的位置6-10和15-18，从每条链的5’端计数。
93.如实施方案92的dsRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分缀合于一个或多个内部位置，所述内部位置选自有义链上的位置5、6、7、15和17以及反义链上的位置15和17，从每条链的5’端计数。
94.如实施方案48的dsRNA剂，其中双链区中的位置不包括有义链的切割位点区域。
95.如实施方案47-80中任一项的dsRNA剂，其中有义链长度为21个核苷酸，反义链长度为23个核苷酸，且亲脂性部分缀合于有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或者反义链的位置16。
96.如实施方案95的dsRNA剂，其中亲脂性部分缀合于有义链的位置21、位置20、位置15、位置1或位置7。
97.如实施方案95的dsRNA剂，其中亲脂性部分缀合于有义链的位置21、位置20或位置15。
98.如实施方案95的dsRNA剂，其中亲脂性部分缀合于有义链的位置20或位置15。
99.如实施方案95的dsRNA剂，其中亲脂性部分缀合于反义链的位置16。
100.如实施方案95的dsRNA剂，其中亲脂性部分缀合于从有义链的5’端计数的位置6。
101.如实施方案47-100中任一项的dsRNA剂，其中亲脂性部分是脂族、脂环族或多脂环族化合物。
102.如实施方案101的dsRNA剂，其中亲脂性部分选自脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
103.如实施方案102的dsRNA剂，其中亲脂性部分包含饱和或不饱和的C4-C30烃链，和选自羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮化物和炔的任选的官能团。
104.如实施方案103的dsRNA剂，其中亲脂性部分包含饱和或不饱和的C6-C18烃链。
105.如实施方案103的dsRNA剂，其中亲脂性部分包含饱和或不饱和的C16烃链。
106.如实施方案47-105中任一项的dsRNA剂，其中亲脂性部分通过替代内部位置或双链区中的一个或多个核苷酸的载体缀合。
107.如实施方案106的dsRNA剂，其中所述载体是选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基的环状基团；或者是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的无环部分。
108.如实施方案47-105中任一项的dsRNA剂，其中亲脂性部分通过包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应产物或氨基甲酸酯的接头与双链iRNA剂缀合。
109.如实施方案47-108中任一项的双链iRNA剂，其中亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
110.如实施方案47-109中任一项的dsRNA剂，其中亲脂性部分或靶向配体通过可生物切割的接头缀合，该可生物切割的接头选自DNA，RNA，二硫化物，酰胺，半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的功能化单糖或寡糖，及其组合。
111.如实施方案47-110中任一项的dsRNA剂，其中有义链的3’端通过端帽保护，所述端帽是具有胺的环状基团，所述环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢萘基。
112.如实施方案47-111中任一项的dsRNA剂，进一步包含靶向配体，例如靶向CNS组织或肝组织的配体。
113.如实施方案108的dsRNA剂，其中所述CNS组织是脑组织或脊髓组织。
114.如实施方案112的dsRNA剂，其中靶向配体是GalNAc缀合物。
115.如实施方案1-114中任一项的dsRNA剂，其进一步包含在反义链3’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Sp构型的连接磷原子，
在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子，和
在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型或Sp构型的连接磷原子。
116.如实施方案1-114中任一项的dsRNA剂，进一步包含
在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Sp构型的连接磷原子，
在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子，和
在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
117.如实施方案1-114中任一项的dsRNA剂，进一步包含
在反义链3’端的第一、第二和第三核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Sp构型的连接磷原子，
在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子，和
在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
118.如实施方案1-114中任一项的dsRNA剂，进一步包含
在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Sp构型的连接磷原子，
在反义链3’端的第三核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子，
在反义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子，和
在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
119.如实施方案1-118中任一项的dsRNA剂，进一步包含
在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Sp构型的连接磷原子，
在反义链5’端的第一和第二核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子，和
在有义链5’端的第一核苷酸间键处存在的末端手性修饰，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
120.如实施方案1-119中任一项的dsRNA剂，进一步包含位于反义链5’端的磷酸酯或磷酸酯模拟物。
121.如实施方案120的dsRNA剂，其中磷酸酯模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
122.包含实施方案1-121中任一项的dsRNA剂的细胞。
123.一种人外周感觉神经元，例如(背根神经节中的外周感觉神经元，或伤害感受神经元，例如A-δ纤维或C-型纤维)，其包含其他类似的未处理的外周感觉神经元相比降低的SCN9A mRNA水平或SCN9A蛋白水平，其中任选地该水平降低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
124.如实施方案123的人外周感觉神经元，其通过包括使外周感觉神经元与实施方案1-121中任一项的dsRNA剂接触的方法产生。
125.一种用于抑制SCN9A表达的药物组合物，其包含实施方案1-121中任一项的dsRNA剂。
126.一种药物组合物，其包含实施方案1-121中任一项的dsRNA剂和脂质制剂。
127.一种抑制细胞中SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)使细胞与实施方案1-121中任一项的dsRNA剂或实施方案125或126的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够的时间以获得SCN9A的mRNA转录物的降解，从而抑制细胞中SCN9A的表达。
128.一种抑制细胞中SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)使细胞与实施方案1-121中任一项的dsRNA剂或实施方案125或126的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够的时间以降低SCN9A mRNA、SCN9A蛋白或SCN9A mRNA和蛋白两者的水平，从而抑制细胞中SCN9A的表达。
129.如实施方案127或128的方法，其中所述细胞在受试者体内。
130.如实施方案129的方法，其中受试者是人。
131.如实施方案127-130中任一项的方法，其中SCN9A mRNA的水平被抑制至少50％。
132.如实施方案127-130中任一项的方法，其中SCN9A蛋白的水平被抑制至少50％。
133.如实施方案130-132的方法，其中抑制SCN9A的表达将来自受试者的生物样品(例如，脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品)中的SCN9A蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
134.如实施方案130-133中任一项所述的方法，其中受试者已诊断有SCN9A相关障碍，例如疼痛，例如慢性疼痛，例如炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛。
135.一种抑制神经元细胞或组织中SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)使细胞或组织与结合SCN9A的dsRNA剂接触；和
(b)使步骤(a)中产生的细胞或组织维持足够的时间以降低SCN9A mRNA、SCN9A蛋白或SCN9A mRNA和蛋白两者的水平，从而抑制细胞或组织中SCN9A的表达。
136.如实施方案135的方法，其中所述神经细胞或组织包括外周感觉神经元，例如背根神经节中的外周感觉神经元，或伤害感受神经元，例如A-δ纤维或C型纤维。
137.一种治疗患有或诊断有SCN9A相关障碍的受试者的方法，包括向该受试者施用治疗有效量的实施方案1-121中任一项的dsRNA剂或实施方案125或126的药物组合物，从而治疗该障碍。
138.如实施方案134或137的方法，其中SCN9A相关障碍为疼痛，例如慢性疼痛。
139.如实施方案138的方法，其中慢性疼痛与一种或多种下组的障碍相关：疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)或与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤或病毒感染相关的疼痛。
140.如实施方案137-139中任一项的方法，其中治疗包括改善该障碍的至少一种体征或症状。
141.如实施方案140所述的方法，其中疼痛(例如，慢性疼痛)的至少一种体征或症状包括对疼痛敏感性、疼痛阈值、疼痛水平、疼痛残疾水平或者SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)存在、水平或活性的一种或多种的测量。
142.如实施方案137-139中任一项的方法，其中治疗包括防止障碍的进展。
143.如实施方案137-142中任一项的方法，其中所述治疗包括以下一项或多项：(a)减轻疼痛；或(b)抑制或降低SCN9A的表达或活性。
144.如实施方案143的方法，其中所述治疗导致背根神经节中相对于SCN9A mRNA的基线的至少30％平均降低。
145.如实施方案144的方法，其中所述治疗导致背根神经节中相对于SCN9A mRNA的基线的至少60％平均降低。
146.如实施方案145的方法，其中所述治疗导致背根神经节中相对于SCN9A mRNA的基线的至少90％平均降低。
147.如实施方案137-146中任一项的方法，其中在治疗后，受试者在单剂量dsRNA后经历至少8周的敲减持续时间，如通过脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品中的SCN9A蛋白评估的。
148.如实施方案147的方法，其中受试者在单剂量dsRNA后经历至少12周的敲减持续时间，如通过脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品中的SCN9A蛋白评估的。
149.如实施方案148的方法，其中受试者在单剂量dsRNA后经历至少16周的敲减持续时间，如通过脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品中的SCN9A蛋白评估的。
150.如实施方案129-149中任一项的方法，其中所述受试者是人。
151.如实施方案130-150中任一项的方法，其中dsRNA剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
152.如实施方案130-151中任一项的方法，其中dsRNA剂颅内或鞘内施用于受试者。
153.根据实施方案130-151中任一项的方法，其中dsRNA剂鞘内、脑室内或脑内施用于受试者。
154.如实施方案130-153中任一项的方法，进一步包括测量受试者中的SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)的水平。
155.如实施方案154的方法，其中测量受试者中的SCN9A水平包括测量来自受试者的生物样品(例如，脑脊液(CSF)样品或CNS活检样品)中的SCN9A基因、SCN9A蛋白或SCN9AmRNA的水平。
156.如实施方案130-155中任一项的方法，进一步包括进行血液测试、成像测试、CNS活检样品或水性脑脊液活检。
157.如实施方案154-156中任一项的方法，其中在用dsRNA剂或药物组合物治疗之前，测量受试者中的SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)的水平。
158.如实施方案157的方法，其中在确定受试者的SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9AmRNA或SCN9A蛋白)水平高于参考水平时，向受试者施用dsRNA剂或药物组合物。
159.如实施方案155-158中任一项的方法，其中在用dsRNA剂或药物组合物治疗后进行受试者中SCN9A(例如，SCN9A基因、SCN9A mRNA或SCN9A蛋白)水平的测量。
160.如实施方案137-159中任一项的方法，进一步包括向受试者施用适用于治疗或预防SCN9A相关障碍的另外的药剂和/或疗法。
161.如实施方案160所述的方法，其中另外的药剂和/或疗法包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、对乙酰氨基酚、阿片样物质或皮质类固醇、针灸、治疗性按摩、背根神经节刺激、脊髓刺激或局部止痛剂中的一种或多种。
实施例
实施例1.SCN9A siRNA
本文提供的核酸序列使用标准命名法表示。参见表1的缩写。
表1：在核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。
应当理解的是，当这些单体存在于寡核苷酸中时，其通过5’-3’-磷酸二酯键相互连接；且应当理解的是，当核苷酸包含2’-氟修饰时，则氟替代母体核苷酸中该位置处的羟基(即，其是2’-脱氧-2’-氟核苷酸)。
Figure BDA0004004320660001911
Figure BDA0004004320660001921
Figure BDA0004004320660001931
1L96的化学结构如下所示：
Figure BDA0004004320660001932
实验方法
生物信息学
转录物
生成靶向人SCN9A，“电压门控钠通道，IX型α亚基”(人：NCBI refseqID NM_002977.3；NCBI GeneID:6335或人：NCBI refseqID NM_001365536.1；NCBI GeneID:6335)的一组siRNA。人NM_001365536.1REFSEQ mRNA长度为9752个碱基。使用生物信息方法生成寡核苷酸的对并进行排序，示例性的寡核苷酸对如表2A、表2B、表4A、表4B、表5A、表5B、表6A、表6B、表13A、表13B、表14A、表14B、表15A、表15B和表16所示。修饰的序列呈现于表2A、表4A、表5A、表6A、表13A、表14A、表15A和表16中。未修饰的序列呈现于表2B、表4B、表5B、表6B、表13B、表14B和表15B中。表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B和16中每个示例性双链体组的靶mRNA来源在表格中表示。表中所示的双链体名称中小数点后的数字仅指批产生编号。
Figure BDA0004004320660001951
Figure BDA0004004320660001961
Figure BDA0004004320660001971
Figure BDA0004004320660001981
Figure BDA0004004320660001991
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Figure BDA0004004320660002971
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Figure BDA0004004320660002991
Figure BDA0004004320660003001
Figure BDA0004004320660003011
Figure BDA0004004320660003021
Figure BDA0004004320660003031
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Figure BDA0004004320660003051
Figure BDA0004004320660003061
Figure BDA0004004320660003071
Figure BDA0004004320660003081
Figure BDA0004004320660003091
Figure BDA0004004320660003101
实施例2.SCN9A siRNA的体外筛选
实验方法
Dual-
Figure BDA0004004320660003111
荧光素酶测定
Hepa1-6细胞(ATCC)在补充10％ FBS的DMEM(ATCC)中5％CO2气氛中于37℃下生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从平板释放。在10nM最终双链体浓度下进行单剂量实验。用含有3’非翻译区(UTR)的每个质粒进行三次不同的siRNA和psiCHECK2-SCN9A质粒转染。三种质粒被称为SCN9A-1、SCN9A-2和SCN9A-3。通过每孔加入10nM的siRNA双链体和30-75ng的三个psiCHECK2-SCN9A质粒之一，以及每孔4.9μL Opti-MEM加0.5μL Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad CA，cat#13778-150)，然后在室温下孵育15分钟进行转染。然后将混合物加入到细胞中(每孔约15,000个)，其重悬在35μL新鲜的完全培养基中。将转染的细胞在37℃下5％ CO2气氛中孵育。
siRNA和psiCHECK2-SCN9A质粒转染后24小时；测量萤火虫(转染对照)和Renilla(融合到SCN9A靶序列)荧光素酶。首先，从细胞移除培养基。然后通过向每个孔中加入等于培养基体积的20μL Dual-
Figure BDA0004004320660003112
荧光素酶试剂(Promega)并混合来测量萤火虫荧光素酶活性。混合物在室温下孵育30分钟，然后在Spectramax(Molecular Devices)上测量发光(500nm)以检测萤火虫荧光素酶信号。通过向每个孔中加入20μL室温的Dual-
Figure BDA0004004320660003113
Stop&
Figure BDA0004004320660003114
试剂(Promega)来测量Renilla荧光素酶活性，并将平板孵育10-15分钟，然后再次测量发光以确定Renilla荧光素酶信号。Dual-
Figure BDA0004004320660003115
Stop&
Figure BDA0004004320660003116
试剂淬灭萤火虫荧光素酶信号，并持续Renilla荧光素酶反应的发光。通过将每个孔内的Renilla(SCN9A)信号相对萤火虫(对照)信号标准化来确定siRNA活性。然后，相对于用相同载体转染但未用siRNA处理或用非SCN9A靶向siRNA处理的细胞，评估siRNA活性的大小。所有转染均以n＝4完成。
结果
表3显示了用SCN9A-1(以30ng/孔添加)、SCN9A-2(以75ng/孔添加)或SCN9A-3质粒(以30ng/孔添加)转染并用一组示例性SCN9A siRNA处理的Hepa1-6细胞中的单剂量双重荧光素酶筛选的结果(对应于表2A中的SiRNA)。单剂量实验在10nM最终双链体浓度下进行，且数据表示为相对于用非靶向对照处理的细胞的保留SCN9A荧光素酶信号的百分比。
在用SCN9A-1转染的细胞中评估的siRNA双链体中，2个实现了SCN9A的≥80％的敲减，34个实现了SCN9A的≥60％的敲减，92个实现了SCN9A的≥30％的敲减，和95个实现了SCN9A的≥20％的敲减。
在用SCN9A-2转染的细胞中评估的siRNA双链体中，9个实现了SCN9A的≥80％的敲减，90个实现了SCN9A的≥60％的敲减，130个实现了SCN9A的≥30％的敲减，和132个实现了SCN9A的≥20％的敲减。
在用SCN9A-3转染的细胞中评估的siRNA双链体中，7个实现了SCN9A的≥60％的敲减，34个实现了SCN9A的≥30％的敲减，和47个实现了SCN9A的≥20％的敲减。
表3:一组示例性人SCN9A siRNAs双链体的SCN9A体外双重荧光素酶10nM筛选(*双链体名称中小数点后的数字仅指批产生编号)
Figure BDA0004004320660003121
Figure BDA0004004320660003131
Figure BDA0004004320660003141
Figure BDA0004004320660003151
Figure BDA0004004320660003161
Figure BDA0004004320660003171
Figure BDA0004004320660003181
Figure BDA0004004320660003191
实施例3.SCN9A siRNA的体外筛选
实验方法
细胞培养和转染：
表达SC9NA基因的人神经母细胞瘤BE(2)-C细胞通过向384孔板中添加每孔5μlOpti-MEM加0.1μl Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)到每孔5.1μl siRNA双链体进行独立转染，并在室温下孵育15分钟。然后将40μl含有5×103BE(2)-C细胞的InVitroGRO CP培养基(BioIVT Cat#Z99029)加入到siRNA混合物中。在RNA纯化前，细胞孵育24小时。实验在0.1nM、1nM、10nM和50nM的最终双链体浓度下进行，且结果见表8。
在第二实验中，表达SC9NA基因的BE(2)-C细胞通过向384孔板中添加每孔5μlOpti-MEM加0.1μl Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，Carlsbad CA)至每孔5.1μlsiRNA双链体而独立转染，并在室温下孵育15分钟。然后将40μl含有5×103BE(2)-C细胞的InVitroGRO CP培养基(BioIVT Cat#Z99029)加入到siRNA混合物中。在RNA纯化前，细胞孵育24小时。实验在0.1nM、1nM、10nM和50nM的最终双链体浓度下进行，且结果见表17。
RNA分离：
在BioTek-EL406平台上使用DYNABEADs(Invitrogen，Cat#61012)使用自动化方案分离RNA。简而言之，将70μl裂解/结合缓冲液和10μl含有3μl磁珠的裂解缓冲液加入到具有细胞的平板中。平板在电磁摇床上于室温下孵育10分钟，然后捕获磁珠并去除上清液。然后用150μl洗涤缓冲液A洗涤珠结合的RNA两次，用洗涤缓冲液B洗涤一次。然后用150μl洗脱缓冲液洗涤珠，再次捕获并去除上清液。
cDNA合成：
使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat#4368813)合成cDNA。将10μl含有1μl 10X缓冲液、0.4μl 25X dNTPs、1μl 10X随机引物、0.5μl反转录酶、0.5μl RNase抑制剂和6.6μl H2O的主混合物加入以上分离的RNA中。将平板密封、混合，并在室温下在电磁摇床上孵育10分钟，随后在37℃下孵育2小时。
实时PCR：
在384孔板(Roche cat#04887301001)中，向每孔0.5μl人GAPDH TaqMan探针(4326317E)和0.5μl SCN9A人探针中加入2μl cDNA和5μl Lightcycler 480探针主混合物(Roche Cat#04887301001)。实时PCR在LightCycler480实时PCR系统(Roche)中进行。每个双链体测试至少两次，并将数据针对用非靶向对照siRNA转染的细胞标准化。为计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并将其针对用非靶向对照siRNA转染的细胞进行的分析标准化。
结果：
表8显示了用SCN9A转染并用一组示例性SCN9A siRNA处理的BE(2)-C细胞的多剂量筛选的结果(对应于表4A、4B、5A、5B、6A和6B中的SiRNA)。实验在0.1nM、1nM、10nM和50nM最终双链体浓度下进行，且数据以相对于非靶向对照的信使保留百分比表示。
在50nM下评估的siRNA双链体中，5个实现了SCN9A的≥80％的敲减，86个实现了SCN9A的≥60％的敲减，266个实现了SCN9A的≥30％的敲减，298个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和314个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
在10nM下评估的siRNA双链体中，2个实现了SCN9A的≥80％的敲减，104个实现了SCN9A的≥60％的敲减，290个实现了SCN9A的≥30％的敲减，316个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和324个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
在1nM下评估的siRNA双链体中，32个实现了SCN9A的≥60％的敲减，203个实现了SCN9A的≥30％的敲减，256个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和296个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
在0.1nM下评估的siRNA双链体中，6个实现了SCN9A的≥60％的敲减，111个实现了SCN9A的≥30％的敲减，167个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和213个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
表8.一组示例性人SCN9A siRNA双链体的SCN9A体外多剂量筛选(*双链体名称中小数点后的数字仅指批产生编号)
Figure BDA0004004320660003221
Figure BDA0004004320660003231
Figure BDA0004004320660003241
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Figure BDA0004004320660003301
表17显示了在表达SCN9A基因并用一组示例性SCN9A siRNA处理的BE(2)-C细胞中多剂量筛选的结果(对应于表13A中的siRNA)。实验在0.1nM、1nM、10nM和50nM的最终双链体浓度下进行，且数据以相对于非靶向对照的信使保留百分比表示。
在表17中以50nM评估的siRNA双链体中，5个实现了SCN9A的≥90％的敲减，52个实现了SCN9A的≥80％的敲减，180个实现了SCN9A的≥60％的敲减，254个实现了SCN9A的≥30％的敲减，261个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和264个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
在表17中以10nM评估的siRNA双链体中，3个实现了SCN9A的≥90％的敲减，59个实现了SCN9A的≥80％的敲减，174个实现了SCN9A的≥60％的敲减，233个实现了SCN9A的≥30％的敲减，249个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和255个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
在表17中以1nM评估的siRNA双链体中，2个实现了SCN9A的≥90％的敲减，15个实现了SCN9A的≥80％的敲减，109个实现了SCN9A的≥60％的敲减，228个实现了SCN9A的≥30％的敲减，247个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和258个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
在表17中以0.1nM评估的siRNA双链体中，9个实现了SCN9A的≥70％的敲减，30个实现了SCN9A的≥60％的敲减，77个实现了SCN9A的≥50％的敲减，178个实现了SCN9A的≥30％的敲减，203个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和225个实现了SCN9A的≥10％的敲减。
表17.一组示例性人SCN9A siRNA双链体的SCN9A体外多剂量筛选(*双链体名称小数点后的数字仅指批产生编号)
Figure BDA0004004320660003311
Figure BDA0004004320660003321
Figure BDA0004004320660003331
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Figure BDA0004004320660003381
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Figure BDA0004004320660003401
Figure BDA0004004320660003411
实施例4.SCN9A siRNA的体内筛选
实验方法
野生型B6/C57小鼠(Charles Rivers Laboratory)眶后注射人SCN9A构建体，该构建体设计为跨越包装在AAV颗粒中的人SCN9A的各个不同区域(例如，3’UTR_AAV1(位置6266至7998)、3’UTR-AAV2(位置7999至9750)和两个开放阅读框(ORF-1(位置299至2441)或ORF-2(位置2392至4354))(2x1010gc/小鼠)。两周后，向小鼠皮下注射3mg/kg示例性siRNA(C16、VCP或GalNAc)(表4A、5A、6A、18(也在图1A-1C中总结)或20(也在图3A-3D中总结)，或PBS或非靶向siRNA对照(表9)。在处理后第14天，收获肝脏用于以特异性识别SCN9A的探针进行qPCR分析。小鼠GAPDH用作标准化对照。用Δ/ΔCt法计算肝脏中SCN9A mRNA的相对水平，相对于对照组标准化，且在以下表10-12、19和21中显示为信使保留百分比。
表9：对照siRNA序列
Figure BDA0004004320660003421
表18：所研究的靶向SCN9A ORF-1(例如，位置299-2441)的示例性SCN9A双链体及相应化学性。在该表中，“双链体名称”栏提供双链体名称的数字部分，带有仅指批产生编号的后缀(双链体名称中小数点后的数字)。在不改变化学结构的情况下，后缀可以从双联体名称中省略。
Figure BDA0004004320660003422
Figure BDA0004004320660003431
表20：靶向SCN9A 3’UTR的区域2(HsSCN9A_3UTR2，例如位置7999至9750)、SCN9A的ORF-1(HsSCN9A_ORF1rp，例如位置299-2441)和SCN9A的ORF2(HsSCN9A_ORF2rp，例如位置2392-4345)的所研究的示例性SCN9A双链体和相应的化学性。在该表中，“双链体名称”栏提供双链体名称的数字部分，具有仅指批产生编号的后缀(双链体名称中小数点后的数字)。在不改变化学结构的情况下，后缀可以从双联体名称中省略。
Figure BDA0004004320660003432
Figure BDA0004004320660003441
结果
表10(siRNA双链体对应于表4A和5A中的siRNA序列)显示了ORF-1靶向双链体的体内筛选的结果，且包括具有氟和非氟化学性的siRNA双链体。在表10所示的体内筛选中评估的siRNA双链体中，1个实现了SCN9A的≥80％的敲减，8个实现了SCN9A的≥60％的敲减，13个实现了SCN9A的≥40％的敲减，和15个实现了SCN9A的≥20％的敲减。
表10：示例性ORF-1靶向SCN9A siRNA在小鼠中的效力和持续时间(*双链体名称中小数点后的数字仅指批产生编号)
Figure BDA0004004320660003451
表11(siRNA双链体对应于表4A、5A和6A中的siRNA序列)显示了ORF-2靶向双链体以及3’UTR_AAV1和3’UTR_AAV2靶向双链体的体内筛选的结果，且包括具有氟、非氟、氟+GNA化学性的siRNA双链体。在表11所示的体内筛选中评估的ORF-2靶向siRNA双链体中，3个实现了SCN9A的≥80％的敲减，4个实现了SCN9A的≥30％的敲减，和5个实现了SCN9A的≥20％的敲减。在表11所示的该筛选中评估的3’UTR_AAV1靶向siRNA双链体(位置6266至7998)中，2个实现了SCN9A的≥20％的敲减。在表11所示的该筛选中评估的3’UTR_AAV2靶向siRNA双链体(位置7999至9750)中，2个实现了SCN9A的≥60％的敲减，和5个实现了SCN9A的≥30％的敲减。
表11：示例性ORF-2和3’UTR靶向SCN9A siRNA在小鼠中的效力和持续时间(*双链体名称中小数点后的数字仅指批产生编号)
Figure BDA0004004320660003461
表12(siRNA双链体对应于表4A、5A和6A中的siRNA序列)显示了3’UTR AAV2靶向siRNA双链体(位置7999至9750)的体内筛选的结果，并包括具有替代化学性的siRNA双链体。在表12所示的体内筛选中评估的3’UTR_AAV2靶向siRNA双链体(位置7999至9750)中，1个实现了SCN9A的≥80％的敲减，4个实现了SCN9A的≥60％的敲减，6个实现了SCN9A的≥30％的敲减，和7个实现了SCN9A的≥20％的敲减。
表12：示例性远端3’UTR靶向SCN9A siRNA(位置7999至9750)在小鼠中的效力和持续时间(*双链体名称中小数点后的数字仅指批产生编号)
Figure BDA0004004320660003471
表19和图2(siRNA双链体对应于表18和图1A-1C中的siRNA序列)显示了具有表18中所述和图1A-1C中所示的化学性的ORF-1靶向双链体的体内筛选的结果。在表19所示的体内筛选中评估的ORF-1靶向双链体中，1个实现了SCN9A的≥80％的敲减，8个实现了SCN9A的≥70％的敲减，13个实现了SCN9A的≥60％的敲减，14个实现了SCN9A的≥50％的敲减，和15个实现了SCN9A的≥30％的敲减。表19中总结的结果还表明，几种修饰在体内是可耐受的，具有与亲本双链体相比相似或改进的效力。
表19：示例性SCN9A siRNA双链体在小鼠中的效力。在该表中，“双链体名称”栏提供了双链体名称的数字部分，而没有后缀(例如，可以在双链体名称中包括的小数点后的数字)。后缀仅指批产生编号。在不改变化学结构的情况下，可以从双联体名称中省略后缀。例如，表19中的双链体AD-795305指与表18中的AD-795305.2相同的双链体。
Figure BDA0004004320660003481
根据实施例3中的体外测试和表17中的结果，选择双链体的子集，并将其分为两组：筛选1，其包括AD-1010663.3、AD-1251301.1、AD-1251249.1、AD-1251251.1、AD-795305.3、AD-1251363.1、AD-1251364.1、AD-1251373.1、AD-795634.4、AD-1251385.1、AD-1251391.1、AD-1251317.1、AD-1251318.1、AD-1251323.1、AD-1251325.1和AD-961179.3；筛选2，其包括AD-1251492.1、AD-1251279.1、AD-961334.3、AD-1251284.1、AD-1251334.1、AD-1251377.1、AD-1251398.1、AD-1251399.1、AD-1251274.2、AD-961188.3、AD-1251411.1、AD-1251419.1、AD-796825、AD-1251428.1、AD-797564.4和AD-1251434.1。将这些双链体在0.1nM(图4A)、1nM(图4B)和10nM(图4C)下测试时的SCN9A信使保留的百分比针对测试的双链体的有义链在靶SCN9A mRNA中的位置作图。从这些图中，选择了一组双链体用于体内研究，如表20和图3A-3D所示。
表21和图5(siRNA双链体对应于表20和图3A-3D中的siRNA序列)显示了具有表20中所述的和图3A-3D中所示的化学性的靶向SCN9A 3’UTR的区域2(HsSCN9A_3UTR2，例如位置7999至9750)、SCN9A ORF-1(HsSCN9A_ORF1rp，例如位置299-2441)和SCN9A ORF2(HsSCN9A_ORF2rp，例如位置2392-4345)的双链体的体内筛选结果。在表20所示的体内筛选中研究的示例性双链体中，4个实现了SCN9A的≥80％的敲减，11个实现了SCN9A的≥70％的敲减，13个实现了SCN9A的≥50％的敲减，14个实现了SCN9A的≥30％的敲减，15个实现了SCN9A的≥20％的敲减，和16个实现了SCN9A的≥10％的敲减。表19中总结的结果还表明，几种修饰在体内是可耐受的，且与亲本双链体相比具有相似的效力。
表21：示例性SCN9A siRNA双链体在小鼠中的效力。在该表中，所研究的示例性双链体对应于表20和图3A-3D中总结的那些。先前的亲本数据对应于具有表10-12中总结的数据的测试双链体。“亲本双链体体名称”栏提供双链体体名称中的数字部分，而无后缀(例如，双链体体名称中小数点后的数字)。后缀仅指批产生编号。在不改变化学结构的情况下，可以从双联体名称中省略后缀。例如，表21中的双链体AD-802471指与表12中的AD-802471.2相同的双链体。
Figure BDA0004004320660003491
Figure BDA0004004320660003501

Claims (48)

1.一种用于抑制电压门控钠通道，IX型α亚基(SCN9A)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA剂包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包含含有选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20中任一个所列的反义序列之一的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配，并且其中所述有义链包含含有对应于所述反义序列的选自表2A、2B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、13A、13B、14A、14B、15A、15B、16、18和20中任一个所列的有义序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列，具有0、1、2或3个错配。
2.根据权利要求1所述的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是SEQ ID NO：4001的核苷酸581-601、760-780或8498-8518内的部分。
3.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是选自AD-1251284(UGUCGAGUACACUUUUACUGA(SEQ IDNO:4827))、AD-961334(CAACACAATUTCUUCUUAGCA(SEQIDNO:5026))或AD-1251325(AAAACAAUCUUCCGUUUCAAA(SEQ ID NO:4822))的双链体的有义链内的部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的部分是选自AD-1251284(UGUCGAGUACACUUUUACUGA(SEQ ID NO:4827))、AD-961334(CAACACAATUTCUUCUUAGCA(SEQ ID NO:5026))或AD-1251325(AAAACAAUCUUCCGUUUCAAA(SEQID NO:4822))的有义链的有义链。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链的部分是选自AD-1251284(UCAGTAAAAGUGUACTCGACAUU(SEQ ID NO:5093))、AD-961334(UGCUAAGAAGAAATUGUGUUGUU(SEQ ID NO:5292))或AD-1251325(UUUGAAACGGAAGAUUGUUUUCC(SEQ ID NO:5088))的双链体的反义链内的部分。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的dsRNA，其中所述反义链的部分是选自AD-1251284(UCAGTAAAAGUGUACTCGACAUU(SEQ ID NO:5093))、AD-961334(UGCUAAGAAGAAATUGUGUUGUU(SEQ ID NO:5292))或AD-1251325(UUUGAAACGGAAGAUUGUUUUCC(SEQ ID NO:5088))的反义链的反义链。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的dsRNA，其中所述有义链和所述反义链包含选自AD-1251284(SEQ ID NO:4827和5093)、AD-961334(SEQ ID NO:5026和5292)或AD-1251325(SEQ ID NO:4822和5088)的双链体的成对有义链和反义链的核苷酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含表16中所列的反义序列的核苷酸序列，并且所述有义链包含对应于所述反义序列的表16中所列的有义序列的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂是AD-1251284、AD-961334、AD-1251325、AD-1331352、AD-1209344或AD-1331350。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链和所述反义链中的至少一个与一个或多个亲脂性部分缀合。
11.根据权利要求10所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分经由接头或载体缀合。
12.根据权利要求10或11所述的dsRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分缀合于至少一条链上的一个或多个内部位置。
13.根据权利要求12所述的dsRNA剂，其中所述一个或多个亲脂性部分经由接头或载体缀合于至少一条链上的一个或多个内部位置。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分是脂族、脂环族或聚脂环族化合物。
15.根据权利要求14所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分经由替代所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载体缀合。
17.根据权利要求10-15中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分经由包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应产物或氨基甲酸酯的接头与所述双链iRNA剂缀合。
18.根据权利要求10-16中任一项所述的双链iRNA剂，其中所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
19.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。
20.根据权利要求19所述的dsRNA剂，其中所述有义链的不超过5个核苷酸和所述反义链的不超过5个核苷酸是未修饰的核苷酸。
21.根据权利要求19所述的dsRNA剂，其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都包含修饰。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的dsRNA剂，其中所述修饰的核苷酸中的至少一个选自脱氧核苷酸、3’末端脱氧胸苷(dT)核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸、2’-氟修饰的核苷酸、2’-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、解锁的核苷酸、构象限制的核苷酸、约束的乙基核苷酸、脱碱基的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基修饰的核苷酸、2’-C-烷基修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及它们的组合。
23.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
24.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为15-30个核苷酸对。
25.根据权利要求24所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为17-23个核苷酸对。
26.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，其中每条链具有19-30个核苷酸。
27.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，其中所述剂包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
28.根据权利要求10-27中任一项所述的dsRNA剂，其进一步包含靶向配体，例如靶向CNS组织的配体。
29.根据权利要求28所述的dsRNA剂，其中所述靶向配体是靶向CNS组织的配体。
30.根据权利要求29所述的dsRNA剂，其中所述CNS组织是脑组织或脊髓组织。
31.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，进一步包含所述反义链5’端处的磷酸酯或磷酸酯模拟物。
32.根据权利要求31所述的dsRNA剂，其中所述磷酸酯模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
33.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA剂，其中：
(i)所述有义链包含SEQ ID NO:4029的序列和所有修饰，和所述反义链包含SEQ IDNO:4295的序列和所有修饰；
(ii)所述有义链包含SEQ ID NO:4228的序列和所有修饰，和所述反义链包含SEQ IDNO:4494的序列和所有修饰；
(iii)所述有义链包含SEQ ID NO:5339的序列和所有修饰，和所述反义链包含SEQ IDNO:5355的序列和所有修饰；
(iv)所述有义链包含SEQ ID NO:5800的序列和所有修饰，和所述反义链包含SEQ IDNO:5801的序列和所有修饰；
(v)所述有义链包含SEQ ID NO:5526的序列和所有修饰，和所述反义链包含SEQ IDNO:5681的序列和所有修饰；或
(vi)所述有义链包含SEQ ID NO:5542的序列和所有修饰，和所述反义链包含SEQ IDNO:5697的序列和所有修饰。
34.一种含有权利要求1-33中任一项所述的dsRNA剂的细胞。
35.一种用于抑制SCN9A表达的药物组合物，其包含权利要求1-33中任一项所述的dsRNA剂。
36.一种抑制细胞中的SCN9A表达的方法，该方法包括：
(a)使所述细胞与权利要求1-33中任一项所述的dsRNA剂或权利要求35所述的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够的时间以降低SCN9AmRNA、SCN9A蛋白或SCN9AmRNA和蛋白两者的水平，从而抑制所述细胞中的SCN9A表达。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者是人。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者被诊断有SCN9A相关障碍，例如疼痛，例如慢性疼痛，例如炎性疼痛、神经病理性疼痛、疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)以及与例如癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤和病毒感染相关的疼痛。
40.一种治疗患有或诊断有SCN9A相关障碍的受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-33中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求35所述的药物组合物，从而治疗所述障碍。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述SCN9A相关障碍是疼痛，例如慢性疼痛。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述SCN9A相关障碍是慢性疼痛。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述慢性疼痛与下组中的一种或多种障碍相关：疼痛超敏反应、疼痛低敏感性、无法感知疼痛、原发性红斑性肢痛症(PE)、阵发性剧痛症(PEPD)、小纤维神经病(SFN)、三叉神经痛(TN)或与癌症、关节炎、糖尿病、创伤性损伤或病毒感染相关的疼痛。
44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中治疗包括缓解所述障碍的至少一种体征或症状。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述治疗包括(a)减轻疼痛；或(b)抑制或降低SCN9A的表达或活性。
46.根据权利要求37-45中任一项所述的方法，其中所述dsRNA剂颅内或鞘内施用于所述受试者。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述dsRNA剂鞘内、脑室内或脑内施用于所述受试者。
48.根据权利要求37-47中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用适于治疗或预防SCN9A相关障碍的另外的药剂或疗法(例如，非甾体抗炎药(NSAID)、对乙酰氨基酚、阿片样物质或皮质类固醇、针灸、治疗性按摩、背根神经节刺激、脊髓刺激或局部疼痛缓解剂)。
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