CN116033911A

CN116033911A - 一种源自胎盘的细胞外囊泡的抗炎症抗病毒作用的组合物

Info

Publication number: CN116033911A
Application number: CN202080100527.5A
Authority: CN
Inventors: 文之淑
Original assignee: Teas Cell Biology Co ltd
Current assignee: Teas Cell Biology Co ltd
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2020-06-25
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-06-25
Also published as: KR20210157276A; KR20230112590A; WO2021225214A1; KR20210157370A; KR102355236B1; CN116033911B; EP4197548A4; EP4197548A1; US20230107241A1; KR20250070017A; KR102317052B1; JP7486209B2; JP2022534844A

Abstract

本发明涉及一种源自胎盘的各种物质的种类及其作用，即包括源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle，EV)及源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的间充质干细胞(placental mesenchymalstem cell，pMSC)及由此衍生的细胞外囊泡(EV)以及在所述EV中包含的miRNA和cargo在内的各种生物分子的种类及其作用，通过本发明证实了，所述EV中含有的miRNA不仅能够有效地降解冠状病毒的RNA基因组，从而不仅具有直接的抗病毒作用，而且EV自身具有的各种生物分子的抗炎症功效，从而能够间接地预防及治疗各种病毒感染症。

Description

一种源自胎盘的细胞外囊泡的抗炎症抗病毒作用的组合物

技术领域

本发明涉及一种源自胎盘的各种物质的种类及其作用，即包括源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle，EV)及源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的间充质干细胞(placental mesenchymalstem cell，pMSC)及由此衍生的细胞外囊泡(EV)以及在所述EV中包含的miRNA和cargo在内的各种生物分子的种类及其作用，通过本发明证实了，所述EV中含有的miRNA能够有效地降解冠状病毒的RNA基因组，从而不仅具有直接的抗病毒作用，而且EV自身具有的各种生物分子的抗炎症功效，从而能够间接地预防及治疗各种病毒感染症。

背景技术

胎盘及脐带、脐带血是分娩时可以获得的源自胎儿的组织及干细胞，特别是胎盘，其从母体子宫脱落而产生的副产品，具有连接胎儿和母体的作用。

关于胎盘及脐带、脐带血一直以来被视为产后废弃的临时器官。但是，最近被研究人员发现，胎盘的不同部位存在间充质细胞、脱落膜(decidua)细胞、羊膜(amnion)、上皮细胞(endothelial cells)等多种细胞。

据悉，胎盘及脐带、脐带血中存在必需氨基酸、褪黑素、RNA及DNA等核酸成分、抗氧化酶SOD(superoxide dismutase)、透明质酸(hyaluronic acid)、抗氧化剂、细胞因子、胰岛素样生长因子(insulin-like-growth factor)、表皮生长因子(EGF、epidermal growthfactor)及衰老细胞激活因子(SCAF，senescent cell activating factor)等。

据悉，胎盘及脐带、脐带血富含传递给胎儿的营养成分，并具有防止母体免疫系统攻击胎儿的免疫抑制功能。

通常胎盘及脐带、脐带血用于母体或胎儿的诊断后被废弃掉，但是最近从多方面进行研究，以便将胎盘的上述特性能够应用于医疗领域。

在医疗领域，将人类胎盘水解而制造的药剂以注射安瓿的形式销售等，利用胎盘的营养成分开发了各种产品，但是从源自胎盘的细胞外囊泡(EV)以及其含有的各种生物分子，尤其是从miRNA的角度对胎盘所进行的研究可以说寥寥无几。

另外，到目前为止进行的临床实验中，以往的病毒治疗剂副作用强，因此很难给轻症患者开处方，或者很难使用高容量抗病毒药物来进行治疗，以达到抗病毒药物的效果。

因此，有必要开发更多的病毒特异性药物，从而克服现有抗病毒药物的副作用问题。

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的是为了解决上述现有技术的问题而提供一种抗炎症抗病毒作用的组合物，该组合物是通过特定包括源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle，EV)及源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的间充质干细胞(placentalmesenchymalstem cell，pMSC)及由此衍生的细胞外囊泡(EV)以及在所述EV中包含的miRNA和cargo在内的各种生物分子(cargos)并对其进行了分析。

本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗频繁发生变异的冠状病毒的组合物，该组合物与在冠状病毒的基因组中的突变较少的3′UTR部位结合。

用于解决问题的方法

本发明的一个方面提供了一种无细胞组合物(cell-free composition)，其包括至少一种载体、赋形剂或稀释剂，还包括从胎盘、脐带或脐带血中提取的生物分子。

在本发明中，所述生物分子选自蛋白质、肽、抗原、抗体、蛋白质片段、DNA、RNA、细胞、微囊泡和其他生物颗粒中的任一种以上，优先地包含细胞外囊泡和miRNA，但并不限于此。

在本发明中，所述载体、赋形剂或稀释剂可以是乳糖、糊精、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、合金欢树胶、藻蛋白酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸三钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。

本发明的组合物的特征在于，其无细胞。静脉注射干细胞时，会引起栓塞症、血液凝集及免疫反应。因此，在此方面本发明具有优势。

具体地，所述生物分子可以是直接从胎盘、脐带、脐带血中获得的EV以及源自胎盘、脐带、脐带血的间充质干细胞(placental mesenchymal stem cell，pMSC)衍生的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle，EV)，所述生物分子是77个被包含在组织衍生的EV、组织提取物衍生的EV和pMSC-EV中的miRNA，可以选自由miR-92a-3p、miR-26a-5p、miR-23a-3p、miR-103a-3p及miR-181a-5p等组成的组中的一种以上，但不限于此。

具体地，所述77个miRNA分别为hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-484、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-3615、hsa-miR-320c、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-99a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-1249-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-652-3p以及hsa-miR-424-3p。

另外，本发明的无细胞组合物作为所述生物分子，可包含细胞外囊泡和/或77个种的miRNA中的一种以上，但不限于此。

在本发明中证实了，微型RNA(miRNA)是由碱基序列长度18～25个的核苷酸(Nucleotide)组成的微小的非编码RNA，miRNA通过有效降解SARS-CoV-2的RNA基因组以抑制病毒。

本发明人证实了miRNA直接与SARS-CoV-2的3′UTR相互作用，且在组织-EV(tissue-EV)、组织提取物EV(tissue extract EV)和MSC-EV中存在的77个miRNA，其中选择了与SARS-CoV-2的3′UTR结合的18个miRNA，并且在18个miRNA中又选择了表达水平较高且结合更强的前5个miRNA。

具体地，所述18个miRNA分别为hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-424-3p及hsa-miR-23b-3p，所述5个miRNA分别为miR-92a-3p、miR-103a-3p、miR-181a-5p、miR-26a-5p以及miR-23a-3p。

在本发明实施例中证实了，上述5个miRNA均从组织-EV(tissue-EV)和组织提取物EV(tissue extract EV)中表达，从而能够成功抑制SARS-CoV-2。

此外，存在于组织-EV(tissue-EV)、组织提取物EV(tissueextract EV)和MSC-EV中的中胚层衍生的细胞外囊泡(pMSC-EV)含有许多已知的可预防致命性的细胞因子风暴且具有良好再生作用的抗炎症因子，通过实验结果证实了EV在已知为表达ACE2受体的几个宿主细胞中调节炎症环境以抑制炎症反应。

本发明的另一方面提供一种含有所述无细胞组合物的抗病毒组合物。

具体地，所述病毒可以选自由冠状病毒、HIV、流感、肠道病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)、丙型肝炎病毒和牛病毒性泻病毒(Bovine viral diarrheavirus)组成的组中的一种以上，更具体地，可以是新型冠状病毒(NMC-nCoV02)或SARS-CoV-2，但不限于此。

本发明的另一个方面提供了一种用于预防或治疗病毒感染的药学组合物，其含有抗病毒组合物。

具体地，所述病毒可以是冠状病毒，但不限于此。

所述药学组合物可进一步包含用于常规的药学组合物的配制的载体、赋形剂和稀释剂。

所述载体、赋形剂或稀释剂可以例举乳糖、糊精、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、合金欢树胶、藻蛋白酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸三钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油，但不限于此。

另外，所述组合物可以以酸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气溶胶等口服制剂，或者以注射液、鼻喷剂(nasal spray)、吸入液体、乳液(cream)、凝胶、软膏(ointment)、栓剂或爽肤水(lotion)形态的非口服制剂制成制剂来使用。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、酸剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂可以在所述miRNA组合物及其分馏物中混合至少一种以上的赋形剂混合而配置，这里的赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等。除了所述赋形剂以外，还可以使用硬脂酸镁和滑石等润滑剂。

用于口服给药的液相制剂可以使用悬浮剂、内容液剂、乳剂、糖浆剂等，除单纯稀释剂水、液体石蜡以外，还可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。

用于非口服给药的制剂可以使用灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂、栓剂。所述非水溶剂和所述悬浮剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油，以及油酸乙酯等可注射的酯。作为所述栓剂的机制，可以使用witepsol、聚乙二醇、聚山梨酯(tween)61、可可脂(kakaozy)、月桂脂、甘油明胶。

含有所述抗病毒组合物的药学组合物，可以给受试者给药药理学有效剂量。所述"药理学有效剂量"是指以可适用于医学治疗的合理的受益/风险比来治疗疾病所必要的充分的量，有效的剂量可以根据患者疾病种类、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径及排出率、疗程、同时使用的药物等因素以及在医学领域中已知的因素来定夺。

所述药学组合物可以以单独治疗剂来给药，也可以与其他治疗剂一并给药，也可以与目前使用的治疗剂依次或同时给药，可单次或多次给药。鉴于上述的各种因素，优选地，能够以最小的量来获得最大效果的剂量给药，从而不产生副作用。作为本领域普通技术人员能够容易地定夺这一用量。

本发明的用于治疗的组合物的优选的剂量可以根据状态和体重、疾病的程度、药物类型、给药途径和疗程而异，即便如此，作为本领域普通技术人员而言，可以选择合适的剂量。优选地，本发明的用于治疗的组合物的给药量是，以EV的量为基准，每日给药后使EV的数量达到10²至10¹⁶个，更优选地，使EV的数量达到10⁵至10¹²个即可，但不限于此。

此外，以miRNA的量为基准，每日为0.0001至1000mg/kg，为了使效果更加有效，优选地以0.01至100mg/kg给药。给药时，可以每日一次，也可以每日分多次给药。所述剂量和给药次数并非从某种层面限定本发明的范围。

本发明的另一个方面提供一种用于预防或改善的食品组合物，其含有所述抗病毒组合物。

本发明的抗病毒组合物包括细胞外囊泡(EV)，其特征在于，即使通过口服摄取，也可以将EV和miRNA传递到体内，从而具有优秀的预防和治疗病毒感染症的效果。

在本发明中，食品是指含有一种或一种以上营养素的天然物或加工品，优选地指经过一定程度的加工工艺后可供人类或动物直接食用的状态，从通常的意义来讲，食品包括饮料、食品添加剂和饮料添加剂。

本发明的食品例如各种食品类、饮料、口香糖、茶等。所述食品，饮料、食品添加剂和饮料添加剂可采用常规的生产方法来制造。

在本发明中，饮料是指为了解渴或品味而饮用的所有饮品的总称，其包括保健功能饮料。所述饮料在其必需成分中，除了以规定的比率作为有效成分含有本发明的组合物以外，对其他成分没有特别的限制，可以像普通饮料一样，作为附加成分含有各种调味剂或天然碳水化合物等。

所述天然碳水化合物，例如单糖，葡萄糖、果糖等双糖，麦芽糖、蔗糖等聚糖，糊精、环糊精等常规的糖，木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。除此以外，作为调味剂，可以有利地使用天然调味剂(如索马甜、甜菊糖提取物(如莱苞迪苷A、甘草酸等)和合成调味剂(如糖精、阿斯巴甜代糖等)。所述天然碳水化合物的比率一般为每100毫升本发明的组合物约1至20克，优选地，可以是5至12克。另外，本发明的组合物可以进一步含有用于制造天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。

除此以外，本发明的食品组合物可以含有各种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成风味剂和天然风味剂等风味剂、着色剂、增量剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸盐、海藻酸盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独或组合来使用。

发明效果

本发明提供一种组合物，该组合物是包含源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的EV及源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的间充质干细胞(pMSC)及由此衍生的细胞外囊泡(EV)以及在所述EV中含有的miRNA以及包含这些的组合物，使用该组合物来开发预防或治疗冠状病毒的治疗剂时，具有如下的效果：1)本发明的miRNA与冠状病毒基因组的3′UTR高特异性结合，因此有望几乎不会对正常组织及内脏器官产生副作用，2)病毒基因的3′UTR是一个几乎没有突变的高度保守的位点，因此即使在频繁突变的RNA病毒中，也很少受到突变的影响，因此可普遍适用于RNA病毒，3)EV中存在的各种生物分子还具有使损伤的组织再生的作用和免疫调节作用等，因此，使用该组合物的治疗剂会使效果更加显著。

另外，本发明的组合物除了具有上述的直接的抗病毒作用以外，由于EV内部可以包含通过与炎症相关的基因的相互作用来抑制炎症的各种生物物质和miRNA，因此具有能够缓解病毒感染引起的症状的间接效果。

也就是说，本发明的组合物其特征在于，除了具有直接的抑制病毒的效果以外，还具有可抑制病毒感染引起的炎症和细胞因子风暴的间接治疗效果，因此，可以用于病毒感染预防剂。

本发明的效果并不限于上述的效果，理应理解为本发明的效果包括：从本发明的说明书或权利要求中记载的发明的构成中可以推断的所有的效果。

附图说明

图1涉及一种对SARS-CoV-2病毒的组织-EV(tissue-EV)、组织提取物EV(tissueextract EV)、MSC-EV及其含有的miRNA的抗病毒作用机制，直接的抗病毒作用是miRNA直接结合至SARS-CoV-2的3′UTR、5′UTR或编码序列等区域，从而对SARS-CoV-2RNA进行下调。间接的抗病毒作用是，通过EV中包含的miRNA和蛋白质来调节炎症性mRNA的表达，且通过这种调节来再生受损的组织，并通过它们的miRNA和蛋白质来调节促炎症环境来抑制细胞因子风暴；

图2是pMSC-EV特性的观察结果(A:pMSC-EV是通过荧光显微镜检测到的CD63阳性。B:pMSC-EV的平均大小为在1ml提取物中直径为121.8nm。C:代表性TEM图像。D:对CD81、CD9、膜联蛋白(annexin)A2和HSP70的pMSC-EV的蛋白质印迹结果)；

图3是本发明的miRNA可与SARS-CoV-2的3′UTR结合的潜在结合位点；

图4是实施qPCR分析结果，用以确认本发明的miRNA是否存在于EV中；

图5是实施荧光素酶分析结果，用以确认本发明的EV是否具有直接抗病毒作用(A:PCR片段被克隆到荧光素酶ORF和合成聚(A)序列之间的荧光素酶报告质粒中，以此制备重组质粒。B:在以重组质粒来转染的SK-N-BE(2)C细胞中的相对荧光素酶活性)；

图6是本发明的miRNA对多种冠状病毒是否产生效果的证实结果(A:5个冠状病毒的3′UTR和miRNA的结合位点。B:本发明的miRNA与其他病毒的相互作用)；

图7是用于确认EV和miRNA的间接抗病毒效果的实验方法的示意图；

图8是对以EV和miRNA处理BEAS-2B(胃肠道上皮细胞)后的效果证实结果(A:EV，B:miRNA)；

图9是对以EV和miRNA处理LL-24后的保护和修复效果的证实结果(A:EV，B:miRNA)；

图10是对MEF(成纤维细胞)和BV2(微胶质细胞株)的保护和修复作用的证实结果，将其结果分别在图10A和图10B所示；

图11是对以EV处理神经细胞M2后的炎症相关因子的表达水平的证实结果；

图12是对以PKH26标记的EV处理上述各细胞株前后的状态进行拍摄的图；

图13是本发明的EV和miRNA使用直接和间接的所有途径治疗或改善病毒以及病毒感染症状的过程的概念图。

最佳实施方式

下面，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，下面的实施例只是为了举例说明本发明，因此，本发明不应被下面的实施例而限定。

实验方法及材料

获取胎盘提取物及EV

获取无内科、产科或者外科并发症的人类胎盘。将每个胎盘小心地切开，并用PBS洗涤数次，然后使用机械进行粉碎，在37℃下用0.5％胶原酶IV(Sigma，St.LouisMO，USA)降解(Digest)30秒，从而得到胎盘提取物，并获取了EV。

细胞株及病毒

使用了非洲绿猴肾脏上皮细胞的细胞株即绿猴肾脏细胞(Vero cell)。细胞是在DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium，Gibco，美国)中培养。

2020年2月初，用从新型冠状病毒国内感染患者的呼吸道标本中分离出来的新型冠状病毒(NMC-nCoV02)和SARS-CoV-2病毒来感染了绿猴肾脏E6细胞，并根据细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)通过50％的组织培养感染容量(TCID50)来证实了病毒滴度(titer)。此外，所有关于病毒的实验均在满足生物安全水平-3(BLS-3)的实验室里进行。

细胞毒性分析

通过MTT-assay评价了EV对绿猴肾脏细胞的细胞毒性效果。

具体地，在96孔板中，用磷酸盐缓冲盐(PBS)洗涤绿猴肾脏细胞的单层，并处理了连续量的EV。绿猴肾脏细胞的1x104是在5％CO2和37℃下用96孔板培育了24小时，并使用读板器在波长500nm至600nm处测量了吸光度。

细胞病变效应(CPE)的抑制作用分析

将绿猴肾脏细胞1x104分别注入到96孔中，将含有EV的培养液50μL，含有SARS-CoV-2病毒的50μL在37℃下处理了72个小时。用病毒接种的细胞用作对照组。在显微镜下用100％CPE观察被感染的细胞。细胞是用1％结晶紫来染色。在EV处理的细胞中计算CPE的百分比(阳性孔/总孔数)，并拍摄了其结果。

对纳米颗粒跟踪分析

EV在胎牛血清(PBS)中最终稀释至1毫升，这是在ZetaView纳米颗粒示踪成像显微镜(ParticelMetrix，Inning，德国)中检查到的。选择软件厂商对EV或纳米颗粒的基本设置，每次测量扫描了3次。

对EV的荧光成像方法

使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)来对EV进行了生物素化(biotinylated)。

经过生物素化的EV被加载到Zeba spin desalting columns 7K MWCO(ThermoScientific)中，以去除剩余的自由生物素。

为了染色，将20μL的已被生物素化的EV添加到在涂覆链霉亲和素的玻璃载玻片(Arrayit Corporation)上画的圆圈内，30分钟后，用BD Fix Perm(BD生物科学)固定处理EV，用0.2％BSA-PBS来封闭。

EV的免疫荧光染色是使用抗人类CD63(1:100；美国德克萨斯州达拉斯的圣克鲁斯生物技术公司(SC-5275)在室温下进行2小时，然后在室温下与Alexa Fluor488缀合的二抗孵育了1小时。

透射电子显微镜(TEM)成像方法

将含有0.5μg蛋白质的稀释样品的5ml等分样品滴在亲水网格上。几分钟后，用蒸馏水洗涤网格，并与2％醋酸双氧铀对照20秒。在80kV下运行的JEM-1010显微镜(JEOL)下获得了图像。

蛋白质印迹

将EV溶解于含有蛋白酶混合物片剂(Roche)和磷酸酶抑制剂II和III(Sigma)的10×RIPA缓冲液中。使用BCA分析法(Thermo Fisher Scientific)测量了蛋白质浓度。对每个样品的30μg等分样品进行10％SDS-PAGE，然后进行了蛋白质印迹。

且在TBS-T中10％脱脂乳来阻断1小时。从以下供应商那里获取了针对下列蛋白质的抗体。CD81(1:1，000，Santa Cruz Biotechnology)，Alix(1:1，000，Santa CruzBiotechnology)，CD9(1:500，Santa Cruz)，and GAPDH(1:10，000，sc-32233，Santa CruzBiotechnology)。

将一抗稀释在TBS-T中，并在4℃下印迹中孵育过夜，然后与二抗孵育1小时。使用增强化学发光HRP底物(enhancedchemiluminescentHRP亚基，Millipore)检测免疫反应性。

培养细胞

人肝癌细胞株HepG2和小鼠微胶质细胞株BV2购自AmericanTypeCultureCollection(ATCC、Manassas、CA、USA)。将两种细胞株均在补充10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青霉素/链霉素(P/S)的生长培养基(DMEM；Gibco，Carlsbad，CA，USA)中在37℃和5％ CO₂下培养。两种细胞株均每隔2至4天传代一次。

正常肺细胞株LL24也从ATCC获得。将LL24细胞在补充10％FBS和1％P/S的RPMI-1640培养基(Gibco/Life Technologies，USA，NY，USA)中在37℃和5％CO₂的加湿气氛中生长。每三天进行传代。

将MEF细胞从-13.5天的小鼠胚胎中分离出来。将MEF细胞在补充10％FBS、1％抗生素抗真菌剂(250ng/mL两性霉素、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)、8μg/ml酪氨酸(Sigma)和15μg/mL庆大霉素(Gibco)的DMEM培养基中在37℃和5％ CO₂下培养。MEF细胞每隔3天传代一次，传到2至5代时使用。

将形质转化的人支气管上皮细胞株BEAS-2B在5μg/mL庆大霉素(Gibco)和被定义为无血清1X的角化细胞SFM(Gibco)中在37℃和5％ CO₂下培养。培养基每2-3天更换一次，细胞每4-5天传代一次。

在妊娠第10周、第12周和第14周时，获得妊娠期母亲的同意下从人类胎儿组织中分离神经元。将神经元在补充B27补充剂(Gibco)50μg/mL、庆大霉素(Gibco)、人bFGF、人EGF20ng/mL(Peprotech)、生育酚和醋酸生育酚(Sigmaaldrich)1μg/mL的DMEM/F12(Gibco)培养基中在37℃和5％ CO₂和3％ CO₂下培养。

在EV中PKH26标记处理

EV用PKH26红色荧光细胞链接试剂盒(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kitfor General Cell Membranes，Sigma-Aldrich)标记，用来标记常规细胞膜。具体地，将EV颗粒以200μg/mL重新悬浮在稀释剂C中，然后与染料溶液(2μL的PKH26乙醇染料和500μL的稀释剂C)以1:1混合5分钟。接下来，加入等同体积的1％牛血清白蛋白(BSA)，从而使其结合过量染料，并在生成的溶液中使用7K MWCO Zeba脱盐离心柱(7K MWCO Zeba SpinDesalting Columns，Thermo Fisher Scientific)去除了过量染料。

随后，将样品在-80℃下储存。

LPS及EV处理

为了实验，用96孔或6孔板(Nunc、Roskilde、Denmark)的孔以相同的密度接种细胞。为了证实修复作用，以LPS(MEFs和BV2:0.5-2μg/mL、HepG2和LL24:2或4μg/mL)刺激细胞，然后以EV处理24小时。

为了证实保护作用，将细胞以EV预处理24小时，然后以LPS刺激细胞24小时。孵育24小时后，将细胞适用于MTT分析或RNA提取上。

miRNA转染(transfection)

为了转染miRNA，将6×10⁴至2×10⁵的细胞接种到24孔板中，用20nM的miRNA(hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-103-3p、and hsa-miR-181-5p)(生物体)进行感染，Pre-miR miRNA阴性对照组则用Lipofectamine 3000代替。

MTT分析

用MTT分析评价了EV的细胞毒性。简而言之，将细胞接种到96-孔板中，用指定浓度的EV处理，并以LPS刺激24小时。去除培养上清液后，将生成的深蓝色结晶用DMSO溶解。在570nm处测量了吸光度。

RNA提取和定量PCR(qPCR)

总RNA从BV2、MEF、HepG2、LL24、BEAS-2B和神经细胞中提取，以用于qPCR，并从EV中提取了miRNA。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取了总RNA。

使用cDNA试剂盒(iNtRON)从1μg总RNA中合成了cDNA。使用总外泌体RNA和蛋白质分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)提取miRNA，然后使用miScript II RT(Qigen)进行了逆转录。

为了PCR和qPCR，设计了与炎症相关的基因的引物。反应混合物(总体积为20μL)含有引物混合物10μM、具有低ROX的SYBR-Green(Enzynomics)、不含有核酸酶的水(深色，非离子)和cDNA 2μL。条件如下:95℃下变性/活化步骤10分钟，然后95℃下15秒、56℃下30秒、72℃下20秒，以此循环重复了40次。在StepOne Real-Time PCR仪器(Applied Biosystems)中进行了反应。基因表达的定量基于每个样品的C_T值。

转染和报告分析

SARS-CoV-2基因组的3′UTR的208bp片段是通过仿生方法合成。将3′UTR片段用XbaI降解，在pGL3-对照组(Promega)中，将萤光插入到荧光素酶基因的下游，以获得pGL3covi-3UTR_Luc。

通过测序证实了所有的构建体。将人神经胚细胞瘤SK-N-BE(2)C细胞在补充10％FBS的DMEM中维持。所有培养基均含有100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素。为了转染，在转染前1天将细胞在不含抗生素的DMEM中以1.2x10⁵个细胞/孔铺板到24孔板中。用脂质体2000(Invitrogen)进行转染。DNA总量为每孔0.5μg，作为内部对照组，其由pGL3covi-3UTR_Luc0.2μg和pRSVβgal 0.3μg组成。每个转染还含有标记的miRNA。转染后待24小时后，将源自各孔的细胞用100μL溶解缓冲剂(25mM三磷酸盐[pH7.8]、2mM DTT、2mM CDTA[1，2-二氨基环己烷四乙酸]、10％甘油和1％三酮X-100)进行溶解。加入相同体积的萤火虫荧光素酶底物，并使用光度计读板器测定荧光素酶活性，并对β-半乳糖苷酶活性进行了规范。

RNA测序和数据处理

使用从八种不同条件的hpMSC培养基和两种胎盘组织提取物获得的细胞外囊泡(EV)进行了小RNA测序分析。测序是在北京基因组研究所(BGI，Shenzhen，China)的BGISeq-500测序仪上进行的。使用subread aligner将引物与人类参考基因组(GRCh38)进行比对，并为了获得miRNA引物数量使用了featureCounts工具。对miRNA读板次数进行标准化，并使用edgeRR包过滤掉低表达miRNA。将每个miRNA的表达转化为CPM(counts per million)。使用qrqcR包进行读板质量控制，并使用sRNAtoolbox获得小RNA频率的分布。

miRNA靶标预测和功能分析

为了查找3′UTR与miRNA结合位点，使用了PITA工具(Kertesz外，2007)。

SARS-CoV-2全基因组序列(NC_045512.2)是从NCBI序列数据库(O′LearyO′Learyet al，2016)中获得，3′UTR序列是从SARS-CoV-2全基因组中提取的。

我们使用基本设定值的PITA tool来预测miRNA的结合位点。

新的miRNA结合位点是通过miRDB自定义预测工具(Chen and Xiaowei，2020)预测的。

为了证实miRNAs的生物学功能，从miRTarBase(Huang et al.2020)获得已通过实验验证的miRNAs的靶标，分析时排除了低于1％的比例的miRNA。

为了证实miRNA的生物学功能，使用DAVID Bioinformatics Resource 6.8(Huanget al.，2009)进行了GO term和KEGG pathway分析。

功能分析结果是使用Cytoscape3.8和PathviewR包来实现可视化显示。

关于ACE2表达分析

人类组织和细胞株表达数据是从人类蛋白免疫组化表达数据库(Human ProteinAtlas database)获得的(Uhlén et al.,2015)。使用表达数据分析了各细胞或组织类型的ACE2表达。

关于miRNA的结合位点的保守区域分析

为了分析SARS-CoV-2中与miRNA结合位点的保守区域，从NCBI参考序列数据库获得3′UTR序列，并使用了与SARS-CoV-2相关的病毒3′UTR序列。

具体地，使用了SARS冠状病毒(NC_004718.3)、SARS-CoV-2(NC_045512.2)、SARS冠状病毒BJ01(AY278488.2)、蝙蝠SARS冠状病毒HKU3-1(DQ022305.2)、蝙蝠SARS样冠状病毒SL-CoVZC45(MG772933.1)和蝙蝠SARS样冠状病毒SL-CoVZC2129.1(MG)。

使用MUSCLE tool(Edgaretal.，2004)对冠状病毒的3′UTR测序进行比对，在肌组织(MUSCLE)分析时使用了基本值。

统计分析

统计分析是先使用方差分析(ANOVA)，然后在R中采用Tukey HSD事后检验进行的。热图是，在hpMSC-EV中表达miRNA的log2-CPM，并使用gplotsR包生成的(Warnesetal.，2015)。关于GO术语分析和KEGG途径分析的P值，为了使用Benjamini-Hochberg法进行多重比较，对此进行了修改。数据是以平均值的均值±标准误差给出的，p值或调整后的p值<0.05被视为是显著的。

以下，参照附图详细说明通过上述实验方法证实的本发明的效果。但是，下面的实施例只是为了帮助对本发明的理解，因此，本发明不应被下面的实施例而限定。

实施例1胎盘-EVmiRNA对SARS-CoV-2病毒的病毒抑制机制

图1是胎盘-EVmiRNA对SARS-CoV-2病毒的抗病毒作用机制。针对SARSCoV-2的直接抗病毒机制是通过miRNA与病毒的3′UTR、5′UTR或编码区直接结合来诱导SARS-CoV-2RNA的下调以此实现的。此外，作为间接的治疗效果，其包括调节炎症性mRNAs的表达，以此抑制细胞因子风暴。

也就是说，本发明证实了源自间充质干细胞(MSC)的EV及其含有的miRNA和蛋白质分子能够再生受损的组织，并且调节miRNAs和抗炎症环境。

从pMSC中分离出的EV对常见的EV标记CD63呈阳性(图2A)，EV的大小是通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透视电镜检查(TEM)来分析的。

通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量的外泌体的流体力学直径为121.8nm(图2B)，代表性的TEM图像如图2C所示。通过EV标记的蛋白质印迹分离的EV的附加特征呈现出典型的EV标记，例如CD81、CD9、annexinA2和HSP70(图2D)。

实施例2筛选与SARS-CoV-2病毒结合的miRNA

根据病毒基因组可以通过人类miRNA用作靶向的事实，本发明人证实了EV中的miRNA是否可以与SARS-CoV-2的3′UTR相互作用。

在SARS-CoV2的3′UTR中含有靶向miR-92a-3p、miR-26a-5p、miR-23a-3p、miR-103a-3p和miR-181a-5p的结合位点。

具体地，对SARS-Cov-2的3′UTR测序进行比对，并使用MicroInspector软件进行序列分析，其结果预测如下：通过PITA软件共有18个miRNA靶向SARS-Cov-2的3′UTR(表1)，27个miRNA结合到SARS-CoV-2病毒的整个基因组位点(表2)。

【表1】

所述表1是18个靶向SARS-Cov-2的3′UTR的miRNA的列表。

【表2】

表2是预测与SARS-CoV-2病毒整个基因组位点结合的27个miRNA的列表。所述表2中的表达量(expression％)是通过相应的miRNACPM/总miRNACPM计算的，评分(score)越高，意味着结合的可能性越大，根据参考文献，评分高于80分时，意味着可以结合。

如下表3是SARS-CoV-2基因组内结合位点的信息和结合预测结果。五个miRNA(miR-92a-3p、miR-26a-5p、miR-23a-3p、miR-103a-3p、miR-181a-5p)是基于热力学能量评分和使用PITA和miRDB两种预测工具的评分中获得高分而被筛选的。

【表3】

使用PITA预测了最终选定的miR-92a-3p、miR-26a-5p、miR-23a-3p、miR-103a-3p和miR-181a-5p5个miRNA可能与SARS-CoV-2的3′UTR结合的潜在结合位点(图3A、3B)。使用PITA，获得了这些miRNAs各自的总自由能。例如，针对3′UTR的miR-181a-5p的结合能量为-microRNA靶向杂交能量，即18.7kcal/mol，这暗示了miRNA3′UTR的结合将会自发地进行。低结合热力学能(kcal/mol)表示着更强的结合。

然后，为了证实在EV中是否存在上述5个miRNA，进行了qPCR分析(图4)。其结果证实，EV中的miRNA以miR-92a-3p、miR-181a-5p、miR-26a-5p、miR-23a-3p和miR-103a-3p的顺序呈现出高表达。也就是说，miR-92a-3p和miR-181a-5p的表达明显高于其它，其顺序也跟预测值的顺序相同。这些结果表明，由于EV含有五个miRNA，因此其本身也可以用作针对SARS-CoV-2的治疗剂。

实施例3证实EV和miRNA的直接抗病毒作用

为了证实上述实施例2中选定的每个独特特征的miRNA或五个miRNAs是否可以直接与SARS-CoV-2基因组相互作用，进行了荧光素酶分析。

进行荧光素酶-报告分析，以此证实了个别特异性的miRNA或五个miRNA是否分别直接跟SARS-CoV-2基因组相互作用。

将PCR片段克隆到荧光素酶ORF和合成聚(A)序列之间的荧光素酶报告质粒中。将重组质粒命名为pGL3 SARS-CoV-3′-UTR_Luc(图5A)。随后将重组质粒转染到人神经母细胞瘤SK-N-BE(2)C细胞中，并在转染后48小时测定荧光素酶活性。

如图5B所示，与使用psi-control空载体转染的细胞相比，用重组质粒转染的SK-N-BE(2)C细胞中的相对荧光素酶活性明显减少(ps<0.0001)。

具体地，当冠状病毒的3′UTR用五个miRNA或五个miRNA以各自的表达载体共转染到DF-1细胞时，相对荧光素酶活性下调，通过这一结果证实了psi-59UTR的荧光素酶活性显著下降。

上述实验结果意味着，miR-92a-3p、miR-26a-5p、miR-23a-3p、miR-103a-3p和miR-181a-5p与SARS-CoV-2的3′UTR结合，从而诱导显著沉默。

基于这一结果，证实了五个miRNA均与SARS-CoV-2的3′UTR直接结合，并证实了，选自由miR-92a-3p、miR-26a-5p、miR-23a-3p、miR-103a-3p和miR-181a-5p组成的组中的一个以上的miRNA可以降解SARS-CoV-2病毒基因组，从而能够抑制SARS-CoV-2感染。

实施例4对多种冠状病毒及其他病毒的直接抗病毒能力进行证实

为了证实3′UTR序列会在冠状病毒家族中保守，miRNA靶位点会在所有冠状病毒中保守的这一假设，随机选择了5个冠状病毒，并使用MUSLCE工具比较了3′UTR区域的测序。

如图6A所示，证实了：5个冠状病毒的3′UTR大多数是保守的，因此，其变异程度不大，特别是预测与5个miRNAs结合的结合位点(用红框标记)也均保守很好。

也就是说，鉴于对多种冠状病毒的3′UTR的证实结果显示，在3′UTR几乎不产生突变，miRNA的结合率高的这一点，不妨预测，五个被选定的miRNA可能具有普遍的抗病毒能力，从而能够适用于因突变而新产生的病毒上。

据悉，EV的多个miRNA与其他病毒相互作用(图6B)。

具体证实了，miR-150-5p、miR-223-3p和miR-29-3p与HIV相互作用，从而抑制病毒翻译和最后的潜伏性T细胞。

据悉，miR-23b-3p会阻断肠道病毒71的翻译，而Let-7c-5p可降低对流感病毒重要的基质蛋白的表达。

miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-23a-3p、miR-23b-3p和miR-378a-3p降解猪繁殖与呼吸综合征病毒。

miR-122-5p和let-7c-5p分别抑制丙型肝炎病毒和牛病毒性腹泻病毒。

也就是说，EV和EV中包含的多种miRNA通过与多种病毒和突变频率较低的3′UTR结合而产生抑制作用，这一结果暗示了EV可以用于针对多种病毒感染的常用治疗和预防治疗剂。

实施例5对EV和miRNA的间接抗病毒作用进行证实

感染包括冠状病毒在内的呼吸道系统的病毒会渗透到表达ACE2受体的细胞中，从而导致细胞损伤。

由于ACE2受体主要存在于肝脏、肾脏、男性生殖器官、肌肉组织和胃肠道中，因此这些目标器官会被病毒受到损伤。在最近的临床研究中，大量患者出现肝脏损伤或器官损伤的情况，从而佐证了这一观点。

在中国武汉儿童医院重症监护室接受治疗的8名COVID-19患者中，有6名出现了C反应性蛋白质、降钙素原及脱氢酶增高。而且8名中有4名出现了肝功能异常。在这些患者中，3名患者出现了细胞因子风暴，而在重症患者中这种现象尤为严重。

另一项研究证明，651名患者中有74名患者(11.4％，平均年龄46.14岁)出现恶心、呕吐或腹泻等至少一种胃肠道(GI)症状，有10.8％的患者患有肝病。

此外，74名新冠肺炎患者中，29名患者(39.19％)出现高烧(38.5℃)，23名(31.08％)患者表示疲劳，8名(10.81％)患者出现呼吸困难，16名(21.62％)患者表示头痛。

从这些结果可以推断，ACE2受体在LL24(肺成纤维细胞)、BEAS-2B细胞(GI上皮细胞)和肝细胞中表达。此外，正如BrainAtlas数据库所证实的一样，ACE2在大脑中的表达水平尚未得到充分的研究，但是即使其实际表达水平较低，鉴于上述临床结果表明，我们预测大脑很可能是SARS-CoV-2的靶器官。类似地，ACE2在脑肿瘤细胞中高表达，这暗示了脑细胞可能是病毒的靶标。

因此，为了证实多种EV衍生的miRNA的间接抗病毒作用，以可能会被SARS-COV2而引起超敏反应的细胞为对象进行了实验，例如肝细胞、GI细胞和脑细胞。

具体实验方法和细胞培养方法等如前所述，简而言之，在细胞株中以EV和miRNA处理24小时后以LPS处理，从而证实了EV和miRNA的保护作用，反之，先以LPS处理24h后以EV和miRNA处理，以此证实了修复效果(图7)。

实施例6EV及miRNA的抗炎症及细胞因子风暴抑制作用

以BEAS-2B(胃肠道上皮细胞)、LL24(肺细胞株)、HepG2(肝癌细胞株)、MEF(成纤维细胞)、BV2(微胶质细胞株)和M2(神经元细胞)为对象，通过不同的LPS和EV处理对EV和miRNA的抗炎症和细胞因子风暴抑制作用进行实验，其结果如图8至图12所示。

以EV处理BEAS-2B(胃肠道上皮细胞)后，再以LPS处理，以此证实了保护作用，其结果图8A所示，结果证实：与炎症因子IL-1、IL-6、IL-8和TNF-a均未以EV处理的情况相比，相对表达显著降低。

此外，如图8B所示，分别处理5个miRNA后，以LPS处理，以此证实了保护作用，结果证实：处理miRNA181a时，IL-1、IL-6和IL-8的表达显著降低。

以EV处理LL-24时，对保护和修复作用进行了证实，其结果如图9A所示，结果证实：以EV处理时，炎症因子IL-1、IL-6和IL-8的表达均显著降低，保护和修复作用均优秀，尤其是修复作用极佳。

此外，如图9B所示，5个miRNA分别以LL-24处理后，以LPS处理，以证实保护作用，结果证实：处理miRNA181 a时，IL-6的表达显著降低到与对照组相同的水平。

对MEF(成纤维细胞)和BV2(微胶质细胞株)的保护和修复作用进行了证实，并将结果分别如图10A和10B所示，结果证实：MEF和BV2均因为EV处理而使炎症因子IL-1、IL-6和TNF-a显著降低。

对神经元细胞M2处理EV后的炎症相关因子的表达水平进行了证实，并将结果如图11所示，结果证实：只有IL-1呈显著效果。

图12是对用PKH26标记的EV处理上述各细胞株前后的情况进行拍摄的图，由此证实了EV与各细胞成功结合(fusion)的状态。

也就是说，综合上述结果可以证实：本发明的EV和EV中包含的miRNA单个或整体均表现出抑制炎症因子的表达的作用，因此不仅具有抗炎效果，而且具有抑制超敏反应的细胞因子风暴的效果。

实施例7EV及miRNA的病毒感染症治疗作用

本发明的EV和miRNA使用直接和间接的所有途径治疗或改善病毒以及病毒感染症状(图13)。

本发明人通过上述各种实验证实：源自胎盘、脐带、脐带血、胎盘的EV及从这些组织获得的干细胞(pMSC)以及由此衍生的EV不仅可以改善肺部的病理学损伤，还可以大幅改善其他类型的肺炎及病毒感染症。

特别是EV含有干细胞的再生因子，因此治疗肺炎时，其发挥与间充质干细胞相似的治疗机制，但是被认为更加安全。

具体地，静脉注射间充质干细胞可引起栓塞、血液凝集，而EV由于尺寸在200nm～10亿纳米之间，比干细胞更安全，且EV本身相较于干细胞具有更稳定、易储存、不转化成恶性或有害细胞、不易产生免疫反应等优点。

另外，通过本发明的实验结果证实：组织-EV(tissue-EV)、组织提取物EV(tissueextract EV)和pMSC-EV中的miRNA可以直接结合病毒基因组，抑制RNA病毒的转录，从而能够抑制病毒的增殖。

作为EV miRNAs的其他重要功能，存在于多种EV中的77个miRNA由于以刺激免疫反应的mRNA作为靶向，因此可以起到去除被病毒转录的RNA(Viral RNAs)的作用，从而不仅具有直接的抗病毒作用，而且间接作用也非常强大。

另外，本发明的miRNA不仅与Viral RNA结合，还与促炎基因相互作用，以显著抑制炎症因子的表达，从而能够解决细胞因子风暴。

此外，由于本发明的miRNA具有上调IFN-α/β水平的作用，因此可以通过抑制IFN-α/β信号通路来抑制逃避宿主免疫反应的病毒感染。

并且证实了，多种EV的18个miRNA直接与SARS-CoV-2的3′UTR相互作用，源自EV的5个主要miRNA能够成功地抑制SARS-CoV-2。

感染冠状病毒的几名患者除了呼吸道相关的主要症状以外，还出现了肝损伤和胃肠损伤的现象。武汉金银潭医院的99例患者中，43例肝功能受损，其中1例肝功能受损严重。轻症患者肝功能损伤尚不清楚，但重症患者中，出现了主要肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)指标的恶化。

因此，不仅发挥直接的病毒抑制能力，而且能够协同发挥源自胎盘、脐带、脐带血的EV所具有的抗炎症等效能，因此，如果将源自胎盘的EV用作冠状病毒的治疗剂，有望起到显著地、优秀的治疗效果。

前述的本发明的说明只是举例说明，因此，理应理解为，本领域普通技术人员在不改变本发明的技术思想或必不可少的特征的情况下，可以容易地以其他具体的方式予以实施。因此以上描述的实施例，从所有的层面上这些实施例只是示例性的，因此理应理解为这些实施例不是用来限定的。例如，以单一形态描述的各构成要素可以分开实施，同样，以分开的状态说明的构成要素也可以以组合的形式实施。

因此，本发明的范围应以后述的权利要求为准，权利要求的意义、范围以及由等同的概念导出的所有修改以及变形都应列入本发明的范围。

Claims

1.一种无细胞组合物(cell-free composition)，其包括：

至少一种载体，赋形剂或稀释剂，同时还包括从胎盘、脐带或脐带血中提取的生物分子。

2.根据权利要求1所述的无细胞组合物，

所述生物分子是源自胎盘及脐带的间充质干细胞(placental mesenchymal stemcell，pMSC)衍生的细胞外囊泡(Extracellular Vesicle，EV)。

3.根据权利要求1所述的无细胞组合物，

所述生物分子是被包含在源自胎盘的间充质干细胞(pMSC)的细胞外囊泡(EV)中的miRNA。

4.根据权利要求3所述的无细胞组合物，

所述miRNA选自由hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-424-3p及hsa-miR-23b-3p组成的组中的一种以上。

5.根据权利要求3所述的无细胞组合物，

被包含在所述无细胞组合物的生物分子选自所述细胞外囊泡和所述miRNA中的一种以上。

6.一种抗病毒组合物，

其包含权利要求1至权利要求5中的任一项所述的无细胞组合物。

7.根据权利要求6所述的抗病毒组合物，

所述病毒选自由冠状病毒、HIV、流感、肠道病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus)、丙型肝炎病毒和牛病毒性泻病毒(Bovine viral diarrheavirus)组成的组中的一种以上。

8.根据权利要求7所述的抗病毒组合物，

所述冠状病毒是新型冠状病毒(NMC-nCoV02)或SARS-CoV-2。

9.一种用于预防或治疗病毒感染症的药学组合物，

其包含权利要求6所述的抗病毒组合物。

10.根据权利要求9所述的用于预防或治疗病毒感染症的药学组合物，

所述病毒感染症是指被冠状病毒感染。

11.一种用于预防或改善病毒感染症的食品组合物，

其包含权利要求6所述的抗病毒组合物。

12.一种用于抗炎症的组合物，

其包含根据权利要求1至3中的任一项所述的无细胞组合物。