CN115916208A

CN115916208A - 用于治疗肌肉萎缩症的方法和组合物

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Publication number: CN115916208A
Application number: CN202180051021.4A
Authority: CN
Inventors: D·布朗; J·卡尔; D·基夫
Original assignee: Kant Biomedical Co ltd
Current assignee: Kant Biomedical Co ltd
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2023-04-04
Also published as: EP4168425A2; CA3187301A1; WO2021257673A2; US20230256047A1; WO2021257673A3; EP4168425A4

Abstract

本公开提供了在哺乳动物受试者中治疗肌肉萎缩症(MD)如杜氏肌肉萎缩症(DMD)或贝克氏肌肉萎缩症(BMD)的方法。所述方法对于在诊断患有MD和/或正在接受MD治疗的受试者中治疗、抑制、减少、改善肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭和/或心肌纤维化或延迟其发作中特别有用。所述方法包括向受试者施用有效量的肽如H‑D‑Arg‑2,6‑Dmt‑Lys‑PHe‑NH₂(又名elamipretide)或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体，所述肽任选地与至少一种其他活性成分(即药物)如皮质类固醇、ACE抑制剂、ARB、β‑阻断剂或增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白表达的药物(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys45^TM))联合。

Description

用于治疗肌肉萎缩症的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月17日提交的美国临时专利申请第63/040,185号的优先权，该申请的全部内容特此通过引用并入。

技术领域

本公开一般涉及组合物(例如药剂或制剂)、方法和用途，其用于治疗由于受试者产生蛋白质抗肌萎缩蛋白的能力受损而导致患有肌肉萎缩症(MD，如杜氏肌肉萎缩症(DMD)或贝克氏肌肉萎缩症(BMD))的受试者的心脏疾病(如肥厚型心肌病(HCM)、扩张型心肌病(DCM)、心力衰竭和/或心肌纤维化)，和/或预防、抑制、改善所述受试者中此类心脏疾病或延迟此类心脏疾病的发作。本技术涉及向患有MD、DMD或BMD的受试者(如那些处于发展心脏疾病的风险中的受试者或已发展心脏疾病的受试者)施用例如有效量的肽和/或肽混合物，如H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂(更通常称为elamipretide、SS-31、MTP-131或bendavia)；或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体，和/或其羧酸盐形式H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH(或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体)。此类治疗特别涉及包括以下的治疗并且可以与包括以下的治疗协同作用：共同施用皮质类固醇、ACE抑制剂、ARB、β-阻断剂或增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物/药剂(例如，正在接受磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)治疗的受试者，如Exondys

(Eteplirsen)、Vyondys 53^TM(Golodirsen)或Amondys 45^TM(Casimersen))，或PPMO(定义如下)。

背景技术

提供下面的描述以帮助读者理解。不承认所提供的信息或引用的参考文献是本文所公开的组合物和方法的现有技术。

肌肉萎缩症(MD)是一组遗传非发炎性但渐进性的肌肉病症。杜氏肌肉萎缩症(DMD)是最常见的肌肉萎缩症，全世界每大约3500名出生的男性中就有1人受到影响。贝克氏肌肉萎缩症(BMD)比DMD更温和，并且主要引起心脏问题。BMD只影响男性(约3万分之一)，通常在2至16岁之间首次出现，但可晚至25岁才出现。DMD和BMD都是由于蛋白质抗肌萎缩蛋白的生产异常或不足而导致的。

DMD开始是渐进性的肌肉无力，演变为丧失行走能力，并进一步进展为早期发作和死亡。DMD是由位于X染色体的短臂上的基因座Xp21处的抗肌萎缩蛋白基因中的突变造成的。抗肌萎缩蛋白编码在肌纤维的结构稳定性中发挥整合作用的427-kD蛋白质。抗肌萎缩蛋白的丧失破坏了肌肉膜和纤维。在无抗肌萎缩蛋白的情况下，肌肉纤维易受机械损伤和坏死/凋亡细胞死亡的影响。

DMD是一种最终影响所有随意肌以及后期心肌和呼吸肌的渐进性疾病。该疾病在男性中最为流行。虽然DMD突变的女性携带者大部分没有症状，但有些女性(20-30％)表现为轻度至中度的肌肉无力，并且发展为DCM的风险增加。男孩一般在三至五岁时出现症状。这些症状通常随着时间的推移而恶化，导致丧失行走能力，并在青春期早期需要坐轮椅。DMD的进一步进展导致呼吸窘迫和心肌病，几乎所有男性在18岁时都会出现这种情况。患有DMD的个体的平均预期寿命是25岁左右。

DMD的体征或症状包含：伴随腿部和骨盘发作的渐进性近端无力、伴有宽阔步态的脊柱前凸过度、薄弱肌肥大、假性肥大(小腿和三角肌经脂肪和纤维化组织的扩大)、在疾病晚期对电刺激的肌肉收缩性减少、延缓的运动里程、渐进性不能行走、足跟跟腱挛缩、瘫痪、疲劳、包含脊柱侧凸的骨架变形、肌肉纤维变形、心肌病、充血性心力衰竭或心律不齐、肌肉萎缩、呼吸紊乱、膀胱或肠道功能障碍、感觉紊乱或发热性疾病。骨骼肌无力可以促成心肺并发症。由于脊椎旁肌肉不对称萎缩的脊柱侧凸变形损害肺部和胃肠功能，使个体易感染肺炎、呼吸衰竭和营养不良。由于抗肌萎缩蛋白异常或缺失的平滑肌功能障碍，以及不活动导致胃肠蠕动异常，进而造成便秘和腹泻。

DMD可以若干方式诊断。可以在男童具有渐进性对称肌肉无力时进行临床诊断。肌肉活检是用于量化肌肉抗肌萎缩蛋白量以及用于检测DMD的无症状女性携带者的重要手段。使用针对抗肌萎缩蛋白的杆域、羧基末端和氨基末端的抗体对肌肉进行的免疫染色显示出在患有DMD的男孩中不存在常用的肌膜染色。临床发现、家族病史、肌酸磷酸激酶的血液浓度和在抗肌萎缩蛋白研究下的肌肉活检的组合证实了诊断(肌酸磷酸激酶通常以高浓度存在于肌肉细胞中)。然而，DMD患者在疾病早期阶段期间呈现为参考范围(高达20,000mU/mL)的50-100倍的肌酸磷酸激酶含量。肌电描记术、心电图和超声心动图，以及肺监测测试可以用于确认DMD的诊断。DMD进展以5个阶段出现：症状发生前、早期可走动、晚期可走动、早期不能走动和晚期不能走动。

与DMD的其他方面一样，心肌病是渐进性的，但一般以心力衰竭结束。超声检查可以在收缩功能障碍和明显的心肌病发作之前就检测出心肌的结构变化。尽管心力衰竭的发生率高，但大多数DMD患儿在病程晚期之前都是相对无症状的，可能是因为他们不能运动。心力衰竭和心律失常可能在疾病的晚期发展，尤其是在并发感染或手术期间。晚期心肌病的特点是左心室后基底壁广泛纤维化，随后纤维化扩散到左心室的侧游离壁。心肌病的持续进展常常导致输出衰竭和肺部充血。可替代地，心肌纤维化可以包含心肌病和传导异常，这可以诱发致命的心律失常。心力衰竭是DMD患者最常见的死亡原因。

DMD的心肌能量平衡被破坏，其中线粒体功能障碍是核心因素。在动物DMD模型和人类研究中，心脏营养不良中的线粒体功能受损都是早期观察到的，往往在可观察到心功能下降之前观察到。抗肌萎缩蛋白的缺乏导致了细胞膜的脆弱和对膜破裂的高度敏感性。

细胞膜完整性的丧失诱发了离子、酶和代谢物的‘泄漏性’流动。钙的流入在心脏中尤其成问题，心脏的泵功能需要严格调节钙的循环。与细胞外部相比，细胞溶质中的钙含量通常低三到四个数量级。DMD心肌细胞内的钙含量升高导致线粒体中的肌节破坏和钙超载。

线粒体钙超载导致DMD心脏出现几个相互关联的问题。钙超载会打开线粒体通透性转换孔，这是可以启动凋亡细胞死亡的非特异性线粒体通道。这个孔的打开对线粒体来说可能是灾难性的，因为它破坏了对ATP生成至关重要的电化学和代谢物梯度。DMD线粒体的活性氧产生升高，这可能会加剧细胞损伤。破裂的线粒体碎片可以从细胞中漏出，并促进炎性信号传导级联。最后，在DMD中，与生物能量功能直接相关的线粒体结构受到损害。

DMD的线粒体功能障碍是导致细胞死亡的关键因素。由于心脏的再生能力非常低，所以肌细胞的损失增加了幸存细胞的负担。活细胞内的线粒体承受的压力升高，以满足心脏对ATP的持续需求。随着疾病的进展，徒劳的病理循环继续压倒了细胞的防御机制。随之而来的心脏重塑导致了更高的机电功能障碍的倾向，并最终损害了心脏功能。

从历史上看，DMD和BMD患者都是针对其症状进行治疗。治疗的护理标准是用皮质类固醇来增加肌肉功能，用ACE抑制剂、ARB和β阻断剂来解决渐进性心肌病，并用辅助装置来解决行走需求。最近，美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了基于外显子跳跃作用机制的药物，这些药物旨在上调DMD患者的蛋白质抗肌萎缩蛋白的表达(即Exondys

(Eteplirsen)、Vyondys 53^TM(Golodirsen)或Amondys 45^TM(Casimersen))。虽然这些药物似乎增加了骨骼肌中抗肌萎缩蛋白的表达，但它们似乎并没有改善心肌中抗肌萎缩蛋白的表达。事实上，似乎没有任何证据表明这些药物可以减缓DMD患者心肌病的进展，并且如果骨骼肌功能的增加导致DMD患者的力量和体力消耗增加，从而增加患者因体力活动增加而对心脏的压力，则确实可能加速心脏疾病和相关心肌病的进展。

总之，尽管目前有针对症状的治疗，并且最近的医学进展已经开始解决该疾病的分子基础，但MD(包含但不限于DMD和BMD)仍然是不治之症，迫切需要额外的治疗和疗法。

发明内容

在一个方面，本公开提供了一种在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的方法，包括向受试者施用治疗有效量的式A的肽：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体，其中每个R₁独立地是H或-CH₃；R₂是-OH或-NH₂；X_a和Y_a各自独立地选自

每个m是2、3或4；每个n独立地是1、2或3；以及立体中心1*、2*、3*和4*中每个的绝对立体化学独立地是D或L。

在一些实施例中，通式A的肽是式A-1的肽：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。

在一些实施例中，通式A的肽是式A-2的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8的肽：

在一些实施例中，在被诊断患有肌肉萎缩症和/或正在接受肌肉萎缩症治疗的受试者中，施用肽减少、改善肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭和/或心肌纤维化和/或延迟其发作。

在一些实施例中，施用肽预防、抑制、减少、改善肥厚型心肌病和/或延迟其发作。

在一些实施例中，施用肽预防、抑制、减少、改善扩张型心肌病和/或延迟其发作。

在一些实施例中，施用肽预防、抑制、减少、改善心力衰竭和/或延迟其发作。

在一些实施例中，施用肽预防、抑制、减少、改善心肌纤维化和/或延迟其发作。

在一些实施例中，与未接受治疗的对照受试者或未施用肽的对照组的心脏相比，施用肽增加受试者心脏的射血分数、缩短分数、心搏量或心输出量。

在一些实施例中，肽每天施用，持续：(i)24周或更长时间；(ii)48周或更长时间；(iii)72周或更长时间；或(iv)96周或更长时间。在一些实施例中，肽每周施用，持续：(i)24周或更长时间；(ii)48周或更长时间；(iii)72周或更长时间；或(iv)96周或更长时间。在一些实施例中，从诊断时(或接近诊断时)到生命结束时或接近生命结束时，每天或每周向受试者施用肽。

在一些实施例中，肽经口、局部、全身性、腹膜内、皮内、经皮、眼科、鞘内、脑室内、离子导入、经粘膜、玻璃体内、鼻内或肌肉内施用。在一些实施例中，肽皮下或静脉内施用。在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症(DMD)。在一些实施例中，肌肉萎缩症是贝克氏肌肉萎缩症(BMD)。

在一些实施例中，该方法进一步包括分别、依次或同时向受试者施用额外治疗剂。

在一些实施例中，肽与已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物联合向受试者施用。在一些实施例中，受试者已被诊断为患有DMD，并且肽与作为已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物的磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO联合向受试者施用。

在一些实施例中，静脉内施用肽和PMO或PPMO。在一些实施例中，同时施用肽和PMO或PPMO。

在一些实施例中，肽与皮质类固醇联合向受试者施用。在一些实施例中，肽与ACE抑制剂联合向受试者施用。在一些实施例中，肽与ARB联合向受试者施用。在一些实施例中，肽与β阻断剂联合向受试者施用。

在一些实施例中，肽和额外治疗剂的联合施用对治疗DMD或BMD有协同作用。

在一些实施例中，肽的药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐。也可以使用其他药学上可接受的盐；许多非限制性实例提供在“药学上可接受的盐”的定义中或另外在下面更详细地描述。

在一些实施例中，式A的肽以贮库制剂的形式施用。在一些实施例中，贮库制剂包括包封在或以其他方式布置在二氧化硅微粒中的式A的肽。在一些实施例中，贮库制剂是持续释放贮库制剂。在一些实施例中，式A的肽在几天、几周或几个月内以有效量释放。

在一个方面，本公开涉及一种组合物在制备用于在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的药剂中的用途，其中所述组合物包括治疗有效量的式A的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-1的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-2的肽：

在一些实施例中，该药剂进一步包括已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物。在一些实施例中，受试者已被诊断为患有DMD，并且已知增加或纠正抗肌萎缩蛋白产生的药物是磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO。

在一些实施例中，肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症。在一些实施例中，肌肉萎缩症是贝克氏肌肉萎缩症。

在一些实施例中，心肌病是肥厚型心肌病。在一些实施例中，心肌病是扩张型心肌病。在一些实施例中，心肌病是心力衰竭。在一些实施例中，心肌病是心肌纤维化。

在一些实施例中，与未接受治疗的对照受试者或未施用该组合物的对照组的心脏相比，该药剂增加了受试者心脏的射血分数。

在一些实施例中，与未接受治疗的对照受试者或未施用该组合物的对照组的心脏相比，该药剂增加了受试者心脏的缩短分数。

在一些实施例中，与未接受治疗的对照受试者或未施用该组合物的对照组的心脏相比，该药剂增加了受试者心脏的心搏量。

在一些实施例中，与未接受治疗的对照受试者或未施用该组合物的对照组的心脏相比，该药剂增加了受试者心脏的心输出量。

在一些实施例中，与未接受治疗的对照受试者或未施用该组合物的对照组的心脏相比，该药剂减少受试者心脏的心肌纤维化或延迟其发作。

在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包括：

a)式A的肽：

每个m是2、3或4；每个n独立地是1、2或3；以及立体中心1*、2*、3*和4*中每个的绝对立体化学独立地是D或L；和

b)已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物。

在一些实施例中，通式A的肽是式A-1或A-2的肽：

在一些实施例中，已知增加或纠正抗肌萎缩蛋白产生的药物是磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO。

在一些实施例中，该组合物是药剂。

在一些实施例中，本公开提供了一种在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的方法，包括向受试者施用治疗有效量的组合物。

在一些实施例中，该组合物每天、每周或每月施用。

在一些实施例中，该组合物静脉内施用。

在一些实施例中，肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症。

在一个方面，本公开提供了包括式A的肽的制剂：

每个m是2、3或4；每个n独立地是1、2或3；以及立体中心1*、2*、3*和4*中每个的绝对立体化学独立地是D或L，其中：(i)所述肽被二氧化硅微粒包封或布置在二氧化硅微粒中；以及(ii)所述二氧化硅微粒被配制成在数天、数周或数月内向受试者全身性递送肽，从而递送有效剂量以治疗受试者的与MD、DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征、症状或风险因素。

附图说明

图1是通式A的肽四聚体化合物和两个示例性肽A-1(H-D-Arg-2,6-Dmt-Lys-Phe-NH₂)和A-2(H-D-Arg-2,6-Dmt-Lys-Phe-OH)的图示。

图2是示例性肽A-2的四肽的各种盐形式的图示。

图3是示例性肽A-1(elamipretide)的四肽的各种盐形式的图示。

具体实施方式

定义

应了解，本技术的某些方面、模式、实施例、变型和特征在下文以各种水平的细节描述，以便提供本公开的基本理解。如本说明书中所使用的某些术语的定义提供在下文中。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语通常具有与本技术所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一/一个(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指代。例如，提及“一个细胞”包含两个或更多个细胞的组合等。

如本文所用，向受试者“施用(administering/administration)”药剂(例如肽)或药物是指将化合物(例如，肽或肽混合物)引入或递送到受试者以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何适合途径进行，如经口施用。施用可以皮下进行。施用可以静脉内进行。施用可以眼内进行。施用可以全身性进行。可替代地，施用可以局部、鼻内、腹膜内、皮内、眼科、鞘内、脑室内、离子导入、经粘膜、玻璃体内或肌肉内施用。施用包含自我施用、由他人施用或由装置(例如泵)施用。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸、以及后来经修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，结合到氢、羧基、氨基和R基团的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号表示。

如本文所用，术语或短语“载体”和“药学上可接受的载体”是指与肽/化合物/组合物一起施用或配制以供施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药学上可接受的载体的非限制性实例包含液体，如水、盐水和油；以及固体，如阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、二氧化硅颗粒(纳米颗粒或微粒)、尿素等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂、调味剂和着色剂。合适的药物载体的其他实例描述于E.W.Martin.的“雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”，该文献全文通过引用并入本文。

如本文所用，短语“延迟发作”是指在统计样品中，相对于未接受治疗的对照样品，延迟、阻碍治疗样品中病症、症状、病况或适应症的一个或多个症状的发生，或导致其比正常情况下发生得更慢。

如本文所用，术语“有效量”是指足以获得所需治疗性和/或防止性效果的量，例如治疗、抑制、减少、改善心肌病或心力衰竭或延迟其发作的量。在治疗性或防止性应用方面，在一些实施例中，向受试者施用的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。本文所公开的肽/化合物/组合物可以在与MD相关的心肌病发作之前或响应于MD患者发生的心肌病以有效量施用。本文公开的肽/化合物/组合物也可以与一种或多种额外的治疗性化合物联合施用(所谓的“共同施用”，例如，额外的治疗性化合物可以同时、依次施用或单独施用)。一种或多种额外的治疗性化合物/组合物可以是例如皮质类固醇、ACE抑制剂、ARB、β-阻断剂和/或已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO)。在一些实施例中，肽(或肽混合物)的共同施用可产生协同治疗效果。

在本文描述的方法中，治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)，或其药学上可接受的盐、立体异构体、立体异构体的混合物、互变异构体、水合物和/或溶剂化物可被施用于具有与MD、DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征、症状或风险因素的受试者。例如，治疗性化合物(例如肽或肽混合物)的“治疗有效量”包含抑制、减少或消除心肌病的一个或多个体征、症状或风险因素的存在、频率或严重程度的水平。在一些实施例中，治疗有效量减少或改善肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭和/或心肌纤维化的生理影响。

如本文所用，术语“水合物”是指与水缔合的化合物(例如肽或肽混合物)。化合物的水合物中所含的水分子量可能(也可能不)与水合物中的化合物分子数量成一定比例。

如本文所用，术语“抑制(inhibit/inhibits/inhibiting)”意指与对照相比减少客观可测量的量或程度。在一个实施例中，抑制意指与对照相比减少至少统计上显著的量。在一些实施例中，抑制意指与对照相比减少至少1-5％。在各个单独的实施例中，抑制意指与对照相比减少至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、33％、40％、50％、60％、67％、70％、75％、80％、90％、95％或99％。

如本文所用，关于治疗用途的术语“单独”是指在同一时间或基本上在同一时间通过不同途径施用至少两种活性成分。例如，“活性成分”可以是本文所公开的肽或肽混合物，以及皮质类固醇、ACE抑制剂、ARB、β-阻断剂或已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO)中的至少一种。

如本文所用，关于治疗用途的术语“依次”是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地说，依次使用是指在开始施用另一种或其他活性成分之前全部施用一种活性成分。因此，有可能在数分钟、数小时或数天内施用一种活性成分，然后施用其他活性成分。这个定义中没有同时治疗。例如，“活性成分”可以是本文所公开的肽或肽混合物，以及皮质类固醇、ACE抑制剂、β-阻断剂或已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

如本文所用，关于治疗用途的术语“同时”是指通过相同或不同的途径，但在同一时间或基本上在同一时间施用至少两种活性成分(即两种药理活性成分)。例如，“活性成分”可以是本文所公开的肽或肽混合物，以及皮质类固醇、ACE抑制剂、ARB、β-阻断剂或已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

如本文所用，术语“受试者”是指活体动物。在各种实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是非人类哺乳动物，包含但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、猫、狗、猪、小型猪、马、牛或非人灵长类动物。在一些实施例中，受试者是人。

如本文所用，术语“治疗(treat/treats/treating/treatment)”是指治疗性治疗，其中目标是减少、缓解目标病理状况或病症的进展或发展或延迟其发作，和/或逆转目标病理状况或病症的进展。

如本文所用，“肽缀合的PMO(PPMO)”是为了提高PMO的细胞摄取率而与细胞渗透性肽相连的PMO。参见：Tsoumpra等人(2019)“基于肽缀合反义的杜氏肌肉萎缩症和其他神经肌肉疾病的剪接纠正(Peptide-conjugated antisense based splice-correction forDuchenne muscular dystrophy and other neuromuscular diseases)”EBioMedicine,45,630-645；doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.036。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指治疗性活性化合物(例如肽或肽混合物)的盐，根据在本文所述化合物上发现的特定取代基，该盐可以用相对无毒的酸或碱制备。当本申请化合物含有相对酸性的官能团时，碱加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所需碱接触而获得，所述碱是纯的或在合适的惰性溶剂中。药学上可接受的碱加成盐的实例包含钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本申请化合物含有相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所需酸接触而获得，所述酸是纯的或在合适的惰性溶剂中。衍生自药学上可接受的无机碱的盐包含铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、三价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包含伯胺、仲胺和叔胺的盐，包含取代的胺、环胺、天然存在的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海巴明、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺(NEt₃)、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等，如其中盐包含有机碱的质子化形式(例如，[HNEt₃]⁺)。衍生自药学上可接受的无机酸的盐包含以下各酸的盐：硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸。衍生自药学上可接受的有机酸的盐包含以下各酸的盐：脂肪族羟基酸(例如柠檬酸、葡糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族单羧酸(例如乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡糖醛酸、杏仁酸、粘液酸、烟碱酸、乳清酸、双羟酸、泛酸、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、1,2-乙烷二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、甲烷磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸(PTSA))、羟萘甲酸等。在一些实施例中，药学上可接受的反离子选自由以下组成的群组：乙酸根、苯甲酸根、苯磺酸根、溴离子、樟脑磺酸根、氯离子、氯茶碱离子、柠檬酸根、乙二磺酸根、富马酸根、葡庚糖酸根、葡糖酸根、葡萄糖醛酸根、马尿酸根、碘离子、羟乙基磺酸根、乳酸根、乳糖醛酸根、月桂基硫酸根、苹果酸根、马来酸根、甲磺酸根、甲基硫酸根、萘甲酸根、sapsylate、硝酸根、十八酸根、油酸根、草酸根、双羟萘酸根、磷酸根、聚半乳糖醛酸根、琥珀酸根、硫酸根、磺基水杨酸根、酒石酸根、对甲苯磺酸根和三氟乙酸根。在一些实施例中，盐是酒石酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、马来酸盐、三氟乙酸盐、盐酸盐或甲苯磺酸盐。还包含氨基酸如精氨酸等的盐，以及有机酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等人，《药物科学杂志(Journal of Pharmaceutical Science)》66:1-19(1977))。本申请的某些特定化合物可能同时含有碱性和酸性官能团，使该化合物可以转化为碱加成盐或酸加成盐。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。本领域技术人员已知的其他药学上可接受的载体也适用于本技术。在一些实施例中，化合物是两性离子(分子内盐)。肽H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH(A-2)的示例性盐形式在图2中例示。肽H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH2(A-1)的示例性盐形式在图3中例示。

如本文所用，“磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)”是指包括通过磷酰二胺基团而不是磷酸主链与亚甲基吗啉环连接的天然核碱基的合成低聚物。参见：Summerton JE(2017).“吗啉代的发现和早期史：从梦想到实用产品(Invention and Early History ofMorpholinos:From Pipe Dream to Practical Products)”.吗啉代低聚物(MorpholinoOligomers).分子生物学方法(Methods in Molecular Biology).1565.Humana Press(Springer).pp.1–15。

如本文所用，术语“预防(prevent/prevents/preventing/prevention)”是指在统计样品中相对于未接受治疗的对照样品减少经治疗样品的病症、症状、病况或适应症的出现。

如本文所用，术语“防止性的”是指旨在防止病症、症状、病况或适应症出现的行动。

如本文所用，术语“溶剂化物”是指化合物(例如肽或肽混合物)与溶剂缔合的形式，通常通过溶剂分解反应而与溶剂相关。这种物理缔合可能包含氢键。传统的溶剂包含水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、己烷、二甲亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二乙醚等。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。

如本文所用，术语“协同治疗效果”是指由至少两种治疗剂的组合产生的并且超过另外单独施用该药剂所产生的效果的大于累加的治疗效果。例如，在治疗MD(例如DMD或BMD)时可使用较低剂量的一种或多种治疗剂，从而增加治疗功效和减少副作用。

如本文所用，术语“互变异构体”是指化合物(例如肽或肽混合物)，它们是特定化合物结构的可互换形式，并且在氢原子和电子的置换上有所不同。因此，两个结构可以通过π电子和原子(通常是H)的移动而达到平衡。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们在用酸或碱处理后会迅速相互转化。互变异构形式可能与实现感兴趣的化合物的最佳化学反应性和生物活性有关。

如本文所用，当提到心脏功能参数如心搏量、射血分数、缩短分数和心输出量时，我们指的是左心室心搏量、左心室射血分数、左心室缩短分数和左心室心输出量。

如本文所用，术语缩短率和缩短分数可以互换。

详细描述

在一个方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中治疗心肌病或抑制心肌病的发作或进展的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的下文更详细描述的肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。一般来说，哺乳动物受试者将携带影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在该方法的一些实施例中，基因置换是与抗肌萎缩蛋白的产生有关的插入、缺失、复制、框移或无义突变。所述肽或肽混合物可以单独施用，在组合物或制剂(例如，药剂)中施用和/或与一种或多种额外治疗剂/药物(即活性成分)联合施用。在一些实施例中，受试者是人。

肽混合物内的一种或多种肽可以具有通式A：

每个m是2、3或4；每个n独立地是1、2或3；以及立体中心1*、2*、3*和4*中每个的绝对立体化学独立地是D或L。例如，肽可以具有式A-1：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-2：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-3：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-4：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-5：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-6：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-7：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以具有式A-8：

或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。肽可以单独施用，或者可以作为包括本文定义的两种或更多种肽混合物施用。如所指出的，肽或肽混合物可以单独施用，在制剂(例如药剂)中施用，或与一种或多种其他活性成分联合施用。在一些实施例中，肽的药学上可接受的盐可以选自盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐。

如背景技术中所指出的，心脏疾病和心肌病是与肌肉萎缩症相关的预期的、逐渐衰弱的病况。因此，在一些实施例中，本公开涉及治疗、抑制、预防、减少、改善受试者中与肌肉萎缩症相关的心肌病的体征、症状、或严重程度或延迟其发作的方法。在一些实施例中，该方法包括在可检测到的心肌病发作之前，向受试者防止性地施用肽或肽混合物，从而延迟可检测到的心肌病的发作或进展。在一些实施例中，可施用肽或肽混合物以减缓心肌病的进展或减轻心肌病的严重程度。在一些实施例中，可施用肽或肽混合物以逆转心肌病的生理影响(例如减少左心室壁的大小或厚度)。在一些实施例中，可施用肽或肽混合物以逆转心律失常的影响、发生或严重程度。在一些实施例中，可施用肽或肽混合物以抑制心脏纤维化，延迟心脏纤维化的发生或减少受试者心脏纤维化的程度。在一些实施例中，心肌病是肥厚型心肌病。在一些实施例中，心肌病是扩张型心肌病。在一些实施例中，要解决的病况是渐进性心力衰竭。

施用肽(或肽混合物)可表现出对施用肽(或肽混合物)的受试者的心脏的各种有益影响。例如，相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽可增加受试者(或受试者组)的射血分数。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)可以增加受试者(或受试者组)的缩短分数(在本领域有时也称为缩短率)。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)可以增加受试者(或受试者组)的心搏量。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)可以增加受试者(或受试者组)的心输出量。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)可增加以下中的两项或更多项：(i)射血分数；(ii)缩短分数；(iii)心搏量和(iv)心输出量。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)可延迟被诊断为肌肉萎缩症的受试者(或受试者组)的以下一项或多项的任意下降的发作：(i)射血分数；(ii)缩短分数；(iii)心搏量和(iv)心输出量。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)可延迟受试者(或受试者组)的心肌纤维化的发作或延迟其进展。

肽、肽混合物和/或其他治疗剂/药物可以通过任何已知或未来开发的施用模式施用。例如，施用可以是经口施用。施用可以是全身性施用。施用可以是皮下施用。施用可以是静脉内施用。施用可以是局部、腹膜内、皮内、经皮、眼科、鞘内、脑室内、离子导入、经粘膜、玻璃体内、鼻内或肌肉内施用。在一些实施例中，肽、肽混合物和/或其他治疗剂/药物被分别、依次或同时施用。在一些实施例中，将肽或肽混合物与另一种治疗剂一起施用会产生协同治疗效果。

在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续6周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续12周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续24周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续48周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续72周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续96周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续2年或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续3年或更长时间。在一些实施例中，施用肽或肽混合物直到没有观察到持续的治疗效益。在一些实施例中，施用肽或肽混合物直到受试者的生命结束或接近生命结束。在一些实施例中，受试者是人，并且一旦诊断或观察到肌肉萎缩症的症状，就开始施用肽，并在受试者的一生中持续施用。

肽或肽混合物可以任何合理的时间间隔施用。施用(即给药)间隔将取决于几个因素，包含施用模式、待施用的剂量、活性成分的制剂、制剂的毒性以及受试者的任何过敏或其他特征。本领域技术人员将能够确定适当的给药间隔。在一些实施例中，给药将大约每天一次发生。在一些实施例中，给药将大约每天两次发生。在一些实施例中，给药将大约每天三次发生。在一些实施例中，给药将大约每隔一天一次发生。在一些实施例中，给药将大约每周一次发生。在一些实施例中，给药将大约每隔一周一次发生。在一些实施例中，给药将大约每月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每隔一月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每三个月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每六个月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每九个月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每年一次发生。在一些实施例中，肽或肽混合物作为贮库制剂施用，该制剂包括被二氧化硅微粒包封或布置于二氧化硅微粒中的一种或多种肽。

如背景技术中所指出的，存在许多既定的用于解决与MD相关的心肌病症状的治疗/药物。这些包含例如施用皮质类固醇(例如，倍他米松、强的松、泼尼松龙、曲安奈德、甲基泼尼松龙或地塞米松)，施用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂(例如，贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫西普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利或群多普利)，施用β阻断剂(例如，醋丁洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、奈比洛尔或普萘洛尔)，施用血管紧张素受体阻断剂(ARB，例如，阿齐沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦、奥美沙坦、替米沙坦和缬沙坦)和/或施用增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，那些正在接受磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO治疗的受试者)。因此，在一些实施例中，本文所述的方法可以进一步涉及与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(下文更详细地定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)ARB，(iv)β阻断剂；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO)。

因此，在一些实施例中，本文所述的方法可进一步涉及与增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物联合施用本文所述的肽或肽混合物。例如，在一些实施例中，本文所述的方法可进一步涉及与Exondys

(Eteplirsen)联合施用肽或肽混合物。进一步地，在一些实施例中，本文所述的方法可进一步涉及与Vyondys 53^TM(Golodirsen)联合施用肽或肽混合物。进一步地，在一些实施例中，本文所述的方法可进一步涉及与Amondys 45^TM(Casimersen)联合施用肽或肽混合物。在一些实施例中，与增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Amondys 45^TM(Casimersen))或PPMO)联合施用的肽是H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或其羧酸盐形式H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH(或上述任何一种的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体)。此类药物组合可能具有协同作用，因为在增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物提高受试者的行走和运动能力时，肽(或肽混合物)的施用可以缓解这种增加的身体活动对心脏施加的至少一些额外压力，从而抑制或延迟与肌肉萎缩症相关的心脏疾病和/或心肌病的发作和/或进展。在药物组合允许受试者接受更高剂量的增加抗肌萎缩蛋白产生的药物，而不伴随对受试者心脏的有害影响的情况下，该组合也可能被认为具有协同作用。在药物组合在改善心脏功能的同时也改善受试者的骨骼肌功能和行走能力，超过单独施用每种药物的观察结果的情况下，该组合也可能被认为具有协同作用。例如，在肽或肽混合物解决线粒体功能障碍，从而增加可用于为肌肉(包含心肌)提供动力的ATP时，其他药物(例如，Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Amondys45^TM(Casimersen))增加肌肉中的抗肌萎缩蛋白水平，从而改善整个肌肉结构和功能。

方法和治疗：

在一个方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中治疗心肌病的体征、症状或严重程度的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文更详细描述的治疗活性肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。在一些实施例中，受试者带有影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在一些实施例中，此方法进一步包括与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(如本文所定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)和ARB；(iv)β阻断剂；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys53^TM)或Casimersen(Amondys45^TM))或PPMO)。在一些实施例中，共同施用是同时的，如通过IV注射同时施用。在一些实施例中，共同施用是同时的，但通过不同的施用途径进行，如通过IV注射施用增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物，同时通过例如皮下注射或长期全身释放贮库制剂的其他施用途径施用肽或肽混合物。

在另一方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中抑制心肌病的体征、症状或严重程度的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文更详细描述的治疗活性肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。在一些实施例中，受试者带有影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在一些实施例中，此方法进一步包括与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(如本文所定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)β阻断剂；和(iv)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO)。在一些实施例中，共同施用是同时的，如通过IV注射同时施用。在一些实施例中，共同施用是同时的，但通过不同的施用途径进行，如通过IV注射施用增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物，同时通过例如皮下注射或长期全身释放贮库制剂的其他施用途径施用肽或肽混合物。

在又一个方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中预防心肌病的体征、症状或严重程度的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文更详细描述的治疗活性肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。在一些实施例中，受试者带有影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在一些实施例中，此方法进一步包括与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(如本文所定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)和ARB；(iv)β阻断剂；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

在再一个方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中改善心肌病的体征、症状或严重程度的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文更详细描述的治疗活性肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。在一些实施例中，受试者带有影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在一些实施例中，此方法进一步包括与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(如本文所定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)ARB；(iv)β阻断剂；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

在又一方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中延迟心肌病的体征、症状或严重程度的发作的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文更详细描述的治疗活性肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。在一些实施例中，受试者带有影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在一些实施例中，此方法进一步包括与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(如本文所定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)β阻断剂；(iv)ARB；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

在再一个方面，本公开提供了在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中延迟心肌纤维化的发作的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文更详细描述的治疗活性肽或肽混合物，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体。在一些实施例中，受试者带有影响抗肌萎缩蛋白的产生和/或功能的基因置换。在一些实施例中，此方法进一步包括与以下一种或多种治疗剂联合施用肽或肽混合物(如本文所定义)：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)β阻断剂；(iv)ARB；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

按照本方法治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包含例如农场动物，如绵羊、猪、牛和马；宠物，如狗和猫；实验室动物，如大鼠、小鼠和兔。在一些实施例中，哺乳动物是非人灵长类动物。在一些实施例中，哺乳动物是人。

所述肽或肽混合物可以单独施用，在组合物或制剂中施用，或与一种或多种额外治疗剂联合施用。在一些实施例中，组合物用作药剂或用于制备药剂，所述药剂用于：(i)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中治疗心肌病的体征、症状或严重程度；(ii)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中抑制心肌病的体征、症状或严重程度；(iii)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中预防心肌病的体征、症状或严重程度；(iv)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中改善心肌病的体征、症状或严重程度；或(v)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中延迟心肌病的体征、症状或严重程度的发作。在一些实施例中，组合物用作药剂或用于制备药剂，所述药剂用于在受试者中减少心肌纤维化的数量和/或延迟其发作。在一些实施例中，该用途进一步包括，与上述用于在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗、抑制、预防、改善心肌病的体征、症状或严重程度或延迟心肌病的体征、症状或严重程度的发作的药剂，其他增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药剂(例如，包括磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO的药剂)联合使用。在一些实施例中，受试者是人。

在一些实施例中，肽的肽混合物在贮库制剂(下文讨论)中施用的，如基于二氧化硅的贮库制剂，其中一种或多种肽被包封/封装在随着时间的推移缓慢释放一种或多种肽(例如在几天、几周或几个月内持续和/或控制释放)的二氧化硅颗粒(纳米颗粒或微粒)中。例如，肽的贮库制剂可在皮下注射，以便向受试者提供一种或多种肽的长期全身性释放。

施用肽(或肽混合物)或包括肽的组合物可表现出对施用肽(或肽混合物)或组合物的受试者的心脏的各种有益影响。例如，相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽或组合物可增加受试者(或受试者组)的射血分数。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽或组合物可以增加受试者(或受试者组)的缩短分数。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽或组合物可以增加受试者(或受试者组)的心搏量。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽或组合物可以增加受试者(或受试者组)的心输出量。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽或组合物可降低受试者(或受试者组)的心肌纤维化或延迟其发作。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽或组合物可增加受试者(或受试者组)的以下中的两项或更多项：(i)射血分数；(ii)缩短分数；(iii)心搏量；(iv)心输出量和(v)心肌纤维化。相对于未接受治疗的受试者(或未接受治疗的受试者对照组)，施用肽(或肽混合物)或组合物可延迟被诊断为肌肉萎缩症的受试者(或受试者组)的以下一项或多项的任意下降的发作：(i)射血分数；(ii)缩短分数；(iii)心搏量和(iv)心输出量；或者延迟心肌纤维化的发作。

肽和肽混合物：

上述方法可以用肽或肽混合物进行实践。适合用于上述方法的肽是通式A的肽或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体，其中式A是：

其中每个R₁独立地是H或-CH₃；R₂是-OH或-NH₂；X_a和Y_a各自独立地选自

在一些实施例中，通式A的肽是式A-1的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-2的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-3的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-4的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-5的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-6的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-7的肽：

在一些实施例中，通式A的肽是式A-8的肽：

在一些实施例中，上述肽中两种或更多种的混合物用作治疗剂。此类混合物可以有意地存在(例如通过在合成后混合肽)或偶然地存在(例如通过C末端酰胺水解为C末端羧酸)。每当本文提到‘肽或肽混合物’时，都暗示并意指所述“肽或肽混合物”的每个单独的肽可以作为游离酸/碱存在、以两性离子形式存在或以任何盐形式存在，包含以药学上可接受的盐形式存在(例如参见：A-1和A-2的各种盐形式的图2和3)。

肽合成：

肽可以通过本领域众所周知的任何方法合成。肽可以用固相合成方法制备。肽可以通过使用溶液相方法合成。合适的化学合成肽的方法包含例如WO 2004/070054、WO2018/03490、WO 2019/099481、WO 2018/187400或WO 2019/118878中任何一项所述的方法。在一些实施例中，肽是C-末端酰胺，并且在一些实施例中，肽是C-末端羧酸。具有C末端酰胺的肽可以通过简单的水解转化为包括C末端酸的肽，如下文实例5所述。

例如，本文所公开的肽可以用任何肽合成方法来制备，如传统的液相肽合成或固相肽合成，或借助自动肽合成仪通过肽合成来制备(Kelley等人，《遗传学工程原理和方法(Genetics Engineering Principles and Methods)》，Setlow,J.K.编辑，PlenumPressNY.(1990)Vol.12,pp.1-19；Stewart等人,《固相肽合成(Solid-Phase PeptideSynthesis)》(1989)W.H.；Houghten,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》USA(1985)82:p.5132；Stuart和Young，《固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)》,第二版,Pierce Chemical Company(1984)和《酶促方法(Methods Enzymol.)》,289,AcademicPress,Inc.,New York(1997))。这样产生的肽可以通过常规方法收集或纯化，例如色谱法，如凝胶过滤色谱法、离子交换柱色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法，以及HPLC、硫酸铵分级沉淀、超滤和免疫吸附。

在固相肽合成中，肽通常从氨基酸链的羰基侧(C末端)到氨基侧(N末端)进行合成。在某些实施例中，受氨基保护的氨基酸通过氨基酸的羧基通常经由酯或酰胺键并且任选地经由连接基团与固体载体材料共价结合。氨基可以被脱保护，并使用偶联试剂与第二个受氨基保护的氨基酸的羰基反应(即“偶联”)，从而产生与固体载体结合的二肽。通常在固相合成中，在偶联之后，会进行封端步骤以封端任何未反应的胺基团(使任何未反应的胺基团失去活性)。这些步骤(即脱保护、偶联和任选地封端)可以重复进行以形成所需的肽链。一旦所需的肽链完成，肽就可以从固体载体上裂解。

在某些实施例中，在氨基酸残基的氨基上使用的保护基团包含9-芴甲氧基羰基(Fmoc)和叔丁氧羰基(Boc)。用碱从氨基末端去除Fmoc基团，而用酸去除Boc基团。在替代实施例中，氨基保护基团可以是甲酰基；丙烯酰基(Acr)；苯甲酰基(Bz)；乙酰基(Ac)；三氟乙酰基；芳烷氧基羰基类型的取代的或未取代的基团，如苄氧基羰基(Z、cbz或Cbz)、对氯苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、2(对联苯基)异丙氧基羰基、2-(3,5-二甲氧基苯基)异丙氧基羰基、对苯基偶氮苄氧基羰基、三苯基膦酰基乙基氧基羰基或9-芴甲氧基羰基(Fmoc)；烷氧基羰基类型的取代的或未取代的基团，如叔丁氧基羰基(BOC)、叔戊基氧基羰基、二异丙基甲基氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、2甲基磺酰基乙基氧基羰基或2,2,2-三氯乙基氧基羰基；环烷氧基羰基类型的基团，如环戊基氧基羰基、环己基氧基羰基、金刚烷基氧基羰基或异冰片基氧基羰基；以及含杂原子的基团，如苯磺酰基、对甲苯磺酰基、均三甲苯磺酰基、甲氧基三甲基苯基磺酰基、2-硝基苯磺酰基、2-硝基苯亚磺酰基、4-硝基苯磺酰基或4-硝基苯亚磺酰基。

许多氨基酸在侧链中携带反应性官能团。在某些实施例中，保护此类官能团以防止官能团与进入的氨基酸反应。与这些官能团一起使用的保护基团必须对肽合成的条件稳定，但是可在从固体载体裂解肽之前、之后或同时除去。此外还参考以下文献作为对肽合成中常用保护基团的全面综述：Isidro-Llobet,A.,Alvarez,M.,Albericio,F.,“氨基酸保护基团(Amino Acid-Protecting Groups)”；《化学综述(Chem.Rev.)》,109:2455-2504(2009)。

在某些实施例中，用于固相肽合成方法中的固体载体材料是凝胶型载体，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺或聚乙二醇。可替代地，可将如多孔玻璃、纤维素纤维或聚苯乙烯的材料在其表面上官能化以提供用于肽合成的固体载体。

可用于本文所讨论的固相或溶液相肽合成中的偶联试剂通常是碳二亚胺试剂。碳二亚胺试剂的实例包含但不限于N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)及其HCl盐(EDC.HCl)、N-环己基-N'-异丙基碳二亚胺(CIC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-叔丁基-N'-甲基碳二亚胺(BMC)、N-叔丁基-N'-乙基碳二亚胺(BEC)、双[[4-(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烯基)]-甲基]碳二亚胺(BDDC)和N,N-二环戊基碳二亚胺。DCC是优选的偶联试剂。其他偶联试剂包含(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)和(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，一般与有机碱如N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和受阻的吡啶类碱如卢剔啶或可力丁联合使用。

在一些实施例中，氨基酸可以通过形成N-羧酸酐而被激活以进行偶联，如Fuller等人，尿烷保护的α-氨基酸N-羧酸酐和肽合成(Urethane-Protectedα-Amino Acid N-Carboxyanhydrides and Peptide Synthesis),《生物聚合物(肽科学)(Biopolymers(Peptide Science))》,Vol.40,183-205(1996)；和WO 2018/034901中所述。此类肽合成方法可用于通过溶液相或固相方法生产本文所公开的肽。

盐形式(其中一些是药学上可接受的盐)和其他形式：

式A的化合物(包含但不限于A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7和A-8)可以以各种形式存在，如盐形式(如药学上可接受的盐形式)、互变异构体形式、溶剂化物形式和/或水合物形式。

例如，图2说明了化合物A-2可以采取的各种形式，并且图3说明了化合物A-1可以采取的各种形式。参照图2，(20)说明了化合物A-2的单碱盐形式，其中C末端羧酸盐已被电离为其碱盐。如图所示，由YOH代表的碱性通用盐可以电离产生Y+和OH-，从而电离化合物A-2(21)以形成(20)。由YOH代表的通用碱性盐可以是例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)或氢氧化锂(LiOH)。单碱盐形式(20)可以用酸质子化以形成化合物A-2(21)。然而，化合物A-2(21)也可以以两性离子形式(22)表示，这是由于质子在羧酸盐和一个碱性基团之间的内部分布造成的。化合物A-2((21)或(22))可以进一步用单一当量的酸(例如用HX表示，其中H+是质子，并且X-代表反离子并且由如HCl、HBr或HI的酸体现)质子化，从而产生单酸盐(23)。单酸盐(23)可以进一步用另一当量的酸来酸化，从而产生双酸盐(24)。双酸盐(24)可以进一步用另一当量的酸来酸化，从而产生三酸盐(25)。本领域的技术人员将理解，通过使用适量的酸或碱容易实现各种盐形式之间的这些转换。本领域的技术人员将进一步理解，盐形式之间的此类转换也适用于由式A代表的任何化合物，包含但不限于化合物A-1、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8。

肽可被配制成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”意指由碱或酸制备的盐，该盐在施用于患者如哺乳动物上是可接受的(例如，对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，可以理解的是，盐不需要是药学上可接受的盐，如不意图施用于患者的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱以及药学上可接受的无机或有机酸。另外，当肽同时含有碱性部分(如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(如羧酸或四唑)时，可以形成两性离子，并且包含在如本文所用的术语“盐”内。衍生自药学上可接受的无机碱的盐包含铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、三价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包含伯胺、仲胺和叔胺的盐，包含取代的胺、环胺、天然存在的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海巴明、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。衍生自药学上可接受的无机酸的盐包含以下各酸的盐：硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、氨基磺酸和硫酸。衍生自药学上可接受的有机酸的盐包含以下各酸的盐：脂肪族羟基酸(例如柠檬酸、葡糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族单羧酸(例如乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如富马酸、马来酸、草酸和琥珀酸)、葡糖醛酸、杏仁酸、粘液酸、烟碱酸、乳清酸、双羟酸、泛酸、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、1,2-乙烷二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、甲烷磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、羟萘甲酸等。在一些实施例中，药学上可接受的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐。

本公开的某些化合物/肽可以非溶剂化物形式和溶剂化物形式(包含水合形式)存在。例如，由于合成后很难或不可能从肽中去除所有的溶剂，所以可能存在溶剂化物形式。一般来说，溶剂化物形式等同于非溶剂化物形式，并涵盖在本公开的范围内。

本公开的某些化合物/肽可以结晶形式、多种结晶形式、无定形形式或上述的任何组合存在。本公开的某些化合物/肽可以各种互变异构体形式存在。本公开的某些化合物/肽可以各种盐形式或盐形式的混合物存在。一般来说，本文公开的所有化合物/肽的物理形式对于本公开所设想的用途来说都是等同的，并旨在本公开的范围内。

手性/立体化学考虑：

本文所述的肽/化合物可以包括一个或多个不对称中心，因此可以以各种异构体形式存在，例如，对映异构体和/或非对映异构体(即立体异构体)。所示结构(包含权利要求)中的手性中心可在本文中通过使用星号(*)来标识。例如，本文所述的化合物可以是单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或者可以是立体异构体混合物的形式，包含外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可以通过本领域技术人员已知的方法(包含手性高压液相色谱法(HPLC)和手性盐的形成和结晶)从混合物中分离；或优选的异构体可以通过不对称合成来制备。参见，例如Jacques等人，《对映异构体、外消旋体和拆分(Enantiomers,Racemates and Resolutions)》(Wiley lnterscience,NewYork,1981)；Wilen等人,《四面体(Tetrahedron)》33:2725(1977)；Eliel,《碳化合物的立体化学(Stereochemistry of Carbon Compounds)》(McGraw-Hill,NY,1962)；和Wilen,《拆分试剂和光学拆分表(Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions)》p.268(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。本申请的公开另外涵盖本文所述的化合物作为基本上不含其他异构体的单独异构体，并可替代地作为各种异构体的混合物。

如本文所用，纯对映异构体化合物基本上不含该化合物的其他对映异构体化或立体异构体(即，对映体过量)；因为纯度是相对术语，从某种意义上说要达到100％纯度非常困难。换言之，化合物的“S”型基本上不含化合物的“R”型，并且因此是“R”型的对映体过量。关于氨基酸(更常以“D”和“L”对映异构体描述)，应理解，对于“D”-氨基酸，构型是“R”，对于“L”-氨基酸，构型是“S”。在一些实施例中，‘基本上不含’是指：(i)含有少于2％“S”型的“R”型化合物的等分试样；或(ii)含有少于2％“R”型的“S”型化合物的等分试样。术语“对映异构体纯的”或“纯对映异构体”表示化合物包括大于90重量％、大于91重量％、大于92重量％、大于93重量％、大于94重量％、大于95重量％、大于96重量％、大于97重量％、大于98重量％、大于99重量％、大于99.5重量％或大于99.9重量％的特别确定的对映异构体(如，与其他对映异构体相比)。在某些实施例中，重量基于化合物的所有对映异构体或立体异构体的总重量。

在本文提供的组合物中，对映异构体纯的化合物(例如，肽)可以与其他活性或非活性成分一起存在。例如，包括对映异构体纯的“R”型化合物的药物组合物可以包括例如约90％的赋形剂和约10％的对映异构体纯的“R”型化合物。在某些实施例中，此类组合物中的对映异构体纯的“R”型化合物可以例如按化合物总重量计包括至少约95重量％的“R”型化合物和至多约5重量％的“S”型化合物。例如，包括对映异构体纯的“S”型化合物的药物组合物可包括例如约90％的赋形剂和约10％的对映异构体纯的“S”型化合物。在某些实施例中，此类组合物中的对映异构体纯的“S”型化合物可以例如按化合物的对映异构体总重量计包括至少约95重量％的“S”型化合物和至多约5重量％的“R”型化合物。在某些实施例中，活性成分可以与很少的赋形剂或载体一起配制，或者不与赋形剂或载体一起配制。

组合物、制剂和给药：

本公开进一步涉及可用于所公开的方法的组合物，其中组合物包括至少一种式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)，但也可包含下列化合物/治疗剂中的或多种：(i)皮质类固醇；(ii)ACE抑制剂；(iii)β阻断剂；(iv)ARB；和(v)增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药物(例如，磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO)。此类组合物可以例如通过将选定的化合物/肽(或肽混合物)溶解或悬浮在水、缓冲液、洗涤剂、赋形剂、有机溶剂或上述两种或更多种的混合物中来形成。在一些实施例中，组合物可以通过将选定的化合物/肽溶解或悬浮在水中来制备。在一些实施例中，组合物可以通过将选定的化合物/肽溶解或悬浮在缓冲液中来制备。在一些实施例中，组合物可以通过将选定的化合物/肽溶解或悬浮在赋形剂中来制备。在一些实施例中，组合物可以通过将选定的化合物/肽溶解或悬浮在药学上可接受的载体中来制备。在一些实施例中，组合物或制剂是药剂。

肽或肽混合物以及任选地其他治疗剂/药物可以本身(纯)或以药学上可接受的盐的形式施用。当用于医药时，盐应是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐。当本公开的化合物含有相对酸性的官能团时，可通过使此类化合物的中性形式与足量的所需碱(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触来获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包含钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本公开的化合物含有相对碱性的官能团时，可通过使此类化合物的中性形式与足量的所需酸(纯的或在合适的惰性溶剂中)接触来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包含那些衍生自无机酸的盐，如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸、碳酸、一氢碳酸或磷酸等以及那些衍生自有机酸的盐，如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、草酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸、三氟乙酸等。还包含氨基酸如精氨酸等的盐，以及有机酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如Berge等人，《药物科学杂志(Journal ofPharmaceutical Science)》66:1-19(1977))。本公开的某些特定化合物可能同时含有碱性和酸性官能团，使该化合物可以转化为碱加成盐或酸加成盐(参见例如：图2、3)。这些盐可以通过本领域技术人员已知的方法制备。本领域技术人员已知的其他药学上可接受的载体也适合与本技术一起使用。合适的缓冲剂可包含：乙酸和盐(1-2％w/v)；柠檬酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。合适的防腐剂包含苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。

在一些实施例中，组合物或制剂可用作药剂或用于制备药剂，所述药剂用于：(i)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中治疗心肌病的体征、症状或严重程度；(ii)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中抑制心肌病的体征、症状或严重程度；(iii)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中预防心肌病的体征、症状或严重程度；(iv)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中改善心肌病的体征、症状或严重程度；或(v)在患有肌肉萎缩症(如杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症)的哺乳动物受试者中延迟心肌病的体征、症状或严重程度的发作。在一些实施例中，组合物或制剂可用作药剂或用于制备药剂，所述药剂用于减少心肌纤维化的数量或延迟心肌纤维化的发作。在一些实施例中，该用途进一步包括，与上述用于在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗、抑制、预防、改善心肌病的体征、症状或严重程度或延迟心肌病的体征、症状或严重程度的发作的药剂，其他增加肌肉中抗肌萎缩蛋白产生的药剂(例如，包括磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM))或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO的药剂)联合使用。

本公开的组合物和方法可用于治疗有此需要的个体/受试者。在某些实施例中，个体是哺乳动物，如人或非人哺乳动物。当向动物(如人)施用时，组合物或化合物/肽优选地以药物组合物的形式施用，该药物组合物包括例如肽或肽混合物和赋形剂或药学上可接受的载体。

如上所述，“有效量”是指足以实现所需生物学效应的活性化合物(例如，单独或配制的肽或肽混合物)的任何量。结合本文提供的教导，通过在各种活性化合物和加权因子(如效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的严重程度和施用模式)中进行选择，可以计划有效的防止性(即预防性)或治疗性治疗方案，它不会引起实质性的不希望的毒性，但对治疗特定受试者的特定病况或疾病仍是有效的。用于任何特定适应症的有效量可以根据如所治疗的疾病或病况、所施用的本申请的特定化合物、受试者的大小、或疾病或病况的严重程度的因素而变化。有效量可以在临床前试验和/或临床试验期间通过医师和临床医师熟悉的方法来确定。本领域普通技术人员可以凭经验确定本申请的特定肽或肽混合物和/或其他治疗剂的有效量，而无需过度实验。可以使用最大剂量，即根据一些医学判断的最高安全剂量。可以考虑每天多个剂量以实现适当的全身化合物水平。适当的全身水平可以通过例如测量患者的药物峰值或持续血浆水平来确定。“剂量(Dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换使用。剂量可以由自己、他人或通过装置(如，泵)来施用。

对于本文所述的任何化合物(例如肽或肽混合物)，治疗有效量可以从动物模型中初步确定。治疗有效剂量也可以根据已在人类中测试的化合物和已知表现出类似药理活性的化合物(如其他相关的活性剂)的人类数据来确定。肠胃外施用可能需要更大的剂量。可以根据所施用的化合物的相对生物利用度和效力来调整应用剂量。根据上述方法和本领域众所周知的其他方法调整剂量以达到最大功效完全在普通技术人员的能力范围之内。

用于疗法或预防的肽/化合物(单独或配制成药物组合物)可以在合适的动物模型系统中进行测试。适合的动物模型系统包含但不限于在人类受试者中测试之前的大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔、猪、小型猪等。在体内测试中，在对人类受试者施用之前，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。

任何治疗肽、化合物、组合物(如制剂或药剂)、其他治疗剂、或其混合物的剂量、毒性和治疗功效可以通过例如用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且所述治疗指数可以被表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是有利的。虽然可以使用表现出毒副作用的化合物，但应注意设计将此类化合物靶向到受影响组织的位点的递送系统，以最小化对未感染细胞的潜在损害并从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于制定用于在人类中使用的剂量范围。此类化合物的剂量可以在包含ED50在内的循环浓度范围内，很少毒性或没有毒性。根据所用剂型和所用施用途径，剂量可在此范围内变化。对于该方法中使用的任何化合物，治疗有效的剂量可以最初从细胞培养测定中估算。可以在动物模型中制定剂量以实现循环血浆浓度范围，该范围包含在细胞培养物中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于准确确定人中的有用剂量。血浆中的含量可以通过例如任选与质谱法检测相结合的高效液相色谱法(例如LC/MS)测量。

有效量可在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医生熟悉的方法确定。对本文所公开的方法有用的有效量的化合物/肽可以通过许多众所周知的施用药物化合物的方法施用给有此需要的哺乳动物。肽可以全身或局部施用。

通常，化合物/肽的足以实现治疗性或防止性效果的有效量范围为每天每千克体重约0.000001mg至每天每千克体重约10,000mg。适合地，剂量范围为每天每千克体重约0.0001mg至每天每千克体重约100mg。例如，剂量可以是每天、每两天或每三天1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在每周、每两周或每三周1mg/kg至10mg/kg的范围内。在一个实施例中，肽的单剂量范围可以为每kg体重0.001微克至10,000微克。在一个实施例中，在载体中的肽浓度范围为每递送一毫升0.2微克至2000微克。示例性治疗方案需要每天一次或每周一次施用。

在一些实施例中，肽的治疗有效量可被定义为靶组织(例如，心脏组织)处的10^-12摩尔至10^-6摩尔、例如大约10^-7摩尔的肽浓度。此浓度可通过0.001mg/kg至100mg/kg的全身剂量或按体表面积计算的等效剂量来递送。将优化剂量时间表以维持靶组织处的治疗浓度，如通过每天或每周一次施用，但也包含连续施用(例如，肠胃外输注或经皮施加)。

在某些实施例中，静脉内施用化合物(例如，肽或肽混合物)可通常为0.1mg/kg/天至20mg/kg/天。在一个实施例中，静脉内施用化合物可通常为0.1mg/kg/天至2mg/kg/天。在一个实施例中，静脉内施用化合物可通常为0.5mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个实施例中，静脉内施用化合物可通常为1mg/kg/天至20mg/kg/天。在一个实施例中，静脉内施用化合物可通常为1mg/kg/天至10mg/kg/天。

在某些实施例中，皮下施用化合物(例如，肽或肽混合物)可通常为0.1mg/kg/天至20mg/kg/天。在一个实施例中，皮下施用化合物可通常为0.1mg/kg/天至2mg/kg/天。在一个实施例中，皮下施用化合物可通常为0.5mg/kg/天至5mg/kg/天。在一个实施例中，皮下施用化合物可通常为1mg/kg/天至20mg/kg/天。在一个实施例中，皮下施用化合物可通常为1mg/kg/天至10mg/kg/天。在一个实施例中，皮下施用化合物可通常为0.5mg/kg/天至1.0mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为10mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为9mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为8mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为7mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为6mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为5mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为4mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为3mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为2mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为1mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.9mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.8mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.75mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.7mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.6mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.5mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.4mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.3mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.25mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.2mg/kg/天。在一些实施例中，皮下施用化合物可通常为0.1mg/kg/天。一般来说，对于人类受试者来说，化合物的每日口服剂量将从每天约0.01毫克/kg到每天1000毫克/kg。预计在0.5毫克/kg至50毫克/kg范围内，每天一次或多次施用的口服剂量将产生治疗成果。根据施用模式，可适当调整剂量以达到所需的局部或全身的药物水平。例如，预期每天施用的静脉内剂量将是一个数量级到几个数量级以下。如果在此类剂量下受试者体内的响应不充分，在患者耐受允许的范围内，可以使用甚至更高的剂量(或有效的更高剂量，通过不同的更局部的递送途径递送)。考虑每天多个剂量以达到适合的全身化合物水平。

本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量、施用模式和时机，包含但不限于疾病或病症的严重程度、以前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的本文所述治疗组合物治疗受试者可以包含单次治疗或一系列治疗。

肽、肽混合物或其他治疗剂/药物可以通过任何已知或未来开发的施用模式施用。例如，施用可以是经口施用。施用可以是全身性施用。施用可以是皮下施用。施用可以是静脉内施用。施用可以是局部、腹膜内、皮内、经皮、眼科、鞘内、脑室内、离子导入、经粘膜、玻璃体内、鼻内或肌肉内施用。在一些实施例中，肽或肽混合物和其他治疗剂/药物被分别、依次或同时施用。在一些实施例中，将肽或肽混合物与另一种治疗剂一起施用会产生协同治疗效果。

在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续6周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续12周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续24周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续48周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续72周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续96周或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续2年或更长时间。在一些实施例中，将肽或肽混合物施用于受试者，持续3年或更长时间。在一些实施例中，施用肽或肽混合物直到没有观察到持续的治疗效益。在一些实施例中，施用肽或肽混合物直到受试者的生命结束。

肽或肽混合物可以任何合理的时间间隔施用。施用(即给药)间隔将取决于几个因素，包含施用模式、待施用的剂量、活性成分的制剂、制剂的毒性以及受试者的任何过敏或其他特征。本领域技术人员将能够确定适当的给药间隔。在一些实施例中，给药将大约每天一次发生。在一些实施例中，给药将大约每天两次发生。在一些实施例中，给药将大约每天三次发生。在一些实施例中，给药将大约每隔一天一次发生。在一些实施例中，给药将大约每周一次发生。在一些实施例中，给药将大约每隔一周一次发生。在一些实施例中，给药将大约每月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每隔一月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每三个月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每六个月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每九个月一次发生。在一些实施例中，给药将大约每年一次发生。

药物组合物(例如，制剂或药剂)可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。可以包含谷胱甘肽和其他抗氧化剂以防止氧化。在许多情况下，在组合物中包含等渗剂将是有利的，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来延长可注射组合物的吸收。

用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液(例如，制剂或药剂)可以包含以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠来调节。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。为方便患者或治疗医师，给药制剂可在治疗过程(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天；2周、3周、4周、5周、6周、7周；2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月或更长时间的治疗)期间单独提供或提供在含有所有必须设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的试剂盒中。

全身性制剂包含经设计用于通过注射(例如，皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射)施用的那些，以及经设计用于经皮、经口腔粘膜、或经肺施用的那些。

对于静脉内和其他肠胃外施用途径，本申请的化合物(例如，肽或肽混合物)可配制成冻干制剂、脂质体嵌入的或脂质体包封的活性化合物的冻干制剂、水性悬浮液中的脂质复合物、或盐复合物。冻干制剂通常在施用前不久重构在适合的水溶液中，例如在无菌水或盐水中。

适用于注射的药物组合物(例如，制剂或药剂)可包含无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包含生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，帕西波尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。用于通过注射施用的组合物通常是无菌的，并且在易于注射的程度下应该是流体的。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须防止如细菌和真菌的微生物的污染作用。

无菌可注射溶液(例如，制剂或药剂)可通过将所需量的活性化合物(例如，肽或肽混合物)与上面列举的成分中的一种或组合(根据需要)掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和来自上述列举的那些的所需的其他成分的无菌媒介物中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包含真空干燥和冷冻干燥，这可以从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。

当需要全身递送时，治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或药物组合物可以被配制用于通过注射，例如通过团注注射或连续输注(例如，通过IV注射或经由泵以在规定的时间内计量施用)进行肠胃外施用。注射用制剂可以以单位剂型存在，如在安瓿或多剂量容器中，并添加防腐剂。组合物可以采取如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配方剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包含呈水溶性形式的活性化合物(例如，肽或肽混合物)的水溶液。此外，可以将治疗性化合物的悬浮液制备成适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒介物包含脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以含有适合的稳定剂或增加治疗性化合物的溶解度以允许制备高浓缩的溶液的试剂。

对于经口施用，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来容易地配制化合物(例如，肽或肽混合物)。此类载体使得本申请的化合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、悬浮液等，以供待治疗的受试者经口消化。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、羧甲基淀粉

或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或硬脂酸盐；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄菏、水杨酸甲酯或橙子调味剂。

用于经口使用的药物制剂可以作为固体赋形剂获得，任选地研磨所得混合物，并在添加适合的辅助剂(如果需要)后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。适合的赋形剂特别是填充剂，如糖，包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，如例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，则可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐如藻酸钠。任选地，经口制剂也可以配制在盐水或缓冲液(例如，用于中和内部酸性条件的EDTA)中，或者可以在没有任何载体的情况下施用。

还特别考虑了上述的经口剂型，可以对其进行化学修饰，从而使衍生物的口服递送有效。通常，所考虑的化学修饰是将至少一个部分附接至治疗剂、成分和/或赋形剂，其中所述部分允许：(a)抑制酸水解；和(b)从胃或肠吸收到血流中。还希望增加治疗剂、成分和/或赋形剂的整体稳定性和增加体内循环时间。此类部分的实例包含：聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis,“可溶性聚合物-酶加和物(Soluble Polymer-Enzyme Adducts)”,《作为药物的酶(Enzymes as Drugs)》,Hocenberg和Roberts编辑,Wiley-Interscience,NewYork,N.Y.,pp.367-383(1981)；Newmark等人,《应用生物化学杂志(J Appl Biochem)》4:185-9(1982)。可以使用的其他聚合物是聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧辛环。如上所指定，对于药物用途，各种分子量的聚乙二醇(PEG)部分是适合的。

对于治疗剂、成分和/或赋形剂的制剂，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或大肠。本领域技术人员有可用的制剂，它们不会在胃中溶解，但会在十二指肠或肠的其他地方释放材料。优选地，通过保护本申请的化合物(或衍生物)或通过将生物活性材料释放到胃环境之外(如在肠中)，释放将避免胃环境的有害影响。

包衣或包衣混合物也可用于片剂上，其不意在用于免受胃的影响。这可以包含糖衣或使片剂更容易吞咽的包衣。胶囊剂可以由用于递送干的治疗剂(例如粉末)的硬壳(如明胶)组成；对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳材料可以是厚淀粉或其他可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片剂或片剂研磨剂，可以使用湿法聚集技术。

治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或药物组合物可以包含在制剂中作为细的多颗粒，其呈粒度约1mm至2mm的颗粒剂或球团剂形式。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉末剂、轻压塞或甚至片剂。治疗性化合物或药物组合物可以通过压制来制备。

着色剂和调味剂都可以包含在内。例如，可以配制本申请的化合物或药物组合物(或衍生物)，然后进一步包含在可食用产品中，如含有着色剂和调味剂的冷冻饮料。

可以稀释或增加治疗性化合物或药物组合物与惰性材料的体积。这些稀释剂可以包含碳水化合物，尤其是甘露糖醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性右旋糖酐和淀粉。某些无机盐也可用作填充剂，包含三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些可商购获得的稀释剂是

和

崩解剂可以包含在治疗性化合物或组合物的制剂中从而成为固体剂型。用作崩解剂的材料包含但不限于淀粉，包含基于淀粉的商业崩解剂Explotab。羟乙酸淀粉钠、阿尔伯特试剂

羧甲基纤维素钠、超支链淀粉、藻酸钠、明胶、橘皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土都可以使用。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉末胶可用作崩解剂和粘合剂，并且这些可包含粉末胶，如琼脂、梧桐树胶或黄蓍胶。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。

粘合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬片剂并且包含来自天然产物的材料，如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其他包含甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)都可以在醇溶液中用于颗粒化治疗剂。

抗摩擦剂可包含在治疗剂的制剂中，以防止在配制过程中出现粘连。润滑剂可以用作治疗剂和模具壁之间的层，并且这些可以包含但不限于：硬脂酸，包含其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。还可使用可溶性润滑剂，如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇^TM(Carbowax^TM)4000和6000。

可以添加助流剂，其会在配制过程中改善药物的流动特性并在压缩过程中有助于重新排列。助流剂可包含淀粉、滑石、气相二氧化硅、热解二氧化硅和水合硅铝酸盐。

为了有助于治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或组合物溶解到水性环境中，可以添加表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可以包含阴离子洗涤剂，如月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。可以使用的阳离子洗涤剂可包含苯扎氯铵和苄索氯铵。可作为表面活性剂包含在制剂中的潜在非离子洗涤剂包含聚桂醇400、聚乙二醇(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或作为不同比率的混合物存在于本申请的化合物或衍生物的制剂中。

可经口使用的药物制剂包含由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂掺混的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在适合的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。也可以使用经配制用于经口施用的微球。此类微球在本领域中已经被很好地定义。所有用于经口施用的制剂都应采用适合此类施用的剂量。

本文公开的化合物、肽、肽混合物和组合物可以包含在制剂中作为细的多颗粒，其呈粒度约1mm的颗粒剂或球团剂形式。用于胶囊施用的材料的制剂也可以是粉末剂、轻压塞或甚至片剂。制剂可以通过压制来制备。

对于颊施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

对于局部施用，化合物、肽或肽混合物可以配制成溶液、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、悬浮液等，如本领域所熟知的。

对于通过吸入施用，根据本申请使用的肽、化合物或组合物(例如，药剂)可以使用适合的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体)，以气溶胶喷雾呈递形式从加压包装或雾化器方便地递送。在一些实施例中，制剂、药剂或治疗性化合物可以以气溶胶喷雾的形式从含有适合的推进剂(例如，气体，如二氧化碳)的加压容器或分配器或者雾化器中递送。此类方法包括美国专利第6,468,798号中描述的那些。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。例如，用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊剂和药筒可被配制为含有治疗性化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

还考虑了本申请的治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或药物组合物的经鼻递送。经鼻递送允许本申请的治疗性化合物或药物组合物在将治疗性化合物或药物组合物施用给鼻后直接通过至血流，而无需将产物沉积在肺中。用于经鼻递送的制剂包含具有右旋糖酐或环右旋糖酐的那些。

对于经鼻施用，有用的装置是小而硬的瓶子，其附有计量剂量的喷雾器。在一些实施例中，通过将本申请方案的药物组合物吸入限定体积的腔室中来递送计量剂量，该腔室具有被制作成特定尺寸以当腔室中的液体被压缩时通过形成喷雾来使气溶胶制剂成气雾状喷洒的孔。压缩腔室以施用治疗性化合物或药物组合物。在特定的实施例中，腔室是活塞布置。此类装置是可商购获得的。

可替代地，使用具有被制作成特定尺寸以通过在挤压时形成喷雾来使气溶胶制剂成气雾状喷洒的孔或开口的塑料挤压瓶。开口通常位于瓶子的顶部，并且顶部通常呈锥形以部分适合鼻道，以有效施用气溶胶制剂。优选地，鼻吸入器将提供计量量的气溶胶制剂，用于施用测量剂量的治疗性化合物或药物组合物。

可替代地，治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或药物组合物可以是粉末形式，用于在使用前用适合的媒介物(例如，无菌无热原水)重构。

本文还考虑了本文公开的化合物、肽或肽混合物(或其盐、水合物、溶剂化物和/或互变异构体)的经肺递送。化合物、肽或肽混合物在吸入时被递送至哺乳动物的肺并穿过肺上皮层进入血流。其他关于吸入分子的报道包含Adjei等人,《药物研究(Pharm Res)》7:565-569(1990)；Adjei等人,《制药学国际杂志(Int J Pharmaceutics)》63:135-144(1990)(醋酸亮丙瑞林)；Braquet等人,《心血管药理学杂志(J Cardiovasc Pharmacol)》13(增刊5):143-146(1989)(内皮素1)；Hubbard等人,《内科学年鉴(Annal Int Med)》3:206-212(1989)(抗胰蛋白酶)；Smith等人,1989,《临床研究杂志(J Clin Invest)》84:1145-1146(a-1-蛋白酶)；Oswein等人,1990,“蛋白质气溶胶化(Aerosolization of Proteins)”,《呼吸道药物输送研讨会论文集II(Proceedings of Symposium on Respiratory DrugDelivery II)》,Keystone,Colorado,March,(重组人生长激素)；Debs等人,1988,《免疫学杂志(J Immunol)》140:3482-3488(干扰素γ和肿瘤坏死因子α)和Platz等人,美国专利第5,284,656号(粒细胞集落刺激因子；通过引用并入)。一种用于经肺递送药物以产生全身作用的方法和组合物描述于1995年9月19日授予Wong等人的美国专利第5,451,569号(通过引用并入)。

考虑在本发明的实践中使用为治疗产品的经肺递送而设计的广泛的机械装置，包含但不限于雾化器、计量剂量吸入器、和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。

适用于本发明实践的可商购获得的装置的一些特定实例是由Mallinckrodt,Inc.,圣路易斯，密苏里州制造的Ultravent^TM雾化器；由Marquest Medical Products,恩格尔伍德，科罗拉多州制造的

雾化器；由Glaxo Inc.,研究三角园区(ResearchTriangle Park)，北卡罗来纳州制造的

计量剂量吸入器；和由Fisons Corp.,贝德福德,Mass制造的

粉末吸入器。

所有此类装置都需要使用适合分配本文公开的化合物、肽或肽混合物的制剂。通常，每种制剂对于所用装置的类型是特定的，并且除了用于疗法中的常用稀释剂、佐剂和/或载体之外，还会涉及使用适当的推进剂材料。此外，考虑使用脂质体、微胶囊或微球、包合复合物或其他类型的载体。例如，脂质体递送体系是本领域已知的，参见例如，Chonn和Cullis,“脂质体药物递送系统的最新进展(Recent Advances in Liposome DrugDelivery Systems),”《生物技术的最新观点(Current Opinion in Biotechnology)》6:698-708(1995)；Weiner,“用于蛋白质递送的脂质体：选择制造和开发过程(Liposomes forProtein Delivery:Selecting Manufacture and Development Processes),”《免疫方法(Immunomethods)》,4(3):201-9(1994)；和Gregoriadis,“用于药物递送的工程脂质体：进展和问题(Engineering Liposomes for Drug Delivery:Progress and Problems),”《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》,13(12):527-37(1995)。Mizguchi等人,《癌症通讯(Cancer Lett.)》,100:63-69(1996)描述了使用融合脂质体在体内和体外向细胞输送蛋白质。化学修饰的化合物也可以根据化学修饰的类型或所用装置的类型制备成不同的制剂。

适于与喷射或超声波雾化器一起使用的制剂通常包括溶解在水中的本文公开的肽或肽混合物，浓度为每mL溶液约0.1mg至25mg的生物活性化合物(例如，肽或肽混合物)。该制剂还可以包含缓冲剂和单糖(例如，用于抑制剂稳定和调控渗透压)。雾化器制剂还可以含有表面活性剂以减少或防止由溶液在形成气溶胶时的雾化引起的化合物的表面诱导聚集。

与计量剂量吸入器装置一起使用的制剂通常包括细碎的粉末，该粉末含有借助表面活性剂悬浮在推进剂中的本文公开的肽或肽混合物。推进剂可以是为此目的使用的任何常规材料，如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包含三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷或它们的组合。适合的表面活性剂包含脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。

用于从粉末吸入器装置分配的制剂包括含有本文公开的肽或肽混合物的细碎干粉，并且还可以以便于来自装置的粉末分散的量(例如制剂的50重量％至90重量％)包含膨胀剂，如乳糖、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖或甘露糖醇。化合物(或衍生物)应该有利地以平均粒度小于10微米(μm)、最优选0.5μm至5μm的颗粒形式制备，以最有效地递送至肺深部。

除上述制剂外，肽或肽混合物也可配制成贮库制剂。此类长效制剂可以用合适的聚合物或疏水材料(例如在可接受的油中作为乳液)或离子交换树脂配制，或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐配制。

药物组合物还可包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。此类载体或赋形剂的实例包含但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。

适合的液体或固体药物制剂形式例如是用于吸入的水溶液或盐水溶液，被微囊化，被螺旋包埋，被包被在微观金颗粒上，被含在脂质体中，成喷雾状，是气溶胶，是用于植入皮肤中的团粒，或被干燥到将划入皮肤中的尖锐物体上。药物组合物还包含颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂、乳膏剂、滴剂或具有活性化合物缓释的制剂，其中制剂赋形剂和添加剂和/或辅助剂如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂通常如上所述使用。药物组合物适用于多种药物递送系统。对于用于药物递送的方法的简述，参见Langer R,《科学(Science)》249:1527-33(1990)。

肽或肽混合物可以提供在颗粒中。如本文所用的颗粒意指纳米颗粒或微粒/微球(或在一些情况下的较大颗粒)，其可以全部或部分地由本文所述的化合物或其他治疗剂组成。聚合物微球持续释放制剂的实例描述于PCT公开WO 99/15154(Tracy等人)，美国专利第5,674,534号和第5,716,644号(均属于Zale等人)，PCT公开WO 96/40073(Zale等人)和PCT公开WO 00/38651(Shah等人)，美国专利第5,674,534号和第5,716,644号和PCT公开WO 96/40073描述了含有红细胞生成素颗粒的聚合物基质，该颗粒被盐稳定以防止聚集。颗粒可以在被包衣(包含但不限于肠溶包衣)包围的核中含有治疗剂。肽或肽混合物也可以分散在整个颗粒中。肽或肽混合物也可以被吸附到颗粒中。颗粒可以具有任何级别的释放动力学，包含零级释放、一级释放、二级释放、延迟释放、持续释放、立即释放、以及它们的任何组合。除了肽或肽混合物之外，颗粒可以包含在药学和医学领域中常规使用的那些材料中的任一种，包含但不限于可侵蚀的、不可侵蚀的、可生物降解的或不可生物降解的材料或其组合。颗粒可以是微胶囊，其含有呈溶液或半固态的化合物。颗粒实际上可以是任何形状。

不可生物降解的和可生物降解的聚合物材料都可以用于制造用于递送肽或肽混合物的颗粒。此类聚合物可以是天然的或合成的聚合物。聚合物可以是天然的，如多肽、蛋白质或多糖，或者是合成的，如聚α-羟基酸。实例包含由例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体。特别感兴趣的生物粘附性聚合物包含在Sawhney H S等人(1993)《大分子(Macromolecules)》26:581-7(其教导内容并入本文)中描述的可生物侵蚀的水凝胶。这些包含聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、藻酸盐、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)和聚己内酯。

治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或其他治疗剂或其混合物可于载体系统中配制。载体可以是胶体系统。载体或胶体系统可以是脂质体，磷脂双层媒介物。在一个实施例中，治疗性化合物或其他治疗剂或其混合物可以包封在脂质体中，同时保持治疗性化合物或其他治疗剂或其混合物的完整性。本领域技术人员会理解，存在多种制备脂质体的方法。(参见Lichtenberg等人，《生物化学分析方法(Methods Biochem.Anal.)》,33:337-462(1988)；Anselem等人，《脂质体技术(Liposome Technology)》,CRC Press(1993))。脂质体制剂可以延迟清除并增加细胞摄取(参见Reddy,《药物治疗年鉴(Ann.Pharmacother.)》,34(7-8):915-923(2000))。例如，活性剂也可以加载到由药学上可接受的成分制备的颗粒中，所述成分包含但不限于可溶的、不溶的、可渗透的、不可渗透的、可生物降解的或胃滞留的聚合物或脂质体。此类颗粒包含但不限于纳米颗粒、可生物降解的纳米颗粒、微粒、可生物降解的微粒、纳米球、可生物降解的纳米球、微球、可生物降解的微球、胶囊、乳液、脂质体、胶束和病毒载体系统。

载体也可以是聚合物，例如可生物降解的、生物相容的聚合物基质。在一个实施例中，治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或其他治疗剂或其混合物可以嵌入聚合物基质中，同时保持组合物的完整性。聚合物可以是包封一种或多种治疗剂的微粒或纳米颗粒。聚合物可以是天然的，如多肽、蛋白质或多糖，或者是合成的，如聚α-羟基酸。实例包含由例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体。在一个实施例中，聚合物是聚乳酸(PLA)或聚乳酸/乙醇酸(PLGA)。聚合物基质可以以多种形式和尺寸制备和分离，包含微球和纳米球。聚合物制剂可以导致治疗效果的持续时间延长。(参见Reddy,《药物治疗年鉴(Ann.Pharmacother.)》,34(7-8):915-923(2000))。用于人生长激素(hGH)的聚合物制剂已用于临床试验。(参见Kozarich和Rich,《化学生物学(Chemical Biology)》,2:548-552(1998))。

聚合物微球持续释放制剂的实例描述于PCT公开WO 99/15154(Tracy等人)，美国专利第5,674,534号和第5,716,644号(均属于Zale等人)，PCT公开WO 96/40073(Zale等人)和PCT公开WO 00/38651(Shah等人)，美国专利第5,674,534号和第5,716,644号和PCT公开WO 96/40073描述了含有红细胞生成素颗粒的聚合物基质，该颗粒被盐稳定以防止聚集。

在一些实施例中，治疗性化合物(例如，肽或肽混合物)或其他治疗剂或其混合物与将保护治疗性化合物、其他治疗剂或其混合物免于从体内快速消除的载体一起制备，如控制释放制剂，包含植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂可以使用已知技术制备。该材料也可以商业获得，如从阿尔扎公司(Alza Corporation)和Nova制药公司获得。脂质体悬浮液(包含靶向特定细胞的脂质体，该脂质体具有针对细胞特异性抗原的单克隆抗体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如美国专利第4,522,811号所述。

治疗剂可含在控制释放系统中。术语“控制释放”旨在指其中药物从制剂中释放的方式和概况受到控制的任何含药物的制剂。这是指立即以及非立即释放制剂，其中非立即释放制剂包含但不限于持续释放制剂和延迟释放制剂。术语“持续释放”(也称为“延长释放”)以其常规意义使用，是指在延长的时间段内提供药物逐渐释放并且优选但不一定导致血液药物水平在延长的时间段内基本恒定的药物制剂。术语“延迟释放”以其常规意义使用，是指其中在施用制剂与药物从制剂中释放之间存在时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可能会或可能不会涉及药物在延长的时间段内的逐渐释放，并因此可能会或可能不会是“持续释放”。

长期持续释放植入物或贮库制剂的使用可特别适用于治疗慢性病况。术语“植入物”和“贮库制剂”旨在包含单一组合物(如网)或包括多个组分的组合物(例如，由若干单独的网材片构成的纤维网)或多种单独的组合物，其中多个保持局部并提供由多种组合物的聚集体产生的长期持续释放。如本文所用，“长期”释放意指构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少2天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少7天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少14天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少30天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少60天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少90天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少180天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少一年。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少15-30天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少30-60天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少60-90天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少90-120天。在一些实施例中，构建和布置植入物或贮库制剂以递送治疗性或防止性水平的活性成分持续至少120-180天。在一些实施例中，长期持续释放植入物是本领域普通技术人员熟知的并且包含上述的一些释放系统的植入物或贮库制剂。在一些实施例中，此类植入物或贮库制剂可以通过手术施用。在一些实施例中，此类植入物或贮库制剂可以局部或通过注射施用。

在一些实施例中，贮备制剂包括包封或以其他方式布置在二氧化硅微粒内的肽或肽混合物，如WO2000/050349、WO2001/013924、WO2001/015751、WO2001/040556、WO2002/080977、WO2005/082781、WO2007/135224、WO2008/104635、WO2014/207304和WO2017/068845中描述的那些，其中待递送的活性药物成分是本文公开的肽或肽混合物。在一些实施例中，贮库制剂是持续释放制剂，使得该制剂在延长的时间段内提供一种或多种肽(例如式A的肽)的逐渐释放，并且优选地，尽管不一定，在延长的时间段内导致药物的血液水平基本恒定。在一些实施例中，持续释放发生在几天、几周或几个月内。在一些实施例中，持续释放发生在一个月或几个月内，如1-2个月、2-4个月、3-5个月、3-6个月、5-7个月、6-8个月、6-9个月或8-12个月。

相关领域的普通技术人员将理解，鉴于普通技术人员已知的信息，对本文所述的组合物和方法的其他适合的修改和修订从本文所包含的本技术的描述中是显而易见的，并且可以在不脱离本申请或其任何实施例的范围的情况下进行。

肽或肽混合物的生物学效应的确定：

在各种实施例中，进行合适的体外或体内测定以确定肽或肽混合物的效果和其施用是否指定用于治疗。在各种实施例中，可以利用代表性动物模型执行体外测定，以确定给定肽或肽混合物是否在受试者的心脏疾病或心肌病上发挥期望的作用。在人类受试者中进行测试之前，用于疗法中的化合物(肽或肽混合物)可以在适合动物模型系统中进行测试，包含但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。类似地，用于在体内测试中，在对人类受试者施用之前，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。

DMD的动物模型是本领域已知的，包含例如金毛猎犬肌肉萎缩症(GRMD)犬、CXMDJ比格犬、肥大性猫肌肉萎缩症(hfmd)猫和mdx小鼠。参见：Spurney C.,《肌肉神经(MuscleNerve)》44(1):8-19(2011)；Willmann R.等人,《神经肌肉病症(NeuromuscularDisorders)》19:241–249(2009)；Partridge TA,FEBS J.280(17):4177-86(2013)和Coley等人,“遗传背景对mdx小鼠营养不良表型的影响(Effect of genetic background on thedystrophic phenotype in mdx mice)”,《人类分子遗传学(Human MolecularGenetics)》,2016,Vol.25,No.1,130-145。最近，已经创建了兔模型，其表现出与人类观察到的非常相似的心脏病理。参见：Sui,T等人,“用CRISPR/Cas9生成的杜氏肌肉萎缩症的新型兔模型(A novel rabbit model of Duchenne muscular dystrophy generated byCRISPR/Cas9)”,《疾病模型和机制(Disease Models&Mechanisms)》(2018)11,dmm032201。此类模型可用于证明本文公开的肽和肽的混合物对包含人在内的受试者中与MD(包含DMD和BMD)相关的心脏疾病和心肌病的发作、发生、严重程度和进展的生物学效应。

联合疗法：

在一些实施例中，本文公开的肽或肽混合物可与一种或多种在受试者(包含人类受试者)中与治疗(包含但不限于抑制、预防、改善或延迟发作)MD、DMD或BMD的体征、症状或严重程度有关的额外疗法联合。额外治疗剂包含但不限于皮质类固醇、ACE抑制剂、ARB、β阻断剂、利尿剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、艾地苯醌、磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)。在一些实施例中，磷酰二胺吗啉代低聚物包括Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)或PPMO。

在一些实施例中，皮质类固醇选自由强的松和地夫可特组成的群组。在一些实施例中，ACE抑制剂选自由以下组成的群组：卡托普利、阿拉普利、赖诺普利、咪达普利、喹那普利、替莫普利、地拉普利、贝那普利、西拉普利、群多普利、依那普利、西罗普利、福辛普利、吗达普利、莫呗普利、培哚普利、雷米普利、螺普利、群多普利和此类化合物的药学上可接受的盐。在一些实施例中，ARB选自由以下组成的群组：氯沙坦、坎地沙坦、维沙坦、依普罗沙坦、替米沙坦和依贝沙坦。

在一些实施例中，在额外治疗剂与肽或肽混合物联合向受试者施用时，产生协同治疗效果。例如，肽或肽混合物与一种或多种额外治疗剂一起施用以用于解决肌肉萎缩症(例如DMD或BMD)的体征、症状或严重程度在治疗疾病方面的效果将大于累加效果。例如，任何个别治疗剂中的一种或多种的较低剂量可用于治疗或预防DMD，从而增加治疗功效和减少副作用。可替代地，例如，可以使用比以其他方式耐受的剂量高的剂量的以下中的一种或多种：(i)皮质类固醇，(ii)ACE抑制剂，(iii)ARB，(iv)β阻断剂，(v)利尿剂，(vi)艾地苯醌，和/或(vii)磷酰二胺吗啉代低聚物(例如Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))，因为用本文所述的肽或肽混合物治疗保护受试者免受以其他方式影响受试者心脏的有害影响。在一些实施例中，协同作用将是改善行走能力(或延迟行走能力减少)，这是由于与改善受试者(和受试者的肌肉)的线粒体健康相关的肌肉抗肌萎缩蛋白的增加和肌肉功能和能量的增加与延迟、减少、改善或抑制心血管压力和相关的心肌病(例如，HCM、DCM、心力衰竭和/或心肌纤维化)的联合效应。

在任何情况下，多种治疗剂(例如，肽(例如化合物A-1或A-2)或肽混合物(例如，化合物A-1和A-2))与Exondys

(Eteplirsen)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)的组合可以按任何顺序或甚至同时施用。如果同时进行，则多种治疗剂可以以单一的、统一的形式提供，或以多种形式提供(仅举例说明，作为IV注射或者作为两个独立的IV注射提供)。一种治疗剂可以多剂量给予，或两种治疗剂都可以多剂量给予。如果不是同时进行，多剂量之间的时机可以从超过零周到低于四周不等。此外，组合方法、组合物和制剂并不限于只使用两种药剂。

预期治疗效果：

在某些实施例中，与未接受治疗的DMD受试者相比，用肽或肽混合物治疗的DMD受试者将显示出肌酸磷酸激酶血液水平正常化至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％或至少90％。在某些实施例中，用肽或肽混合物治疗的DMD受试者将显示出肌酸磷酸激酶血液水平与在正常对照受试者中观察到的水平相似。

在该方法的一些实施例中，与未接受治疗的DMD对照受试者相比，用肽或肽混合物治疗的DMD受试者将显示出抗肌萎缩蛋白相关蛋白表达水平和/或活性增加至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％或至少90％。在某些实施例中，与未接受治疗的DMD对照受试者相比，用肽或肽混合物治疗的DMD受试者将显示出IGF-1表达水平和/或活性增加至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％或至少90％。在该方法的一些实施例中，与未接受治疗的DMD对照受试者相比，用肽或肽混合物治疗的DMD受试者将显示出卵泡抑素表达水平和/或活性增加至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％或至少90％。

在该方法的一些实施例中，与未接受治疗的对照组受试者相比，用肽或肽混合物治疗的DMD受试者将显示出心脏功能的改善。对于同时用肽或肽混合物和增加抗肌萎缩蛋白表达的药物治疗的受试者，与未接受治疗的对照组受试者相比，预计心脏功能和行走能力将得到改善。

相关领域的普通技术人员可以理解，鉴于普通技术人员已知的信息，从本文所含的发明描述中容易看出对本文所述的组合物和方法进行的其他适当修改和调整，并且可以在不偏离本发明或其任何实施例的范围进行该修改和调整。在详细描述了本发明之后，通过参考以下实例可以更清楚地理解本发明，这些实例仅出于说明的目的而随附于此，并不旨在对本发明进行限制。

实例

下面的实例进一步说明了本技术，该实例不应解释为以任何方式进行限制。

实例1-H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂在DMD敲除(KO)兔模型中治疗心肌病进展的用途

此实例预示性地证明了H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂(elamipretide)在DMDKO兔模型中治疗心肌病进展(以及在DMD患者中常见的其他症状和生理学)的用途。

兔：本研究中使用的DMD KO兔将从吉林大学实验动物中心获得，或如Sui等人《疾病模型与机制(Disease Models&Mechanisms)》11(2018)所述准备。这些DMD KO兔拥有51号外显子的工程化突变。这些DMD KO兔表现出DMD病理学的几个人类特征，包含抗肌萎缩蛋白表达中断、身体活动受损(丧失行走能力)、体重降低、寿命缩短、血清肌酸激酶(CK)水平升高，以及最重要的是，与人类观察到的相似的导致心力衰竭的渐进性心肌病。新西兰兔(WT)将被用作对照。

方法：本研究中涉及兔的所有实验都将按照所有适用的法律和法规来进行。

体重和存活曲线：将每两周一次测量年龄和性别匹配的WT兔和DMD KO兔的体重。所有数据将以平均值±s.e.m.表示，并且每个基因型的动物至少有三个个体将被用于所有实验。

血清生化分析：血液样品将从耳静脉收集到肝素化管中，并将通过沉淀和离心制备血清。血清CK、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平将分别使用CK检测试剂盒(N-乙酰-L-半胱氨酸法)、ALT检测试剂盒(连续监测法)和AST检测试剂盒(连续监测法)来测量。

活性测量：将使用Millet运动手镯可穿戴装置(或其他合适的装置)来记录DMD KO和WT兔在1小时时段内的运动步数。在右后腿上佩戴该装置的兔将被放置在适当大小的房间中以允许自由活动。

超声心动图学：超声心动图记录将按照之前的描述进行(Han等人，2007；Xu等人，2015a)。简而言之，二维和M型经胸廓超声心动图将如前所述由SIUI全数字彩色多普勒超声诊断系统(如Apogee 300，汕头，中国)对WT和DMD KO兔(每组n≥3)进行。兔将在右侧卧位从胸骨旁长轴和短轴视图进行研究。通过用人约束兔的四肢，将兔固定在正确的位置。将使用线性阵列探头和10.0MHz的中心频率。将确定心脏尺寸[舒张末期室间隔厚度(IVSd)、左心室舒张末期内径(LVDd)和左心室收缩末期内径(LVDs)]，并计算缩短分数(FS)百分比和左心室射血分数(EF)。如果可能的话，还将对心搏量和心输出量进行评估。

组织学：心脏组织将从DMD KO和WT兔(在5-6和10-12月龄时安乐死)中收集。组织将在4℃下用4％多聚甲醛固定，在越来越高浓度的乙醇中脱水(70％乙醇持续6小时，80％乙醇持续1小时，96％乙醇持续1小时，以及100％乙醇持续3小时)，在二甲苯中清除，并嵌入石蜡中进行组织学检查。切割5μm切片以进行H&E(Han等人，2007；Xu等人，2015a)，从而研究单核细胞浸润/炎症。心肌的纤维化将采用标准做法，用Masson三色染色和抗胶原蛋白免疫组化法进行评估。染色后的切片将用适当的显微镜如尼康TS100显微镜进行成像。

研究设计：在大约3-4周大时，将通过腹膜内(i.p.)注射每天一次向兔施用溶解在无菌盐水中的肽(或肽混合物)，剂量范围为0.5mg/kg至5mg/kg。对照组将被给予安慰剂(无菌盐水)。将每天用肽(或肽混合物)或生理盐水媒介物对照治疗兔，治疗持续时间大约为3-5个月。例如，所用的肽可以是式A-1的肽(即H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂)。将每月收集超声心动图，直到动物大约4-6个月龄或生命结束。在死亡时，将收获组织并收集上述变量。

预期结果：

1.重量和存活：预计与WT兔相比，DMD KO兔的尺寸会更小，寿命也会明显缩短。然而，预计与未接受治疗的DMD KO兔对照组相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的DMD KO兔的寿命将有统计学显著的增加，该寿命增加将归因于心肌病和由此产生的心力衰竭的发作和进展的延迟。

2.血清生物化学分析：预计与WT兔相比，DMD KO兔将表现出显著增加的血清CK、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。然而，预计与未用肽治疗的DMDKO兔相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的DMD KO兔的血清CK、ALT和AST水平在统计学上会更低(且更接近WT兔所观察到的那些水平)。

3.活性测量：预计与WT兔相比，DMD KO兔将表现出显著的活性下降。然而，预计与未用肽治疗的DMD KO兔相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的DMD KO兔的活性水平将增加。

4.肌肉组织学：预期与未接受治疗组相比，治疗组的DMD KO兔的心肌将表现出较低的炎症和纤维化水平。

5.超声心动图：预计与WT兔相比，DMD KO兔将表现出左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)的显著下降。然而，预计与未用肽治疗的DMD KO兔相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的DMD KO兔的左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)水平会更高。此外，预计与未接受治疗的兔相比，接受治疗的兔将表现出左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)水平下降的延迟发作。如果获得了心搏量和心输出量的数据，则预期与未接受治疗的DMD KO兔相比，接受治疗的兔将表现出更高的心搏量和改善的心输出量。

因此，这些结果将证明本技术的肽如H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂(elamipretide)可用于在患有肌肉萎缩症如杜氏肌肉萎缩症(DMD)或贝克氏肌肉萎缩症(BMD)的哺乳动物受试者中治疗心肌病(例如，如肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭或心肌纤维化)或延迟其发作的方法。

实例2-H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂在D2-mdx小鼠模型中治疗心肌病的用途

此实例预示性地证明了H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂(elamipretide)在DMD小鼠模型中治疗心肌病进展(以及在DMD患者中常见的其他症状和生理学)的用途，该模型表现出在患有肌肉萎缩症的人类中观察到的肥厚型心肌病的特征。

动物和护理：DBA2(又名D2-mdx)同类品系的mdx小鼠将被用于这些研究。DBA/2J小鼠将被用作野生型对照组。动物将从适当的渠道(例如Jackson实验室)获得。动物将以每笼最多五只雄性或五只雌性的密度在特定的无病原体条件下被饲养在温度为18℃-23℃和湿度为40％-60％的12小时光照/12小时黑暗循环的房间内。本研究中涉及小鼠的所有实验都将按照所有适用的法律和法规来进行。

基因分型：动物的基因分型将根据参考文献(Coley等人)进行。据报道，DBA2小鼠品系具有LTBP4基因中的突变，该突变可能影响肌肉功能和再生。简而言之，这种报告的缺失突变的基因分型将通过标准PCR，然后通过凝胶电泳进行。野生型LTBP4条带的产物大小为273bp，而突变体的条带只有236bp。MDX第23号外显子SNP的基因分型将使用定制的

荧光结合引物、试剂和方案通过实时等位基因分型进行，如参考文献Coley等人)所述。

自主跑轮运动：动物将被放置在配备有锁定的14cm直径跑轮和旋转计数器的独立笼中。在24小时的适应期后，轮将被解锁，24小时内的跑动距离将被记录。在整个实验期间，每周进行记录。

血清肌酸激酶活性：处死后将立即通过心脏穿刺收集小鼠的血液。血清将通过离心与其他血液级份分离，并在没有EDTA或肝素的情况下储存在-80℃。血清中的CK活性将根据制造商的方案使用适当的市售产品(例如Pointe Scientific,Inc.(坎顿市，密歇根州)的肌酸激酶试剂盒)进行测量。可替代地，也可以通过眶后窦穿刺到肝素化的玻璃毛细管中来收集血液。血清可以通过在19,000rpm下离心10分钟来分离。肌酸激酶可以例如用Beckman Coulter AU临床化学分析仪来测量。

超声心动图：为了评估小鼠体内的心脏功能，将对镇静小鼠进行超声心动图。首先对小鼠进行麻醉(例如用5％的异氟烷与100％的氧气混合，流量为1.0升/分钟)，然后保持麻醉状态(例如用1.5％的异氟烷/氧气流量。在小鼠被麻醉和测试时，可在动物的眼睛上涂抹眼科软膏以防止角膜干燥。麻醉诱导后，将动物放置在恒温控制的加热平台上，在该平台上可以通过密封面罩递送来维持麻醉。在超声心动图期间，也可使用加热灯使心率和体温恒定在生理状态。

在检查期间，将通过使用心电图仪来监测动物的心率。在扫描期间，将持续监测小鼠的心率和体温。超声心动图将使用适当的仪器(例如，Vevo770超声机(VisualSonics，多伦多，加拿大))进行。2-D(B型)、M型和多普勒图像将从改良的胸骨旁长轴视图、胸骨旁短轴视图、胸骨上切口视图和心尖三腔视图获取。心率(BPM)、缩短分数、EF、心搏量和心输出量将使用M型改良胸骨旁短轴视图的测量获得以评估心功能。定性和定量测量将使用离线工作站软件进行记录，并将进行成像后分析。

组织学：心脏组织将从DBA2和DBA/2J小鼠(28周龄时安乐死)中收集。组织将在4℃下用4％多聚甲醛固定，在越来越高浓度的乙醇中脱水(70％乙醇持续6小时，80％乙醇持续1小时，96％乙醇持续1小时，以及100％乙醇持续3小时)，在二甲苯中清除，并嵌入石蜡中进行组织学检查。切割5μm切片以进行H&E(Han等人，2007；Xu等人，2015a)，从而研究单核细胞浸润/炎症。心肌的纤维化将采用标准做法，用Masson三色染色和抗胶原蛋白免疫组化法进行评估。组织切片将使用适当的摄像设备(例如，附带奥林巴斯DP70摄像模块的奥林巴斯BX51显微镜)进行成像。

小鼠品系和研究设计：

品系(可从Jackson实验室商业获得)：

·DBA/2J(货号：000671)-野生型对照

·D2-mdx(货号：013141)-营养不良

研究设计

1.N＝总计40-60只小鼠，被分配到以下小组

a.野生型对照-未接受治疗，n＝10-15

b.mdx，媒介物治疗，n＝10-15

c.mdx，每日IP elamipretide 1.0mg/kg，n＝10-15

d.mdx，每日IP elamipretide 5.0mg/kg，n＝10-15

2.给药在4-6周龄开始并持续10-15周

a.每周将采集眶后眼出血以提供血清进行生物标志物分析

3.一生中的端点

a.每周将称量体重

b.将确定每周自主跑轮运动的测量结果

i.总距离(m)

ii.标准化距离(m/kg)

c.超声心动图(至少在第18周和研究结束时，但可能更频繁，包含可能的每两个月一次)。将获取以下参数。

i.射血分数(％)

ii.缩短分数(％)

iii.心搏量(uL)

iv.心输出量(mL)

v.心率(bpm)

4.验尸后的终点

a.肌酸激酶的血清分析

b.心脏的组织学以及炎症和纤维化

预期结果：

1.重量和存活：预计与DBA/2J(对照)小鼠相比，D2-mdx小鼠的尺寸将更小。然而，预计相对于未接受治疗的对照组，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的D2-mdx小鼠将显示加速增重。

2.血清生物化学分析：预计与DBA/2J(对照)小鼠相比，D2-mdx小鼠将表现出血清CK水平的显著增加。然而，预计与未用肽治疗的D2-mdx小鼠相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的D2-mdx小鼠的血清CK水平在统计学上将更低(并且更接近于在DBA/2J(对照)小鼠中观察到的那些水平)。

3.自主跑轮运动：预计与DBA/2J(对照)小鼠相比，D2-mdx小鼠将表现出每24小时总跑动距离和正常化跑动距离的显著下降。然而，预计与未用肽治疗的D2-mdx小鼠相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的D2-mdx小鼠的总跑动距离和正常化跑动距离将增加。

4.心脏的组织学：预计相对于DBA/2J对照小鼠，D2-mdx小鼠将显示出显著增加的炎症(通过用于单核细胞浸润的H+E染色测量)和纤维化(通过Masson三色染色和抗胶原蛋白免疫组化法测量)水平。然而，预计与未用肽治疗的D2-mdx小鼠相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的D2-mdx小鼠的炎症和纤维化将减少。

5.超声心动图：预计与DBA/2J(对照)小鼠相比，D2-mdx小鼠将表现出左心室射血分数(EF)、缩短分数(FS)、心搏量和心输出量的显著下降。然而，预计与未用肽治疗的D2-mdx小鼠相比，用式A的肽(例如化合物A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8)治疗的D2-mdx小鼠的左心室射血分数(EF)、缩短分数(FS)、心搏量和心输出量的水平将更高。此外，预计与未接受治疗的小鼠相比，接受治疗的小鼠将表现出左心室射血分数(EF)、缩短分数(FS)、心搏量和心输出量水平下降的延迟发作。

实例3-H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH在被诊断为肌肉萎缩症的人类受试者中治疗心肌病的用途

此实例预示性地证明了H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH在被诊断为肌肉萎缩症如杜氏肌肉萎缩症(DMD)或贝克氏肌肉萎缩症(BMD)的有此需要的人类受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的用途。

方法：

怀疑患有或诊断患有DMD或BMD的受试者每天接受H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH的皮下注射(例如，0.5mg/kg/天-5.0mg/kg/天)。可替代地，怀疑患有或诊断患有DMD或BMD的受试者每周接受H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH的静脉内施用(例如，0.05mg/kg/小时-1.0mg/kg/小时，持续最多4小时)。在某些情况下，可向受试者共同施用已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物，例如磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)(例如Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM))或PPMO。将定期(例如，每周一次、每两周一次、每月一次等)评价受试者的与DMD或BMD相关的心肌病体征和症状的存在和/或严重程度，包含但不限于左心室动力学受损(例如射血分数降低、缩短分数降低、心搏量降低和/或心输出量降低)，以及与心肌纤维化相关的血清生物标志物水平的升高(如例如I型前胶原(PICP)的羧基末端肽和/或III型前胶原的氨基末端前肽水平升高)。治疗将至少维持到与DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征或症状得到改善或消除时。该研究可在随机戒断试验(如随机、双盲、安慰剂对照的戒断试验)中进行以评估肽对受试者的影响，然后再评估其戒断相对于仍在接受肽(和/或已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物)的对照组的影响。

结果：

据预测，怀疑患有或诊断患有DMD或BMD并且接受治疗有效量的H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH的受试者将显示出与DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征或症状的严重程度降低或消除。这些结果将表明，与未接受治疗的对照相比，H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH可用于改善与DMD或BMD有关的心肌病的以下一种或多种症状：左心室动力学受损(例如射血分数降低、缩短分数降低、心搏量降低和/或心输出量降低)，以及与心肌纤维化相关的血清生物标志物水平的升高(如例如I型前胶原(PICP)的羧基末端肽和/或III型前胶原的氨基末端前肽水平升高)。因此，这些结果将证明H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH可用于在怀疑患有或诊断患有DMD或BMD的受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的方法。

其他可能被评价并导致改善的DMD的体征或症状包含：

·左心室扩张进展的延迟

·左心室纤维化进展的延迟

·左心室心搏量减少的延迟

·左心室舒张末期容积(LVEDV)的改善

·左心室收缩末期容积(LVESV)的改善

·心肌应变的变化

·呼吸功能的改善

·受试者行走能力的改善(例如，受试者行走能力下降的发作或进展的延迟，或受试者行动能力的彻底改善)

实例4-H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH在诊断为DMD并服用皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或 Casimersen(Amondys 45^TM)的人类受试者中治疗心肌病的用途

此实例预示性地证明了H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH在被诊断为肌肉萎缩症如杜氏肌肉萎缩症(DMD)或贝克氏肌肉萎缩症(BMD)并服用皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)的有此需要的人类受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的用途。

方法：

向怀疑患有或诊断患有DMD或BMD并服用皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)的受试者分别、依次或同时皮下施用每日剂量的H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH(例如，0.5mg/kg/天-5.0mg/kg/天)或每周静脉内施用H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂ orH-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH(例如，0.05mg/kg/小时-1.0mg/kg/小时，持续最多4小时)。将定期(例如，，每周一次、每两周一次、每月一次等)评价受试者的与DMD或BMD相关的心肌病体征和症状的存在和/或严重程度，包含但不限于左心室动力学受损(例如射血分数降低、缩短分数降低、心搏量降低和/或心输出量降低)，以及与心肌纤维化相关的血清生物标志物水平的升高(如例如I型前胶原(PICP)的羧基末端肽和/或III型前胶原的氨基末端前肽水平升高)。治疗将至少维持到与DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征或症状得到改善或消除时。该研究可在随机戒断试验(如随机、双盲、安慰剂对照的戒断试验)中进行以评估肽对受试者的影响，然后再评估其戒断相对于仍在接受肽的对照组的影响。

结果：

据预测，怀疑患有或诊断患有DMD或BMD并服用皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)并且接受治疗有效量的H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH的受试者将显示出与DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征或症状的严重程度延迟或降低或消除。进一步预期与使用单独的H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH或单独的皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)治疗的受试者观察到的相比，施用H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH与皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)的组合在这方面将具有协同作用。

这些结果将表明，与未接受治疗的对照相比，H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH可用于改善与DMD或BMD有关的心肌病的以下一种或多种症状如左心室动力学受损(例如射血分数降低、缩短分数降低、心搏量降低和/或心输出量降低)，以及与心肌纤维化相关的血清生物标志物水平的升高(如例如I型前胶原(PICP)的羧基末端肽和/或III型前胶原的氨基末端前肽水平升高)。因此，这些结果将证明H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-NH₂或H-D-Arg-2′6′-Dmt-Lys-Phe-OH可用于在患有或诊断患有DMD或BMD并服用皮质类固醇和/或Eteplirsen(Exondys

)、Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)的受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的方法。

其他可能被评价并改善的DMD的体征或症状包含：

·左心室扩张进展的延迟

·左心室纤维化进展的延迟

·左心室心搏量减少的延迟

·左心室舒张末期容积(LVEDV)的改善

·左心室收缩末期容积(LVESV)的改善

·心肌应变的变化

·呼吸功能的改善

实例5-由elamipretide(A-1，三乙酸盐)一步合成1-((R)-4-铵基-5-(((S)-1- (((S)-6-铵基-1-(((S)-1-羧基-2-苯基乙基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-3-(4-羟基-2, 6-二甲基苯基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-5-氧代戊基)氯化胍(A-2，三盐酸盐)

方案3

将SBT-031三乙酸盐(8.2g,10mmol)在0.5M盐酸水溶液中的溶液在35℃-40℃搅拌5天。然后在减压下除去溶剂，并通过反相快速色谱法(水(pH＝3)/MeCN，从0.25％到4％)纯化粗品，得到A-2(5.6g)，产率75％。

¹H-NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.37–7.14(m,5H),6.43(s,2H),4.80(dd,J＝9.5,6.9Hz,1H),4.64(dd,J＝8.6,5.2Hz,1H),4.37(dd,J＝8.1,5.9Hz,1H),4.01(t,J＝6.3Hz,1H),3.21(dd,J＝14.0,5.2Hz,1H),3.16–2.88(m,7H),2.27(s,6H),1.85–1.54(m,6H),1.53–1.20(m,4H).

等效物

本技术不限于本文所述的特定实施例，这些特定实施例旨在作为本技术的单个方面的单独绘示。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。除了在本文中列举的那些方法和设备之外，根据前面的描述，在本技术范围内的功能上等同的方法和设备对于本领域技术人员将是显而易见的。此类修改和变化也旨在属于所附权利要求书的范围内。本技术仅受所附权利要求书条款以及此类权利要求书所享有的全部等效物范围的限制。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，当然，这些方法、试剂、化合物组合物或生物系统可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在为限制性的。

此外，在根据马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本公开也由此根据马库什组的任何单个成员或成员亚组来描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文中公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为是充分地描述和使能被分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等的相同范围。作为非限制性示例，本文中所讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包含所列举的数字，并且是指后续可分解成如上所述的子范围的范围。最终，熟习此项技术人员应理解，范围包含各单个成员。因此，例如，具有1个至3个单元的组是指具有1个、2个或3个单元的组。类似地，具有1个至5个单元的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个单元的组，等。

本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，在不与本说明书的明确教导相抵触的情况下，均通过引用全部并入，包含所有的图和表。

各种实施例在以下权利要求中阐述。

Claims

1.一种在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的式A的肽：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通式A的肽是式A-1的肽：

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述通式A的肽是式A-2的肽：

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述通式A的肽是式A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8的肽：

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在被诊断患有肌肉萎缩症和/或正在接受肌肉萎缩症治疗的受试者中，施用所述肽减少、改善肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心力衰竭和/或心肌纤维化和/或延迟其发作。

6.根据权利要求5所述的方法，其中施用所述肽预防、抑制、减少、改善肥厚型心肌病和/或延迟其发作。

7.根据权利要求5所述的方法，其中施用所述肽预防、抑制、减少、改善扩张型心肌病和/或延迟其发作。

8.根据权利要求5所述的方法，其中施用所述肽预防、抑制、减少、改善心力衰竭和/或延迟其发作。

9.根据权利要求5所述的方法，其中施用所述肽预防、抑制、减少、改善心肌纤维化和/或延迟其发作。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中与未接受治疗的对照受试者或未施用所述肽的对照组的心脏相比，施用所述肽增加所述受试者心脏的射血分数、缩短分数、心搏量或心输出量。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述肽每天施用，持续：(i)24周或更长时间；(ii)48周或更长时间；(iii)72周或更长时间；或(iv)96周或更长时间。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述肽每周施用一次，持续：(i)24周或更长时间；(ii)48周或更长时间；(iii)72周或更长时间；或(iv)96周或更长时间。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述肽经口、局部、全身性、腹膜内、皮内、经皮、眼科、鞘内、脑室内、离子导入、经粘膜、玻璃体内、鼻内或肌肉内施用。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述肽皮下施用。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述肽静脉内施用。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症(DMD)。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述肌肉萎缩症是贝克氏肌肉萎缩症(BMD)。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，所述方法进一步包括分别、依次或同时向所述受试者施用额外治疗剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述肽与已知增加或纠正所述受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物联合向所述受试者施用。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有DMD，并且所述肽与磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)或PPMO联合向所述受试者施用，所述磷酰二胺吗啉代低聚物例如Eteplirsen

Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys45^TM)。

22.根据权利要求21所述的方法，其中静脉内施用所述肽和所述PMO或PPMO。

23.根据权利要求22所述的方法，其中同时施用所述肽和所述PMO或PPMO。

24.根据权利要求19所述的方法，其中所述肽与皮质类固醇联合向所述受试者施用。

25.根据权利要求19所述的方法，其中所述肽与ACE抑制剂联合向所述受试者施用。

26.根据权利要求19所述的方法，其中所述肽与ARB联合向所述受试者施用。

27.根据权利要求19所述的方法，其中所述肽与β阻断剂联合向所述受试者施用。

28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述肽和额外治疗剂的组合对治疗DMD或BMD有协同作用。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述肽的药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、草酸盐、邻苯二甲酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或三氟乙酸盐。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述式A的肽以贮库制剂的形式施用。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述贮库制剂包括包封在或以其他方式布置在二氧化硅微粒中的所述式A的肽。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述贮库制剂是持续释放贮库制剂。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述式A的肽在几天、几周或几个月内以有效量释放。

34.一种组合物在制备用于在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的药剂中的用途，其中所述组合物包括治疗有效量的式A的肽：

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述通式A的肽是式A-1或A-2的肽：

36.根据权利要求34所述的用途，其中所述通式A的肽是式A-3、A-4、A-5、A-6、A-7或A-8的肽：

37.根据权利要求34至36中任一项所述的用途，其中所述药剂进一步包括已知增加或纠正所述受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物。

38.根据权利要求37所述的用途，其中所述受试者已被诊断为患有DMD，并且已知增加或纠正抗肌萎缩蛋白产生的药物是磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)或PPMO，所述磷酰二胺吗啉代低聚物例如Eteplirsen

Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的用途，其中所述肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症。

40.根据权利要求34至38中任一项所述的用途，其中所述肌肉萎缩症是贝克氏肌肉萎缩症。

41.根据权利要求34至40中任一项所述的用途，其中所述心肌病是肥厚型心肌病。

42.根据权利要求34至40中任一项所述的用途，其中所述心肌病是扩张型心肌病。

43.根据权利要求34至40中任一项所述的用途，其中所述心肌病是心力衰竭。

44.根据权利要求34至40中任一项所述的用途，其中所述心肌病是心肌纤维化。

45.根据权利要求34至44中任一项所述的用途，其中与未接受治疗的对照受试者或未施用所述组合物的对照组的心脏相比，所述药剂增加所述受试者心脏的射血分数。

46.根据权利要求34至44中任一项所述的用途，其中与未接受治疗的对照受试者或未施用所述组合物的对照组的心脏相比，所述药剂增加所述受试者心脏的缩短分数。

47.根据权利要求34至44中任一项所述的用途，其中与未接受治疗的对照受试者或未施用所述组合物的对照组的心脏相比，所述药剂增加所述受试者心脏的心搏量。

48.根据权利要求34至44中任一项所述的用途，其中与未接受治疗的对照受试者或未施用所述组合物的对照组的心脏相比，所述药剂增加了所述受试者心脏的心输出量。

49.根据权利要求34至44中任一项所述的用途，其中与未接受治疗的对照受试者或未施用所述组合物的对照组的心脏相比，所述药剂预防、抑制、减少、改善所述受试者的心肌纤维化和/或延迟其发作。

50.根据权利要求34至49中任一项所述的用途，其中所述药剂是贮库制剂。

51.根据权利要求50所述的用途，其中所述贮库制剂包括包封在或以其他方式布置在二氧化硅微粒中的所述式A的肽。

52.根据权利要求50或51所述的用途，其中所述贮库制剂是持续释放贮库制剂。

53.根据权利要求52所述的用途，其中所述式A的肽在几天、几周或几个月内以有效量释放。

54.一种组合物，其包括：

a)式A的肽：

b)已知增加或纠正受试者中的抗肌萎缩蛋白产生的药物。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述肽是A-1或A-2：

56.根据权利要求54或55所述的组合物，其中所述已知增加或纠正抗肌萎缩蛋白产生的药物是磷酰二胺吗啉代低聚物(PMO)或PPMO，所述磷酰二胺吗啉代低聚物例如Eteplirsen

Golodirsen(Vyondys 53^TM)或Casimersen(Amondys 45^TM)。

57.根据权利要求54至56中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药剂。

58.一种在患有肌肉萎缩症的哺乳动物受试者中治疗心肌病或延迟心肌病发作的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求55至58中任一项所述的组合物。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述组合物每天、每周或每月施用。

60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述组合物静脉内施用。

61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述肌肉萎缩症是杜氏肌肉萎缩症或贝克氏肌肉萎缩症。

62.一种制剂，其包括式A的肽：

每个m是2、3或4；每个n独立地是1、2或3；以及立体中心1*、2*、3*和4*中每个的绝对立体化学独立地是D或L，其中：(i)所述肽被二氧化硅微粒包封或布置在二氧化硅微粒中；以及(ii)所述二氧化硅微粒被配制成在几天、几周或几个月内向受试者全身性递送所述肽，从而递送有效剂量以治疗所述受试者的与MD、DMD或BMD相关的心肌病的一个或多个体征、症状或风险因素。