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WO2025206033A1 - ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、ペプチド－薬物複合体および組成物 - Google Patents

ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、ペプチド－薬物複合体および組成物

Info

Publication number
WO2025206033A1
WO2025206033A1 PCT/JP2025/012193 JP2025012193W WO2025206033A1 WO 2025206033 A1 WO2025206033 A1 WO 2025206033A1 JP 2025012193 W JP2025012193 W JP 2025012193W WO 2025206033 A1 WO2025206033 A1 WO 2025206033A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
upar
peptide
binding
amino acid
helix
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/012193
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
郁雄 藤井
雅孝 道上
勇登 中谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University Public Corporation Osaka
Original Assignee
University Public Corporation Osaka
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University Public Corporation Osaka filed Critical University Public Corporation Osaka
Publication of WO2025206033A1 publication Critical patent/WO2025206033A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Definitions

  • Urokinase-type plasminogen activator receptor is a GPI-anchored membrane receptor expressed on the cell surface and is generally known to be involved in all physiological and pathological processes involving extracellular matrix (ECM) remodeling, such as embryogenesis, inflammation, tissue repair, tumor invasion, and metastasis.
  • ECM extracellular matrix
  • uPAR binds to its ligand, urokinase-type plasminogen activator (uPA), promoting pericellular activation of the plasmin system by uPA and subsequent degradation of the extracellular matrix (ECM), which is thought to contribute to cell migration and other processes.
  • ECM extracellular matrix
  • Peptides with a helix-loop-helix (HLH) structure are disclosed in Patent Documents 1 and 2, among others, as peptide-based molecules that bind to targets.
  • Peptides with a helix-loop-helix structure include an N-terminal helix region, a C-terminal helix region, and a loop region connecting them.
  • the N-terminal and C-terminal helices each form an ⁇ -helical coiled-coil structure.
  • these peptides adopt stable secondary structures in solution, making it easy to introduce functional groups with different chemical properties into the solvent-exposed portions of the molecule (Non-Patent Document 1). Utilizing these properties, various peptides with helix-loop-helix structures that possess physiological activity have been proposed.
  • the present disclosure aims to provide uPAR-binding HLH peptides, peptide-drug conjugates (PDCs), and compositions containing the uPAR-binding HLH peptides or the PDCs.
  • PDCs peptide-drug conjugates
  • the inventors constructed a peptide library that retained its three-dimensional structure using phage surface display, performed screening, and obtained peptides that bind to uPAR. Furthermore, they obtained PDCs in which drugs were linked to the obtained peptides.
  • the present disclosure relates to a peptide (“uPAR-binding peptide”) that binds to the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), comprising a (helix 1)-(loop)-(helix 2) structure from the N-terminus to the C-terminus.
  • uPAR-binding peptide that binds to the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), comprising a (helix 1)-(loop)-(helix 2) structure from the N-terminus to the C-terminus.
  • the present disclosure relates to a uPAR-binding peptide-drug conjugate (PDC) comprising the uPAR-binding peptide and a drug linked to the peptide.
  • PDC uPAR-binding peptide-drug conjugate
  • the present disclosure relates to a composition comprising the uPAR-binding peptide or the PDC.
  • the present disclosure provides a uPAR-binding HLH peptide, a peptide-drug conjugate (PDC) in which a drug is linked to the uPAR-binding HLH peptide, and a composition comprising the peptide or the PDC.
  • PDC peptide-drug conjugate
  • the present disclosure relates to peptides ("uPAR-binding peptides”) that bind to the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), including a helix-loop-helix (HLH) structure, peptide-drug conjugates (PDCs) in which a drug is linked to the uPAR-binding peptide, and compositions containing the uPAR-binding peptide or PDC, as well as uses thereof.
  • uPAR-binding peptides that bind to the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR), including a helix-loop-helix (HLH) structure, peptide-drug conjugates (PDCs) in which a drug is linked to the uPAR-binding peptide, and compositions containing the uPAR-binding peptide or PDC, as well as uses thereof.
  • the present disclosure relates to a uPAR-binding peptide (also referred to herein as a uPAR-binding HLH peptide or simply as a uPAR-binding peptide) that comprises a (helix 1)-(loop)-(helix 2) structure from the N-terminus to the C-terminus.
  • a uPAR-binding peptide also referred to herein as a uPAR-binding HLH peptide or simply as a uPAR-binding peptide
  • helix 1 and helix 2 are each an ⁇ -helix.
  • the uPAR-binding HLH peptide can form a stable structure by bringing the two helices closer together through hydrophobic interactions between the leucine residues contained in helix 1 and helix 2 and electrostatic interactions between glutamic acid and lysine residues.
  • the amino acid residues located in the solvent-exposed regions of the two helices that are closer together contribute little to the three-dimensional structure of the HLH peptide; rather, by constituting the regions that interact with the target, they can independently contribute to the binding activity of the HLH peptide to its target.
  • Helix 1 and helix 2 may have any sequence length that maintains a stable helix structure, for example, approximately 4 to 40 residues.
  • the sequence length of the helix is determined appropriately depending on factors such as target specificity, stability, and intracellular internalization.
  • the lengths of helix 1 and helix 2 may be equal or may differ by no more than two amino acid residues.
  • helix 1 and helix 2 may be 10 to 20 amino acid residues.
  • helix 1 consists of 14 amino acid residues and helix 2 consists of 14 or 15 amino acid residues.
  • helix 1 and helix 2 consist of 14 amino acid residues.
  • X9 , X10 , X12 , and X14 may be any amino acid.
  • X9 , X10 , X12 , and X14 are amino acids suitable for maintaining a helix structure, such as amino acids other than C, P, G, or S, and more preferably amino acids selected from the group consisting of A, R, N, E, H, L, K, M, F, V, and Y.
  • X9 is A.
  • X10 is A.
  • X12 is A.
  • X14 is A.
  • Helix 2 of the uPAR-binding HLH peptide can be helix 2-2 comprising or consisting of the amino acid sequence KLX17X18LX19X20KLX21X22LKX23X24 (SEQ ID NO : 3).
  • X20 is F, Y , or W
  • X22 is R or K
  • X23 is L , I , or V
  • X24 is L, I, or V.
  • X20 is F, Y , or W
  • X22 is R
  • X23 is L, I, or V
  • X24 is L , I, or V.
  • X17 , X18 , X19 , and X21 may be any amino acid.
  • X17 , X18 , X19 , and X21 are amino acids suitable for maintaining a helix structure, such as amino acids other than C, P, G, or S, and more preferably amino acids selected from the group consisting of A, R, N, E, H, L, K, M, F, V, and Y.
  • X17 is A.
  • X18 is A.
  • X19 is K.
  • X21 is A.
  • helix 2-1 comprises or consists of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13-18.
  • helix 2-2 comprises or consists of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 20-25.
  • helix 2-1 comprises the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 13-18.
  • helix 2-2 comprises the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 20-25.
  • helix 2 may not have specific amino acid residues that contribute to maintaining binding to uPAR.
  • X9 to X24 may be any amino acid, preferably an amino acid that is suitable for maintaining a helix structure, for example, an amino acid other than C, P, G, or S, and more preferably an amino acid selected from the group consisting of A, R, N, E, H, L, K, M, F, V, and Y.
  • helix 2 comprises or consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 26.
  • helix 2 consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 26.
  • the uPAR-binding HLH peptide comprises helix 1 comprising or consisting of the amino acid sequence of X 1 ELX 2 X 3 LX 4 X 5 ELX 6 X 7 LX 8 (SEQ ID NO: 1), and helix 2, which is helix 2-1 comprising or consisting of the amino acid sequence of KLX 9 X 10 LX 11 X 12 KLX 13 X 14 LX 15 X 16 (SEQ ID NO: 2) or helix 2-2 comprising or consisting of the amino acid sequence of KLX 17 X 18 LX 19 X 20 KLX 21 X 22 LKX 23 X 24 (SEQ ID NO: 3), wherein X 1 to X 24 represent amino acid residues;
  • These amino acid sequences satisfy the following conditions (a) to (e): (a) X2 is F, Y or W, X5 is R or K, and X6 and X7 are each independently L, I or V; (b) X 11 is
  • the uPAR-binding HLH peptide comprises a helix 1 comprising or consisting of the amino acid sequence X 1 ELX 2 X 3 LX 4 X 5 ELX 6 X 7 LX 8 (SEQ ID NO: 1), and a helix 2-1 comprising or consisting of the amino acid sequence KLX 9 X 10 LX 11 X 12 KLX 13 X 14 LX 15 X 16 (SEQ ID NO: 2), wherein X 1 to X 16 represent amino acid residues; X2 is F, Y or W, X5 is R or K, X6 is L, I or V, X7 is L, I or V, and optionally, X1 , X3 , X4 and X8 to X16 are each independently any amino acid, preferably an amino acid suitable for maintaining a helical structure, for example, an amino acid other than C, P, G or S, more preferably an amino acid selected from the group consisting of A, R
  • the uPAR-binding HLH peptide comprises a helix 1 comprising or consisting of the amino acid sequence X 1 ELX 2 X 3 LX 4 X 5 ELX 6 X 7 LX 8 (SEQ ID NO: 1), and a helix 2-1 comprising or consisting of the amino acid sequence KLX 9 X 10 LX 11 X 12 KLX 13 X 14 LX 15 X 16 (SEQ ID NO: 2), wherein X 1 to X 16 represent amino acid residues; X11 is F, Y or W, X13 is R or K, X15 and X16 are each independently L, I or V, and optionally, X1 to X8 , X9 , X10 , X12 and X14 are each independently any amino acid, preferably an amino acid suitable for maintaining a helix structure, for example, an amino acid other than C, P, G or S, more preferably an amino acid selected from the group consisting of A,
  • the uPAR-binding HLH peptide comprises a helix 1 comprising or consisting of the amino acid sequence X 1 ELX 2 X 3 LX 4 X 5 ELX 6 X 7 LX 8 (SEQ ID NO: 1), and a helix 2-2 comprising or consisting of the amino acid sequence KLX 17 X 18 LX 19 X 20 KLX 21 X 22 LKX 23 X 24 (SEQ ID NO: 3), wherein X 1 to X 8 and X 17 to X 24 represent amino acid residues;
  • These amino acid sequences satisfy the following conditions (a) and (b): (a) X2 is F, Y or W, X5 is R or K, and X6 and X7 are each independently L, I or V; (b) X20 is F, Y or W, X22 is R or K, and X23 and X24 are each independently L, I or V; and optionally, X1 , X3 ,
  • the loop sequence may be any amino acid sequence that does not prevent the two helices from interacting with each other to maintain a stable configuration.
  • the loop sequence may or may not contain a 3D structure such as a helix or sheet, but preferably does not contain a 3D structure.
  • G or P may be selected as an amino acid suitable for the loop sequence because it is less likely to form a 3D structure, and G is preferably selected from the perspective of simple structure.
  • the loop sequence contains at least one G or P, for example, 1 to 20 G or P. The length of the loop sequence is determined appropriately depending on the stability of the peptide, its intracellular transport, the activity of the peptide-drug conjugate, and the like.
  • the loop sequence has a length of 3 to 20, 5 to 15, or 7 to 11 amino acids. In preferred embodiments, the loop sequence is 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more, or 100%, of its sequence is G or P, preferably G. In some embodiments, the loop sequence is a sequence of 3 to 20 consecutive Gs, or a sequence with 1, 2, 3, 4, or 5 amino acid substitutions therein. In some embodiments, the loop is a sequence of 7 consecutive Gs, or a sequence with 1 or 2 amino acid substitutions therein. In some embodiments, the loop is a sequence of 7 consecutive Gs, or a sequence with 1 or 2 amino acid substitutions at the second and/or seventh positions.
  • the amino acid substitutions may be with any amino acid, but are preferably with K.
  • the loop sequence consists of G and K.
  • the loop sequence comprises or consists of a sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 27-30.
  • the uPAR-binding HLH peptide may further comprise 1 to 3 amino acids at the N-terminus of helix 1 and/or the C-terminus of helix 2. These amino acids make a small contribution to maintaining the HLH structure and the uPAR-binding activity of the HLH peptide, and may be any amino acid sequence. In some embodiments, the uPAR-binding HLH peptide further comprises one or two amino acids at the N-terminus of helix 1 and/or the C-terminus of helix 2.
  • the uPAR-binding HLH peptide further comprises two amino acids at the N-terminus of helix 1 and two amino acids at the C-terminus of helix 2-1 or one amino acid at the C-terminus of helix 2-2. In some embodiments, the uPAR-binding HLH peptide further comprises CA at the N-terminus of helix 1 and CA at the C-terminus of helix 2-1 or C at the C-terminus of helix 2-2.
  • the linker is any linker that does not affect the helix structure and higher-order structure of the uPAR-binding HLH peptide. Therefore, a linker with a high degree of structural flexibility is preferred; for example, the linker does not include a specific three-dimensional structure such as a helix or sheet.
  • linkers include linkers in which carbon atoms are linked in a linear chain and linkers in which amino acids are peptide-bonded. The length of the linker is determined appropriately depending on the stability of the peptide, its intracellular transport, the activity of the peptide-drug conjugate, and other factors.
  • the uPAR-binding HLH peptide comprises a cyclic structure in which the N-terminal and C-terminal cysteine residues are linked by a disulfide bond. In some embodiments, the uPAR-binding HLH peptide comprises a cyclic structure in which a chloroacetylated amino acid at either the N-terminus or the C-terminus is linked to a cysteine residue at the other terminus by forming a thioether bond.
  • the uPAR-binding HLH peptide may have a sequence length of at least 35 amino acids.
  • the sequence length of the uPAR-binding HLH peptide may be 35 to 120 amino acids.
  • the uPAR-binding HLH peptide is 120 amino acids or less, 110 amino acids or less, 100 amino acids or less, 90 amino acids or less, 80 amino acids or less, 70 amino acids or less, 60 amino acids or less, 55 amino acids or less, or 50 amino acids or less.
  • sequence length of the uPAR-binding HLH peptide is 35 to 45 amino acids, for example, 45 amino acids, 44 amino acids, 43 amino acids, 42 amino acids, 41 amino acids, 40 amino acids, 39 amino acids, 38 amino acids, 37 amino acids, 36 amino acids, or 35 amino acids. In some embodiments, the sequence length of the uPAR-binding HLH peptide is 39 amino acids.
  • C represents cysteine
  • A represents alanine
  • Y represents tyrosine
  • H represents histidine
  • R represents arginine
  • G represents glycine
  • E represents glutamic acid
  • L represents leucine
  • V valine
  • W represents tryptophan
  • T represents threonine
  • S represents serine
  • I represents isoleucine
  • F represents phenylalanine
  • D represents aspartic acid
  • N represents asparagine
  • Q represents glutamine
  • M represents methionine
  • K represents lysine
  • P proline.
  • amino acid sequence of a peptide is written from left to right from the amino terminus (N-terminus) to the carboxy terminus (C-terminus).
  • amino acid mutations include amino acid deletions, substitutions, insertions, and additions.
  • An amino acid mutation refers to an amino acid residue that differs from that of a reference sequence when a sequence is aligned to the reference sequence according to standard methods in the art. Because amino acid deletions, insertions, and additions change the length of the sequence, when referring to amino acids within a helical region, the amino acid mutation is preferably an amino acid substitution.
  • six or fewer amino acid mutations may be allowed when the full length of the uPAR-binding HLH peptide is used as the reference sequence.
  • two or fewer amino acid mutations may be allowed when the sequence of one helical region is used as the reference sequence.
  • two or fewer amino acid mutations may be allowed when a sequence other than the helical region is used as the reference sequence.
  • the uPAR-binding HLH peptide exhibits binding affinity to human urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR).
  • binding affinity is represented by a dissociation constant ( KD ) measured by the method described in the Examples.
  • KD dissociation constant
  • a peptide is said to bind to a target if it exhibits a KD of at least about 10,000 nM or less for the target.
  • the uPAR-binding HLH peptide exhibits a KD of at least about 10,000 nM or less, preferably 1000 nM or less, 900 nM or less, 800 nM or less, 700 nM or less, 600 nM or less, 500 nM or less, 400 nM or less, 300 nM or less, 200 nM or less, 100 nM or less, 90 nM or less, 80 nM or less, 70 nM or less, 60 nM or less, 5 ...500 nM or less, 600 nM or less, 700 nM or less, 800 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900 nM or less, 900
  • the uPAR-binding HLH peptides exhibit a KD of 600 nM or less. In preferred embodiments, the uPAR-binding HLH peptides exhibit a KD of 5 nM or less.
  • the uPAR-binding HLH peptide inhibits the interaction between uPAR and uPA.
  • the inhibitory activity of the uPAR-binding HLH peptide against uPAR-uPA interaction is measured by the method described in the Examples.
  • "a peptide inhibits interaction” means that addition of the peptide reduces uPAR-uPA interaction by at least 30%, relative to uPAR-uPA interaction under conditions in which the peptide is not added.
  • the uPAR-binding HLH peptide reduces uPAR-uPA interaction by at least 30%, preferably 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100%, relative to uPAR-uPA interaction under conditions in which the uPAR-binding HLH peptide is not added.
  • the uPAR-binding HLH peptide exhibits an IC50 of at least about 1000 nM or less, preferably 500 nM or less, 400 nM or less, 300 nM or less, 200 nM or less, 100 nM or less, 90 nM or less, 80 nM or less, 70 nM or less, 60 nM or less, 50 nM or less, 40 nM or less, 30 nM or less, 20 nM or less, 10 nM or less, 5 nM or less, 1 nM or less, 0.1 nM or less, or 0.01 nM or less, in inhibiting the uPA- uPAR interaction as measured according to the methods described in the Examples.
  • the uPAR-binding HLH peptides of the present disclosure inhibit the uPAR-uPA interaction, thereby reducing the degradation of the extracellular matrix by plasmin and functioning to suppress cell migration, i.e., metastasis, of cells, particularly cancer cells.
  • the uPAR-binding HLH peptides of the present disclosure can be translocated into cells expressing uPAR. It has been reported in the art that uPAR is translocated into cells by endocytosis. Therefore, since ligands that bind to uPAR are translocated into cells along with the translocation of uPAR, it can be considered that ligands with high binding affinity for uPAR are advantageous for translocation into cells. While not wishing to be bound by any particular theory, uPAR-binding HLH peptides have an advantage in translocation into cells by endocytosis because they have a smaller molecular weight than, for example, polymeric ligands such as anti-uPAR antibodies.
  • uPAR-binding HLH peptides can be modified as needed to adjust any of their properties, including peptide stability, solubility, intracellular transport, bioavailability, and peptide-drug conjugate activity, as desired. Examples of modifications include halogenation, polyethylene glycol (PEG)ation, acetamidomethyl (Acm)ation, phosphorylation, glycosylation, biotinylation, glutathione-S-transferase (GST) fusion, and protein A/G fusion.
  • the uPAR-binding HLH peptide is PEGylated.
  • the uPAR-binding HLH peptide is chlorinated for cyclization.
  • the uPAR-binding HLH peptide is Acmylated to protect cysteine residues.
  • the uPAR-binding HLH peptides of the present disclosure may be produced by any method known to those of skill in the art.
  • the uPAR-binding HLH peptides may be produced chemically synthetically using solid-phase synthesis.
  • the uPAR-binding HLH peptides may be produced by transient or stable expression in host cells. Examples of host cells include E. coli, yeast, plant cells, insect cells, and mammalian cells.
  • uPAR-binding HLH peptides can be purified by any method known to those of skill in the art. Examples of purification methods include, for example, chromatography (e.g., ion exchange chromatography, affinity chromatography, and size exclusion chromatography), centrifugation, differential solubility, or other standard techniques for protein purification. In some embodiments, uPAR-binding HLH peptides are purified by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC).
  • RP-HPLC reverse-phase high-performance liquid chromatography
  • the present disclosure relates to a nucleic acid sequence encoding the uPAR-binding HLH peptide of the present disclosure.
  • the nucleic acid sequence encoding the uPAR-binding HLH peptide of the present disclosure can be codon-optimized as appropriate by one of skill in the art depending on its intended use.
  • the nucleic acid sequence encodes the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 32-43.
  • the nucleic acid sequence is the sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 47-58.
  • the present disclosure relates to a vector comprising a nucleic acid sequence encoding a uPAR-binding HLH peptide of the present disclosure.
  • a vector is any molecule used to transfer protein-coding information into a host cell, and includes, for example, a nucleic acid, a plasmid, a bacteriophage, or a viral vector.
  • the vector may further comprise any regulatory sequence, such as a promoter, for regulating expression of the HLH peptide of the present disclosure.
  • the present disclosure relates to a peptide-drug conjugate (PDC) comprising a uPAR-binding HLH peptide of the present disclosure and a drug linked to the peptide.
  • the drug is any molecule that has an independent action function
  • the uPAR-binding HLH peptide contributes to delivering such a drug to its site of action, particularly to cells expressing uPAR or tissues containing such cells, or to lesions.
  • the drug is a detectable label, including enzyme labels, fluorescent labels, radiolabels, etc. Because the detectable label does not require endocytosis by uPAR-expressing cells, labels of any molecular weight can be used.
  • exemplary labels include enzyme labels such as horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), or glucose oxidase.
  • example labels include Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, BODIPY® FL, coumarin, Cy® 3, Cy® 5, fluorescein (FITC), Oregon Green®, Pacific Examples of labels include fluorescent labels such as BlueTM, Pacific GreenTM, Pacific OrangeTM, tetramethylrhodamine (TRITC), Texas Red®, or other fluorescent labels.
  • Alexa Fluor® 350 Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 750, BODIPY® FL
  • the drug is a therapeutic agent, such as a cancer therapeutic agent or an immunosuppressant.
  • the therapeutic agent is a cancer therapeutic agent.
  • the cancer therapeutic agent includes a cytotoxic agent. The cytotoxic agent exerts cytotoxicity by targeting, for example, DNA or microtubules.
  • the cytotoxic agent is an auristatin (such as monomethyl auristatin E (MMAE), monomethyl auristatin F (MMAF), Aur0101, PF06380101, auristatin W, or auristatin F) or a derivative thereof, maytansinoid (such as DM1 or DM4), pyrrolobenzodiazepine (PBD) (such as SGD1882 or SG3199), indolinobenzodiazepine (such as DGN462 or DGN549), calicheamicin (ozogamicin) (such as CM1), camptothecin analogs (SN38, DX-8951f, or is a DX-8951f derivative), duocarmycin (such as seco-duocarmycin-hydroxy-benzamide-azaindole (seco-DUBA), minor groove binding alkylating agent (MGBA), or MED-2460), tubulin inhibitor (such as cryptophycin), tubulys
  • the PDC of the present disclosure may include at least one drug, e.g., one, two, three, or more drugs.
  • the PDC of the present disclosure is linked to a drug at a natural or unnatural amino acid at any position within the peptide that is suitable for linking a drug. Any method known in the art may be used to link a drug to a peptide.
  • the drug is linked via a covalent bond to the side chain of an amino acid residue at the terminus of the peptide or at another position.
  • the drug may be linked via a carboxyl group at the peptide terminus, an amino group at K, or a thiol group at C.
  • the drug is linked via a reaction of a thiol at C introduced at any position with a maleimide.
  • the drug is linked to the peptide via a C residue at the C terminus.
  • the drug is linked to the peptide via a C residue at the N terminus.
  • the PDC of the present disclosure includes a linker that connects the uPAR-binding peptide and the drug.
  • linkers include linkers in which carbon atoms are bonded in a linear chain, and linkers in which amino acids are bonded by peptide bonds. The length of the linker is determined appropriately depending on the stability of the peptide, its intracellular transport, the activity of the peptide-drug conjugate, and the like.
  • the linker includes a linker in which one or more methylene groups are bonded in a linear chain.
  • the linker includes a peptide chain in which one or more amino acids are bonded by amide bonds.
  • the linker is a cleavable linker or a non-cleavable linker.
  • the linker is preferably a non-cleavable linker.
  • the linker is preferably a cleavable linker.
  • the linker comprises one or more PEGs.
  • the cleavable linker may be cleavable under intracellular conditions (e.g., intracellular enzymes, pH, redox, temperature).
  • intracellular conditions e.g., intracellular enzymes, pH, redox, temperature.
  • Exemplary cleavable linker components include valine-citrulline (Val-Cit), valine-alanine (VA), phenylalanine-lysine (FK), maleimidocaproic acid (MC), p-aminobenzyl alcohol (PAB), hydrazone, succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-hydroxysuccinimidyl 4-(2-pyridyldithio)-2-sulfobutanoate (sulfo-SPDB), N-hydroxysuccinimidyl 4-(2-pyridyldithio)butanoate (SPDB), N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate (SPP), and CL2A (MedChemExpress).
  • SMCC succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carbox
  • the PDCs of the present disclosure comprise a linker that is cleavable by an enzyme present in uPAR-expressing cells (e.g., cathepsin B, cathepsin D, plasmin, etc.).
  • the PDCs of the present disclosure comprise a linker that is cleavable by cathepsin B, for example, MC-Val-Cit-PAB.
  • the PDCs of the present disclosure comprise (PEG) 2 -MC-Val-Cit-PAB.
  • the present disclosure relates to a composition comprising a uPAR-binding peptide of the present disclosure or a uPAR-binding peptide-drug conjugate of the present disclosure.
  • compositions of the present disclosure may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the uPAR-binding peptide or uPAR-binding peptide-drug conjugate of the present disclosure.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is any carrier, excipient, or other ingredient commonly used in the art that has no adverse effects on the subject and is understood by those skilled in the art. Examples of carriers or excipients and other ingredients include water, saline, buffer solutions, etc. as carriers; lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose, etc. as excipients; other agents include starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate, etc. as disintegrants; phosphates, citrates, acetates, etc.
  • compositions disclosed herein can be prepared in a variety of dosage forms and administered to a subject via an appropriate route, frequency, and interval.
  • the term "subject" refers to an animal to which the uPAR-binding peptide, uPAR-binding peptide-drug conjugate, or composition of the present disclosure is administered.
  • the subject includes a mammalian, avian, or reptilian subject.
  • the subject includes a mammal, such as a primate, with or without a human.
  • the subject includes pets, such as dogs and cats, and livestock, such as cows and horses.
  • the subject is a human.
  • the subject is a subject in need of treatment for a disease (e.g., cancer) involving cells that express uPAR, such as a cancer patient.
  • a disease e.g., cancer
  • compositions of the present disclosure may be prepared in any dosage form appropriate for their intended use.
  • the compositions of the present disclosure may be solid, such as powder, fine granules, or granules; liquid, such as a suspension or emulsion; or semi-solid, such as a gel.
  • the compositions of the present disclosure may be stored in a solid, liquid, or semi-solid form that has been preserved (e.g., concentrated, frozen, dried, or lyophilized), and may be used after undergoing a preparation process (e.g., melting, diluting, gelling, or mixing with a carrier or solvent) prior to administration to a subject.
  • a preparation process e.g., melting, diluting, gelling, or mixing with a carrier or solvent
  • compositions of the present disclosure may be pharmaceutical compositions used in the treatment of diseases involving cells expressing uPAR.
  • uPAR is known to be expressed particularly in cancer cells
  • the disease is cancer.
  • cancer include melanoma (e.g., advanced melanoma or metastatic melanoma), non-small cell lung cancer, head and neck squamous cell carcinoma, renal cell carcinoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, glioblastoma, glioma, lung squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, hepatocellular carcinoma, bladder cancer, upper tract urothelial carcinoma, esophageal cancer, gastroesophageal junction cancer, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, colorectal cancer, multiple myeloma, sarcoma, acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, nasopharyngeal
  • ductal carcinoma include ductal carcinoma, urothelial carcinoma, HTLV-associated T-cell leukemia/lymphoma, prostate cancer, genitourinary cancer, meningioma, adrenocortical carcinoma, gliosarcoma, fibrosarcoma, kidney cancer, breast cancer, pancreatic cancer, endometrial cancer, basal cell carcinoma of the skin, appendix cancer, bile duct cancer, salivary gland cancer, advanced Merkel cell carcinoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, mesothelioma, neuroendocrine tumors, urinary tract cancer, bone cancer, breast cancer, respiratory tract cancer, adenoid cystic carcinoma, cervical cancer, astrocytoma, chordoma, neuroblastoma, oral cancer, squamous cell carcinoma of the skin, thyroid cancer, Kaposi's sarcoma, anal cancer, gallbladder cancer, thymic carcinoma, uterine cancer, and solid
  • a urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR)-binding peptide which comprises a (helix 1)-(loop)-(helix 2) structure from the N-terminus to the C-terminus.
  • Helix 1 consists of the amino acid sequence: X1ELX2X3LX4X5ELX6X7LX8 ( SEQ ID NO : 1), and helix 2 is helix 2-1 consisting of the amino acid sequence : KLX9X10LX11X12KLX13X14LX15X16 ( SEQ ID NO: 2 ) , or helix 2-2 consisting of the amino acid sequence : KLX17X18LX19X20KLX21X22LKX23X24 (SEQ ID NO: 3 ) , where X 1 to X 24 represent amino acid residues, These amino acid sequences satisfy the following conditions (a) to (e): (a) X2 is F, Y or W, X5 is R or K, and X6 and X7 are each independently L, I or V; (b) X 11 is F, Y or W, X 13 is R or K, and X 15 and X 16 are each independently L, I or V; (b)
  • Item 2. The uPAR-binding peptide according to Item 1.
  • Item 3. The uPAR-binding peptide according to Item 2, wherein X n (n is an integer of 1 to 24) not specified in each of the conditions (a) to (e) is independently selected from amino acids other than C, P, G, or S.
  • Item 4. The uPAR-binding peptide according to Item 3, wherein X n (n is an integer of 1 to 24) not specified in each of conditions (a) to (e) is independently selected from the group consisting of A, R, N, E, H, L, K, M, F, V and Y.
  • Item 6 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 5, wherein X3 is L, V, R, K, or Y.
  • Item 7 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 6, wherein X4 is E or N.
  • Item 8 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 7, wherein X4 is N.
  • Item 16 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 9, 14 and 15, wherein X 19 is K.
  • Item 17 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 9 and 14 to 16, wherein X 21 is A.
  • X1 is Y, L, R, or H
  • X3 is L, V, R, K, or Y
  • X4 is E or N
  • X8 is E
  • X9 is A and X10 is A
  • X 12 is A
  • X 14 is A; Item 14.
  • X1 is Y, L, R, or H
  • X3 is L, V, R, K, or Y
  • X4 is E or N
  • X8 is E
  • X 17 is A and X 18 is A
  • X 19 is K and X 21 is A
  • Item 14 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 13.
  • Item 19 The uPAR-binding peptide according to any one of Items 2 to 13 and 18, wherein helix 2 consists of the amino acid sequence KLAALKAKLAALKA (SEQ ID NO: 19). [21] 20.
  • X 2 , X 5 , X 6 and X 7 are, respectively, in order: (i) F, R, I and L; (ii) F, R, L and I; (iii) W, R, L and V; (iv) Y, R, L and I, (v) F, R, L and V, or (vi) F, R, L and L Item 22.
  • Helix 1 is YELFLERELILLE (SEQ ID NO: 4), LELFVLERELLILE (SEQ ID NO: 5), RELWRLERELLVLE (SEQ ID NO: 6), HELYKLERELLILE (SEQ ID NO: 7), LELFLLERELLILE (SEQ ID NO: 8), RELFYLERELLVLE (SEQ ID NO: 9), RELFYLNRELLVLE (SEQ ID NO: 10), LELFLLERELLLLE (SEQ ID NO: 11) or LELFLLERELLVLE (SEQ ID NO: 12), Item 23.
  • the uPAR-binding peptide according to any one of Items 1 to 25 wherein the loop has a sequence length of 7 to 11 amino acids.
  • Item 27 Item 27.
  • Item 28. The uPAR-binding peptide according to any one of Items 1 to 27, wherein the loop is a sequence consisting of seven consecutive Gs or a sequence having one or two amino acid substitutions therein.
  • 29. The uPAR-binding peptide of claim 28, wherein the loop comprises an amino acid substitution at the second and/or seventh position.
  • the loop GGGGGGG (SEQ ID NO: 27), GKGGGGGG (SEQ ID NO: 28), GGGGGGK (SEQ ID NO: 29), or GKGGGGK (SEQ ID NO: 30) Item 30.
  • uPAR-binding peptides in which some amino acids of R4I-7 were substituted, R4I-7 E9N, R4I-7 G18K, R4I-7 G23K, and R4I-7 E9N/G18K/G23K mutants were identified.
  • the amino acid sequences of the identified uPAR-binding peptides are shown in Table 1 below.
  • the purified fractions were analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) on an Autoflex II (Bruker Daltonics) instrument.
  • the purified peptide was dissolved in 50 mL of 20 mM NH 4 HCO 3 (pH 8) and stirred for 12 hours to form a disulfide bridge between the thiol group of the N-terminal Cys and the thiol group of the C-terminal Cys, thereby cyclizing the peptide.
  • the cyclized peptide was purified using RP-HPLC. The purity was 95% or higher.
  • R4I-7 E9N, R4I-7 G18K, R4I-7 G23K, and R4I-7 E9N/G18K/G23K mutants all showed superior uPAR binding activity compared to wild-type R4I-7.
  • R4I-7 exhibited a K D of 4.39 nM, R4I-7 E9N a K D of 0.44 nM, R4I-7 G18K a K D of 3.61 nM, R4I-7 G23K a K D of 3.36 nM, and R4I-7 E9N/G18K/G23K a K D of 0.17 nM.
  • R4I-7-linker (ClCH 2 CO-GAREFYLERELLVLEGGGGGGGGKLAALKAKLAALKAAAC(Peg)(Peg)C-NH 2 ) (SEQ ID NO: 45) was synthesized by Fmoc solid-phase synthesis, in which 2-[2-( 2 -aminoethoxy)ethoxy]acetic acid (amino-PEG2-acetic acid) was linked to R4I-7 as a linker.
  • YT1-S-linker (ClCH 2 CO-GAAELAALEAELAALEGGGGGGGGKLAALKAKLAALKAYC(Peg)(Peg)C-NH 2 ) (SEQ ID NO: 46) was synthesized.
  • a cocktail of TFA/HO/triisopropylsilane (95/2.5/2.5) was used for deprotection and deprotection, and the C-terminal Cys was protected with an acetamidomethyl group (Acm).
  • the peptide was cyclized by reacting the chloro group of the N-terminal Chloroacetyl-Gly with the thiol group of the 39th Cys residue to form a thioether bridge.
  • the C-terminal Cys (Acm) was deprotected, and the thiol group of the C-terminal Cys of the peptide R4I-7-linker was reacted with the maleimide group of MC-Val-Cit-PAB-MMAE (MedChemExpress) to synthesize the conjugate.
  • the crude product was purified by RP-HPLC using a C18 column (AM12S05-2510WT, YMC), and the purified fractions were analyzed by MALDI-TOF-MS. The purity of the purified R4I-7-MMAE was 95% or higher.
  • the results of evaluating the binding activity of uPAR-binding PDC are shown in Figure 6.
  • the R4I-7-MMAE complex showed a K D of 8 nM for uPAR, confirming its binding activity.
  • the YT1-S-MMAE complex showed no binding activity to uPAR.
  • the cell proliferation inhibitory effect of the R4I-7-MMAE conjugate on cancer cells was evaluated.
  • the R4I-7-MMAE conjugate, YT1-S-MMAE conjugate, R4I-7 (thioether), and YT1-S (thioether) were added to MDA-MB-231 cells (uPAR-positive cells) and MCF-7 cells (uPAR-negative cells).
  • the cells were cultured at 37°C for 3 days, after which Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche) was added.
  • the absorbance at 450 nm of each well was measured using a plate reader.
  • the cell viability was normalized by setting the cell viability in the presence of only the medium to the cells at 100% and the cell viability in the absence of cells at 0%.
  • the normalized relative values were used as the cell growth inhibitory activity of the compound.
  • Figure 7 shows the results of evaluating the cancer cell growth inhibitory ability of uPAR-binding PDC.
  • the R4I-7-MMAE conjugate exhibited a significant concentration-dependent inhibitory effect on cell growth in MDA-MB-231 cells, but not in MCF-7 cells. In both cell types, a slight decrease in cell viability was observed at high concentrations of the YT1-S-MMAE conjugate, but no significant concentration-dependent inhibitory effect on cell growth was observed. Furthermore, R4I-7 (thioether) and YT1-S (thioether), which do not contain MMAE, did not exhibit any inhibitory effect on cell growth in either cell type or at any concentration. These results indicate that after binding to uPAR, the R4I-7-MMAE conjugate was transported into the cell via uPAR endocytosis and released MMAE, thereby inhibiting cell growth.
  • the expression level of uPAR in human cancer cell lines was quantified by immunostaining using a fluorescently labeled anti-uPAR antibody.
  • Cultured human cancer cell lines MCF-7, U-87MG, MAD-MB-231, and HeLa were collected and suspended in 1 mL of PBS (+1% FCS) to obtain a cell suspension of 1.0 x 10 6 /mL.
  • 5 ⁇ L of fluorescent dye (APC)-labeled anti-uPAR antibody or isotype control antibody was added to 100 ⁇ L of each cell suspension and allowed to stand for 1 hour for antibody staining. After washing the cells three times with PBS (+1% FCS), fluorescence intensity was measured using a flow cytometer (Becton Dickinson and Company, FACS Aria TM IIIu Cell Sorter).
  • R4I-7 E9N/G18K/G23K Mutant Peptide 4-1 Preparation of Fluorescently Labeled Peptide
  • R4I-7(3M) peptide The intracellular transport of the fluorescently labeled R4I-7(3M) peptide was evaluated.
  • Human cancer cell lines U-87MG and HeLa (uPAR-positive cells) and MCF-7 cells (uPAR-negative cells) were immunostained and observed using a confocal microscope.
  • R4I-7(3M)-linker (CGCARELFYLNRELLVLEGKGGGGKKLAALKAKLAALKAAC) (SEQ ID NO: 59) was synthesized by Fmoc solid-phase synthesis, in which Cys and Gly were linked as a linker to the N-terminus of R4I-7(3M).
  • the peptide R4I-7(3M) was cyclized by reacting the thiol groups of the third residue from the N-terminus and the C-terminal Cys residue of the linker to form disulfide bonds.
  • Fluorescently labeled peptide R4I-7(3M) was synthesized by reacting the thiol group of the N-terminal Cys residue of the linker with the maleimide group of a maleimide-derivatized fluorescent dye (Alexa Fluor® 488C 5 Maleimide) (Thermo Fisher Scientific).
  • the crude product was purified by RP-HPLC using a C18 column (AM12S05-2510WT, YMC), and the purified fraction was analyzed by MALDI-TOF-MS to confirm that the fluorescently labeled peptide R4I-7(3M) had been synthesized.
  • the structure of the R4I-7(3M)-linker is shown below. (SEQ ID NO: 59)
  • Each cancer cell line was seeded at a seeding density of 2.4 x 104 cells/well on a glass-based dish ( ⁇ 27 mm) (IWAKI) and cultured overnight at 37°C, 5% CO2 .
  • Fluorescently labeled R4I-7 (3M) 1 ⁇ M was added at 100 ⁇ L/well, and after 24 hours, the cells were observed using a confocal laser microscope (FV1200, Olympus). Prior to observation, cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (Nacalai Tesque).
  • uPAR-binding PDC was prepared by conjugating the peptide R4I-7(3M) with monomethyl auristatin F (MMAF) as an anticancer agent.
  • MMAF is a known tubulin polymerization inhibitor.
  • R4I-7(3M)-linker (CGCARELFYLNRELLVLEGKGGGGKKLAALKAKLAALKAAC) (SEQ ID NO: 59) was synthesized by Fmoc solid-phase synthesis, in which Cys and Gly were linked to the N-terminus of R4I-7(3M).
  • YT1-S-linker (CGCAAELAALEAELAALEGGGGGGGGKLAALKAKLAALKAYC) (SEQ ID NO: 60) was synthesized.
  • the peptide R4I-7(3M) was cyclized by reacting the thiol groups of the third residue from the N-terminus and the C-terminal Cys residue of the linker to form disulfide bonds.
  • a peptide-drug conjugate was synthesized by reacting the thiol group of the N-terminal Cys residue of the linker with the maleimide group of MC-Val-Cit-PAB-MMAF (MedChemExpress).
  • the crude product was purified by RP-HPLC using a C18 column (AM12S05-2510WT, YMC), and the purified fraction was analyzed by MALDI-TOF-MS to confirm the synthesis of the R4I-7(3M)-MMAF conjugate.
  • YT1-S-MMAF was also synthesized in the same manner as a control.

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Abstract

本開示は、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、および前記ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドに薬物が連結したペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）などに関する。

Description

ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、ペプチド－薬物複合体および組成物
　本出願は、日本国特許出願第２０２４－０４９５５９号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、および前記ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドに薬物が連結したペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）などに関する。
　ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）は、細胞表面に発現するＧＰＩアンカー型膜受容体であり、胚形成、炎症、組織修復、腫瘍浸潤および転移などの、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングを伴う全ての生理学的および病理学的過程に関与することなどが一般的に知られている。ｕＰＡＲはそのリガンドであるウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）に結合することで、細胞周囲でのｕＰＡによるプラスミン系の活性化、およびそれに続く細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解を促進し、細胞の遊走などに寄与すると考えられている。
　標的に結合するペプチドベースの分子として、ヘリックス－ループ－ヘリックス（Ｈｅｌｉｘ－Ｌｏｏｐ－Ｈｅｌｉｘ；ＨＬＨとも記載する）構造を有するペプチドが特許文献１および２などに開示されている。ヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有するペプチドは、Ｎ末端側のヘリックス領域、Ｃ末端側のヘリックス領域、およびそれらを連結するループ領域を含む。Ｎ末端側およびＣ末端側のヘリックスはそれぞれα－ヘリカルコイルドコイル構造を形成する。このペプチドは低分子構造でありながら溶液中で安定した二次構造を取り、分子中の溶媒側に露出する部分に化学的に異なる性質の官能基を導入しやすい（非特許文献１）。このような性質を利用して、生理活性を有するヘリックス－ループ－ヘリックス構造を有する種々のペプチドが提案されている。
特開２０１４－０４７１５６号公報 国際公開第２０１６／２０８７６１号
藤井郁雄、藤原大佑、道上雅孝、「分子標的ＨＬＨペプチドを基盤とした新しい創薬モダリティー」、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、２０２０、３５巻、３号、ｐ．２１２－２２１、公開日２０２０／１０／２５
　本開示は、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、ペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）および前記ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドまたは前記ＰＤＣを含む組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、ファージ表層提示法により立体構造を保持したペプチドライブラリーを構築してスクリーニングを行い、ｕＰＡＲに結合するペプチドを取得した。さらに、得られたペプチドに薬物を連結したＰＤＣを取得した。
　１つの態様では、本開示は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）に結合するペプチド（「ｕＰＡＲ結合性ペプチド」）であって、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ヘリックス１）－（ループ）－（ヘリックス２）の構造を含む、ペプチドに関する。
　１つの態様では、本開示は、前記ｕＰＡＲ結合性ペプチド、および前記ペプチドに連結された薬物を含む、ｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）に関する。
　１つの態様では、本開示は、前記ｕＰＡＲ結合性ペプチドまたは前記ＰＤＣを含む組成物に関する。
　本開示により、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、前記ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドに薬物が連結したペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）、および前記ペプチドまたは前記ＰＤＣを含む組成物が提供される。
ペプチド（Ｒ４Ｇ－６、Ｒ４Ｇ－８、Ｒ４Ｇ－１０、Ｒ４Ｉ－７およびＲ４Ｉ－１２）のスペクトル評価 ペプチド（Ｒ４Ｇ－６）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｇ－８）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｇ－１０）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－１２）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－７）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－７　Ｇ１８Ｋ）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－７　Ｇ２３Ｋ）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３Ｋ）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ペプチド（Ｒ４Ｉ－７）のｕＰＡ－ｕＰＡＲ相互作用阻害の評価 共焦点顕微鏡による抗ｕＰＡＲ抗体の細胞内移行の評価 共焦点顕微鏡によるペプチド（Ｒ４Ｉ－７）の細胞内移行の評価 ＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ）作製スキーム ＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＭＣＦ－７細胞における、ＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ）の細胞傷害活性の評価 フローサイトメーターによるｕＰＡＲの発現解析 共焦点顕微鏡によるペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）の細胞内移行の評価 ＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ）のｕＰＡＲ結合活性の評価 ＭＣＦ－７細胞におけるＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ）の細胞傷害活性の評価 Ｕ－８７ＭＧ細胞におけるＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ）の細胞傷害活性の評価 ＨｅＬａ細胞におけるＰＤＣ（Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ）の細胞傷害活性の評価
　本開示は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）に結合するペプチド（「ｕＰＡＲ結合性ペプチド」）であって、ヘリックス－ループ－ヘリックス（ＨＬＨ）構造を含むペプチド、前記ｕＰＡＲ結合性ペプチドに薬物が連結したペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）、および前記ｕＰＡＲ結合性ペプチドまたはＰＤＣを含む組成物、ならびにその使用などに関する。
　１つの態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ヘリックス１）－（ループ）－（ヘリックス２）の構造を含むｕＰＡＲ結合性ペプチド（本明細書において、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドまたは単にｕＰＡＲ結合性ペプチドとも称する）に関する。
　本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドにおいて、ヘリックス１およびヘリックス２はそれぞれα－ヘリックスである。ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ヘリックス１およびヘリックス２に含まれるロイシン残基間の疎水性相互作用ならびにグルタミン酸残基とリジン残基との静電相互作用によって２つのヘリックスが寄り添うことで安定な構造を形成し得る。寄り添った２つのヘリックスの溶媒側に露出する領域に位置するアミノ酸残基は、ＨＬＨペプチドの立体構造への寄与は小さく、むしろ標的と相互作用する領域を構成することで、独立してＨＬＨペプチドの標的に対する結合活性に寄与し得る。ヘリックス１およびヘリックス２は安定なヘリックス構造を維持し得る長さである限り任意の配列長を有していてよく、例えば約４～４０残基であり得る。ヘリックスの配列長は、標的特異性、安定性、細胞内移行性等などに応じて適宜定められる。いくつかの実施形態では、ヘリックス１およびヘリックス２の長さは等しいか、差分が２アミノ酸残基以下で異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ヘリックス１およびヘリックス２は１０～２０アミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、ヘリックス１は１４アミノ酸残基からなり、ヘリックス２は１４または１５アミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、ヘリックス１およびヘリックス２は、１４アミノ酸残基からなる。
　本発明者らは、ファージ表層提示法を用いて、ランダム化したＨＬＨペプチドのライブラリーについてスクリーニングを行い、ｕＰＡＲへの結合性が高いと考えられる複数のＨＬＨペプチドのアミノ酸配列を取得した。ＨＬＨペプチドの外側のいくつかの位置におけるアミノ酸の種類は限定的なものであった。この位置のアミノ酸には、ヘリックス１をアミノ酸配列：Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）としたときのＸ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７を含み、これは構造的にヘリックス２をアミノ酸配列：ＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（ヘリックス２－１；配列番号２）としたときのＸ１１、Ｘ１３、Ｘ１５、およびＸ１６、またはヘリックス２をアミノ酸配列：ＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（ヘリックス２－２；配列番号３）としたときのＸ２０、Ｘ２２、Ｘ２３およびＸ２４とそれぞれ対応する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これらの位置のアミノ酸残基はｕＰＡＲとの相互作用に重要であり、特定のアミノ酸残基がｕＰＡＲのエピトープと強く相互作用することでｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドのｕＰＡＲへの結合性の維持に寄与するものと考えられる。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドのヘリックス１は、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含んでいても、またはそれからなっていてもよい。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、Ｘ６はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ７はＬ、ＩまたはＶである。いくつかの実施形態では、Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲであり、Ｘ６はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ７はＬ、ＩまたはＶである。いくつかの実施形態では、Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７は、それぞれ順番に、（ｉ）Ｆ、Ｒ、ＩおよびＬ；（ｉｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＩ；（ｉｉｉ）Ｗ、Ｒ、ＬおよびＶ；（ｉｖ）Ｙ、Ｒ、ＬおよびＩ；（ｖ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＶ；または（ｖｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＬである。
　ヘリックス１において、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ８は任意のアミノ酸であってよい。好ましくは、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ８は、ヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸であり、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、Ｙ、Ｌ、Ｒ、またはＨである。いくつかの実施形態では、Ｘ３は、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、またはＹである。いくつかの実施形態では、Ｘ４は、ＥまたはＮである。いくつかの実施形態では、Ｘ８は、Ｅである。
　いくつかの実施形態では、ヘリックス１は、配列番号４～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヘリックス１は、配列番号４～１２のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる。
　いくつかの実施形態では、ヘリックス１はｕＰＡＲへの結合性の維持に寄与する特定のアミノ酸残基を有していなくてもよい。このような実施形態では、ヘリックス１において、Ｘ１～Ｘ８は任意のアミノ酸であってよく、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸であり、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドのヘリックス２は、ＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲまたはＫであり、Ｘ１５はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ１６はＬ、ＩまたはＶである。いくつかの実施形態では、Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲであり、Ｘ１５はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ１６はＬ、ＩまたはＶである。いくつかの実施形態では、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１６は、それぞれ順番に、（ｉ）Ｆ、Ｒ、ＩおよびＬ；（ｉｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＩ；（ｉｉｉ）Ｗ、Ｒ、ＬおよびＶ；（ｉｖ）Ｙ、Ｒ、ＬおよびＩ；（ｖ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＶ；または（ｖｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＬである。
　ヘリックス２－１において、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１４は任意のアミノ酸であってよい。好ましくは、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１４は、ヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸であり、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘ９は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ１０は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ１２は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ１４は、Ａである。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドのヘリックス２は、ＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－２であり得る。いくつかの実施形態では、Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲまたはＫであり、Ｘ２３はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ２４はＬ、ＩまたはＶである。いくつかの実施形態では、Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲであり、Ｘ２３はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ２４はＬ、ＩまたはＶである。いくつかの実施形態では、Ｘ２０、Ｘ２２、Ｘ２３およびＸ２４は、それぞれ順番に、（ｉ）Ｆ、Ｒ、ＩおよびＬ；（ｉｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＩ；（ｉｉｉ）Ｗ、Ｒ、ＬおよびＶ；（ｉｖ）Ｙ、Ｒ、ＬおよびＩ；（ｖ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＶ；または（ｖｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＬである。
　ヘリックス２－２において、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９およびＸ２１は任意のアミノ酸であってよい。好ましくは、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９およびＸ２１は、ヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸であり、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘ１７は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ１８は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ１９は、Ｋである。いくつかの実施形態では、Ｘ２１は、Ａである。
　いくつかの実施形態では、ヘリックス２－１は、配列番号１３～１８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヘリックス２－２は、配列番号２０～２５に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヘリックス２－１は、配列番号１３～１８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、ヘリックス２－２は、配列番号２０～２５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる。
　いくつかの実施形態ではヘリックス２はｕＰＡＲへの結合性の維持に寄与する特定のアミノ酸残基を有していなくてもよい。このような実施形態では、ヘリックス２－１またはヘリックス２－２において、Ｘ９～Ｘ２４は任意のアミノ酸であってよく、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸であり、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ヘリックス２は、配列番号１９または２６に記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、ヘリックス２は、配列番号１９または２６に記載のアミノ酸配列からなる。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－１またはＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－２であるヘリックス２を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ２４はアミノ酸残基を示し、
　これらのアミノ酸配列が、次の（ａ）から（ｅ）までの条件、すなわち、
　（ａ）Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、かつＸ６およびＸ７はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｂ）Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲまたはＫであり、かつＸ１５およびＸ１６はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｃ）Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲまたはＫであり、かつＸ２３およびＸ２４はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｄ）上記（ａ）および（ｂ）の双方の条件を充足すること；または
　（ｅ）上記（ａ）および（ｃ）の双方の条件を充足すること
のいずれかの条件を満たし、
　任意選択で、（ａ）～（ｅ）の各条件において特定されていないＸｎ（ｎは１～２４の整数）は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－１を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ１６はアミノ酸残基を示し、
　Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、Ｘ６はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ７はＬ、ＩまたはＶであり、かつ
　任意選択で、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ８～Ｘ１６は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－１を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ１６はアミノ酸残基を示し、
　Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲまたはＫであり、Ｘ１５およびＸ１６はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであり、かつ
　任意選択で、Ｘ１～Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１４は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－２を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ８、およびＸ１７～Ｘ２４はアミノ酸残基を示し、
　Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、Ｘ６はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ７はＬ、ＩまたはＶであり、かつ
　任意選択で、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８およびＸ１７～Ｘ２４は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－２を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ８、およびＸ１７～Ｘ２４はアミノ酸残基を示し、
　Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲまたはＫであり、Ｘ２３はＬ、ＩまたはＶであり、Ｘ２４はＬ、ＩまたはＶであり、かつ
　任意選択で、Ｘ１～Ｘ８、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９およびＸ２１は、それぞれ独立に、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－１を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ１６はアミノ酸残基を示し、
　これらのアミノ酸配列が、次の（ａ）および（ｂ）の条件、すなわち、
　（ａ）Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、かつＸ６およびＸ７はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｂ）Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲまたはＫであり、かつＸ１５およびＸ１６はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること
　の双方の条件を充足し、かつ
　任意選択で、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸あり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス１、およびＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるヘリックス２－２を含み、ここで
　Ｘ１～Ｘ８、およびＸ１７～Ｘ２４はアミノ酸残基を示し、
　これらのアミノ酸配列が、次の（ａ）および（ｂ）の条件、すなわち、
　（ａ）Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、かつＸ６およびＸ７はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｂ）Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲまたはＫであり、かつＸ２３およびＸ２４はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること
　の双方の条件を充足し、かつ
　任意選択で、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９およびＸ２１は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、好ましくはヘリックス構造の維持に好適なアミノ酸、例えばＣ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸あり、より好ましくはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸である。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドにおいて、ループ配列は、２つのヘリックスが互いの相互作用により安定な配置に維持されることを妨げない任意のアミノ酸配列であってよい。ループ配列は、その一部にヘリックスやシート等の立体構造を含んでも、含まなくてもよいが、好ましくは立体構造を含まない。立体構造を形成しにくい点から、ループ配列に好適なアミノ酸としてＧまたはＰが選択され得て、単純な構造の観点から、好ましくはＧが選択される。いくつかの実施形態ではループ配列は少なくとも１つ、例えば１～２０個のＧまたはＰを含む。ループ配列の配列長はペプチドの安定性や細胞内への移行性、ペプチド－薬物複合体の活性などに応じて適宜定められる。いくつかの実施形態では、ループ配列は３～２０、５～１５、または７～１１アミノ酸の配列長を有する。好ましい実施形態では、ループ配列はその配列の３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％以上、または１００％がＧまたはＰであり、好ましくはＧである。いくつかの実施形態では、ループ配列は、３～２０個の連続したＧからなる配列であるか、またはそれに対して１、２、３、４または５つのアミノ酸置換を有する配列である。いくつかの実施形態では、ループは、７個の連続したＧからなる配列であるか、またはそれに対して１つまたは２つのアミノ酸置換を有する配列である。いくつかの実施形態では、ループは、７個の連続したＧからなる配列であるか、またはその２番目および／または７番目に１つまたは２つのアミノ酸置換を有する配列である。アミノ酸置換は、いずれのアミノ酸による置換であってもよいが、好ましくはＫによる置換である。いくつかの実施形態では、ループ配列はＧおよびＫからなる。いくつかの実施形態では、ループ配列は配列番号２７～３０のいずれかに記載の配列を含むかまたはそれからなる。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ヘリックス１のＮ末端および／またはヘリックス２のＣ末端にそれぞれ１～３個のアミノ酸をさらに含み得る。これらのアミノ酸はＨＬＨ構造の維持およびＨＬＨペプチドのｕＰＡＲ結合活性における寄与が小さく、任意のアミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ヘリックス１のＮ末端および／またはヘリックス２のＣ末端に１つまたは２つのアミノ酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ヘリックス１のＮ末端に２つのアミノ酸をさらに含み、かつヘリックス２－１のＣ末端に２つのアミノ酸をさらに含むかまたはヘリックス２－２のＣ末端に１つのアミノ酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ヘリックス１のＮ末端にＣＡをさらに含み、かつ、ヘリックス２－１のＣ末端にＣＡをさらに含むかまたはヘリックス２－２のＣ末端にＣをさらに含む。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、非環状ペプチドであっても、環状ペプチドであってもよいが、好ましくは環状ペプチドである。環状構造をとらない場合でも、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは２つのヘリックス間の相互作用により安定な構造を維持し得るが、環状構造をとることでより安定であり、物理化学的な分解への耐性、半減期、バイオアベイラビリティ等の面で有利である。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｎ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸が直接的または間接的に結合した環状ペプチドである。ここで直接的に結合したとは、Ｎ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸がリンカーを介さずに結合することを意味し、例えば、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸がアミド結合（ペプチド結合）で結合した実施形態、およびＮ末端とＣ末端のシステイン残基がジスルフィド結合で結合した実施形態を含む。ここで間接的に結合したとは、Ｎ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸がリンカーを介して結合することを意味する。リンカーは、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドのヘリックス構造、およびその高次構造に影響しない任意のリンカーである。よって、リンカーの構造は自由度が高い方が好ましく、例えばリンカーはヘリックスやシート等の特定の立体構造を含まない。リンカーは、例えば、炭素原子が直鎖状に結合したリンカー、アミノ酸がペプチド結合したリンカーを含む。リンカーの長さはペプチドの安定性や細胞内への移行性、ペプチド－薬物複合体の活性などに応じて適宜定められる。いくつかの実施形態では、リンカーは１つ以上のメチレン基が直鎖状に結合したリンカー、または１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が連結したリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１～１０個のアミノ酸がアミド結合により結合したペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～９個、例えば１～５個のグリシンが連続したペプチド鎖を含む。
　ペプチドの環状化は、当分野において知られた任意の方法によって行われてよい。環状化されるペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸は、環状化反応に適した天然のまたは非天然のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｎ末端とＣ末端の２つのアミノ酸残基が、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、チオアミド結合、またはトリアゾール結合によって結合することで形成される環状構造を含む。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端のシステイン残基がジスルフィド結合によって結合した環状構造を含む。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれか一方のクロロアセチル化アミノ酸と、もう片方の末端のシステイン残基がチオエーテル結合を形成することによって結合した環状構造を含む。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、配列番号３２～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、または、配列番号３２～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ここで、特にヘリックスにおいて変異は置換であることが好ましく、Ｃ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸への置換であることがより好ましい。ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドの構造を維持しつつ、その活性を維持するか向上させるための複数の変異を導入するために、ＨＬＨ構造の維持に寄与する位置、ｕＰＡＲ結合性に寄与する位置、ならびにループ領域および各末端を含むその他の位置のそれぞれの位置においてわずかな変異（例えば２つ以下の置換）が許容され得る。いくつかの実施形態では、２つのヘリックスにおけるＨＬＨ構造の維持に寄与する位置およびｕＰＡＲ結合性に寄与する位置、ならびにその他の位置のそれぞれにおいて２つ以下の変異が許容され得る。いくつかの実施形態では、２つのヘリックスにおけるＨＬＨ構造の維持に寄与する位置およびｕＰＡＲ結合性に寄与する位置、ならびにその他の位置のそれぞれにおいて１つ以下の変異が許容され得る。いくつかの実施形態では、１つのヘリックス中のＨＬＨ構造の維持に寄与する位置、およびｕＰＡＲ結合性に寄与する位置のそれぞれにおいて１つ以下の変異が許容され得る。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、少なくとも３５アミノ酸の配列長を有していてよい。ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドの配列長は、３５～１２０アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは１２０アミノ酸以下、１１０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５５アミノ酸以下、５０アミノ酸以下である。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドの配列長は、３５～４５アミノ酸であり、例えば４５アミノ酸、４４アミノ酸、４３アミノ酸、４２アミノ酸、４１アミノ酸、４０アミノ酸、３９アミノ酸、３８アミノ酸、３７アミノ酸、３６アミノ酸または３５アミノ酸の配列長である。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドの配列長は３９アミノ酸である。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、３～１５ｋＤａの分子質量を有していてよい。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは１５ｋＤａ以下、１４ｋＤａ以下、１３ｋＤａ以下、１２ｋＤａ以下、１１ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、９ｋＤａ以下、８ｋＤａ以下、７ｋＤａ以下、６ｋＤａ以下、５ｋＤａ以下、４ｋＤａ以下の分子質量を有する。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドの分子質量は３．５～４．５ｋＤａである。
　本明細書において、当該分野の常法に従って、各種アミノ酸残基を一文字表記で記載する。例えば、Ｃはシステイン、Ａはアラニン、Ｙはチロシン、Ｈはヒスチジン、Ｒはアルギニン、Ｇはグリシン、Ｅはグルタミン酸、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、Ｗはトリプトファン、Ｔはスレオニン、Ｓはセリン、Ｉはイソロイシン、Ｆはフェニルアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｎはアスパラギン、Ｑはグルタミン、Ｍはメチオニン、Ｋはリジン、及びＰはプロリンを表す。また，本明細書においてＸｎ（ｎは自然数）は、アミノ酸を示し、各々定義された複数のアミノ酸からなる群から選択される１種類のアミノ酸を表し得る。例えば、Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）において、「Ｘ２がＦ、ＹまたはＷである」とは、Ｘ２で表されるアミノ酸がフェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのいずれかであることを意味する。
　本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列はアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）方向へ左から右へ記載する。
　アミノ酸は、天然のアミノ酸であっても、非天然のアミノ酸であってもよい。本明細書において、非天然のアミノ酸とは、天然にはコードされないアミノ酸であって、例えば２０種の一般的アミノ酸の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるか、または化学合成されるものである。非天然のアミノ酸は、薬剤やリンカー等への連結のためにｕＰＡＲ結合性ペプチド内に導入されてもよい。非天然のアミノ酸は、ハロゲン基、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基等を含む２０種の一般的アミノ酸の誘導体であってもよい。
　本明細書において、アミノ酸変異には、アミノ酸の欠失、置換、挿入、および付加が含まれる。アミノ酸変異とは、ある配列を、参照配列に対して当分野における定法に従ってアライメントした際に、参照配列とは異なるアミノ酸残基を指す。アミノ酸の欠失、挿入および付加はその配列長を変化させるため、ヘリックス領域内のアミノ酸を参照する場合、アミノ酸変異は好ましくはアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド全長を参照配列として、６つ以下のアミノ酸の変異が許容され得る。いくつかの実施形態では、１つのヘリックス領域の配列を参照配列として、２つ以下のアミノ酸変異が許容され得る。いくつかの実施形態では、ヘリックス領域以外の配列を参照配列として、２つ以下のアミノ酸変異が許容され得る。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）に対する結合親和性を示す。ここで、結合親和性は、実施例に記載の方法によって測定される解離定数（ＫＤ）によって表される。本明細書において、ペプチドが標的に対して少なくとも約１０，０００ｎＭ以下のＫＤを示す場合に、ペプチドは標的に結合するとされる。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、少なくとも約１０，０００ｎＭ以下、好ましくは１０００ｎＭ以下、９００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、７００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、または、０．０５ｎＭ以下のＫＤを示す。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、６００ｎＭ以下のＫＤを示す。好ましい実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、５ｎＭ以下のＫＤを示す。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ｕＰＡＲとｕＰＡ間の相互作用を阻害する。ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドのｕＰＡＲ－ｕＰＡ間相互作用の阻害活性は、実施例に記載の方法によって測定される。本明細書において、ペプチドが相互作用を阻害するとは、ペプチドを添加しない条件下におけるｕＰＡＲ－ｕＰＡ相互作用に対して、ペプチドの添加がｕＰＡＲ－ｕＰＡ相互作用を少なくとも３０％減少させることを意味する。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドを添加しない条件下におけるｕＰＡＲ－ｕＰＡ相互作用に対して、ｕＰＡＲ－ｕＰＡ相互作用を少なくとも３０％、好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％減少させる。
　いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、実施例に記載の方法に従って測定されるｕＰＡ－ｕＰＡＲ間の相互作用の阻害において、少なくとも約１０００ｎＭ以下、好ましくは、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下または０．０１ｎＭ以下のＩＣ５０を示す。
　本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ｕＰＡＲ－ｕＰＡ間相互作用の阻害を介して単独で生理活性を発揮し得る。当分野において、ｕＰＡは細胞表面のｕＰＡＲに結合してプラスミノーゲンを活性型のプラスミンに変換し、プラスミンは細胞外マトリックスの構造タンパク質を分解に寄与すること、さらにｕＰＡＲは、正常細胞に比してがん細胞で高発現することが知られている。したがって、特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ｕＰＡＲ－ｕＰＡ間の相互作用を阻害することでプラスミンによる細胞外マトリックスの分解を減少させ、細胞、特にがん細胞の細胞遊走すなわち転移の抑制において機能することが考えられる。
　いくつかの実施形態では、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ｕＰＡＲ発現細胞において細胞内に移行され得る。当分野において、ｕＰＡＲはエンドサイトーシスによって細胞内に移行することが報告されている。したがって、ｕＰＡＲに結合するリガンドは、ｕＰＡＲの細胞内移行に伴って細胞内に移行されるため、ｕＰＡＲに対する結合親和性が高いリガンドが細胞内移行において有利であるものと考えられ得る。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、例えば、抗ｕＰＡＲ抗体などの高分子リガンドに比して分子量が小さいため、エンドサイトーシスによる細胞内移行において有利である。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ペプチドの安定性、可溶性、細胞内への移行性、バイオアベイラビリティ、ペプチド－薬物複合体の活性等を含む任意の性質について、目的に応じて調整するために適宜修飾され得る。修飾の例には、ハロゲン化、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）化、リン酸化、グリコシル化、ビオチン化、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合およびプロテインＡ／Ｇ融合を含む。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、ＰＥＧ化される。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、環状化のためにクロロ化される。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、システイン残基の保護のためにＡｃｍ化される。
　本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、当業者に知られた任意の方法によって生産され得る。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、固相合成法を用いて化学合成的に産生され得る。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、宿主細胞において一過性または安定的に発現されることによって産生され得る。宿主細胞の例には、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を含む。
　ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、当業者に知られた任意の方法によって精製され得る。精製方法の例には、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはタンパク質精製のためのその他の標準的な手法により精製することができる。いくつかの実施形態では、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製される。
　１つの態様では、本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドをコードする核酸配列に関する。本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドをコードする核酸配列は、その使用態様に応じて当業者により適宜コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号３２～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、核酸配列は配列番号４７～５８のいずれかに記載の配列である。
　１つの態様では、本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドをコードする核酸配列を含むベクターに関する。ここで、ベクターとは、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子であり、例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターを含む。ベクターはさらに、本開示のＨＬＨペプチドの発現を調節するための任意の調節配列、例えばプロモーターを含み得る。
　１つの態様では、本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞に関する。１つの態様では、本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドを発現する宿主細胞に関する。宿主細胞の例には、大腸菌、ファージ、酵母、植物細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞を含む。
　１つの態様では、本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド、および前記ペプチドに連結された薬物を含む、ペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）に関する。ここで、薬物は独立して作用機能を有する任意の分子であって、ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、そのような薬物をその作用部位、特にｕＰＡＲを発現する細胞またはそのような細胞を含む組織、または病変へと送達することに寄与する。
　いくつかの実施形態では、薬物は、酵素標識、蛍光標識および放射線標識などを含む検出可能な標識である。検出可能な標識は、ｕＰＡＲ発現細胞によってエンドサイトーシスによって取り込まれることを必要としないため、任意の分子量の標識が使用され得る。いくつかの実施形態では、標識の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、あるいはグルコースオキシダーゼなどの酵素標識を含む。いくつかの実施形態では、標識の例には、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、クマリン、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｏｒａｎｇｅ（商標）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（登録商標）、あるいは他の蛍光標識などの蛍光標識を含む。いくつかの実施形態では、標識の例には、Ｃｙｃｌｅｎ、Ｃｙｃｌａｍ、ＤＯ２Ａ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＡ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＡＭ、ＣＢ－Ｔ２Ａ、ＤＯＴＡ、あるいはＮＯＴＡなどのキレート剤を含む。いくつかの実施形態では、標識の例には、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、８９Ｚｒ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、あるいは他の放射性同位体などの放射性同位体を含む。特定の実施形態では、標識はフルオレセイン（ＦＩＴＣ）である。
　いくつかの実施形態では、薬物は、がん治療薬または免疫抑制薬などの治療薬である。いくつかの実施形態では、治療薬は、がん治療薬である。がん治療薬には、細胞毒性薬が含まれる。細胞毒性薬は、例えばＤＮＡまたは微小管を標的として細胞毒性を発揮する。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬は、アウリスタチン（モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、Ａｕｒ０１０１、ＰＦ０６３８０１０１、アウリスタチンＷ、またはアウリスタチンＦなど）またはその誘導体、メイタンシノイド（ＤＭ１またはＤＭ４など）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）（ＳＧＤ１８８２またはＳＧ３１９９など）、インドリノベンゾジアゼピン（ＤＧＮ４６２またはＤＧＮ５４９など）、カリケアマイシン（オゾガマイシン）（ＣＭ１など）、カンプトテシン類似体（ＳＮ３８、ＤＸ－８９５１ｆ、またはＤＸ－８９５１ｆ誘導体）、デュオカルマイシン（セコ－デュオカルマイシン－ヒドロキシ－ベンズアミド－アザインドール（セコ－ＤＵＢＡ）、マイナーグルーブ結合アルキル化剤（ＭＧＢＡ）、またはＭＥＤ－２４６０など）、チューブリン阻害薬（クリプトフィシンなど）、チューブリシンまたはチューブリシン類似体（ＡＺ１３５９９１８５など）、アンベルスタチン２６９、ドキソルビシン、抗生物質（リファローグなど）、アントラサイクリン（ＰＮＵ－１５９６８２など）、微小管阻害薬（リゾキシンなど）、スプライセオスタチン、またはタイランスタチンである。特定の実施形態では、細胞毒性薬はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
　いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣは、少なくとも１つ、例えば１つ、２つ、３つまたはそれ以上の薬物を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣは、ペプチド内の薬物の連結に好適な、任意の位置における天然のまたは非天然のアミノ酸において薬物と連結する。薬物のペプチドへの連結には、当分野において知られる任意の方法が使用され得る。いくつかの実施形態では、薬物は、ペプチドの末端、またはその他の位置のアミノ酸残基の側鎖に対して共有結合を介して連結される。例えば、薬物は、ペプチド末端のカルボキシル基、Ｋのアミノ基、またはＣのチオール基などを介して連結され得る。いくつかの実施形態では、薬物は、任意の位置に導入されたＣのチオールとマレイミドとの反応を介して連結される。特定の実施形態では薬物は、Ｃ末端のＣ残基を介してペプチドに連結される。特定の実施形態では薬物はＮ末端のＣ残基を介してペプチドに連結される。
　いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣは、ｕＰＡＲ結合性ペプチドと薬物とを連結するリンカーを含む。リンカーは、例えば、炭素原子が直鎖状に結合したリンカー、アミノ酸がペプチド結合したリンカーを含む。リンカーの長さはペプチドの安定性や細胞内への移行性、ペプチド－薬物複合体の活性などに応じて適宜定められる。いくつかの実施形態では、リンカーは１つ以上のメチレン基が直鎖状に結合したリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは１つ以上のアミノ酸がアミド結合により結合したペプチド鎖を含む。
　いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーであるか、または非切断可能なリンカーである。薬物が検出可能な標識である実施形態では、リンカーは好ましくは非切断可能なリンカーである。薬物が治療薬である実施形態では、リンカーは好ましくは切断可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは１つ以上のＰＥＧを含む。
　いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、細胞内条件下（細胞内酵素、ｐＨ、酸化還元、温度など）において切断可能であり得る。細胞内条件下によって切断可能なリンカーを用いて薬物を連結することによって、本開示のＰＤＣはｕＰＡＲ発現細胞において細胞内に移行するまでの間、例えば血液中において安定であり、当該細胞内において切断を受けることで薬物はその生理活性を発揮する。例示的な切断可能なリンカー構成成分としては、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、バリン－アラニン（ＶＡ）、フェニルアラニン－リジン（ＦＫ）、マレイミドカプロン酸（ＭＣ）、ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）、ヒドラゾン、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホブタノエート（スルホＳＰＤＢ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）およびＣＬ２Ａ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を含む。
　いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣは、ｕＰＡＲ発現細胞中に存在する酵素（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＤおよびプラスミンなど）により切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣは、カテプシンＢにより切断可能なリンカーを含み、例えば、ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＰＤＣは、（ＰＥＧ）２－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＰＤＣは、ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を含み、例えば以下の式で表される、ペプチド－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥである。
　いくつかの実施形態では、本発明のＰＤＣは、ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を含み、例えば以下の式で表される、ペプチド－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦである。
　本開示のＰＤＣは、ペプチドと薬物の連結後、当業者に知られた任意の方法によって精製され得る。精製方法の例には、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度を含み、またはタンパク質精製のためのその他の標準的な手法により精製することができる。特定の実施形態では、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製される。
　１つの態様では、本開示は、本開示のｕＰＡＲ結合性ペプチドまたは本開示のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体を含む組成物に関する。
　本開示の組成物は、本開示のｕＰＡＲ結合性ペプチドまたはｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体に加え、薬学的に許容できる担体をさらに含んでもよい。薬学的に許容できる担体は、当分野で一般に使用され、当業者において理解される対象において悪影響を及ぼさない任意の担体、賦形剤、その他の成分である。担体または賦形剤およびその他の成分の例には、担体として水、生理食塩水、緩衝液等、賦形剤として乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖等；その他の剤として、崩壊剤としてデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等；緩衝剤としてリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等；乳化剤としてアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等；懸濁剤としてモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等；無痛化剤としてベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等；安定剤としてプロピレングリコール、アスコルビン酸等；保存剤としてフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等；防腐剤として塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等；ゲル化剤としてヒアルロン酸、コラーゲン等を含む。
　本開示の組成物は様々な剤形において調製され、適当な投与経路、投与回数、投与間隔にて対象に投与される。
　本明細書において、「対象」とは、本開示のｕＰＡＲ結合性ペプチド、ｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体、または組成物の投与される動物を意味する。いくつかの実施形態において、対象には哺乳類、鳥類、爬虫類対象を含む。いくつかの実施形態において、対象にはヒトを含む、または含まない哺乳類、例えば霊長類を含む。いくつかの実施形態において、対象にはイヌ、ネコ等のペット、ウシやウマ等の家畜を含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、ｕＰＡＲを発現する細胞を含む疾患（例えばがん）の処置を必要とする対象、例えばがん患者である。
　本開示の組成物は、その使用用途に合わせた任意の剤形に調製され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、粉状、細粒、顆粒状などの固体、懸濁液、乳化液などの液体、ゲル状などの半固体であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、保存処理（例えば濃縮、凍結、乾燥、凍結乾燥）した固体、液体、半固体状で保存され、対象への投与の前に調製処理（例えば融解、希釈、ゲル化、担体および溶媒との混合）を経て使用され得る。
　本開示の組成物は、全身投与または局所投与用に調製され得る。本開示の組成物の投与経路の例には、経口、直腸、経鼻、静脈内、関節内、結膜内、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、髄腔内、経皮もしくは皮下投与経路を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は静脈内投与される。
　本開示の組成物は、ｕＰＡＲを発現する細胞を含む疾患の処置において使用される医薬組成物であり得る。ｕＰＡＲは特にがん細胞において発現することが知られているため、いくつかの実施形態では、疾患はがんである。がんの例には、例えば、黒色腫（例えば進行黒色腫、または転移性黒色腫）、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、腎細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫、神経膠腫、肺扁平上皮がん、小細胞肺がん、肝細胞がん、膀胱がん、上部尿路上皮がん、食道がん、胃食道接合部がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、結腸直腸がん、多発性骨髄腫、肉腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、小リンパ性リンパ腫、卵巣がん、胃腸がん、原発性腹腔がん、ファロピウス管がん、尿路上皮がん、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病／リンパ腫、前立腺がん、尿生殖器がん、髄膜腫、副腎皮質がん、神経膠肉腫、線維肉腫、腎臓がん、乳がん、膵臓がん、子宮内膜がん、皮膚基底細胞がん、虫垂がん、胆管がん、唾液腺がん、進行メルケル細胞がん、びまん性大細胞Ｂリンパ腫、濾胞性リンパ腫、中皮腫、神経内分泌腫瘍、泌尿器がん、骨がん、胸部がん、呼吸器がん、腺様嚢胞がん、子宮頚がん、星細胞腫、脊索腫、神経芽腫、口腔がん、皮膚扁平上皮がん、甲状腺がん、カポジ肉腫、肛門がん、胆嚢がん、胸腺がん、子宮がん、および固形腫瘍を含む。がんは、例えば早期がん、進行期がん、または転移段階であり得る。
　本開示は、例えば以下に関する。
［１］
　ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）結合性ペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ヘリックス１）－（ループ）－（ヘリックス２）の構造を含む、ペプチド。
［２］
　前記ヘリックス１が、アミノ酸配列：Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）からなり、かつ前記ヘリックス２が、アミノ酸配列：ＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）からなるヘリックス２－１であるか、またはアミノ酸配列：ＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）からなるヘリックス２－２であり、
　ここで、Ｘ１～Ｘ２４はアミノ酸残基を示し、
　これらのアミノ酸配列が、次の（ａ）から（ｅ）までの条件、すなわち、
　（ａ）Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、かつＸ６およびＸ７はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること、；
　（ｂ）Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲまたはＫであり、かつＸ１５およびＸ１６はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｃ）Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲまたはＫであり、かつＸ２３およびＸ２４はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
　（ｄ）上記（ａ）および（ｂ）の双方の条件を充足すること；または
　（ｅ）上記（ａ）および（ｃ）の双方の条件を充足すること
のいずれかの条件を満たす、
　項１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３］
　（ａ）～（ｅ）の各条件において特定されていないＸｎ（ｎは１～２４の整数）が、それぞれ独立に、Ｃ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸から選択される、項２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［４］
　（ａ）～（ｅ）の各条件において特定されていないＸｎ（ｎは１～２４の整数）が、それぞれ独立に、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択される、項３に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［５］
　Ｘ１が、Ｙ、Ｌ、Ｒ、またはＨである、項２～４のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［６］
　Ｘ３が、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、またはＹである、項２～５のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［７］
　Ｘ４が、ＥまたはＮである、項２～６いずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［８］
　Ｘ４が、Ｎである、項２～７のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［９］
　Ｘ８が、Ｅである、項２～８のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１０］
　Ｘ９が、Ａである、項２～９のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１１］
　Ｘ１０が、Ａである、項２～１０のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１２］
　Ｘ１２が、Ａである、項２～１１のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１３］
　Ｘ１４が、Ａである、項２～１２のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１４］
　Ｘ１７が、Ａである、項２～９のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１５］
　Ｘ１８が、Ａである、項２～９および１４のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１６］
　Ｘ１９が、Ｋである、項２～９、１４および１５のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１７］
　Ｘ２１、Ａである、項２～９および１４～１６のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１８］
　Ｘ１が、Ｙ、Ｌ、Ｒ、またはＨであり、
　Ｘ３が、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、またはＹであり、
　Ｘ４が、ＥまたはＮであり、
　Ｘ８が、Ｅであり、
　Ｘ９が、Ａであり
　Ｘ１０が、Ａであり、
　Ｘ１２が、Ａであり、かつ
　Ｘ１４が、Ａである、
　項２～１３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［１９］
　Ｘ１が、Ｙ、Ｌ、Ｒ、またはＨであり、
　Ｘ３が、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、またはＹであり、
　Ｘ４が、ＥまたはＮであり、
　Ｘ８が、Ｅであり、
　Ｘ１７が、Ａであり
　Ｘ１８が、Ａであり、
　Ｘ１９が、Ｋであり、かつ
　Ｘ２１が、Ａである、
　項２～１３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２０］
　前記ヘリックス２が、ＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ（配列番号１９）のアミノ酸配列からなる、項２～１３および１８のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２１］
　前記ヘリックス２が、ＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＡ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなる、項２～９、１４～１７および１９のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２２］
　Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７が、それぞれ順番に、
（ｉ）Ｆ、Ｒ、ＩおよびＬ、
（ｉｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＩ、
（ｉｉｉ）Ｗ、Ｒ、ＬおよびＶ、
（ｉｖ）Ｙ、Ｒ、ＬおよびＩ、
（ｖ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＶ、または
（ｖｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＬ
　である、項２～２１のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２３］
　前記ヘリックス１が、
　ＹＥＬＦＬＬＥＲＥＬＩＬＬＥ（配列番号４）、
　ＬＥＬＦＶＬＥＲＥＬＬＩＬＥ（配列番号５）、
　ＲＥＬＷＲＬＥＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号６）、
　ＨＥＬＹＫＬＥＲＥＬＬＩＬＥ（配列番号７）、
　ＬＥＬＦＬＬＥＲＥＬＬＩＬＥ（配列番号８）、
　ＲＥＬＦＹＬＥＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号９）、
　ＲＥＬＦＹＬＮＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号１０）、
　ＬＥＬＦＬＬＥＲＥＬＬＬＬＥ（配列番号１１）または
　ＬＥＬＦＬＬＥＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号１２）、
　のいずれかのアミノ酸配列からなる、項２～２２のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２４］
　前記ループが、３～２０アミノ酸の配列長を有する、項１～２３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２５］
　前記ループが、５～１５アミノ酸の配列長を有する、項１～２４に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２６］
　前記ループが、７～１１アミノ酸の配列長を有する、項１～２５に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２７］
　前記ループが、連続したＧからなる配列であるか、またはそれに対して１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列からなる、項１～２６のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２８］
　前記ループが、７個の連続したＧからなる配列であるか、またはそれに対して１つまたは２つのアミノ酸置換を有する配列からなる、項１～２７のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［２９］
　前記ループが、２番目および／または７番目にアミノ酸置換を含む、項２８に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３０］
　前記ループが、
　ＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）、
　ＧＫＧＧＧＧＧ（配列番号２８）、
　ＧＧＧＧＧＧＫ（配列番号２９）、または
　ＧＫＧＧＧＧＫ（配列番号３０）
のいずれかのアミノ酸配列からなる、項１～２９のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３１］
　前記ペプチドが、ヘリックス１のＮ末端および／またはヘリックス２のＣ末端にそれぞれ１～３個のアミノ酸をさらに含む、項１～３０のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３２］
　前記ペプチドが、ヘリックス１のＮ末端および／またはヘリックス２のＣ末端にそれぞれ１～３個のアミノ酸をさらに含み、前記ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端のアミノ酸がＣである、項３１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３３］
　前記ペプチドが、ヘリックス１のＮ末端にＣＡをさらに含み、かつヘリックス２－１のＣ末端にＡＣをさらに含むか、またはヘリックス１のＮ末端にＣＡをさらに含み、かつヘリックス２－２のＣ末端にＣをさらに含む、項３２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３４］
　前記ペプチドの配列長が６０アミノ酸以下である、項１～３３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３５］
　前記ペプチドの配列長が３５～４５アミノ酸である、項３４に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３６］
　前記ペプチドの配列長が３９アミノ酸である、項３５に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３７］
　配列番号３２～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸変異を含む配列からなる、項１～３６のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３８］
　アミノ酸変異が、アミノ酸置換である、項３７に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［３９］
　配列番号３２～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、項３７に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［４０］
　前記ペプチドのＮ末端とＣ末端とが直接的または間接的に結合する、項１～３９のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド
［４１］
　前記ペプチドのＮ末端とＣ末端とがジスルフィド結合もしくはチオエーテル結合によって結合する、またはリンカーを介して連結される、項１～４０のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［４２］
　前記ペプチドのＮ末端とＣ末端とがジスルフィド結合によって結合する、項４１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［４３］
　前記ペプチドのＮ末端とＣ末端とがチオエーテル結合によって結合する、項４１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
［４４］
　項１～４３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、および前記ペプチドに連結された薬物を含む、ｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［４５］
　前記薬物が、がん治療薬である、項４４に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［４６］
　前記がん治療薬が、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である、項４５に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［４７］
　前記ペプチドと前記薬物とを連結するリンカーをさらに含む、項４４～４６のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［４８］
　前記リンカーが、ＰＥＧを含む、項４７に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［４９］
　前記リンカーが、細胞内酵素によって切断可能なリンカーである、項４７または４８に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［５０］
　前記細胞内酵素によって切断可能なリンカーが、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）を含む、項４９に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［５１］
　前記リンカーが、（ＰＥＧ）２－ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢを含む、項４７～５０のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［５２］
　項１～４３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、または項４４～５１のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体を含む、組成物。
［５３］
　がんの処置における使用のための、項５２に記載の組成物。
［５４］
　がんを処置するための方法であって、処置を必要とする対象に項１～４３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、または項４４～５１のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体を投与することを含む方法。
［５５］
　がんを処置するための、項１～４３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、または項４４～５１のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
［５６］
　がんを処置するための、項１～４３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、または項４４～５１のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体の使用。
［５７］
　がんを処置するための医薬の製造のための、項１～４３のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、または項４４～５１のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体の使用。
１．ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドの作製と評価
１－１．ライブラリーの構築
　ファージ表層タンパク質であるｐＩＩＩにＨＬＨペプチドを融合させることで，ファージ表層提示ペプチドライブラリーを構築した。本研究ではＨＬＨペプチドのＮ末端ヘリックス部分をランダム化したライブラリー：ＣＡＸＥＬＸＸＬＥＸＥＬＸＸＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＡＣ（配列番号３１）（ここでＸはＰ、ＴおよびＡを除く天然のアミノ酸１７種から選択されるアミノ酸を表す）用いた。具体的には、ＨＬＨペプチドをコードする核酸配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、ファージ表層提示用ベクターｐＣｏｍｂ３ｄに直接的なライゲーションにより導入した。作製したベクターをエレクトロポレーション法により大腸菌ＴＧ１に導入し、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＳＢ培地中で３７℃で対数増殖期まで培養した。その後ヘルパーファージＶＣＭ１３溶液を大腸菌培養物に添加し、３７℃で３０分培養した。６０００ｇで５分間遠心分離して菌体を回収し、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＳＢ培地中で回収した大腸菌を３０℃で一晩培養した。培養物中の増殖したファージをＰＥＧ沈殿法により回収した。
１－２．スクリーニング
　ペプチドを提示したファージライブラリーを、ｕＰＡＲ－Ｆｃ（ｕＰＡＲと免疫グロブリンＧ　Ｆｃフラグメントの融合タンパク質）と反応させた。ファージとｕＰＡＲ－Ｆｃ複合体をプロテインＡ磁気ビーズで捕捉することで非結合性ファージを除去した。補足したファージを０．２Ｍ　Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ　２．２）を添加することで回収し、大腸菌に感染させることで増幅した。一連の操作を１ラウンドとして、４ラウンドまで繰り返した。最終的に選別したファージクローンのＤＮＡシーケンス解析により、ｕＰＡＲ結合性ペプチドを同定した。
　さらに、Ｒ４Ｉ－７の一部のアミノ酸を置換したｕＰＡＲ結合性ペプチドとして、Ｒ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ、Ｒ４Ｉ－７　Ｇ１８Ｋ、Ｒ４Ｉ－７　Ｇ２３Ｋ、およびＲ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３Ｋ変異体を同定した。同定したｕＰＡＲ結合性ペプチドのアミノ酸配列を以下の表１に示す。
１－３．ｕＰＡＲ結合性ペプチドの合成
　同定したｕＰＡＲ結合性ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各ｕＰＡＲ結合性ペプチドを、ペプチド自動合成機（ＰＳＳＭ－８，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いて、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法により化学合成した。具体的には、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ－ＰＥＧレジン（置換率：０．２２ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて固相合成を行い、２，２，２－トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／１，２－エタンジチオール／トリイソプロピルシラン（９４／２．５／２．５／１）のカクテルをレジンに加えて３時間反応させ、脱樹脂／脱保護を行った。回収したろ液に氷冷ジエチルエーテルを加えてペプチドを析出させた。氷冷ジエチルエーテルで３回洗浄した後、ペプチド粗生成物を、Ｃ１８カラム（ＳＰ－１２０－５－ＯＤＳ－ＲＰＳ，ＤＡＩＳＯＰＡＫ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製した。得られた精製分画を、ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）装置上で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）により解析した。精製したペプチドを２０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ　８）５０ｍＬに溶解し、１２時間撹拌することでＮ末端Ｃｙｓのチオール基とＣ末端Ｃｙｓのチオール基でジスルフィド架橋を形成させ、ペプチドを環状化した。ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて環状化ペプチドを精製した。この際純度は９５％以上であった。また、陰性対照として、ｕＰＡＲに結合しない、ＨＬＨ土台ペプチドＹＴ１－Ｓ（ＣＡＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＹＣ）（配列番号４４）も同様に合成した。
１－４．ｕＰＡＲ結合性ペプチドの構造の評価
　ペプチドＲ４Ｇ－６、Ｒ４Ｇ－８、Ｒ４Ｇ－１０、Ｒ４Ｉ－７およびＲ４Ｉ－１２について、Ｊ－８２０（Ｊａｓｃｏ）を用いた円二色性スペクトル測定により，各ペプチドサンプルの二次構造を評価した。各ペプチドのスペクトルを図１に示す。いずれのペプチドも１９１ｎｍ付近に正の極大，２０８ｎｍおよび２２２ｎｍ付近に負の極大をもつことからα－ヘリックス構造を有することが確認された。
１－５．ｕＰＡＲ結合性ペプチドのｕＰＡＲ結合活性の測定
　ペプチドＲ４Ｇ－６、Ｒ４Ｇ－８、Ｒ４Ｇ－１０、Ｒ４Ｉ－７およびＲ４Ｉ－１２について、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）法により解離定数を測定する事で、ｕＰＡＲに対する結合活性を評価した。センサーチップに固定化したヒトｕＰＡＲ（Ａｃｒｏ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して各濃度のペプチドを添加し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて結合レスポンスを測定した。測定条件はランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋，温度：２５°Ｃで行った。測定データはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて，１：１結合モデルでフィッティングした。さらに、ペプチドＲ４Ｉ－７Ｅ９Ｎ、Ｇ１８Ｋ、Ｇ２３Ｋ、およびＥ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３Ｋ変異体についても同様にｕＰＡＲ結合活性を測定した。
　ｕＰＡＲ結合性ペプチドのｕＰＡＲ結合活性の測定結果を図２Ａ～２Ｉに示す。五つのペプチドのいずれについてもｕＰＡＲとの結合が観察された（Ｒ４Ｇ－６：ＫＤ＝５０７ｎＭ、Ｒ４Ｇ－８：ＫＤ＝５９５ｎＭ、Ｒ４Ｇ－１０：ＫＤ＝１６７ｎＭ、Ｒ４Ｉ－１２：ＫＤ＝３１１ｎＭ、およびＲ４Ｉ－７：ＫＤ＝４ｎＭ）。ｕＰＡＲへの結合活性についてはＲ４Ｉ－７が最も低いＫＤを示した。さらに、Ｒ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ、Ｒ４Ｉ－７　Ｇ１８Ｋ、Ｒ４Ｉ－７　Ｇ２３Ｋ、およびＲ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３Ｋ変異体の変異体のはいずれも野生型Ｒ４Ｉ－７に比して優れたｕＰＡＲ結合性を示した。具体的には、Ｒ４Ｉ－７はＫＤ＝４．３９ｎＭ、Ｒ４Ｉ－７　Ｅ９ＮはＫＤ＝０．４４ｎＭ、Ｒ４Ｉ－７　Ｇ１８ＫはＫＤ＝３．６１ｎＭ、Ｒ４Ｉ－７　Ｇ２３ＫはＫＤ＝３．３６ｎＭ、およびＲ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３ＫはＫＤ＝０．１７ｎＭを示した。
１－６．ｕＰＡＲ結合性ペプチドのｕＰＡ活性の阻害
　Ｒ４Ｉ－７ペプチドについて、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）法により解離定数を測定することで、ｕＰＡ－ｕＰＡＲ間の相互作用の阻害活性を評価した。センサーチップに固定化したヒトｕＰＡ（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対して各濃度のペプチドおよびｕＰＡＲ（３ｎＭ）の混合溶液を添加し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて結合レスポンスを測定した。測定条件はランニング緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ＋，温度：２５°Ｃで行った。ｕＰＡＲのみの添加条件（ｕＰＡＲ：３ｎＭ，測定サンプル：０ｎＭ）のレスポンス値をｕＰＡ－ｕＰＡＲ相互作用１００％と換算して測定データを正規化した。陰性対照として、ＹＴ１－Ｓの阻害活性を同様に評価した。
　Ｒ４Ｉ－７ペプチドのｕＰＡ活性の阻害の結果を図３に示す。測定の結果、Ｒ４Ｉ－７はｕＰＡ－ｕＰＡＲ相互作用を完全に阻害し、ＩＣ５０＝５ｎＭを示した。陰性対照であるＹＴ１－Ｓでは阻害作用が認められなかった。
１－７．ｕＰＡＲ結合性ペプチドの細胞内移行性の評価
　蛍光標識したペプチドＲ４Ｉ－７および抗ｕＰＡＲ抗体の細胞内への移行性について、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ｕＰＡＲ陽性細胞）およびＭＣＦ－７（ｕＰＡＲ陰性細胞）における、免疫染色法により共焦点顕微鏡を用いて観察した。具体的には、マルチウェルガラスボトムデッシュ（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４ｘ１０４細胞／ウェルの播種密度で播種し、またはＭＣＦ－７細胞を６ｘ１０４細胞／ウェルの播種密度で播種し、３７°Ｃ，５％ＣＯ２で２日間培養した。１ウェルの播種した細胞に、ビオチン化抗ｕＰＡＲヤギ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を２μｇ／ｍＬ，１００μＬ／ウェルで添加した後にストレプトアビジン－ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３μｇ／ｍＬ，１００μＬ／ウェルで添加し、また別の１ウェルの細胞にはフルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識したペプチドＲ４Ｉ－７を１μＭ，１００μＬ／ウェルで添加し、残りのウェルはＤＭＥＭ培地を添加した。３７°Ｃで１時間培養した後、核の染色のため細胞にさらにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を２０μｇ／ｍＬ，１００μＬ／ウェルで添加し、３７°Ｃで１５分間培養した。ＤＭＥＭ培地で３回洗浄したのち，再びＤＭＥＭ培地を１００μＬ加え、染色した細胞を、共焦点顕微鏡（ＦＶ１２００（ＯＬＹＭＰＵＳ））を用いて観察した。
　共焦点顕微鏡による観察結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。ビオチン化ｕＰＡＲ抗体は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において細胞表面への局在が観察されたが、ＭＣＦ－７細胞ではそのような局在は見られなかった（図４Ａ）。これはｕＰＡＲがＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞表面上に発現しており、ＭＣＦ－７細胞においては発現していない事を示唆する。蛍光標識したペプチドＲ４Ｉ－７は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において細胞質中に局在が観察され、ＭＣＦ－７細胞では観察されなかった（図４Ｂ）。この結果は、本開示のｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチドが、ｕＰＡＲ陽性がん細胞選択的に細胞内への移行が可能であることを示す。
２．ｕＰＡＲ結合性ＨＬＨペプチド－薬物複合体（ＰＤＣ）の作製および評価
２－１．ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣの作製
　ペプチドＲ４Ｉ－７に抗がん剤としてモノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ　ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ　Ｅ，ＭＭＡＥ）を結合させたｕＰＡＲ結合性ＰＤＣを作製した。ＭＭＡＥは知られたチューブリン重合阻害剤である。Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥの合成スキームの模式図を図５に示す。Ｆｍｏｃ固相合成法により、Ｒ４Ｉ－７に、リンカーとして２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸（アミノ－ＰＥＧ２－酢酸）を連結したＲ４Ｉ－７－リンカー（ＣｌＣＨ２ＣＯ－ＧＡＲＥＬＦＹＬＥＲＥＬＬＶＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＡＣ（Ｐｅｇ）（Ｐｅｇ）Ｃ－ＮＨ２）（配列番号４５）を合成した。同様に、ＹＴ１－Ｓ－リンカー（ＣｌＣＨ２ＣＯ－ＧＡＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＹＣ（Ｐｅｇ）（Ｐｅｇ）Ｃ－ＮＨ２）（配列番号４６）を合成した。この際脱樹脂／脱保護にはＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（９５／２．５／２．５）のカクテルを用い、Ｃ末端のｃｙｓはアセトアミドメチル基（Ａｃｍ）で保護した。Ｎ末端Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ－Ｇｌｙのクロロ基と３９残基目Ｃｙｓのチオール基を反応させ、チオエーテル架橋を形成させる事でペプチドを環状化した。Ｃ末端ｃｙｓ（Ａｃｍ）を脱保護し、ペプチドＲ４Ｉ－７－リンカーＣ末端Ｃｙｓのチオール基とＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）のマレイミド基を反応させ、複合体を合成した。粗生成物を、Ｃ１８カラム（ＡＭ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，ＹＭＣ）を用いたＲＰ－ＨＰＬＣにより精製し、精製分画をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより解析した。精製後のＲ４Ｉ－７－ＭＭＡＥの純度は９５％以上であった。また、対照として、チオエーテル結合により環状化したＲ４Ｉ－７ペプチド（Ｒ４Ｉ－７（チオエーテル））およびＹＴ１－Ｓペプチド（ＹＴ１－Ｓ（チオエーテル））、ならびにＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＥも同様に合成した。
２－２．ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣの結合活性の評価
　Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ複合体およびＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＥ複合体について、ＳＰＲ法により、ｕＰＡＲに対する結合活性を評価した。センサーチップに固定化したヒトｕＰＡＲ（Ａｃｒｏ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して各濃度のＰＤＣを添加し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて結合レスポンスを測定した。測定データはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、１：１結合モデルでフィッティングした。
　ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣの結合活性評価の結果を図６に示す。Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ複合体は、ｕＰＡＲに対してＫＤ＝８ｎＭを示し、結合活性を有することが確認された。ＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＥ複合体はｕＰＡＲに対する結合活性が認められなかった。
２－３．ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣのがん細胞の増殖阻害能の評価
　Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ複合体のがん細胞における細胞増殖阻害効果を評価した。Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ複合体、ＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＥ複合体、Ｒ４Ｉ－７（チオエーテル）およびＹＴ１－Ｓ（チオエーテル）を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（ｕＰＡＲ陽性細胞）およびＭＣＦ－７（ｕＰＡＲ陰性細胞）に添加し、３７°Ｃで３日間培養した後、Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＷＳＴ－１（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。
各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。ここで細胞に培地のみを添加した条件を細胞生存率１００％とし、細胞無しで培地のみの条件下での細胞生存率を０％として測定を正規化し、正規化後の相対値を化合物の細胞増殖阻害活性とした。
　ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣのがん細胞の増殖阻害能評価の結果を図７に示す。Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ複合体は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において濃度依存的な顕著な細胞増殖阻害効果を示したが、ＭＣＦ－７細胞においては有意な細胞増殖阻害効果を示さなかった。両方の細胞において、高濃度のＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＥ複合体において若干の細胞生存率の低下が見られたが、濃度依存的な有意な細胞増殖阻害効果は観察されなかった。また、ＭＭＡＥを持たないＲ４Ｉ－７（チオエーテル）およびＹＴ１－Ｓ（チオエーテル）では、いずれの細胞においても、またいずれの濃度においても、細胞増殖阻害効果は観察されなかった。これらの結果は、Ｒ４Ｉ－７－ＭＭＡＥ複合体は、ｕＰＡＲとの結合後、ｕＰＡＲのエンドサイトーシスを介して細胞内に移行し、ＭＭＡＥを放出することで細胞増殖を阻害したことを示す。
３．ヒトがん細胞株におけるｕＰＡＲの発現解析
　ヒトがん細胞株におけるｕＰＡＲの発現量を、蛍光標識した抗ｕＰＡＲ抗体を用いた免疫染色法により定量した。培養したヒトがん細胞株ＭＣＦ－７、Ｕ－８７ＭＧ、ＭＡＤ－ＭＢ－２３１およびＨｅＬａを回収し、１ｍＬのＰＢＳ（＋１％ＦＣＳ）に懸濁させて、１．０×１０６／ｍＬの細胞懸濁液を得た。各細胞懸濁液１００ｕＬに、蛍光色素（ＡＰＣ）を標識した抗ｕＰＡＲ抗体またはアイソタイプ対照抗体を５μＬずつ添加し、１時間静置して抗体染色を行った。ＰＢＳ（＋１％ＦＣＳ）で３回細胞を洗浄した後、フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（商標）ＩＩＩｕ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ）にて蛍光強度を測定した。
　ヒトがん細胞株におけるｕＰＡＲの発現解析の結果を図８に示す。Ｕ－８７ＭＧ、ＭＡＤ－ＭＢ－２３１およびＨｅＬａにおいてｕＰＡＲの発現が確認された。一方でＭＣＦ細胞ではｕＰＡＲの発現はわずかであった。
４．ペプチドＲ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３Ｋ変異体を用いた試験
４－１．蛍光標識ペプチドの作成
　以降、本明細書において、ペプチドＲ４Ｉ－７　Ｅ９Ｎ／Ｇ１８Ｋ／Ｇ２３Ｋ変異体をペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）と称する。蛍光標識したペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）の細胞内への移行性を評価した。ヒトがん細胞株Ｕ－８７ＭＧおよびＨｅＬａ（ｕＰＡＲ陽性細胞）、ならびにＭＣＦ－７細胞（ｕＰＡＲ陰性細胞）において免疫染色を行い、共焦点顕微鏡を用いて観察した。Ｆｍｏｃ固相合成法により、Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）のＮ末端に、ＣｙｓとリンカーとしてＧｌｙを連結したＲ４Ｉ－７（３Ｍ）－リンカー（ＣＧＣＡＲＥＬＦＹＬＮＲＥＬＬＶＬＥＧＫＧＧＧＧＫＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＡＣ）（配列番号５９）を合成した。ペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）－リンカーのＮ末端から３残基目およびＣ末端のＣｙｓのチオール基を反応させ、ジスルフィド結合を形成させることでペプチドを環状化した。リンカーのＮ末端のＣｙｓのチオール基とマレイミドを誘導化させた蛍光色素（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８Ｃ５　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のマレイミド基を反応させることで蛍光標識したペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）を合成した。粗生成物を、Ｃ１８カラム（ＡＭ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，ＹＭＣ）を用いたＲＰ－ＨＰＬＣにより精製し、精製分画をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより解析し、蛍光標識したペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）が合成されていることを確かめた。
　Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－リンカーの構造を以下に示す。
（配列番号５９）
４－２．蛍光標識ペプチドの細胞内移行性の評価
　ガラスベースディッシュ（φ２７ｍｍ）（ＩＷＡＫＩ）に、各がん細胞を２．４×１０４細胞／ウェルの播種密度で播種し、３７°Ｃ，５％ＣＯ２で１晩培養した。蛍光標識したＲ４Ｉ－７（３Ｍ）　１μＭを１００μＬ／ウェルで添加し、２４時間後に共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１２００，ＯＬＹＭＰＵＳ）で観察した。観察前には細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）で染色した。
　共焦点顕微鏡による観察結果を図９に示す。Ｕ－８７ＭＧ細胞とＨｅＬａ細胞において、ＭＣＦ－７細胞と比べて、多くのドット状の蛍光輝点が細胞質に局在していることが観察された。ｕＰＡＲの発現が高いＵ－８７ＭＧとＨｅＬａ細胞においてより多くの蛍光輝点が観察されたことから、ｕＰＡＲ結合性ペプチドの細胞内への取り込みは、ｕＰＡＲ特異的であることが示された。また、ドット状の蛍光輝点が観察されたことから、ｕＰＡＲ結合性ペプチドが細胞のエンドサイトーシス経路により細胞内に取り込まれることが考えられる。
４－３．ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣの作成
　ペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）に抗がん剤としてモノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ　ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ　Ｆ，ＭＭＡＦ）を結合させたｕＰＡＲ結合性ＰＤＣを作成した。ＭＭＡＦは知られたチューブリン重合阻害剤である。Ｆｍｏｃ固相合成法により、Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）のＮ末端に、ＣｙｓとリンカーとしてＧｌｙを連結したＲ４Ｉ－７（３Ｍ）－リンカー（ＣＧＣＡＲＥＬＦＹＬＮＲＥＬＬＶＬＥＧＫＧＧＧＧＫＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＡＣ）（配列番号５９）を合成した。同様に、ＹＴ１－Ｓ－リンカー（ＣＧＣＡＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＹＣ）（配列番号６０）を合成した。ペプチドＲ４Ｉ－７（３Ｍ）－リンカーのＮ末端から３残基目およびＣ末端のＣｙｓのチオール基を反応させ、ジスルフィド結合を形成させることでペプチドを環状化した。リンカーのＮ末端のＣｙｓのチオール基とＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）のマレイミド基を反応させることでペプチド－薬物複合体を合成した。粗生成物を、Ｃ１８カラム（ＡＭ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，ＹＭＣ）を用いたＲＰ－ＨＰＬＣにより精製し、精製分画をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより解析し、Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体が合成されていることを確かめた。また、対照としてＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦを同様に合成した。
４－４．ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣの結合活性の評価
　Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体およびＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体について、ＳＰＲ法により、ｕＰＡＲに対する結合活性を評価した。アミンカップリング法でＣＭセンサーチップに固定化した組換えヒトｕＰＡＲ（Ａｃｒｏ　ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して各濃度のＰＤＣをアナライトとして添加し、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて結合レスポンスを測定した。測定はＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液において、温度は２５℃、流速は３０μＬ／ｍｉｎで実施した。測定データはＢｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、１：１結合モデルでフィッティングした。
　Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体の結合活性評価の結果を図１０Ａに示す。Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体は、ｕＰＡＲに対してＫＤ＝０．４７ｎＭを示し、結合活性を有することが確認された。ＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体ではｕＰＡＲに対する結合活性が認められなかった。したがって、この結果は、ＰＤＣにおける本開示のＨＬＨペプチド部分がｕＰＡＲの分子認識において重要であることを示す。
　４－５．ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣのがん細胞の増殖阻害能の評価
　Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体およびＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体のがん細胞における細胞増殖阻害効果を評価した。ヒトがん細胞株Ｕ－８７ＭＧ細胞およびＨｅＬａ細胞（ｕＰＡＲ陽性細胞）、ならびにＭＣＦ－７細胞（ｕＰＡＲ陰性細胞）を９６穴プレートに３，０００細胞／ウェル／１００μＬで播種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２で一晩培養した。Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体またはＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体を各細胞に添加し、９６時間培養した後、Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＷＳＴ－１（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーを用いて測定した。ここで細胞に培地のみを添加した条件を細胞生存率１００％とし、細胞無しで培地のみの条件下での細胞生存率を０％として測定を正規化し、正規化後の相対値を化合物の細胞増殖阻害活性とした。
　ｕＰＡＲ結合性ＰＤＣのがん細胞の増殖阻害能評価の結果を図１０Ｂ～Ｃに示す。Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体は、Ｕ－８７ＭＧ細胞およびＨｅＬａ細胞において、ＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体に比して優れた細胞増殖阻害効果を示した。一方で、ＭＣＦ－７細胞においては、Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体とＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦの細胞増殖阻害効果に顕著な差は見られなかった。なお、ｕＰＡＲ結合活性を示さないＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体においても細胞増殖阻害効果が観察されるが、これは培養中にペプチドとＭＭＡＦ間のリンカーが開裂し、遊離したＭＭＡＦの毒性が発揮されたものと考えられる。ｕＰＡＲ陽性細胞においてのみ、ＹＴ１－Ｓ－ＭＭＡＦ複合体と比較してＲ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体が優れた細胞増殖阻害効果を示したことから、この結果は、Ｒ４Ｉ－７（３Ｍ）－ＭＭＡＦ複合体が細胞に発現されるｕＰＡＲへの結合を介して細胞内に移行し、ＭＭＡＦを放出することで細胞増殖を阻害することを示す。
配列表

Claims (19)

  1. 　ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）結合性ペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端にかけて（ヘリックス１）－（ループ）－（ヘリックス２）の構造を含む、ペプチド。
  2. 　前記ヘリックス１が、アミノ酸配列：Ｘ１ＥＬＸ２Ｘ３ＬＸ４Ｘ５ＥＬＸ６Ｘ７ＬＸ８（配列番号１）からなり、かつ前記ヘリックス２が、アミノ酸配列：ＫＬＸ９Ｘ１０ＬＸ１１Ｘ１２ＫＬＸ１３Ｘ１４ＬＸ１５Ｘ１６（配列番号２）からなるヘリックス２－１であるか、またはアミノ酸配列：ＫＬＸ１７Ｘ１８ＬＸ１９Ｘ２０ＫＬＸ２１Ｘ２２ＬＫＸ２３Ｘ２４（配列番号３）からなるヘリックス２－２であり、
    　ここで、Ｘ１～Ｘ２４はアミノ酸残基を示し、
    　これらのアミノ酸配列が、次の（ａ）から（ｅ）までの条件、すなわち、
    　（ａ）Ｘ２はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ５はＲまたはＫであり、かつＸ６およびＸ７はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること、；
    　（ｂ）Ｘ１１はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ１３はＲまたはＫであり、かつＸ１５およびＸ１６はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
    　（ｃ）Ｘ２０はＦ、ＹまたはＷであり、Ｘ２２はＲまたはＫであり、かつＸ２３およびＸ２４はそれぞれ独立してＬ、ＩまたはＶであること；
    　（ｄ）上記（ａ）および（ｂ）の双方の条件を充足すること；または
    　（ｅ）上記（ａ）および（ｃ）の双方の条件を充足すること
    のいずれかの条件を満たす、
    　請求項１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  3. 　（ａ）～（ｅ）の各条件において、特定されていないＸｎ（ｎは１～２４の整数）が、それぞれ独立に、Ｃ、Ｐ、ＧまたはＳ以外のアミノ酸から選択される、請求項２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  4. 　（ａ）～（ｅ）の各条件において、特定されていないＸｎ（ｎは１～２４の整数）が、それぞれ独立に、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＹからなる群より選択される、請求項３に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  5. 　Ｘ１が、Ｙ、Ｌ、Ｒ、またはＨであり、
    　Ｘ３が、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、またはＹであり、
    　Ｘ４が、ＥまたはＮであり、
    　Ｘ８が、Ｅであり、
    　Ｘ９が、Ａであり
    　Ｘ１０が、Ａであり、
    　Ｘ１２が、Ａであり、かつ
    　Ｘ１４が、Ａである、
    　請求項４に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  6. 　Ｘ１が、Ｙ、Ｌ、Ｒ、またはＨであり、
    　Ｘ３が、Ｌ、Ｖ、Ｒ、Ｋ、またはＹであり、
    　Ｘ４が、ＥまたはＮであり、
    　Ｘ８が、Ｅであり、
    　Ｘ１７が、Ａであり
    　Ｘ１８が、Ａであり、
    　Ｘ１９が、Ｋであり、かつ
    　Ｘ２１が、Ａである、
    　請求項４に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  7. 　前記ヘリックス２が、ＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ（配列番号１９）またはＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡＡ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  8. 　Ｘ２、Ｘ５、Ｘ６およびＸ７が、それぞれ順番に、
    （ｉ）Ｆ、Ｒ、ＩおよびＬ、
    （ｉｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＩ、
    （ｉｉｉ）Ｗ、Ｒ、ＬおよびＶ、
    （ｉｖ）Ｙ、Ｒ、ＬおよびＩ、
    （ｖ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＶ、または
    （ｖｉ）Ｆ、Ｒ、ＬおよびＬ
    　である、請求項２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  9. 　前記ヘリックス１が、
    　ＹＥＬＦＬＬＥＲＥＬＩＬＬＥ（配列番号４）、
    　ＬＥＬＦＶＬＥＲＥＬＬＩＬＥ（配列番号５）、
    　ＲＥＬＷＲＬＥＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号６）、
    　ＨＥＬＹＫＬＥＲＥＬＬＩＬＥ（配列番号７）、
    　ＬＥＬＦＬＬＥＲＥＬＬＩＬＥ（配列番号８）、
    　ＲＥＬＦＹＬＥＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号９）、
    　ＲＥＬＦＹＬＮＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号１０）、
    　ＬＥＬＦＬＬＥＲＥＬＬＬＬＥ（配列番号１１）または
    　ＬＥＬＦＬＬＥＲＥＬＬＶＬＥ（配列番号１２）
    のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  10. 　前記ループが、３～２０アミノ酸の配列長を有する、請求項１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  11. 　前記ループが、
    　ＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）、
    　ＧＫＧＧＧＧＧ（配列番号２８）、
    　ＧＧＧＧＧＧＫ（配列番号２９）または
    　ＧＫＧＧＧＧＫ（配列番号３０）
    のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  12. 　前記ペプチドが、ヘリックス１のＮ末端および／またはヘリックス２のＣ末端にそれぞれ１～３個のアミノ酸をさらに含む、請求項２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  13. 　前記ペプチドが、ヘリックス１のＮ末端にＣＡをさらに含み、かつヘリックス２－１のＣ末端にＡＣをさらに含むか、またはヘリックス１のＮ末端にＣＡをさらに含み、かつヘリックス２－２のＣ末端にＣをさらに含む、請求項１２に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  14. 　配列番号３２～４３のいずれかに記載のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列において１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸変異を含む配列からなる、請求項１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  15. 　前記ペプチドのＮ末端とＣ末端とが直接的または間接的に結合する、請求項１に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド
  16. 　前記ペプチドのＮ末端とＣ末端とがジスルフィド結合もしくはチオエーテル結合によって結合する、またはリンカーを介して連結される、請求項１５に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド。
  17. 　請求項１～１６のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、および前記ペプチドに連結された薬物を含む、ｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体。
  18. 　請求項１～１６のいずれかに記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド、または請求項１７に記載のｕＰＡＲ結合性ペプチド－薬物複合体を含む、組成物。
  19. 　がんの処置における使用のための、請求項１８に記載の組成物。
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