CN115845078A

CN115845078A - 基于相分离的肿瘤靶向药物递送系统

Info

Publication number: CN115845078A
Application number: CN202111125398.8A
Authority: CN
Inventors: 薛松; 白迅
Original assignee: Wopeptide Biotechnology Shandong Co ltd
Current assignee: Wopeptide Biotechnology Shandong Co ltd
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明提供了一种利用相分离的肿瘤靶向药物复合物的递送系统。具体来说，将单克隆抗体等和抗肿瘤药物分别与在体内能形成共相分离的两个物质偶联，单克隆抗体等识别在肿瘤细胞表面高表达的抗原并与之结合，通过共相分离将抗肿瘤药物富集在肿瘤细胞表面，之后再通过细胞内吞进入肿瘤细胞，最后杀死肿瘤细胞。通过共相分离，单克隆抗体等可以更多价结合抗肿瘤药物，能够解决ADC所存在的负载抗肿瘤药物拷贝数有限的问题，特别是还能在肿瘤细胞表面形成更高的药物浓度，不仅能够提高抗肿瘤效果，而且可以降低抗肿瘤药物的用量，从而降低副作用。

Description

基于相分离的肿瘤靶向药物递送系统

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别是涉及相分离的肿瘤靶向药物递送系统及其制备方法与应用。

背景技术

抗体-药物偶联物(ADC)的起源可以追溯到一个世纪以前的德国医师和科学家Paul Ehrlich，他们提出了通过靶向剂将细胞毒性药物选择性地递送至肿瘤的概念。ADC旨在利用单克隆抗体(mAb)的特异性，将有效的细胞毒性药物选择性地递送至含有抗原的肿瘤细胞。ADC是由单克隆抗体、强效细胞毒性药物和它们之间的连接子组成的生物治疗药物，通过连接子将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，从而提高肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用。

但是单抗可以负载的抗肿瘤药物拷贝数有限，加之单克隆抗体与肿瘤细胞表面的抗原结合存在饱和，会导致ADC递送药物能力有限，同时逸散的ADC会对正常细胞产生毒性，从而产生副作用。

相分离是用于描述二元或多元混合物发生的重新排列的现象，同时在一定的空间区域内各成一相。细胞内发生相分离的凝聚物，通常称为液体状液滴，是通过液-液相分离(LLPS)形成的。现在，越来越多的细胞生物学家认识到细胞中观察到的许多无膜细胞器是由蛋白质和核酸之间的相互作用、蛋白自发或是蛋白间相互作用引起的LLPS形成的。

总之现有的技术缺乏排除抗原饱和且能够负载更多抗肿瘤药物，特异性高的抑制肿瘤生长的ADC，从而缺乏有效治疗癌症的方法。

发明内容

本发明提供了一种利用相分离的肿瘤靶向药物复合物的递送系统。具体来说，将单克隆抗体等和抗肿瘤药物分别与在体内能形成共相分离的两个物质偶联，单克隆抗体等识别在肿瘤细胞表面高表达的抗原并与之结合，通过共相分离将抗肿瘤药物富集在肿瘤细胞表面，之后再通过细胞内吞进入肿瘤细胞，最后杀死肿瘤细胞。通过共相分离，单克隆抗体等可以更多价结合抗肿瘤药物，能够解决ADC所存在的负载抗肿瘤药物拷贝数有限的问题，特别是还能在肿瘤细胞表面形成更高的药物浓度，不仅能够提高抗肿瘤效果，而且可以降低抗肿瘤药物的用量，从而降低副作用。示意图如图9所示。

根据本发明的一个方面，本发明提供一种药物组合物，含有能够共相分离的组分1和组分2，其中，组分1为能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的偶联物，组分2为抗肿瘤药物与B的偶联物，A和B能够共相分离从而使组分1和组分2能够共相分离。优选地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种药物复合物，其由组分1和组分2共相分离形成，其中，组分1为能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的偶联物，组分2为抗肿瘤药物与B的偶联物，A和B共相分离从而使组分1和组分2共相分离。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种试剂盒，含有彼此独立的两种药物组合物，其中，一种药物组合物含有组分1，组分1为能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的偶联物，另一种药物组合物含有组分2，组分2为抗肿瘤药物与B的偶联物，A和B能够共相分离从而使组分1和组分2能够共相分离。优选地，所述两种药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

根据本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗或预防肿瘤的方法，其特征在于，给予有需要的个体有效量的上述药物组合物或药物复合物。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述药物组合物或药物复合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的上述药物组合物或复合物在给予有需要的个体后，组分1中能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子能够识别在肿瘤细胞表面高表达的抗原并与之结合，通过A和B的共相分离，使组分1和组分2共相分离形成复合物，从而将更多的组分1和组分2富集在肿瘤细胞表面，即将抗肿瘤药物富集在肿瘤细胞表面，之后再通过细胞内吞进入肿瘤细胞，最后杀死肿瘤细胞。

本领域技术人员可以理解，各种能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子均可用于本发明。肿瘤细胞表面抗原例如CD19、CD22、CD3O、CD33、CD37、CD74、CD79b、CD138、BCMA、HER2、DLL3、EGFR、CD56、gpNMB、CEACAM5、PSMA、Trop-2、EGP1、GCC、STEAP1、CA6、AGS-16、nectin-4、cripto、间皮素、SLC44A4、CD70、ENPP3等。

优选地，所述生物分子例如抗体，更优选地，例如单克隆抗体或其识别片段。本领域技术人员可以理解，所述抗体来自哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等。

优选地，所述化学分子例如受体酪氨酸激酶抑制剂类，如克唑替尼(Crizotinib)、Brigatinib、Capmatinib、吉非替尼(Gefitinib)、Almonertinib等；其他癌细胞表面蛋白受体抑制剂如Sonidegib、Glasdegib等。

本领域技术人员可以理解，各种抗肿瘤药物均可用于本发明。优选地，抗肿瘤药物选自DNA损伤剂和/或微管蛋白抑制剂。DNA损伤剂例如卡奇霉素(Calicheamicins，CLM)、倍癌霉素(Duocarmycins)、阿霉素(Doxorubicin)、Pyrrolobenzodiazepines等。微管蛋白抑制剂例如澳瑞他汀类(Auristatins)和美登素类(Maytansines)。奥利他汀类例如澳瑞他汀、一甲基澳瑞他汀(Monomethylauristatin E，MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(Monomethylauristatin F，MMAF)。美登素类例如美登素(Maytansine)，美登素DM1、美登素DM4等。

本领域技术人员可以理解，各种能够共相分离的分子都可用于本发明。并且本领域技术人员可以理解，能够共相分离的两个分子中的任一个都可以用作A，从而另一个可以用作B。能够共相分离的A和B或者B和A例如，人工合成多肽polyE/polyGK、polyE/polyK等；天然蛋白的IDR区域片段如hnRNPA1/FUS、hnRNPA1/TDP-43等；RNA结合蛋白IDR区片段与RNA(或RNA衍生物)，如FUS/RNA等。

本发明中，polyE为聚谷氨酸；polyGK为聚甘-赖氨酸；polyK为聚赖氨酸；hnRNPA1为异质核核糖核蛋白A1；FUS为fused in sarcoma蛋白；TDP-43为TARDNA结合蛋白43。

根据本发明，能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A可直接偶联或者通过连接子偶联。连接子例如多肽连接子，如柔性多肽连接子；或化学连接子，如双活性连接子NHS-PEG-maleimide等。

根据本发明，抗肿瘤药物与B通过连接子偶联。连接子包括在肿瘤药物上修饰的活性基团(例如马来酰亚胺)和与该活性基团反应从而连接的多肽连接子(例如含有半胱氨酸)两部分，其可能有多种组合，例如不可切割连接子，如马来酰亚胺、硫酯、或点击化学连接方法等；或可切割连接子，其在肿瘤细胞特定环境中选择性释放药物，包括(1)pH响应的连接子，如腙；(2)还原环境响应的连接子或官能团间的缩合反应，如二硫键、马来酰亚胺与巯基缩合；(3)酶可切割的连接子，如Val-Cit；(4)光、热响应的连接子等。

本领域技术人员可以理解，组分1和组分2的摩尔比可变，从2000∶1至1∶2000均拥有较单组分更优效果，优选1000∶1至1∶1000，进一步优选500∶1至1∶500，更进一步优选100∶1至1∶100，更进一步优选50∶1至1∶50，更进一步优选10∶1至1∶10，更进一步优选10∶2至2∶10，更进一步优选10∶2至1∶2，更进一步优选10∶2至1∶1，更进一步优选10∶(2～4)，最优选10∶3。

本领域技术人员可以理解，组分1中能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的摩尔比例如1∶1-1∶10，优选1∶1。

本领域技术人员可以理解，组分2中抗肿瘤药物与B的摩尔比例如1∶1-20∶1，优选1∶1-2∶1。

本领域技术人员可以理解，本发明的偶联物可以通过本领域已知的方法制备得到，例如化学合成方法、基因工程方法等，化学合成方法例如但不限于固相合成方法等。

在优选的实施方案中，能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子为西妥昔单抗或其识别片段；抗肿瘤药物为奥利他汀类；A和B为polyE和polyGK、polyE和polyK、polyGK和polyE、polyK和polyE；西妥昔单抗或其识别片段与A直接偶联或通过连接子偶联，连接子例如柔性肽连接子；奥利他汀类与B通过连接子偶联，连接子例如柔性肽连接子-马来酰亚胺。

在优选的实施方案中，西妥昔单抗的识别片段为其单链可变片段(scFv)。本领域技术人员可以理解，因制备和纯化方法，单链可变片段的N端可以有或没有信号肽，C端可以有或没有标签。本领域技术人员可以理解，信号肽、标签不影响蛋白的功能。

优选地，西妥昔单抗的识别片段scFv中，VL与VH之间的连接子为(GGGGS)₃。A为polyE，优选E30-100，进一步优选E40-60，进一步优选E50。西妥昔单抗的识别片段scFv与A通过连接子偶联，连接子优选柔性肽连接子，进一步优选(GGGGS)₃GPQGIASGRIRARYLANASRYRI。优选地，组分1的氨基酸序列为SEQ ID No.4，以下简称scFv-polyE。

在优选的实施方案中，抗肿瘤药物为MMAF。B为polyGK，优选KKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGK。MMAF和B通过连接子偶联，连接子优选含半胱氨酸的柔性肽连接子，进一步优选GSGGGGSGGGGSGGGGC(简称linker1)或GSGGGGSGGGGCGGGGC(简称linker2)。优选地，polyGK-linker1的氨基酸序列为SEQ ID No.8，polyGK-linker2的氨基酸序列为SEQ ID No.10。polyGK通过linker1或linker2上的半胱氨酸与马来亚酰胺修饰的MMAF化学偶联，形成polyGK-linker1-MMAF或polyGK-linker2-MMAF₂，偶联方式如图2所示。

优选地，scFv-polyE和polyGK-linker1-MMAF(实施例中进一步简称polyGK-MMAF)或polyGK-linker2-MMAF₂(实施例中进一步简称polyGK-MMAF₂)的摩尔比为2000∶1至1∶2000，优选1000∶1至1∶1000，进一步优选500∶1至1∶500，更进一步优选100∶1至1∶100，更进一步优选50∶1至1∶50，更进一步优选1O∶1至1∶10，更进一步优选10∶2至2∶10，更进一步优选10∶2至1∶2，更进一步优选10∶2至1∶1，更进一步优选10∶(2～4)，更优选约为10∶3。

本发明的药物组合物可以通过静脉注射或腹腔注射或局部注射给予。本领域技术人员可以理解，组分1和组分2可以同时给予，也可以顺序给予。本领域技术人员可以通过本领域的常规方法确定本发明药物组合物的合适用量。

本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物可以通过本领域的常规方法制备得到。本领域常规的载体均可用于本发明，例如生理盐水、葡萄糖溶液等。

本发明的有益效果在于，通过利用相分离实现靶向递送抗肿瘤药物，使抗肿瘤药物富集在肿瘤细胞表面，之后再通过细胞内吞进入肿瘤细胞，最后杀死肿瘤细胞。通过共相分离，单克隆抗体等可以更多价结合抗肿瘤药物，能够解决AD C所存在的负载抗肿瘤药物拷贝数有限的问题，特别是还能在肿瘤细胞表面形成更高的药物浓度，取得了协同效果，不仅能够提高抗肿瘤效果，而且可以降低抗肿瘤药物的用量，从而降低副作用。

附图说明

图1：实施例1-5SDS-PAGE凝胶电泳图

图2：实施例6-8的药物偶联结构示意图

图3：实施例9药物DTNB检测图

图4：实施例10中的scFv-polyE与polyGK-EYFP细胞表面共聚焦成像图及特异性检测

图5：实施例10中的scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF细胞表面共聚焦成像

图6：实施例11中scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF细胞毒性协同作用验证

图7：实施例12中scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF低浓度细胞毒性特异性检测结果

图8：实施例13中scFv-MMAF₂与相分离药物复合物细胞毒性对比

图9：本发明药物递送系统在体内作用示意图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1.制备scFv-polyE

(1)菌种制备：

将含有scFv-polyE基因序列(SEQ ID NO.3)的pET-28a质粒转化至大肠杆菌origami2(DE3)(购自于北京庄盟国际生物基因，货号ZK259)中，可在15％的甘油中于-80℃保存。

(2)小试管培养：

取步骤(1)菌种适量，接种至5mL LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)中。摇床(37℃，220rpm)培养过夜；

(3)放大培养：

将两个过夜小试管中的大肠杆菌10mL按照1∶100转移至1L LB培养基中，37℃培养至OD600达到0.6-0.8。

(4)诱导表达：

在步骤(3)菌液中加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，37℃诱导6-7h。

(5)收菌、破胞纯化：

将步骤(4)菌液，4000rpm离心15min，取菌体用40mL冷的裂解液(50mM Na₃PO₄、500mM NaCl、10mM咪唑、pH7.0)重悬，加入1％所悬体积的0.5M PMSF，2％所悬体积的50mg/ml溶菌酶，搅拌使沉淀完全溶解，采用高压匀浆机进行破胞，完全破胞后，细胞裂解液呈现澄清透亮，12000rpm离心30min，收集上清。

取用裂解液平衡好的Ni柱，倒入上述上清并摇晃，使蛋白结合到Ni柱上，取下塞子，利用重力流下。用EQB(50mMNa₃PO₄、500mM NaCl、30mM咪唑、pH7.0)洗涤Ni柱至考马斯G250检测不变蓝。加5ml EB(50mMNa₃PO4、500mM NaCl、300mM咪唑、pH7.0)洗脱Ni柱，收集重力流下液体，用分光光度计测浓度(低于0.1mg/ml以下不用再洗脱)。

(6)纯化、蛋白胶分析：

将步骤(5)收集的液体合并，用体积排阻色谱(Superdex-75Increase 10/300，GEHealthcare)纯化，缓冲液使用PBS溶液(含1mM DTT)，得scFv-polyE，其氨基酸序列为SEQID NO.4，用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例2.制备polyGK-EYFP

(1)菌种制备：

将含有polyGK-EYFP基因序列(SEQ ID NO.5)的pET-28a质粒转化至大肠杆菌NiCo21(DE3)(购自于新英格兰生物实验室(NEB)，货号C2529H)中，可在15％的甘油中于-80℃保存。

(2)小试管培养：

(3)放大培养：

(4)诱导表达：

在步骤(3)菌液中加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃诱导16-20h。

(5)收菌、破胞纯化、蛋白胶分析：

取用裂解液平衡好的Ni柱，倒入上述上清并摇晃，使蛋白结合到Ni柱上，取下塞子，利用重力流下。用EQB(50mM Na₃PO₄、500mM NaCl、30mM咪唑、pH7.0)洗涤Ni柱至考马斯G250检测不变蓝。加5ml EB(50mMNa₃PO₄、500mM NaCl、300mM咪唑、pH7.0)洗脱Ni柱，收集重力流下液体，用分光光度计测浓度(低于0.1mg/ml以下不用再洗脱)，得polyGK-EYFP，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6，用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例3.制备scFV

(1)菌种制备：

将含有scFV基因序列(SEQ ID NO.1)的pET-28a质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自于赛默飞公司，货号EC0114)中，可在15％的甘油中于-80℃保存。

(2)小试管培养：

(3)放大培养：

(4)诱导表达：

(5)收菌、破胞纯化：

将步骤(4)菌液，4000rpm离心15min，取菌体用40mL冷的裂解液(50mM Na₃PO₄、500mM NaCl、10mM咪唑、8M尿素、pH7.0)重悬，加入1％所悬体积的0.5MPMSF，2％所悬体积的50mg/ml溶菌酶，搅拌使沉淀完全溶解，采用高压匀浆机进行破胞，完全破胞后，细胞裂解液呈现澄清透亮，12000rpm离心30min，收集上清。

取用裂解液平衡好的Ni柱，倒入上述上清并摇晃，使蛋白结合到Ni柱上，取下塞子，利用重力流下。用WB(50mMNa₃PO₄、500mMNaCl、30mM咪唑、8M尿素、pH7.0)洗涤Ni柱至考马斯G250检测不变蓝。加5ml EB(50mM Na₃PO₄、500mM NaCl、300mM咪唑、8M尿素、pH7.0)洗脱Ni柱，收集重力流下液体，用分光光度计测浓度(低于0.1mg/ml以下不用再洗脱)。

(6)蛋白复性、蛋白胶分析：

以PBS为透析液，将(5)收集的液体加入截留分子量为14000的透析袋中，透析48h，每6h更换透析液。之后收集透析后的蛋白，得scFV，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例4.制备polyGK-linker1

(1)菌种制备：

将含有polyGK-linker1基因序列(SEQ ID NO.7)的6p-1质粒转化至大肠杆菌NiCo21(DE3)(购自于新英格兰生物实验室(NEB)，货号C2529H)中，可在15％的甘油中于-80℃保存。

(2)小试管培养：

取步骤(1)菌种适量，接种至5mL LB培养基(含100μg/ml氨苄霉素)中。摇床(37℃，220rpm)培养过夜；

(3)放大培养：

(4)诱导表达：

(5)收菌、破胞纯化、蛋白胶分析：

将步骤(4)菌液，4000rpm离心15min，取菌体用40mL的PBS溶液(含2mM DTT)重悬，加入1％所悬体积的0.5M PMSF，2％所悬体积的50mg/ml溶菌酶，搅拌使沉淀完全溶解，采用高压匀浆机进行破胞，完全破胞后，细胞裂解液呈现澄清透亮，12000rpm离心30min，收集上清。

取用裂解液平衡好的GST柱，倒入上述上清并摇匀，使蛋白结合到GST柱上，取下塞子，利用重力流下。用PBS溶液(含2mM DTT)洗涤GST柱至考马斯G250检测不变蓝。加入5ml酶切缓冲液(20mM HEPES、200mMNaCl、2mM DTT)和终浓度为1mg/ml PP酶(购自于碧云天公司，货号P2303)，4℃过夜酶切，收集重力流下液体，得polyGK-linker1，其氨基酸序列为SEQ IDNO.8，用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例5.制备polyGK-linker2

(1)菌种制备：

将含有polyGK-linker2基因序列(SEQ ID NO.9)的6p-1质粒转化至大肠杆菌NiCo21(DE3)(购自于新英格兰生物实验室(NEB)，货号C2529H)中，可在15％的甘油中于-80℃保存。

(2)小试管培养：

(3)放大培养：

(4)诱导表达：

(5)收菌、破胞纯化、蛋白胶分析：

取用裂解液平衡好的GST柱，倒入上述上清并摇匀，使蛋白结合到GST柱上，取下塞子，利用重力流下。用PBS溶液(含2mM DTT)洗涤GST柱至考马斯G250检测不变蓝。加入5ml酶切缓冲液(20mMHEPES、200mMNaCl、2mMDTT)和终浓度为1mg/ml PP酶(购自于碧云天公司，货号P2303)，4℃过夜酶切，收集重力流下液体，得polyGK-linker2，其氨基酸序列为SEQ IDNO.10，用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果见图1。

实施例6.制备polyGK-EYFP-MMAF

(1)制备MC-MMAF储存液：将2mg MC-MMAF加入到1ml DMSO中，得2mg/mL的MC-MMAF储存液，于-20℃避光保存；

(2)制备polyGK-EYFP反应液：将1.5mg polyGK-EYFP加入到1ml pH值为7的ddH₂O中，得到1.5mg/mL polyGK-EYFP反应液，于4℃保存；

(3)取5μl步骤(1)MC-MMAF储存液加入到95μl步骤(2)polyGK-EYFP反应液中，放入摇床中，室温、避光、震荡1h，药物偶联结构如图2；

(4)将步骤(3)得到的溶液加入到10kD的透析管中，用1L pH 7的ddH₂O，于4℃透析2次，每次15min；

(5)收集(4)中的溶液，得polyGK-EYFP-MMAF，于4℃保存。

(6)用DTNB方法检测药物偶联情况。

实施例7.制备polyGK-MMAF和polyGK-MMAF₂

(2)制备polyGK-linker1(或polyGK-linker2)反应液：将0.7mg polyGK-linker1(或polyGK-linker2)加入到1ml pH值为7的ddH₂O中，得到0.7mg/mL polyGK-linker1(或polyGK-linker2)反应液，于4℃保存；

(3)取5μl步骤(1)MC-MMAF储存液加入到95μl步骤(2)polyGK-1inker1(或polyGK-linker2)反应液中，放入摇床中，室温、避光、震荡1h，药物偶联结构如图2；

(4)将步骤(3)得到的溶液加入到5kD的透析管中，用1L pH 7的ddH₂O，于4℃透析2次，每次15min；

(5)收集(4)中的溶液，得polyGK-MMAF和polyGK-MMAF₂，于4℃保存。

(6)用DTNB方法检测药物偶联情况。

实施例8.制备scFV-MMAF₂

(2)制备scFV反应液：将0.5mg scFV加入到1ml pH值为7的ddH₂O中，得到0.5mg/mLscFV反应液，于4℃保存；

(3)取5μl步骤(1)MC-MMAF储存液加入到95μl步骤(2)scFV反应液中，放入摇床中，室温、避光、震荡1h，药物偶联结构如图2；

(4)将步骤(3)得到的溶液加入到10kD的透析管中，用1LpH 7的ddH₂O，于4℃透析2次，每次15min；

(5)收集(4)中的溶液，得scFV-MMAF₂，于4℃保存。

(6)用DTNB方法检测药物偶联情况。

实施例9.DTNB检测药物偶联情况

(1)制备DTNB储存液：将4mg DTNB(5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸))溶于1ml缓冲液(0.1M Na₃PO4、1M EDTA、pH8.0)中，避光、4℃储存；

(2)制备DTNB工作液：取100μlDTNB储存液，加入到100μl ddH₂O中，避光、4℃储存；

(3)制备样品液：将0.24mg polyGK-EYFP(或0.7mg polyGK-linker1或0.7mgpolyGK-linker2或0.5mg scFV)加入到1ml ddH₂O中，制成0.24mg/mL polyGK-EYFP(或0.7mg/mL polyGK-linkerl或0.7mg/mL polyGK-linker2或0.5mg/mL scFV)；将0.24mgpolyGK-EYFP-MMAF(或0.7mg polyGK-MMAF或0.7mg polyGK-MMAF₂或0.5mg scFV-MMAF₂)加入到1ml ddH₂O中，制成0.24mg/mL polyGK-EYFP-MMAF(或0.7mg/mL polyGK-MMAF或0.7mg/mL polyGK-MMAF₂或0.5mg/mL scFV-MMAF₂)；

(4)将步骤(3)的样品加入到384孔板中，设置三组平行样品，每孔加入30μl，设置空白组(ddH₂O)，每孔中加入4μl 20％SDS，以暴露半胱氨酸；

(5)使用酶标仪检测步骤(4)各孔在A₄₁₂的吸收值5min，建立样品动态基线；

(6)在各孔中加入2μl的DTNB工作液，使用酶标仪检测各孔在A₄₁₂的吸收值20min，裸露的半胱氨酸与DTNB快速反应；

(7)以步骤(6)中检测到的数据作图，横坐标为时间，纵坐标为OD₄₁₂，见图3，polyGK-linker1、polyGK-linker2、polyGK-EYFP和scFv，因其表面暴露的半胱氨酸可与DTNB反应，从而在OD₄₁₂吸光度增加，表面半胱氨酸数量可由同浓度下游离半胱氨酸反应速率标定。偶连MMAF后，因全部暴露于表面半胱氨酸与MC-MMAF连接，不与DTNB反应，因此在OD₄₁₂吸光度不变。可知反应后产物为：polyGK-MMAF、polyGK-MMAF₂、polyGK-EYFP-MMAF和scFv-MMAF₂。

实施例10.scFv-polyE与polyGK-EYFP(或polyGK-EYFP-MMAF)细胞表面共聚焦成像图

(1)配置试剂和培养基

细胞培养基配置：由90％的DMEM培养基(购自Gibco公司，货号GMS 120523.1)和1O％的FBS配制而成；

细胞培养基用于培养HeLa细胞(人宫颈癌细胞系，购自中科院上海细胞库)、A431细胞(人类皮肤癌细胞，购自中科院上海细胞库)、HEK-293细胞(人类胚胎肾脏细胞，购自中科院上海细胞库)；

Cy3-NHS ester染色液制备：1mg Cy3-NHS ester加入到100μl DMSO中，终浓度为10mg/ml；

scFv-polyE(cy3)染色种子制备：将5μl Cy3-NHS ester染色液加入到90μl 100mMscFv-polyE中，并加入5μl 1M NaHCO₃调节溶液pH值至碱性，溶液终体积为100μl，放置-20℃冰箱存放。染色时取用5μl scFv-polyE(cy3)染色种子加入到1ml 20mM scFv-polyE；

(2)待培养瓶中的上述细胞长到了80％以上后，加入1mL 0.25％胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃、5％CO₂培养箱孵育，当倒置显微镜下观察到细胞消化完成，加入1mL细胞培养基终止后离心，离心条件为1000rpm下离心4min，弃上清液，加入细胞培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；

(3)用细胞计数器计算细胞个数，并添加细胞培养基调整细胞浓度至5×10⁴个/ml；

(4)取步骤(3)的细胞悬液铺板，8孔皿(购自Thermos Fisher Science公司)的每个孔中加入体积为100μl，每孔细胞数目5000个，然后放置5％CO₂、37℃培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁；

(5)孵育结束后，用生理盐水配制1μM scFv-polyE(cy3)与1μM polyGK-EYFP分别加入上述细胞的8孔皿中，共聚焦显微镜(Leica SP8)观察8孔皿中的样品，结果为图4，图中纵向标注显示为荧光通道，分别为明场、cy3(红色)、EYFP(黄色)、叠加通道。上述复合物会和肿瘤细胞上的EGFR结合，当存在结合时，双组份在细胞表面富集，所以可以在细胞表面观察到凝聚物(显色)，上述细胞的EGFR含量从多到少顺序为A431、Hela、HEK-293，且HEK-293基本不含EGFR，所以HEK-293可以作为阴性对照，不会显色。

(6)为验证偶联药物不会对复合物的相分离特性产生影响，用生理盐水配制1μMscFv-polyE(cy3)与1μM polyGK-EYFP-MC-MMAF分别加入A431的8孔皿中，共聚焦显微镜(Leica SP8)观察8孔皿中的样品，结果为图5。

实施例11.scFv-polyE与p0lyGK-EYFP-MMAF不同配比的药物复合物的细胞活性实验

(1)配置试剂和培养基

MTT溶液的配置：用PBS配制5mg/ml的MTT(噻唑蓝，购自Sigma公司，货号M5655)，用锡箔纸包裹好，在室温下搅拌30min，完全溶解后用0.22M的滤膜过滤，在4℃下避光保存；

三联试剂的配制：将SDS(十二烷基硫酸钠)10g、异丁醇5mL、10M盐酸0.12ml，用双蒸水溶解配成100ml溶液；

细胞培养基配置：由90％的DMEM培养基(购自Gibco公司，货号GMS 120523.1)和10％的FBS配制而成；

细胞培养基用于培养A431细胞(人类皮肤癌细胞，购自中科院上海细胞库)；

(2)待培养瓶中的A431细胞长到了80％以上后，加入1mL 0.25％胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃、5％CO2培养箱孵育，当倒置显微镜下观察到细胞消化完成，加入1mL细胞培养基终止后离心，离心条件为1000rpm下离心4min，弃上清液，加入细胞培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；

(4)取步骤(3)的细胞悬液铺板，96孔板(购自Thermos Fisher Science公司)的每个孔中加入体积为100ul，每孔细胞数目5000个，然后放置5％CO₂、37℃培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁；

(5)孵育结束后，用无血清培养基(DMEM，购自Gibco公司，货号GMS 12052.3.2)配制不同配比的scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF的复合物，并加入96孔皿中，与步骤(4)的A431细胞共同孵育，为药物组；空白组仅添加细胞培养基；

(6)各组孵育48小时后，吸出培养基，将MTT溶液用无酚红的DMEM完全培养基稀释十倍，然后每孔加入100μl，再将96孔板放入5％CO₂、37℃细胞培养箱中；

(7)反应4小时后，每孔加入100μl的三联试剂(10％SDS+5％异丁醇+0.012molHCl)，在室温下置于摇床上振荡12-24小时混匀，用酶标仪检测溶液在570mm的OD值；用Prism 8软件计算上述药物对A431细胞的IC_5o值，结果显示在表1中。

(8)IC₅₀值可用于衡量药物对肿瘤细胞的毒性，细胞毒性越强，该数值越低。以

(7)的结果生成图6，横坐标为取IC₅₀时复合物中polyGK-EYFP-MMAF的摩尔浓度，纵坐标为取IC₅₀时复合物中scFv-polyE的摩尔浓度值。本图以细胞存活率为效应指标，分析药物之间的相互作用。首先确定单一药物剂量和细胞存活率之间的关系。若在相同的细胞存活率(即IC50)的情况下，同时药物间如果是相互独立的(即相加作用)，药物会维持一个恒定的效价比，即相同的有效剂量(a是scFv-polyE的剂量，b是polyGK-EYFP-MMAF的剂量)显示一个常数剂量率：a/b＝R(图6中的虚线)。因此，得到下式：

a是scFv-polyE的剂量；b是polyGK-EYFP-MMAF的剂量；A为scFv-polyE单独处理时的IC₅₀，B为polyGK-EYFP-MMAF单独处理时的IC₅₀。

式中C的数值将组合分类如下：

C＝1：药物间相互独立(相加作用)

C＜1：药物间协同作用(协同作用)

C＞1：药物间相互排斥(拮抗作用)

我们通过对不同配比的复合物IC₅₀的分析，验证了scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF间为协同作用，并找到了复合物两组分效果较好的混合比例为scFv-polyE：polyGK-EYFP-MMAF＝10∶3(如图6)。

实施例12.scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF的药物复合物的细胞特异性实验

(1)配置试剂和培养基

HEK-293细胞(人类胚胎肾脏细胞，购自中科院上海细胞库)；

(2)待培养瓶中的A431或HEK-293细胞长到了80％以上后，加入1mL 0.25％胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃、5％CO₂培养箱孵育，当倒置显微镜下观察到细胞消化完成，加入1mL细胞培养基终止后离心，离心条件为1000rpm下离心4min，弃上清液，加入细胞培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；

(5)孵育结束后，用无血清培养基(DMEM，购自Gibco公司，货号GMS 12052.3.2)配制scFv-polyE：polyGK-EYFP-MMAF＝10∶3的复合物，并加入96孔皿中，与步骤(4)的A431或HEK-293细胞共同孵育，为药物组；空白组仅添加细胞培养基；

(7)反应4小时后，每孔加入100μl的三联试剂(10％SDS+5％异丁醇+0.012molHCl)，在室温下，置于摇床上振荡12-24小时混匀，用酶标仪检测溶液在570nm的OD值；用Prism 8软件计算上述药物对A431或HEK-293细胞的IC_s0值，结果显示在表1中。

(8)以(7)的结果生成图7，横坐标为polyGK-EYFP-MMAF的摩尔浓度，纵坐标为细胞存活率，scFv-polyE与polyGK-EYFP-MMAF的摩尔比为10∶3，HEK-293细胞作为阴性对照。图7表明两组分对肿瘤细胞(A431)具有杀伤作用，而对正常细胞(HEK-293)细胞毒性低甚至没有，说明两组分复合物对肿瘤细胞具有特异性的杀伤作用。

实施例13.scFv-polyE与polyGK-MMAF(或polyGK-MMAF₂)的复合物A431细胞活性实验

scFv-polyE与polyGK-MMAF(或polyGK-MMAF₂)的复合物细胞活性实验采用MTT法检测，具体操作步骤如下：

(1)配置试剂和培养基

(2)待培养瓶中的A431细胞长到了80％以上后，加入1mL 0.25％胰酶(购自Sigma公司)消化，放置在37℃、5％CO₂培养箱孵育，当倒置显微镜下观察到细胞消化完成，加入1mL细胞培养基终止后离心，离心条件为1000rpm下离心4min，弃上清液，加入细胞培养基轻轻吹打，使细胞均匀地分散在培养基中；

(4)取步骤(3)的细胞悬液铺板，96孔板(购自Thermos Fisher Science公司)的每个孔中加入体积为100ul，每孔细胞数目5000个，然后放置5％CO2、37℃培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁；

(5)孵育结束后，用无血清培养基(DMEM，购自Gibco公司，货号GMS 12052.3.2)配制scFv-polyE：polyGK-MMAF(或polyGK-MMAF₂或polyGK-EYFP-MMAF)＝10：3复合物及同浓度范围下的polyGK-EYFP-MMAF和scFV-MMAF₂，分别并加入96孔皿中，与步骤(4)的A431细胞共同孵育，为给药组；空白组仅添加细胞培养基；

(6)各组孵育48小时后，吸出培养基，将MTT溶液用无酚红的DMEM完全培养基稀释十倍，然后每孔加入100μl，再将96孔板放入5％CO₂、37℃细胞培养箱中；(7)反应4小时后，每孔加入100μl的三联试剂(10％SDS+5％异丁醇+0.012molHCI)，在室温下，置于摇床上振荡12-24小时混匀，用酶标仪检测溶液在570mm的OD值；用Prism 8软件计算上述药物对A431细胞的IC₅₀值，结果显示在表1中。

(8)以(7)的结果生成图8，横坐标为MMAF药物的摩尔浓度，纵坐标为细胞存活率，scFv-polyE与MMAF药物的摩尔比为10∶3，scFv-MMAF₂作为传统ADC对照。图8表明当两种药物结合时，polyGK-MMAF₂的毒性比polyGK-MMAF高，这意味着有效载荷数是一个重要的药物疗效参数。同时传统的scFv-MMAF₂在相同有效载荷浓度下的活性也低于任何相分离的药物。这是一个强有力的证据，表明通过在系统中引入LLPS，有效载荷可以有效地浓缩在细胞表面，并增加药物的局部浓度，从而产生更好的疗效。

表1：各组分药物对A431或HEK-293细胞毒性检测的IC₅₀值

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 沃肽生物科技（山东）有限公司

<120> 基于相分离的肿瘤靶向药物递送系统

<130> CPCN21411249

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggatattc tgctgaccca gagcccggtg attctgagcg tgagcccggg cgaacgcgtg 120

agctttagct gccgcgcgag ccagagcatt ggcaccaaca ttcattggta tcagcagcgc 180

accaacggca gcccgcgcct gctgattaaa tatgcgagcg aaagcattag cggcattccg 240

agccgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattttaccc tgagcattaa cagcgtggaa 300

agcgaagata ttgcggatta ttattgccag cagaacaaca actggccgac cacctttggc 360

gcgggcacca aactggaact gaaacgcacc gtggcggcgc cgagcgtgtt tatttttccg 420

ccgagcgatg aacagctgaa aagcggcacc gcgagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttt 480

tatccgcgcg aagcgaaagt gcagtggaaa gtggataacg cgctgcagag cggcaacagc 540

caggaaagcg tgaccgaaca ggatagcaaa gatagcacct atagcctgag cagcaccctg 600

accctgagca aagcggatta tgaaaaacat aaagtgtatg cgtgcgaagt gacccatcag 660

ggcctgagca gcccggtgac caaaagcttt aaccgcggcg cgggcggcgg cggcagcggc 720

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctga aacagagcgg cccgggcctg 780

gtgcagccga gccagagcct gagcattacc tgcaccgtga gcggctttag cctgaccaac 840

tatggcgtgc attgggtgcg ccagagcccg ggcaaaggcc tggaatggct gggcgtgatt 900

tggagcggcg gcaacaccga ttataacacc ccgtttacca gccgcctgag cattaacaaa 960

gataacagca aaagccaggt gttttttaaa atgaacagcc tgcagagcaa cgataccgcg 1020

atttattatt gcgcgcgcgc gctgacctat tatgattatg aatttgcgta ttggggccag 1080

ggcaccctgg tgaccgtgag cgcggcgagc accaaaggcc cgagcgtgtt tccgctggcg 1140

ccgagcagca aaagcaccag cggcggcacc gcggcgctgg gctgcctggt gaaagattat 1200

tttccggaac cggtgaccgt gagctggaac agcggcgcgc tgaccagcgg cgtgcatacc 1260

tttccggcgg tgctgcagag cagcggcctg tatagcctga gcagcgtggt gaccgtgccg 1320

agcagcagcc tgggcaccca gacctatatt tgcaacgtga accataaacc gagcaacacc 1380

aaagtggata aacgcgtgga accgaaa 1407

<210> 2

<211> 469

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu

20 25 30

Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser

50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile

85 90 95

Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn

100 105 110

Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser

245 250 255

Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr

260 265 270

Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln

275 280 285

Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly

290 295 300

Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys

305 310 315 320

Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser

325 330 335

Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp

340 345 350

Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

355 360 365

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

370 375 380

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

405 410 415

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

420 425 430

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

435 440 445

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

450 455 460

Arg Val Glu Pro Lys

465

<210> 3

<211> 1671

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggatattc tgctgaccca gagcccggtg attctgagcg tgagcccggg cgaacgcgtg 120

agctttagct gccgcgcgag ccagagcatt ggcaccaaca ttcattggta tcagcagcgc 180

accaacggca gcccgcgcct gctgattaaa tatgcgagcg aaagcattag cggcattccg 240

agccgcttta gcggcagcgg cagcggcacc gattttaccc tgagcattaa cagcgtggaa 300

agcgaagata ttgcggatta ttattgccag cagaacaaca actggccgac cacctttggc 360

gcgggcacca aactggaact gaaacgcacc gtggcggcgc cgagcgtgtt tatttttccg 420

ccgagcgatg aacagctgaa aagcggcacc gcgagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttt 480

tatccgcgcg aagcgaaagt gcagtggaaa gtggataacg cgctgcagag cggcaacagc 540

caggaaagcg tgaccgaaca ggatagcaaa gatagcacct atagcctgag cagcaccctg 600

accctgagca aagcggatta tgaaaaacat aaagtgtatg cgtgcgaagt gacccatcag 660

ggcctgagca gcccggtgac caaaagcttt aaccgcggcg cgggcggcgg cggcagcggc 720

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagccag gtgcagctga aacagagcgg cccgggcctg 780

gtgcagccga gccagagcct gagcattacc tgcaccgtga gcggctttag cctgaccaac 840

tatggcgtgc attgggtgcg ccagagcccg ggcaaaggcc tggaatggct gggcgtgatt 900

tggagcggcg gcaacaccga ttataacacc ccgtttacca gccgcctgag cattaacaaa 960

gataacagca aaagccaggt gttttttaaa atgaacagcc tgcagagcaa cgataccgcg 1020

atttattatt gcgcgcgcgc gctgacctat tatgattatg aatttgcgta ttggggccag 1080

ggcaccctgg tgaccgtgag cgcggcgagc accaaaggcc cgagcgtgtt tccgctggcg 1140

ccgagcagca aaagcaccag cggcggcacc gcggcgctgg gctgcctggt gaaagattat 1200

tttccggaac cggtgaccgt gagctggaac agcggcgcgc tgaccagcgg cgtgcatacc 1260

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agcagcagcc tgggcaccca gacctatatt tgcaacgtga accataaacc gagcaacacc 1380

aaagtggata aacgcgtgga accgaaaggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc 1440

ggcggcggca gcggcccgca gggcattgcg agcgggcgaa ttcgagctcg gtacctcgcg 1500

aatgcatcta gatatcggat cgaagaagaa gaagaagagg aagaggaaga agaagaagag 1560

gaagaggaag aagaagaaga ggaagaggaa gaagaagaag aggaagagga agaagaagaa 1620

gaggaagagg aagaagaaga agaggaagag gaagaggaag aagaagagga a 1671

<210> 4

<211> 557

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu

20 25 30

Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser

50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile

85 90 95

Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn

100 105 110

Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser

245 250 255

Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr

260 265 270

Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln

275 280 285

Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly

290 295 300

Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys

305 310 315 320

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325 330 335

Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp

340 345 350

Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

355 360 365

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

370 375 380

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

385 390 395 400

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

405 410 415

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

420 425 430

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

435 440 445

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

450 455 460

Arg Val Glu Pro Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Gly Pro Gln Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ile Arg Ala

485 490 495

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Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

515 520 525

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

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Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

545 550 555

<210> 5

<211> 894

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

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ggtggcaaga aaggcggtaa aaaaggcgga aaaaaaggcg gtaagaaagg tgggaaaaaa 120

ggtggcaaaa aaggtgggaa aaaaggcggt aaaatggtga gcaaaggtga agaactgttt 180

accggtgttg ttccgattct ggttgaactg gatggtgatg ttaatggcca caaattttca 240

gttagcggtg aaggcgaagg tgatgcaacc tatggtaaac tgaccctgaa atttatctgt 300

accaccggca aactgccggt tccgtggccg acactggtga ccacctttgg ttatggtctg 360

cagtgttttg cacgttatcc ggatcatatg aaacagcacg attttttcaa aagcgcaatg 420

ccggaaggtt atgttcaaga acgtaccatc ttcttcaaag atgacggcaa ctataaaacc 480

cgtgccgaag ttaaatttga aggtgatacc ctggtgaatc gcattgaact gaaaggcatc 540

gattttaaag aggatggtaa tatcctgggc cacaaactgg aatataatta taatagccac 600

aacgtgtaca tcatggccga caaacagaaa aatggcatca aagtgaactt caagatccgc 660

cataatattg aagatggttc agttcagctg gccgatcatt atcagcagaa taccccgatt 720

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attaccttag gtatggatga actgtacaaa ctcgagcacc accaccacca ccac 894

<210> 6

<211> 298

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

Met Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys

1 5 10 15

Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys

20 25 30

Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys

35 40 45

Gly Gly Lys Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val

50 55 60

Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser

65 70 75 80

Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu

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100 105 110

Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp

115 120 125

His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr

130 135 140

Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr

145 150 155 160

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu

165 170 175

Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys

180 185 190

Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys

195 200 205

Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu

210 215 220

Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile

225 230 235 240

Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln

245 250 255

Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu

260 265 270

Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu

275 280 285

Tyr Lys Leu Glu His His His His His His

290 295

<210> 7

<211> 240

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

gggcccctgg gatccatggg taaaaaaggt ggcaaaaaag gcggaaagaa aggtggtaaa 60

aaaggtggta agaaaggtgg caagaaaggc ggtaaaaaag gcggaaaaaa aggcggtaag 120

aaaggtggga aaaaaggtgg caaaaaaggt gggaaaaaag gcggtaaagg atccggcggc 180

ggcggcagcg gcggcggcgg cagcggcggc ggcggctgcc tcgagcggcc gcatcgtgac 240

<210> 8

<211> 80

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Gly Pro Leu Gly Ser Met Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys

1 5 10 15

Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys

20 25 30

Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys

35 40 45

Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Cys Leu Glu Arg Pro His Arg Asp

65 70 75 80

<210> 9

<211> 240

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

gggcccctgg gatccatggg taaaaaaggt ggcaaaaaag gcggaaagaa aggtggtaaa 60

aaaggtggta agaaaggtgg caagaaaggc ggtaaaaaag gcggaaaaaa aggcggtaag 120

aaaggtggga aaaaaggtgg caaaaaaggt gggaaaaaag gcggtaaagg atccggcggc 180

ggcggcagcg gcggcggcgg ctgcggcggc ggcggctgcc tcgagcggcc gcatcgtgac 240

<210> 10

<211> 80

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Gly Pro Leu Gly Ser Met Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys

1 5 10 15

Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys

20 25 30

Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys

35 40 45

Lys Gly Gly Lys Lys Gly Gly Lys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Leu Glu Arg Pro His Arg Asp

65 70 75 80

Claims

1.一种药物组合物，含有能够共相分离的组分1和组分2，其中，组分1为能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的偶联物，组分2为抗肿瘤药物与B的偶联物，A和B能够共相分离从而使组分1和组分2能够共相分离。优选地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

2.一种药物复合物，其由组分1和组分2共相分离形成，其中，组分1为能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的偶联物，组分2为抗肿瘤药物与B的偶联物，A和B共相分离从而使组分1和组分2共相分离。

3.一种试剂盒，含有彼此独立的两种药物组合物，其中，一种药物组合物含有组分l，组分1为能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A的偶联物，另一种药物组合物含有组分2，组分2为抗肿瘤药物与B的偶联物，A和B能够共相分离从而使组分1和组分2能够共相分离。优选地，所述两种药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

4.如权利要求1-3所述的药物组合物或药物复合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

5.如权利要求1-4所述的药物组合物、药物复合物、试剂盒和用途，其中，肿瘤细胞表面抗原选自CD19、CD22、CD30、CD33、CD37、CD74、CD79b、CD138、BCMA、HER2、DLL3、EGFR、CD56、gpNMB、CEACAM5、PSMA、Trop-2、EGP1、GCC、STEAP1、CA6、AGS-16、nectin-4、cripto、间皮素、SLC44A4、CD70、ENPP3。

优选地，所述生物分子为抗体，更优选地，所述生物分子为单克隆抗体或其识别片段。

优选地，所述化学分子为受体酪氨酸激酶抑制剂，更优选地，所述化学分子为克唑替尼、Brigatinib、Capmatinib、吉非替尼、Almonertinib。

优选地，所述化学分子为癌细胞表面蛋白受体抑制剂，更优选地，所述化学分子为Sonidegib、Glasdegib。

优选地，抗肿瘤药物选自DNA损伤剂和/或微管蛋白抑制剂。优选地，DNA损伤剂选自卡奇霉素、倍癌霉素、阿霉素、Pyrrolobenzodiazepines。优选地，微管蛋白抑制剂选自澳瑞他汀类和美登素类。优选地，奥利他汀类选自澳瑞他汀、一甲基澳瑞他汀、一甲基澳瑞他汀F。优选地，美登素类选自美登素，美登素DM1、美登素DM4。

优选地，能够共相分离的A和B或者B和A选自polyE/polyGK、polyE/polyK、hnRNPA1/FUS、hnRNPA1/TDP-43、RNA结合蛋白IDR区片段与RNA或RNA衍生物，如FUS/RNA。优选地，polyE/polyGK。

6.如权利要求1-5所述的药物组合物、药物复合物、试剂盒和用途，其中，能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子或化学分子与A可直接偶联或者通过连接子偶联。

优选地，连接子为多肽连接子，更优选地，连接子为柔性多肽连接子。

优选地，连接子为化学连接子，更优选地，连接子为双活性连接子NHS-PEG-maleimide。

优选地，抗肿瘤药物与B通过连接子偶联。优选地，连接子包括在肿瘤药物上修饰的活性基团和与该活性基团反应从而连接的多肽两部分。优选地，活性基团为马来酰亚胺，多肽连接子含有半胱氨酸。

7.如权利要求1-6所述的药物组合物、药物复合物、试剂盒和用途，其中，能够与肿瘤细胞表面抗原特异性结合的生物分子为西妥昔单抗或其识别片段；抗肿瘤药物为奥利他汀类；A和B为polyE和polyGK、polyE和polyK、polyGK和polyE、或polyK和polyE；西妥昔单抗或其识别片段与A直接偶联或通过连接子偶联；奥利他汀类与B通过连接子偶联。

优选地，西妥昔单抗或其识别片段与A的连接子为柔性肽连接子。

优选地，奥利他汀类与B的连接子为柔性肽连接子-马来酰亚胺。

8.如权利要求7所述的药物组合物、药物复合物、试剂盒和用途，其中，西妥昔单抗的识别片段为其单链可变片段scFv，其中，VL与VH之间的连接子为(GGGGS)₃。

优选地，A为polyE，优选E30-100，进一步优选E40-60，进一步优选E50。

优选地，西妥昔单抗的识别片段scFv与A通过连接子偶联，连接子优选柔性肽连接子，进一步优选(GGGGS)₃GPQGIASGRIRARYLANASRYRI。

优选地，组分1的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

9.如权利要求7所述的药物组合物、药物复合物、试剂盒和用途，其中，抗肿瘤药物为MMAF。

优选地，B为polyGK，优选KKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGKKGGK。

优选地，MMAF和B通过连接子偶联，连接子优选含半胱氨酸的柔性肽连接子，进一步优选GSGGGGSGGGGSGGGGC(linker1)或GSGGGGSGGGGCGGGGC(linker2)。

优选地，polyGK-linker1的氨基酸序列为SEQ ID No.8。

优选地，polyGK-linker2的氨基酸序列为SEQ ID No.10。

优选地，polyGK通过linker1或linker2上的半胱氨酸与马来亚酰胺修饰的MMAF化学偶联，形成polyGK-linker1-MMAF或polyGK-linker2-MMAF₂。

10.如权利要求7-9所述的药物组合物、药物复合物、试剂盒和用途，其中，scFv-polyE和polyGK-linker1-MMAF或polyGK-linker2-MMAF₂的摩尔比为2000∶1至1∶2000，优选1000∶1至1∶1000，进一步优选500∶1至1∶500，更进一步优选100∶1至1∶100，更进一步优选50∶1至1∶50，更进一步优选10∶1至1∶10，更进一步优选10∶2至2∶10，更进一步优选10∶2至1∶2，更进一步优选10∶2至1∶1，更进一步优选10∶(2～4)，更优选约为10∶3。