CN119570819B

CN119570819B - 高粱蚜MsCYP1基因、其编码蛋白、dsRNA及应用

Info

Publication number: CN119570819B
Application number: CN202411532158.3A
Authority: CN
Inventors: 吴迪; 王道文; 雷康; 魏明舒; 李永邦; 胡志强; 牛梦迪; 张坤普
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2024-10-30
Filing date: 2024-10-30
Publication date: 2025-11-18
Anticipated expiration: 2044-10-30
Also published as: CN119570819A

Abstract

本发明申请公开了一种高粱蚜MsCYP1基因、其编码蛋白、dsRNA及应用，旨在解决当前利用RNA干扰技术进行高粱蚜生物防治时缺乏关键基因的技术问题。本申请筛选到了能够分泌到高粱细胞内的高粱蚜蛋白MsCYP1，该蛋白及其编码基因能够抑制高粱中过氧化氢含量及其免疫反应。同时本申请根据高粱蚜MsCYP1基因的cDNA序列，设计的针对该基因的dsRNA，通过人工喂食的方式将该dsRNA导入高粱蚜体内，发现其能够显著抑制高粱蚜MsCYP1基因，进而影响高粱蚜的蜜露分泌量和繁殖率，MsCYP1基因可作为RNAi靶标基因用于蚜虫防治，有利于降低农药使用，维持生态平衡。

Description

高粱蚜MsCYP1基因、其编码蛋白、dsRNA及应用

技术领域

本发明申请涉及生物防治技术领域，具体涉及一种高粱蚜MsCYP1基因、其编码蛋白、dsRNA及应用。

背景技术

高粱是全球第五大粮食作物，也是中国重要最早栽培的禾谷类作物之一，在农业生产中占据着极其重要的地位。高粱具有较强的抗旱、耐涝、耐盐碱、耐贫瘠、耐高温等抗逆特性，可食用、饲用、酿造用、生物能源用、化工材料用等，是最具开发潜力的粮饲兼用作物和能源植物。但高粱出苗后即受到高粱蚜（Melanaphis sacchari）的危害，单株虫数可达30000头，因此，高粱蚜被认定是我国高粱生产中的主要害虫。高粱蚜利用其刺吸式口器侵入植物体内，吸食高粱叶片背面及茎秆韧皮部的汁液，并排泄高糖分的蜜露，这不仅导致霉菌生长，还造成营养物质的流失，进而引发农作物减产，甚至整株枯死。此外高粱蚜还是谷类红叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病等植物病毒病的传播媒介，对农作物构成间接危害。如采取杀虫措施，高粱蚜引起的产量损失可达46%~78%，同时严重影响高粱的各项经济性状，如降低籽粒的蛋白质含量、显著减少茎秆含糖量、导致受害茎秆不耐贮藏等问题，造成毁灭性灾害，因此，对高粱蚜的有效控制对于保障高粱产量和质量至关重要。

传统防治高粱蚜的方法是使用化学杀虫剂，化学防治见效快，功效高，不受地域和时间的限制，但是化学农药的大量使用会造成环境污染，不符合绿色发展主题，其次高粱的农药残留会对人畜造成危害，化学农药的长期使用也会使蚜虫产生抗药性从而失去防治效果。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指双链RNA（dsRNA）进入细胞内指导同源mRNA 的高效特异性降解，从而抑制和下调靶标基因表达。目前RNAi技术已被广泛研究并应用于现代农业领域，通过人工饲喂、显微注射dsRNA和纳米颗粒介导的方法沉默靶标基因，已经被广泛应用于昆虫基因功能的鉴定和分析中。因此，挖掘高粱蚜中具有RNAi生物防治的关键基因，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

鉴于以上技术问题中的至少一项，本公开提供了一种高粱蚜MsCYP1基因、其编码蛋白、dsRNA及应用，旨在解决当前利用RNA干扰技术进行高粱蚜生物防治时缺乏关键基因的技术问题。

根据本公开的一个方面，提供一种高粱蚜基因MsCYP1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本公开的第二个方面，提供一种所述高粱蚜基因MsCYP1的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

根据本公开的第三个方面，提供一种抑制所述高粱蚜基因MsCYP1表达的dsRNA。

在本公开的一些实施例中，所述的dsRNA为由SEQ ID NO .3所示序列和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。

根据本公开的第四个方面，提供一种生物材料，其含有所述高粱蚜基因MsCYP1或所述dsRNA。

在本公开的一些实施例中，所述的生物材料包括重组DNA、表达盒、质粒载体、病毒载体或工程菌。

根据本公开的第五个方面，将所述高粱蚜基因MsCYP1、所述编码蛋白、所述dsRNA或所述生物材料，应用在如下（1）～（6）任一项中：

（1）防治高粱蚜或制备防治高粱蚜的产品；

（2）降低高粱蚜存活率或制备降低高粱蚜存活率的产品；

（3）抑制高粱蚜基因MsCYP1表达或制备抑制蚜虫高粱蚜基因MsCYP1表达的产品；

（4）调节高粱免疫反应和/或高粱过氧化氢含量或制备调节高粱免疫反应和/或高粱过氧化氢含量的产品；

（5）抑制高粱蚜取食和/或蜜露分泌或制备抑制高粱蚜取食和/或蜜露分泌的产品；

（6）抑制高粱蚜繁殖和/或高粱蚜生长或制备抑制高粱蚜繁殖和/或高粱蚜生长的产品。

根据本公开的第六个方面，提供一种活性成分为如下A～D中任一种的产品：

A、上述高粱蚜基因MsCYP1；

B、上述编码蛋白；

C、上述dsRNA；

D、上述生物材料；

所述产品具有如下（1）～（6）功能中的至少一种：

（1）防治高粱蚜；

（2）降低高粱蚜存活率；

（3）抑制高粱蚜基因MsCYP1表达；

（4）调节高粱免疫反应和/或高粱过氧化氢含量；

（5）抑制高粱蚜取食和/或蜜露分泌；

（6）抑制高粱蚜繁殖和/或高粱蚜生长。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：

1. 筛选到了能够分泌到高粱细胞内的高粱蚜蛋白MsCYP1，该蛋白及其编码基因能够抑制高粱中过氧化氢含量及其免疫反应。

2. 根据高粱蚜MsCYP1基因的cDNA序列，设计的针对该基因的dsRNA，通过人工喂食的方式将该dsRNA导入高粱蚜体内，发现其能够显著抑制高粱蚜MsCYP1基因，进而影响高粱蚜的蜜露分泌量（取食量）和繁殖率，因此，MsCYP1基因可作为RNAi靶标基因用于蚜虫防治，有利于降低农药使用，维持生态平衡。

附图说明

图1为本申请一实施例中dsMsCYP1和dsGFP的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本申请一实施例中人工喂食dsRNA后MsCYP1基因相对表达量分析结果；其中，dsGFP：喂食dsGFP的高粱蚜；dsMsCYP1：喂食dsMsCYP1的高粱蚜；**表示P<0.01，达极显著差异。

图3为本申请一实施例中人工喂食后高粱蚜繁殖率和蜜露量分析结果；其中，A：人工喂食后的高粱蚜，取食两天后，排泄蜜露量的结果，B：人工喂食后2、4、6 d新产生的高粱蚜个数；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图4为本申请一实施例中高粱蚜MsCYP1蛋白在高粱原生质体中表达的结果；其中，GFP-Flag：高粱原生质体中表达GFP-Flag融合蛋白；MsCYP1-Flag：高粱原生质体中表达MsCYP1-Flag融合蛋白。

图5为本申请一实施例中过表达MsCYP1的高粱原生质体细胞过氧化氢积累的结果；其中，GFP+chitosan：几丁质处理表达GFP基因的高粱原生质体后过氧化氢的积累量（对照组）；MsCYP1+chitosan：几丁质处理表达MsCYP1基因的高粱原生质体后过氧化氢的积累量；**表示P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明申请的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本申请，并不以任何方式限制本申请的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的检测方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例一、高粱蚜MsCYP1基因的分离

本例通过对高粱蚜取食高粱后的高粱蛋白质组进行分析，鉴定到一种能分泌到高粱细胞内的高粱蚜蛋白MsCYP1，并根据该蛋白的编码序列设计引物：

MsCYP1-F: 5'-ATGGCGTCCACCACGTTT-3'；

MsCYP1-R: 5'-TTAACTCAATTGTCCACA-3'。

以高粱蚜cDNA为模板进行PCR扩增，采用高保真酶KOD-FX-Neo（TOYOBO，日本）50µl反应体系扩增。PCR条件为：94℃预变性2 min；98℃变性10 s，68℃退火延伸30 s/kb，32个循环。PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

。

PCR扩增完成后，将扩增产物进行胶回收，回收后连入pEASY^®-Blunt Zero载体上，筛选阳性克隆并测序。测序结果如SEQ ID NO:1所示。

实施例二、dsMsCYP1及其对照dsGFP的制备

以高粱蚜的cDNA为模板，用dsMsCYP1-F，dsMsCYP1-R为引物（下划线标注的区域为T7 RNA聚合酶启动子序列）进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTCGAGCTTCGCAGTGATGTT-3’；

R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGTCCACAATTAGCGACAGTGA-3’。

以含GFP的质粒为模板，用dsGFP-F，dsGFP-R为引物（下划线标注的区域为T7 RNA聚合酶启动子序列）进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

F：5’-TAATACGACTCACTATAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；

R：5’-TAATACGACTCACTATAGGGTTGAAGTTCACCTTGATGCCGT-3’。

将上述扩增产物连接至pEASY^®-Blunt Zero载体，送测序得到正确的阳性克隆，以该克隆质粒为模板，同样用上述引物进行扩增，扩增产物纯化、回收，浓度为1μg/μL，并作为dsRNA合成的模板。

按以下比例加入1μg模板、2 μL 10× T7 Reaction Buffer、2 μL ATP Solution(75 mM)、2 μL CTP Solution (75 mM)、2 μL GTP Solution (75 mM)、2 μL UTP Solution(75 mM)、2 μL T7 Enzyme Mix、Nuclease-free Water定容至20μL。轻弹混匀，瞬时离心。放入PCR中，程序为37℃，4h，完成转录产生dsRNA。

随后进行核酸酶切去除模板DNA和ssRNA：加入20 μL dsRNA、21 μL Nuclease-free Water、5 μL 10× Digestion Buffer、2 μL DNase I、2 μL Rnase，充分混匀，瞬时离心，放入PCR仪中37℃，1 h，得到去除了模板DNA和ssRNA的dsRNA。

最后进行dsRNA的过滤和回收：50 μL dsRNA、50 μL 10× Binding Buffer、150 μL Nuclease-free Water、250 μL100% Ethanol，颠倒混匀，加到过滤器中，离心2min，经500μL Wash Solution洗涤后，加入50μL Elution Solution，离心2 min，得到dsRNA，用NANOdrop紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测浓度和纯度，如果检测条带是很单一明亮的条带，如图1所示，且其OD260/280在1.8-2.0之间，则说明dsRNA质量良好，将dsRNA调到250 ng/μL，放入-20℃保存备用。

实施例三、dsMsCYP1和dsGFP的人工喂食及效果检测

高粱蚜准备：取饲养于BTx623高粱苗上且大小一致的高粱蚜，放入培养皿中，饥饿处理12 h。

人工喂食：配制15%的蔗糖水，将其与dsRNA按照1:1的比例配制成人工饲料，采用人工喂食的方法将dsMsCYP1导入高粱蚜体内。

人工喂食高粱蚜24 h后，开始取样，5头为一个重复，重复3次，同时取喂食dsGFP的高粱蚜作为对照，用qRT-PCR验证基因表达量变化。

具体操作如下：取样后，提RNA，用Invitrogen SuperScript II 反转录酶（货号18064014）按照说明书进行反转，得到cDNA产物。将cDNA产物用水稀释10倍，然后按照SYBRHPremix ExTaqTM II（TaKaRa）说明书配制反应体系并在罗氏LightCycler 480仪器上进行实时定量PCR。实时定量PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性10 s，60℃退火延伸30s，重复后两步骤40个循环，最后65℃-95℃，每步增加0.5℃，5s做溶解曲线以确定扩增产物的特异性。

内参基因actin引物：

Actin-F：5’-TGTGACGATGATGTAGCAGCTT-3’ ；

Actin-R：5’-TACCGACCATGACTCCTTGATG-3’ 。

MsCYP1定量引物：

QMsCYP1-F：5’-ACTGCTCCACTCCGAATCAC-3’ ；

QMsCYP1-R：5’-TCGGGAGACTCATTTTGGCA-3’ 。

结果如图2所示，与人工喂食dsGFP的对照组相比，人工喂食dsMsCYP1后高粱蚜体内MsCYP1基因的相对表达量显著降低，与对照相比有极显著差异(P<0 .01)。说明通过人工喂食dsMsCYP1能够引起高粱蚜体内MsCYP1基因的RNA干扰，导致基因表达量明显降低。

实施例四、人工喂食后高粱蚜表型检测

高粱蚜蜜露量实验：人工喂食dsMsCYP1的高粱蚜放到培养皿中（皿中铺上一层用水浸湿的滤纸），并放入2 cm的高粱苗茎秆，两天后，取下滤纸，用0.1%的茚三酮染色，ImageJ计算染色面积。每次3头虫，重复5次。结果如图3所示，喂食dsMsCYP1后的高粱蚜蜜露量明显减少。说明dsMsCYP1通过抑制MsCYP1基因的表达量，进而影响高粱蚜的取食。

高粱蚜繁殖率实验：高粱蚜分两组，人工喂食dsGFP和人工喂食dsMsCYP1，喂食24h后，放回高粱苗BTx623上。每次10头虫，重复5次。结果如图3所示，人工喂食dsMsCYP1后高粱蚜的产蚜量从喂食第4天开始一直显著性低于人工喂食dsGFP的高粱蚜，说明dsMsCYP1能够抑制高粱蚜的繁殖。

实施例五、高粱蚜MsCYP1基因表达载体的构建

以含有MsCYP1基因的质粒作为模板，用高保真酶KOD-FX-Neo（TOYOBO，日本）及引物EMsCYP1-F和EMsCYP1-R（下划线标注的区域为构建载体的接头序列）扩增MsCYP1基因的ORF序列。

F：5’-AGATCCAGTGGGATCCATGGCGTCCACCACGTTTCG-3’ ；

R：5’-TTATAGTCAAGCTTGGTACCACTCAATTGTCCACAATT-3’ 。

PCR扩增完成后，利用In-Fusion克隆试剂盒（TaKaRa，日本），将该基因连入载体pHZ-206（带有Flag标签）上构建重组质粒MsCYP1-Flag，然后将其转化至DH5α大肠杆菌菌株，挑单克隆，PCR鉴定阳性克隆并送测序，保存测序正确的重组质粒。

实施例六、高粱蚜MsCYP1基因过表达后的高粱细胞免疫功能验证

结合玉米原生质体制备方法（Coy等. Protoplast Isolation and Transfectionin Maize. In: Wang, K., Zhang, F. (eds)Protoplast Technology. Methods inMolecular Biology. 2022. 2464. ），优化高粱原生质体制备，具体如下：选用在1/2 MS培养基上生长14 d的高粱幼苗，取幼茎切成0.5 cm的小段，放入酶解液中（10 mM MES-KOH，0.6 M D-mannitol，1.5% w/v Cellulase R-10，0.75%w/v Macerozyme R-10，0.1% w/vBSA，1 mM CaCl₂），28 ℃，80 rpm，酶解4 h，收集高粱原生质体。利用高粱原生质体瞬时转化体系将实施例五中的重组质粒MsCYP1-Flag导入高粱原生质体中，使高粱原生质体表达重组蛋白MsCYP1-Flag，以GFP-Flag作为对照。转化后，在28℃下培养16 h，提取高粱原生质体蛋白进行western blot检测，结果如图4所示，高粱蚜MsCYP1蛋白在高粱细胞中能够稳定表达。随后同样利用原生质体转化体系过表达高粱蚜MsCYP1基因和对照GFP基因，转化培养16 h后，加入0.04%的几丁质处理8 h，收集原生质体细胞，利用过氧化氢含量试剂盒（科铭生物）测定过氧化氢含量，结果如图5所示，几丁质处理以后，表达MsCYP1蛋白的原生质体过氧化氢含量显著下降，说明高粱蚜MsCYP1基因能够抑制高粱细胞免疫反应。

尽管已描述了本发明申请的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明申请范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明申请进行各种改动和变型而不脱离其发明构思之精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.抑制核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示高粱蚜基因MsCYP1表达的dsRNA，其特征在于，其为由SEQ ID NO .3所示序列和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。

2.一种生物材料，为含有权利要求1所述dsRNA的重组DNA、表达盒、质粒载体、病毒载体或工程菌。

3.权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述生物材料在如下（1）～（5）任一项中的应用：

（1）防治高粱蚜或制备防治高粱蚜的产品；

（2）降低高粱蚜存活率或制备降低高粱蚜存活率的产品；

（3）抑制高粱蚜基因MsCYP1表达或制备抑制高粱蚜基因MsCYP1表达的产品；

（4）抑制高粱蚜取食和/或蜜露分泌或制备抑制高粱蚜取食和/或蜜露分泌的产品；

（5）抑制高粱蚜繁殖和/或高粱蚜生长或制备抑制高粱蚜繁殖和/或高粱蚜生长的产品。