CN116103301B - 转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用。本发明发现在对Cry1Ac毒素不敏感Sf9细胞系超表达草地贪夜蛾SfGATAe，能够显著提高Sf9细胞对Cry1Ac毒素的敏感性；在草地贪夜蛾幼虫体内干扰SfGATAe的表达，能够显著增加草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ac毒素的抗性，因此草地贪夜蛾转录因子SfGATAe可应用于草地贪夜蛾种群绿色防控。

Description

转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用

技术领域

本发明属于昆虫生长发育调控和基因工程领域，涉及转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bt)作为一种对人畜安全、环境友好型的高效微生物杀虫剂在全球得到广泛应用。Bt毒素基因作为转基因植物的靶标基因转入作物中，这样可以有效地减少化学合成杀虫剂在玉米、棉花、大豆等农作物中的使用，促进现代农业的健康发展。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是原产于美洲热带及亚热带重大迁飞性杂食害虫，其寄主广泛、繁殖能力强，迁飞速度快，防控难度较大，严重威胁世界各国粮食安全。2019年1月底草地贪夜蛾入侵我国云南西部，随后不断蔓延。Bt防控是一种防治草地贪夜蛾的重要绿色防控策略之一。转录调控是生命有机体遗传信息表达的关键环节之一，涉及昆虫代谢调控、分化发育、免疫应答、信号转导等重要生理生化过程。GATA因子是一个经典的转录因子家族，介导昆虫中肠组织和细胞的发育、分化和基因表达过程。

发明内容

本发明目的在于提供草地贪夜蛾的重要转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用。

本发明发现在对Cry1Ac毒素不敏感Sf9细胞系超表达草地贪夜蛾SfGATAe，能够显著提高Sf9细胞对Cry1Ac毒素的敏感性；在草地贪夜蛾幼虫体内干扰SfGATAe的表达，能够显著增加草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ac毒素的抗性，因此草地贪夜蛾转录因子SfGATAe可应用于草地贪夜蛾种群绿色防控。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种草地贪夜蛾Cry1Ac毒素抗性相关的转录因子SfGATAe，其开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

草地贪夜蛾转录因子SfGATAe在调控草地贪夜蛾对Cry1Ac毒素敏感性中的应用。

草地贪夜蛾转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用。

草地贪夜蛾转录因子SfGATAe在培育对Cry1Ac毒素敏感的草地贪夜蛾品种中的应用。

草地贪夜蛾转录因子SfGATAe在制备提高草地贪夜蛾对Cry1Ac毒素敏感性的饲料或绿色农药中的应用。

一种提高草地贪夜蛾对Cry1Ac毒素敏感性的饲料或农药，包含草地贪夜蛾转录因子SfGATAe。

一种防治草地贪夜蛾的农药，包含草地贪夜蛾转录因子SfGATAe、Cry1Ac毒素，还包含农药上可接受的赋形剂。

本发明的优点和有益效果：草地贪夜蛾SfGATAe转录因子调控虫体Bt毒素受体基因的表达调控，从而引起虫体对Bt毒素敏感性改变，为草地贪夜蛾绿色防控提供重要理论和应用参考。

附图说明

图1是构建的转录因子SfGATAe昆虫细胞表达载体的图谱。

图2是10μg/mL Cry1Ac活化毒素处理转染不同质粒介导的Sf9细胞病变的显微镜观察图。其中，A：10μg/mL Cry1Ac处理不转染质粒正常细胞组，无病变细胞出现；B：10μg/mLCry1Ac处理瞬时转染空载pIE2-EGFP-N1质粒组，也无病变细胞出现；C：10μg/mL Cry1Ac处理瞬时转染pIE2-SfGATAe-EGFP重组质粒组，有73.7％病变细胞出现。

图3是利用荧光定量PCR分别检测草地贪夜蛾注射dsGFP和dsSfGATAe 24h、48h、72h、96h后转录因子SfGATAe的表达水平。干扰SfGATAe组SfGATAe基因表达量均下调，干扰72h检测效果最好。

图4是选取草地贪夜蛾二龄末期幼虫注射dsGFP和dsSfGATAe后，分别用40μg/g和80μg/g Cry1Ac有毒饲料饲喂七天后的幼虫存活率。

具体实施方式

下文将结合实施例具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

如无特殊提及，以下方案中提到的分子克隆方法、蛋白表达纯化方法、细胞培养方法及各种检测方法等均为传统实验方法，可通过查询文献获得；用到的相关试剂可从对应试剂商处购买获得。

实施例1

1、草地贪夜蛾SfGATAe转录因子的昆虫表达重组载体构建

将草地贪夜蛾转录因子SfGATAe基因构建到昆虫细胞系表达载体pIE2-EGFP-N1(pIE2-EGFP-N1的构建见申请人在先专利申请《一种昆虫细胞表达系统载体重组质粒及其制备方法与应用》，公开号CN114540388A)，获得带有Opie2启动子、Corzak序列、SfGATAe目的基因、EGFP荧光标签、KanR标签等特征的融合质粒pIE2-SfGATAe-EGFP，其质粒图谱如图1所示，具体构建过程如下。

(1)昆虫组织总RNA的提取

将活体状态良好的昆虫低温冷冻5min，解剖约3条昆虫幼虫解剖取出中肠组织，用PBS缓冲液洗净中肠并置于无RNA酶的洁净EP管中，加入1mL Trizol溶液低温下用匀浆器充分研磨组织，时间不宜太久，研磨完成待用。置于冷冻高速离心机4℃低温离心，转速12000×g下离心5min，用移液器取上清液至另一个洁净EP管中，弃去沉淀。向有上清液的EP管中加入200μL的三氯甲烷(氯仿)，用移液器轻轻混匀，混合液冰浴10～15min。再次置于冷冻高速离心机4℃低温离心，转速12000×g离心15min，EP管中液体会出现分层现象，小心仔细吸取上层水相置于另一洁净EP管中，不可吸取中层或下层(弃去)。在所取的水相EP中混入500μL的异丙醇，上下颠倒轻轻混匀，室温静置10min。置于冷冻高速离心机4℃低温离心，转速12000×g离心10min，弃掉上清液，EP管底部有白色RNA沉淀。加入1000μL的75％冷乙醇，轻轻震荡混匀RNA沉淀，可能发现白色沉淀不溶于乙醇，但切忌用移液器吹散，此过程的作用是在除去残留的异丙醇。冷冻高速离心机低温离心4℃、8000×g离心5min，弃掉上清液，RNA白色沉淀重新出现在管底。将EP管盖子打开室温干燥5～10min挥发残留的乙醇，但不可过度干燥。向EP管中加入20～50μL无RNase的水溶解管底RNA沉淀，取少许样品测RNA浓度，RNA溶液备用或置于-80℃保存。

(2)草地贪夜蛾幼虫cDNA的合成

gDNA消除反应，参考TaKaRa PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser指导手册，基因组DNA去除体系：gDNA Eraser 1.0μL，5×gDNAEraser buffer 2.0μL，总RNA量约1μg/mL，补足RNase Free water至总体系10.0μL，整个体系置于42℃水浴，反应30min，反应物备用或4℃保存。

RNA逆转录获得cDNA：取上述总反应体系10.0μL，加入5×PrimeScript Buffer24.0μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μL，RT Primer Mix 4.0μL以及RNase Free water1.0μL，使得总反应体系为20μL。将反应体系置于37℃水浴，反应15min；随后85℃水浴，反应5秒，使酶灭活；反应完成获得的cDNA备用或分装至洁净的PCR管置于-20℃保存。

(3)同源重组法无缝克隆获得pIE2-SfGATAe-EGFP重组质粒

根据pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit说明书总结如下：

目的基因的扩增：以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物，以草地贪夜蛾cDNA为模板扩增目的基因(长度182bp)，获得带载体重复序列目的基因片段长度为1887bp(退火温度为52℃)，将扩增的目的基因利用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit，(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。

SEQ ID NO.2：5’-AGATCTCGAGCTCAAGCTTCGGCCACCATGGAGAACGTGGCTCA GATGGAGC-3’，

SEQ ID NO.3：5’-GGTGGCGACCGGTGGATCACCTCCGCCACCGCCTCCGCGCTGGTACCCCGCCAGC-3’。

载体线性化：利用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5扩增载体，从而获得线性化载体，扩增pIE2-EGFP-N1质粒载体(全长4709bp)线性化载体获得4678bp片段(退火温度为60℃)，将线性划载体利用胶回收试剂盒Gel Extraction Kit(Omega Bio-tek,Inc.,GA,USA)纯化后备用。

SEQ ID NO.4：5’-GATCCACCGGTCGCCACC-3’，

SEQ ID NO.5：5’-CGAAGCTTGAGCTCGAGATCT-3’。

同源重组：将获得的线性化载体和带有线性化载体重复序列的目的基因纯化后按照同源重组无缝克隆试剂盒连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆获得重组质粒pIE2-SfGATAe-EGFP，具体步骤可以参照-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit(北京全式金生物科技有限公司)试剂盒步骤详情。

2、重组质粒pIE2-SfGATAe-EGFP转染至昆虫细胞

(1)取生长状态良好的SF9细胞接种到洁净的48孔细胞板中，用含有8.0％胎牛血清的Grace’s培养基(Grace’s Insect cell culture medium)在28.0℃恒温培养箱过夜培养，待密度为60％～80％便可用于细胞转染。

(2)用作转染的pIE2-SfGATAe-EGFP野生型质粒和pIE2-EGF-N1空载质粒需用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后其浓度在200ng/μL以上、且纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)在1.75～1.85之间为宜。

(3)准备无血清Grace’s培养基，1000μL、200μL、10μL移液器和相应大小的替补头，1.5mL洁净的EP管，酒精灯和酒精棉置于生物安全柜中，紫外灭菌约30min。

(4)取25μL无血清Grace’s培养基到无菌1.5mL EP管中，加入1.0μL的FuGENE HD，同时混入0.25μg质粒(转染试剂体积与质粒质量比的范围建议在3.0：1.0～6.0：1.0之间为宜)。

(5)将加入到1.5mL的EP管中的混合液轻轻混匀，生物安全柜中静置20min，在上述混合液体系中补入95μL无血清Grace’s，使得总体积为120μL。

(6)弃去48孔板中培养基，用无血清Grace’s培养基清洗三次，将步骤(5)中的反应液加入到清洗的48孔板中混匀。

(7)转染的48孔板置于28.0℃细胞恒温培养箱孵育3～5h，弃去48孔板中反应液，加入120μL含有8.0％胎牛血清的Grace’s培养基。

(8)换培养基后，将48孔细胞培养板置于28.0℃细胞恒温培养箱培养24～48h。

3、pIE2-SfGATAe-EGFP转录因子重组质粒转染介导SF9细胞毒力测定

(1)在转染质粒48h后，把48孔板从培养箱中拿出，以用于后续的毒素处理实验。

(2)用PBS液采用两倍稀释法对Cry1Ac毒素进行稀释，稀释过程中一定要加量准确并均匀混合，配制成浓度为10μg/mL毒素。

(3)把48孔板中的培养基吸出来，Pucks液洗3次，然后每孔加入150μL 10μg/mL的毒素溶液。

(4)在加入毒素1h后，使用无目镜倒置显微镜进行拍照。

(5)毒素处理转染的SF9处理1h，在荧光倒置显微镜拍照记录，白光下记录病变数(细胞肿胀、膨大、变圆即为病变)，荧光下记录绿色荧光标签蛋白细胞数为细胞总数，计算病变率，即细胞病变率＝病变数/细胞总数×100％。

(6)设置三次重复，统计病变率。

(7)由图2可知，在10μg/mL的Cry1Ac毒素处理下，未转染组和转染pIE2-EGF-N1空载质粒组1h后均无病变细胞，转染pIE2-SfGATAe-EGFP介导SF9细胞病变率病变率极显著提高(p<0.01)。用不同浓度Cry1Ac毒素处理pIE2-SfGATAe-EGFP重组蛋白介导的Sf9细胞，Cry1Ac毒素浓度为2μg/mL细胞病变率是14.07％，Cry1Ac毒素浓度为4μg/mL细胞病变率是2.58％，Cry1Ac毒素浓度为8μg/mL细胞病变率是61.14％，Cry1Ac毒素浓度为16μg/mL细胞病变率是83.43％，Cry1Ac毒素浓度为32μg/mL细胞病变率是95.51％，计算出不同浓度Cry1Ac毒素对pIE2-SfGATAe-EGFP介导SF9细胞EC₅₀值为6.213μg/mL，结果表明SfGATAe转录因子在Sf9细胞中过表达后，该细胞对Cry1Ac毒素敏感性增强。

4、荧光定量PCR检测转录因子SfGATAe表达水平变化

(1)根据转录因子SfGATAe序列合成dsRNA用于干扰保守区域长度为518bp。根据靶基因的保守区序列设计含T7启动子序列的引物，以草地贪夜蛾三龄幼虫cDNA为模板，PCR扩增其保守区DNA片段约518bp，以此线性DNA为模板体外合成靶基因的dsRNA(具体方法参照T7 RiboMAXTM Express RNAi System产品说明书操作)，浓度测定约1500ng/μL。

合成干扰对照组GFP基因dSRNA引物如下：

SEQ ID NO.6：5’-TAATACGACTCACTATAGGG ACCTACGGCAAGCTGACCC-3’，

SEQ ID NO.7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG CTCGATGTTGTGGCGGATC-3’。

合成干扰靶基因SfGATAe保守区域dSRNA引物如下：

SEQ ID NO.8：5’-TAATACGACTCACTATAGGGACAAAGTGGGAGGGGAGCAC-3’，SEQ IDNO.9：5’-TAATACGACTCACTATAGGGCTTCCTCGTCTGGATGCCGTC-3’。

(2)选取长势大致相同的草地贪夜蛾二龄末期幼虫冰上麻醉30min。

(3)在幼虫倒数第二对腹足和倒数第三对腹足之间进行显微注射，dsRNA注射量2μg/头。

注射干扰EGFP基因的dsRNA作为对照组，注射干扰SfGATAe的dsRNA为实验组每个处理注射幼虫10头，注射后24h、48h、72h、96h分别各抽取3头幼虫解剖提取中肠总RNA通过逆转录获取cDNA，用荧光定量PCR检测靶基因的干扰效率。

用以下引物作为草地贪夜蛾GAPDH内参检测引物：

SEQ ID NO.10：5’-AGATCGCTGTCTTCTGCGAG-3’，

SEQ ID NO.11：5’-CAGACGCCTTCTCTGTGGTT-3’。

用以下引物作为草地贪夜蛾SfGATAe检测引物：

SEQ ID NO.12：5’-GTACAAAGTGGGAGGGGAGC-3’，

SEQ ID NO.13：5’-CGTCGTCGATGGGTAGAAGG-3’。

结果如图3所示。干扰SfGATAe基因24h、48h、72h、96h后，其表达水平较干扰GFP对照组分别下调到80.65％±3.43(p<0.01)，70.49％±2.79(p<0.01)，54.71％±3.83(p<0.01)，85.47％±2.62(p>0.05)，在干扰72小时后SfGATAe显著下调，且干扰效率最高，因此以下毒力实验选用干扰72h后的幼虫实验。

5、干扰转录因子SfGATAe后检测草地贪夜蛾种群对毒素敏感性检测

(1)将草地贪夜蛾置于HP3000GS-C型智能人工气候箱，让其恢复至最佳状态，并使昆虫适应人工气候箱室内环境，控制人工气候箱参数，饲养条件为温度28.0±0.5℃，光照周期比为16L：8D，湿度为60±5％。

(2)收集龄期和生理状态一致的草地贪夜蛾二龄幼虫，置于洁净的24孔板，饥饿处理4-6h。

(3)取配制好的昆虫饲料封闭置于DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱20～30min，将溶解的Cry1Ac原毒素加入饲料中并搅拌均匀，配制成40μg/g和80μg/g的有毒饲料。

(4)注射干扰EGFP基因的dsRNA作为对照组，注射干扰SfGATAe的dsRNA为实验组，每个处理注射幼虫60头。

(5)干扰二龄末期幼虫72h后，取40μg/g和80μg/g有毒饲料饲喂饥饿处理的实验组和对照组幼虫各30头，每个处理重复三次。

(6)每天统计每组昆虫存活数，统计7天，在同一时间检查昆虫死亡情况，记录实验组和对照组昆虫存活率。

(7)计算处理组校正存活率，校正存活率＝(处理组存活数-对照组平均死亡数)/(处理组总数-对照组平均死亡数)×100％，校正存活率均记为存活率。

结果见图4。对照组饲喂毒素40μg/g和80μg/g 7天后存活率率分别是37.78％±6.85，11.11％±4.16。而干扰SfGATAe组40μg/g和80μg/g 7天后存活率88.89％±5.67、72.22％±8.31，较对照组存活率均显著提高(p<0.01)。

Claims (3)

1. 一种转录因子SfGATAe在调控草地贪夜蛾对Cry1Ac毒素敏感性中的应用，其特征在于：所述的转录因子SfGATAe的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种转录因子SfGATAe在草地贪夜蛾种群绿色防控中应用，其特征在于：所述的转录因子SfGATAe的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3. 一种转录因子SfGATAe在培育对Cry1Ac毒素敏感的草地贪夜蛾品种中的应用，其特征在于：所述的转录因子SfGATAe的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。