CN107073057B - 含有朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分的用于预防和治疗病毒性疾病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防和治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum)提取物作为活性成分。发现本发明的朝鲜淫羊藿提取物增加了被病毒感染的细胞(例如水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒)的细胞存活率，并减少了细胞中的病毒数量。本发明的朝鲜淫羊藿提取物抑制细胞中的病毒增殖，因此可以有效地用作用于预防和治疗关于水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒的病毒性疾病的药物组合物。

Description

含有朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分的用于预防和治疗 病毒性疾病的组合物

技术领域

本发明提供一种用于预防和治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿(Epimedium koreanum nakai)提取物作为活性成分。

背景技术

水疱性口炎病毒(VSV)是引起水疱性口炎的病毒性病原体。该病毒主要分为两种血清型(即印第安纳和新泽西类型)。新泽西类型由于其更强的致病性而闻名，具有比印第安纳类型更显著的病变。由于水疱性口炎主要发生在美洲大陆，它也被称为新的大陆疾病。在美利坚合众国，自2004年以来间歇性爆发，然后每年爆发。南部墨西哥、中美洲国家、北部南美洲、巴西等是疾病频繁发生的代表性地区。

水疱性口炎不能与口蹄疫、水疱性疱疹、猪水疱病等区分开，仅具有表现出囊泡的临床症状，因此在实验室中进行快速诊断很有必要。对于具有显著临床症状的情况，用病原体上的病毒分离或逆转录-聚合酶链式反应等来诊断该疾病，而没有这种临床症状时，病原体的分离困难，因此进行血清学诊断。在感染水疱性口炎病毒的宿主动物的血液中，通常在感染后5-8天形成特异性抗体。用于检测抗体的方法包括补体结合试验、中和试验、酶联免疫测定等。水疱性口炎作为被世界动物健康组织(OIE)分类为与口蹄疫同为A类的严重传染病而影响许多农场动物，该疾病给受影响国家造成巨大的经济损失。可能受水疱性口炎影响的农场动物包括几乎每种哺乳动物，例如马、牛、绵羊、山羊和猪，并且已经确认冷血动物也可能被感染。由水疱性口腔炎引起的死亡率非常低。然而，在反刍动物或猪中爆发时由于在舌头、嘴唇、口腔粘膜、乳头和偶蹄表面形成囊泡而使动物急剧贬值。此外，水疱性口炎病毒也可以传播给人，并且据报道它在人类中引起具有轻度流感样症状的疾病。

新城疫病毒(NDV)引起全球已知是最重要的15种动物疾病之一的新城疫病(ND)与急性和强毒性呼吸道疾病，并且韩国当局 将其指定为一级流行病，因为其对没有免疫的家禽的感染导致100％的死亡率。该疾病分为两种类型，命名为亚洲和美洲类型。急性亚洲类型由具有强致病性的病毒引起，而美洲类型由具有弱致病性的病毒引起。韩国 是随时出现新城疫病毒的地区，并且鉴于韩国与具有新城疫病毒流行的南亚、东亚、中国大陆和台湾地区 进行积极贸易，存在潜在的风险因素。

家禽的感染通过空气或口服途径等传播，例如分泌物、排泄物、呼吸排泄物、与感染的禽类体直接接触等。疾病的主要症状是咳嗽、喘息、食欲不振、淡黄色腹泻后的淡绿色腹泻、麻痹、痉挛、盘旋、斜颈、扭曲的翅膀和腿以及气管中的充血。家禽的新城疫发生在所有年龄组中，并且是高传染性的。对未接种疫苗的鸡的感染导致100％的死亡率，并且该疾病已被韩国当局 指定为一级流行病。该局每年公布预防通知，而爆发不仅增加，而且在全国蔓延，对家禽养殖场造成巨大损害。今天，还没有已知用于新城疫的处理或治疗。

大多数人类疱疹病毒(HSV)在韩国 具有70％至80％或更高的感染率。病毒是代表性的慢性病毒，一旦感染，病毒引起无症状感染，并且在其宿主中保持传染性进行重复的失活和再活化。疱疹病毒也是导致机会性感染的代表性病毒，因为病毒通过由功能失调的免疫系统或先天性感染引起的再活化而引起各种疾病，并且根据患者的免疫状态，感染预后可能是致死的。目前，对于除了活的水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗之外的七种人类疱疹病毒，没有用于预防或治疗的疫苗。考虑到器官和造血干细胞移植增加，控制由功能失调的免疫系统(例如人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染)产生的再活化疱疹病毒感染受到关注。

现有的抗疱疹病毒制剂主要是针对病毒DNA聚合酶(DNA pol)开发的。其中，阿昔洛韦及其衍生物是通过疱疹病毒的胸苷激酶(以下称为“TK”)特异性磷酸化后插入由DNApol复制的病毒基因组而诱导DNA过早终止的药物，并且最常用于自开发以来的过去40年。此外，通常使用诸如福斯卡特(例如焦磷酸盐类似物)的药物。这些药物对治疗α-疱疹病毒有效，但对于β-或γ-疱疹病毒感染或再活化感染的初始症状(例如感染性单核细胞增多症)表现出有限的临床效力。特别地，由于不存在可用于控制γ-疱疹病毒的现有抗病毒剂，因此γ- 疱疹病毒感染的治疗主要依赖于使用类固醇型药物的对抗疗法。

鼻病毒属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒属，包括鼻窦炎、哮喘状态、中耳炎、囊性纤维化、支气管炎等。人鼻病毒(HRV)已知是哮喘急性加重的主要原因，并且许多稳定的哮喘患者在其支气管组织中具有人鼻病毒。比较来自哮喘患者和无哮喘患者的支气管粘膜活检标本，哮喘组人类鼻病毒在下呼吸道的发现频率显著高于非哮喘组，人鼻病毒的存在与哮喘临床严重程度之间的相关性也有报道。人鼻病毒阳性患者已知表现出较低的肺功能、支气管粘膜的嗜酸性粒细胞增多、淋巴细胞增多、嗜酸性粒细胞浸润等症状。没有上呼吸道感染临床症状的稳定哮喘患者也显示出在下呼吸道中人鼻病毒与慢性炎症的关联性。

呼吸道合胞病毒(RSV)是下呼吸道感染、肺炎和支气管炎的主要病原体 (Brandt等,Pediatrics 52:56(1973)；Selwyn等,Rev Infect Dis,12:s870(1990))。特别地，该病毒是高风险的，因为感染对患有肺发育不良、先天性心脏病、囊性纤维化、癌症或各种免疫缺陷的婴儿以及在骨髓移植之前免疫功能降低的成人是致死的(Chandwani等,J Pediatr,117:251(1990)；Bruhn等,J Pediatr, 90:382(1977))。老年人的感染率与流行性感冒病毒的比率相似，并且据报道患有RSV的超额死亡率高于流行性感冒。

目前，世界正在为抗病毒药物的开发作出巨大的努力。在市场上授权的代理商中有用于治疗人类免疫缺陷病毒-1和乙型肝炎的拉米夫定、用于治疗疱疹病毒感染的更昔洛韦、主要用于治疗呼吸道合胞病毒和感染并且在紧急时可以用于治疗各种病毒感染的利巴韦林、用于治疗甲型流感病毒的金刚烷胺及其类似物金刚乙胺、人工合成作为流感病毒的神经氨酸酶抑制剂的扎那米韦 (Relenza)和奥司他韦(TAMIFLU^TM)。然而，扎那米韦具有有限的吸入和静脉内注射的给药途径，并且奥司他韦可以口服给药，而其耐药病毒最近已经报道，并且口服给药具有呕吐、头晕等副作用(Ward P等,J.Antimicrob.Chemother., 55(supp1),p.i5-i21,2005)。因此，需要开发具有无毒天然成分的无副作用抗病毒剂以及这样的疫苗和治疗剂。

在上下文中，本发明的发明人已经研究开发了一种来自天然物质的治疗剂，用于预防和治疗由诸如水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒引起的疾病，并成功地证实，作为韩国传统草药的朝鲜中井淫羊藿提取物增加了由上述病毒感染的细胞的存活率、减少细胞中的病毒数量、并抑制细胞内病毒复制。作为结果，本发明人已通过展示朝鲜中井淫羊藿提取物可有效地用作对抗水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒的抗病毒组合物的活性成分而完成了本发明。

发明内容

[技术问题]

本发明的目的是提供一种用于预防和治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

[技术方案]

为了获得上述目的，本发明提供了一种用于预防和治疗病毒的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

此外，本发明提供一种用于预防和减轻病毒的功能性保健食品，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

另外，本发明提供一种用于预防和治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

[有益效果]

本发明涉及一种用于预防和治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。本发明的朝鲜中井淫羊藿提取物已被证实可增加由上述病毒感染的细胞的存活率、减少细胞中的病毒数量、并抑制细胞内病毒复制，因此可有效地用作功能性保健食品，用于预防和减轻由水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒引起的疾病。

附图说明

图1表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被病毒感染的细胞中水疱性口炎病毒(VSV)复制期间显示的绿色荧光蛋白(GFP)的荧光显微镜观察结果：

培养基：培养基；

IFN-β/VSV-GFP：在感染附着有绿色荧光蛋白(GFP)的水疱性口炎病毒后用IFN-β作为阳性对照组处理的细胞；

VSV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒；以及

EYK/VSV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒进行处理的细胞。

图2表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被水疱性口炎病毒感染的细胞中的细胞存活率和病毒含量或数量：

培养基：培养基；

IFN-β/VSV-GFP：在感染附着有绿色荧光蛋白(GFP)的水疱性口炎病毒后用IFN-β作为阳性对照组处理的细胞；

VSV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒；

EYK/VSV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒进行处理的细胞；以及

*：实验独立进行三次，并且学生的t检验分析的p值小于0.05的情况被确定为是统计学显著的。

图3表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被病毒感染的细胞中新城疫病毒(NDV)复制期间显示的绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察结果：

培养基：培养基；

IFN-β/NDV-GFP：在感染附着有绿色荧光蛋白(GFP)的新城疫病毒后用 IFN-β作为阳性对照组处理的细胞；

NDV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒；以及

EYK/NDV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒进行处理的细胞。

图4表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被新城疫病毒感染的细胞中的细胞存活率：

培养基：培养基；

IFN-β/NDV-GFP：在感染附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒后用IFN-β作为阳性对照组处理的细胞；

NDV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒；

EYK/NDV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒进行处理的细胞；以及

*：实验独立进行三次，并且学生的t检验分析的p值小于0.05的情况被确定为是统计学显著的。

图5表示通过按小时测量由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后被新城疫病毒感染的细胞的病毒基质mRNA得到的细胞内病毒感染状态：

NDV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒；

EYK/NDV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的新城疫病毒进行处理的细胞。

图6表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被病毒感染的细胞中疱疹病毒 (HSV)复制期间显示的绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察结果：

培养基：培养基；

IFN-β/HSV-GFP：在感染附着有绿色荧光蛋白(GFP)的疱疹病毒后用IFN-β作为阳性对照组处理的细胞；

HSV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的疱疹病毒；以及

EYK/HSV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的疱疹病毒进行处理的细胞。

图7表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被疱疹病毒感染的细胞中的细胞存活率：

培养基：培养基；

IFN-β/HSV-GFP：在感染附着有绿色荧光蛋白的疱疹病毒后用IFN-β作为阳性对照组处理的细胞；

HSV-GFP：附着有绿色荧光蛋白的疱疹病毒；

EYK/HSV-GFP：其中用朝鲜中井淫羊藿提取物对附着有绿色荧光蛋白的疱疹病毒进行处理的细胞；以及

*：实验独立进行三次，并且学生的t检验分析的p值小于0.05的情况被确定为是统计学显著的。

图8表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被鼻病毒感染的细胞中的细胞存活率：

培养基：含有HeLa细胞的培养基；

仅HRV：被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-0.2％/HRV：用0.2％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-0.5％/HRV：用0.5％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-1.0％/HRV：用1.0％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-2.0％/HRV：用2.0％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞。

图9表示由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被鼻病毒感染的细胞中的病毒含量或数量：

培养基：含有HeLa细胞的培养基；

仅HRV：被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-0.2％/HRV：用0.2％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-0.5％/HRV：用0.5％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-1.0％/HRV：用 1.0％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞；

EYK-2.0％/HRV：用2.0％的朝鲜中井淫羊藿提取物处理被鼻病毒感染的HeLa细胞。

具体实施方式

在下文中，将更详细地描述本发明。

本发明提供了一种用于预防和治疗病毒的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

病毒优选为选自水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、疱疹病毒 (HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒中的任一种，但不限于此。

提取物优选地通过用水、C₁和C₂的低级醇、或其溶剂混合物提取来制备，并且所述低级醇优选为甲醇或乙醇。

在本发明的具体实施例中，本发明人使用荧光显微镜观察水疱性口炎病毒的复制，以确认朝鲜中井淫羊藿提取物对抑制水疱性口炎病毒感染的效果。作为结果，证实了由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被水疱性口炎病毒感染的细胞在复制期间显示降低的荧光(参见图1)。此外，当本发明人进行台盼蓝染色试验以确定细胞存活率和细胞中病毒数量时，证实了由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被水疱性口炎病毒感染的细胞表现出增加的细胞存活率和减少的细胞中病毒数量(参见图2)。

此外，本发明人通过荧光显微镜观察新城疫病毒的复制，以确认朝鲜中井淫羊藿提取物对抑制新城疫病毒感染的效果。作为结果，证实了由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被新城疫病毒感染的细胞在复制期间显示降低的荧光(参见图3)。此外，当本发明人进行台盼蓝试验以确定细胞存活率以及RT-PCR试验以测量细胞内病毒(基质)的mRNA水平时，证实了与未处理的被感染细胞相比，由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被新城疫病毒感染的细胞存活率增加 (参见图4)，并且在已处理的细胞中基质mRNA的表达降低(参见图5)。

另外，本发明人通过荧光显微镜观察疱疹病毒的复制，以确认朝鲜中井淫羊藿提取物对抑制疱疹病毒感染的效果。作为结果，证实了与未处理的被感染细胞相比，由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被疱疹病毒感染的细胞的存活率增加(参见图6和7)。

另外，为了确认本发明的朝鲜中井淫羊藿提取物对抑制鼻病毒感染的效果，本发明人用浓度为0.2％、0.5％、1％和2％的提取物预处理上皮细胞的HeLa细胞系，用1MOI的鼻病毒感染它，并测量24小时后由鼻病毒引起的细胞毒性。作为结果，证实了细胞存活率取决于提取物的浓度，随着浓度增加而增加，并且病毒含量或数量减少(参见图8和9)。

因此，本发明的朝鲜中井淫羊藿提取物被证实为增加了被水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒感染的细胞的存活率，并且减少了细胞中的病毒含量或数量。由于提取物进一步抑制细胞内病毒复制，因此其可有效地用作用于预防和治疗由水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒引起的病毒性疾病的药物组合物。

本发明的组合物还可以包含常规用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的组合物可口服或肠胃外给药。其肠胃外给药优选地选自对皮肤的外用以及腹膜内、直肠内、皮下、静脉内、肌内、胸腔内的注射，但不限于此。

本发明的组合物可以根据各种常规方法用作口服制剂(例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等)、外用制剂、栓剂和无菌注射溶液。可以包含在组合物中的载体、赋形剂或稀释剂可以为乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。通过使用常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂和崩解剂、表面活性剂)来制备制剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且通过混合至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖以及明胶与毛地黄、皂苷、人参和蜂蜜的混合物)来制备。除了这些赋形剂之外，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服给药的液体制剂对应于悬浮剂、原液剂、乳剂、糖浆剂等。制剂可以包含赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、风味剂和防腐剂，以及水和液体石蜡作为常用的简单稀释剂。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。非水溶剂和悬浮剂可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、注射酯(例如油酸乙酯)等。栓剂基质可以包括witepsol、聚乙二醇、吐温61，可可脂、月桂油、甘油明胶等。

尽管本发明组合物的优选给药剂量取决于患者的状态、体重、疾病严重性、药物剂型以及给药途径和时间，本领域技术人员可以适当地选择这样的剂量。然而，为了期望的效果，组合物可以以0.0001g/kg至1g/kg每天的剂量施用，优选地以0.001mg/kg至200mg/kg的剂量施用，但是剂量不限于此。给药可以是一天一次或几次。剂量不以任何方式限制本发明的范围。

此外，本发明提供了一种用于预防和减轻病毒的功能性保健食品，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

病毒优选地选自水疱性口炎病毒(VSV)、新城疫病毒(NDV)、疱疹病毒 (HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒中的任一种，但不限于此。

提取物优选地通过用水、C₁和C₂的低级醇或其溶剂混合物提取来制备，低级醇优选为甲醇或乙醇。

因此，本发明的淫羊藿提取物被证实为增加了被水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒感染的细胞的存活率，并且减少了细胞中的病毒含量或数量。由于提取物进一步抑制细胞内病毒复制，其可有效地用作用于预防和减轻由水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒引起的病毒性疾病的功能性保健食品。

为了具有上述抗病毒用途，本发明的提取物可以以在局部或药学中公开的各种方式制备，并且可以为其本身或与可食用载体、赋形剂、稀释剂等的混合物的任何可口服摄取的食品类型。优选地，提取物为饮料剂、丸剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式。

本发明的功能保健食品还可以包含在制备食品时在食品上可接受并常规加入的成分。例如，在饮料剂的制备中，除了本发明的混合提取物之外，还包含来自柠檬酸、高果糖玉米糖浆、糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果汁等的至少一种成分。

作为本发明的功能性保健食品的活效成分能够包括的量，可以根据想要功能性保健食品抗病毒用途的人的年龄、性别、体重、状态、疾病症状来适当地选择。优选地，成人每天的量为0.01g至10.0g，并且摄取具有该量的功能性保健食品可以产生抗病毒效果。

此外，本发明提供了一种用于预防和治疗病毒性疾病的药物组合物，其包含朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分。

病毒性疾病优选是选自水疱性口炎，新城疫，手足口病，脑膜炎，流感，支气管炎，肺炎，细支气管炎和急性肝炎的任一种，但不限于此。

因此，本发明的朝鲜中井淫羊藿提取物被证实为增加了被水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒感染的细胞的存活率，并且减少了细胞中的病毒含量或数量。由于提取物进一步抑制细胞内病毒复制，其可用作用于预防和治疗由水疱性口炎病毒、新城疫病毒、疱疹病毒和鼻病毒引起的病毒性疾病的药物组合物。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明。

然而，本文公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本发明的范围。

<实施例1>朝鲜中井淫羊藿提取物的制备

购买来自韩国 的朝鲜中井淫羊藿并用作样品，以制备朝鲜中井淫羊藿提取物。将1L水加入到约50g精心挑选的朝鲜中井淫羊藿中，使用医用加热板 (Gyeongseo ExtractorCosmos-600，仁川，韩国)在115℃下进行热水提取3小时，以得到约100mL的朝鲜中井淫羊藿提取物。使用标准测试筛(150μm；莱驰，哈恩，德国)过滤提取物，并在4℃下保存直至用于实验。

<实施例2>细胞培养

对于朝鲜中井淫羊藿提取物的抗病毒效力实验，将鼠巨噬细胞细胞系RAW 264.7细胞和人胚肾细胞系293T分别在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml 青霉素和100μg/ml链霉素的杜尔贝科改进的依格尔培养基(DMEM)(英杰生命技术)中在37℃下在含有5％CO₂的95％湿度的培养箱中培养。每2或3天用新的培养液传代培养细胞。

<实施例3>确认对水疱性口炎病毒(VSV)感染的抑制效果

<3-1>使用荧光显微镜确认对病毒感染的抑制效果

为了确认朝鲜中井淫羊藿提取物对水疱性口炎病毒感染的抑制效果，如下所述在荧光显微镜下观察病毒的复制。

具体地，将上述<实施例1>中制备的1％的朝鲜中井淫羊藿提取物对RAW 264.7细胞系进行处理。12小时后，用1MOI的附着有绿色荧光蛋白(gfp)的水疱性口炎病毒(VSV-gfp病毒)感染细胞系，并进一步培养12或24小时。之后，通过gfp荧光观察VSV-gfp病毒的细胞内复制。1000U/ml IFN-β用作阳性对照组。

作为结果，证实了在朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被水疱性口炎病毒感染的细胞在复制期间显示降低的荧光(参见图1)。

<3-2>使用台盼蓝染色试验确认对病毒感染的抑制效果

为了确认朝鲜中井淫羊藿提取物对水疱性口炎病毒感染的抑制效果，进行台盼蓝染色试验以测定细胞的细胞存活率和细胞中病毒的数量。

具体地，从以与上述实施例<3-1>相同的方法培养的细胞中去除培养基，并且用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理细胞并漂浮。然后，向各孔中加入适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并使细胞凝集以及以2000rpm离心分离5分钟。当去除上清液之后自己留下细胞时，将细胞与加入的1mL PBS充分混合，并进一步与等量的细胞悬浮液和0.5％台盼蓝(Gibco BRL)混合。将混合物处理2分钟，并在荧光显微镜下计数活细胞。1000U/ml IFN-β用作阳性对照组。在培养基上以百分比描述细胞存活率。所有实验结果为三次独立实验的结果，*P<0.05表示通过学生t检验的比较组之间的显著差异。

作为结果，如图2中所示，证实了由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被水疱性口炎病毒感染的细胞表现出增加了细胞存活率(参见图2A)，并且减少了细胞中的病毒数量(参见图2B)。所有实验结果为三次独立进行的实验的结果， *P<0.05表示通过学生t检验的比较组之间的显著差异。

<实施例4>确认对新城疫病毒(NDV)感染的抑制效果

<4-1>使用荧光显微镜确认对病毒感染的抑制效果

为了确认朝鲜中井淫羊藿提取物对新城疫病毒感染的抑制效果，以与上述实施例<3-1>相同的方式在荧光显微镜下观察病毒的复制。

作为结果，证实了在朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被新城疫病毒感染的细胞在复制期间显示降低的荧光(参见图3)。

<4-2>使用台盼蓝染色试验和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)确认对病毒感染的抑制效果

为了确认朝鲜中井淫羊藿提取物对新城疫病毒感染的抑制效果，进行台盼蓝染色试验以测定细胞存活率，并且使用RT-PCR测定法测量病毒基质mRNA 以计数细胞内病毒。

具体地，以与上述实施例<3-2>相同的方法进行台盼蓝染色试验。对于 RT-PCR测定，将在上述实施例<3-1>中描述的方法中培养的细胞用保存在4℃的 PBS洗涤，并使用刮刀分离。将分离的细胞在1200rpm和4℃下离心分离2分钟，去除上清液后，得到沉淀。然后，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，Valencia， CA)在制造商的方案下提取总RNA。使用DEPC处理过的水溶解RNA，使用 A260/280比例(Versa Max酶标仪，分子器件)测量RNA的吸光度，以鉴定纯度和浓度。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量转录mRNA的数量。使用oligo-(dt)₁₅引物将相同量的RNA合成为cDNA，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂(应用生物系统)和7500Fast Real time-PCR系统(应用生物系统)进行PCR。PCR在50℃下进行20秒，并在95℃下进行10分钟，并且基质(M)蛋白和GAPDH的相对条带强度在图中示出。上述RT-PCR中使用的引物公开在下表1中。

作为结果，如图4和5所示，证实了与未处理的感染细胞相比，在朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被新城疫病毒感染的细胞的存活率增加(参见图4)，并且在已处理的细胞中基质mRNA的表达降低(参见图5)。所有实验结果为三次独立实验的结果，*P<0.05表示通过学生t检验的比较组之间的显著差异。

[表1]

<实施例5>确认对疱疹病毒(HSV)感染的抑制效果

为了确认朝鲜中井淫羊藿提取物对疱疹病毒感染的抑制效果，进行了下述实验。

具体地，将上述<实施例1>中制备的1％的朝鲜中井淫羊藿提取物对293T 细胞系处理12或24小时后，用2MOI的疱疹病毒(HSV-GFP)感染细胞系，并测量疱疹病毒的细胞毒性。特别地，将1000U/ml IFN-β用作阳性对照组。在显微镜下观察细胞系，并通过台盼蓝染色试验以与上述实施例<3-2>相同的方式测定培养细胞的存活率。

作为结果，如图6和7中所示，证实了与未处理的感染细胞相比，由朝鲜中井淫羊藿提取物处理后的被疱疹病毒感染的细胞的存活率增加(参见图6和 7)。所有实验结果为三次独立进行的实验的结果，*P<0.05表示通过学生t检验的比较组之间的显著差异。因此，证实了朝鲜中井淫羊藿对作为DNA病毒的疱疹病毒感染的抑制效果。

<实施例6>确认对鼻病毒(HSV)感染的抑制效果

为了确认朝鲜中井淫羊藿提取物对鼻病毒感染的抑制效果，进行了下述实验。

特别地，将上述<实施例1>中制备的0.2％、0.5％、1％和2％的朝鲜中井淫羊藿提取物对上皮细胞的HeLa细胞系处理，用1MOI的鼻病毒感染细胞系，并在24小时后测量鼻病毒的细胞毒性。在显微镜下观察细胞系，并且通过台盼蓝染色试验以与上述实施例<3-2>相同的方法测定培养细胞的存活率。

作为结果，证实了细胞存活率取决于提取物的浓度，随着浓度增加而增加，并且病毒含量或数量减少(参见图8和9)。

<110> 韩国韩医学研究院

<120> 含有朝鲜中井淫羊藿提取物作为活性成分的抗病毒组合物

<130> OPA15219

<150> KR10-2014-0104220

<151> 2014-08-12

<150> KR10-2014-0135163

<151> 2014-10-07

<160> 4

<170> KopatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APMV-1 M_F 引物

<400> 1

agtgatgtgc tcggaccttc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> APMV-1 M_R 引物

<400> 2

cctgaggaga ggcatttgct a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH _F 引物

<400> 3

tgaccacagt ccatgccatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH _R 引物

<400> 4

gacggacaca ttgggggtag 20

Claims (8)

1.朝鲜中井淫羊藿(Epimedium koreanum nakai)提取物在制备用于预防和治疗病毒性疾病的药物中的用途，其中，所述病毒为水疱性口炎病毒(VSV)。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述提取物通过用水、C₁和C₂的低级醇、或其溶剂混合物提取来制备。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述低级醇为甲醇或乙醇。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述病毒性疾病为水疱性口炎。

5.朝鲜中井淫羊藿(Epimedium koreanum nakai)提取物在制备用于预防和治疗病毒性疾病的药物中的用途，其中，所述病毒为水疱性口炎病毒(VSV)，以及选自由疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒组成的组中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述提取物通过用水、C₁和C₂的低级醇、或其溶剂混合物提取来制备。

7.根据权利要求5所述的用途，其中，所述低级醇为甲醇或乙醇。

8.根据权利要求5所述的用途，其中，所述病毒性疾病为水疱性口炎，以及选自由支气管炎、肺炎和细支气管炎组成的组中的至少一种。

Images