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CN1155694C - 在液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法 - Google Patents

在液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在液体培养基中培养食用型担子菌纲真菌如蘑菇类Agaricus Blazei Murill以产生几厘米大小的真菌团聚体的有效方法。特征性地，该液体培养基以粗制甘蔗糖类形式的蔗糖为碳源，还含有不溶于水的可支持生长的细粉状物质作为真菌团聚体的核心，这种细粉状物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、松树和麸皮。进一步特征性地，培养过程在富含氧的条件下进行，该条件通过在0.12-0.5MPa(绝对值)的压力下以一定的送气速度向培养基中输入富含氧的空气，其中氧的体积比至少为30%。

Description

在液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法
                           技术领域
本发明涉及一种在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的有效的新方法，或更具体地，本发明涉及一种在含水液体培养基中培养担子菌纲食用真菌，以获得所述真菌的数厘米大小的菌体团聚体的方法，所述真菌如蘑菇Agaricus Blazei Murill，香菇小丝膜菌(Cortinellus shiitake)，Lyophyllumaggregatum，Pleurotus ostreatus等。本发明还涉及实践所述培养方法的生物反应器。
                        背景技术
在液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法是已知的，如美国专利2,693,665、2,761,246和2,850,841等。现有技术中一种典型的液体培养基在每升中包含50g蔗糖，10g硝酸铵，5g磷酸钠，2.5g硫酸镁，和0.2g硫酸亚铁。接种了真菌菌体如菌丝体的液体培养基通常用较低转速的搅拌器温和搅拌并通气数天，使菌丝体长成直径3-40mm的球形或多面形粒状团聚体。这种菌丝体团聚体被认为借助菌丝体表面形成的、作用类似粘合剂的粘性多糖物质而形成。但现有技术中这些方法的产率很低，其原因包括该真菌的低生长速率以及当真菌在培养基中培养时回收真菌遇到的困难。
本发明因此旨在提供在液体培养基中培养担子菌纲真菌，如蘑菇Agaricus Blazei Murill(本文称为蘑菇属真菌)等的有效工业化新方法。本发明的第二个目的是提供适于在真菌液体培养基中实施上述培养方法的新的生物反应器。
                           发明内容
因此，本发明在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法包括以下步骤：
(a)在含有提供氮、磷酸和钾的无机营养盐的液体培养基中接种真菌菌体如菌丝体；
(b)将该液体培养基与粗制甘蔗糖混合，所述甘蔗糖的量为每升液体培养基50-70g蔗糖；
(c)将该液体培养基与不溶于水的支持生长的物质混合，所述支持生长的物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、和麸皮，其量为每升液体培养基0.2-15g干重；
(d)使该液体培养基在20-30℃一直搅拌；
(e)在0.12-0.5MPa(绝对值)的压力下，以至少0.01升/min/升液体培养基的速率，向该液体培养基中通以富含氧的空气，该富氧空气中至少30％的体积，或优选60-90％的体积为氧气。
实施本发明上述培养方法的生物反应器包括：
(A)一个可承受压力的容器，其用于容纳液体培养基；
(B)一个进气管，其能以0.12-0.5MPa(绝对值)的超大气压力将富含氧的空气吹入液体培养基；
(C)一个出气管，其具有将可承受压力的容器内的压力调节在0.12-0.5MPa(绝对值)范围内的装置(means)；和
(D)一种装置，其能对所述可承受压力之容器内容纳的液体培养基进行搅拌。
                         附图说明
图1是实施本发明方法的一种典型生物反应器系统的剖视图。
图2是实施本发明方法的另一种生物反应器系统的剖视图。
图3是实施本发明方法的又一种生物反应器系统的剖视图。
图4是实施本发明的连续方法的生物反应器系统剖视图。
图5显示蘑菇属真菌在各种液体培养基中的生长曲线。
图6显示从配备了气体旋流器(cyclone)(实线)或未配备(虚线)的生物反应器中出来的薄雾中蘑菇属真菌的菌丝体浓度。
                        具体实施方式
如上述，本发明培养担子菌纲真菌，或主要是蘑菇属真菌的方法，其特征在于液体培养基的组成和在这种液体培养基中进行培养的条件。当在最优选条件下培养时，只要培养基中提供了足够的营养，真菌菌体的团聚体就可快速生长至直径10-20mm，但团聚体的核心有时表现为黑色，可能是液体培养基中局部缺乏溶解氧的结果。该问题可如下解决，即通过将培养基中溶解氧的浓度增加至15-30mg/L，以使真菌团聚体经3-4天的连续培养可生长至直径约40mm而核心部分不发黑。
无机营养盐的种类和浓度无特殊限制，可常规包括10-15g/L硝酸铵作为氮源，5-7g/L磷酸钠作为磷酸盐来源，3-7g/L硫酸钾或磷酸氢二钾作为钾离子来源，2.5-3.5g/L硫酸镁和0.2-0.3g/L硫酸亚铁。
本发明培养方法中所用的液体培养基的特征是，与作为碳源的蔗糖混合，所述蔗糖并非纯糖形式，而是粗制甘蔗糖。粗制甘蔗糖在液体培养基中的起始量相当于纯蔗糖40-200g/L。加入培养基的蔗糖必需是粗制甘蔗糖而非甜菜糖。但对粗制甘蔗糖的这一限制原因不明，假定，来自甘蔗或甜菜的粗制糖除了糖以外总是含有相当量的杂质，粗制糖杂质的种类在粗制甘蔗糖和粗制甜菜糖中不同，粗制甘蔗糖中所含杂质，包括某些金属元素如镁、锌和钴以及其它不明痕量元素对于促进蘑菇属真菌的生长特别有效。
另一特征是，使本发明所用液体培养基与不溶于水的支持生长的物质混合，所述支持生长的物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、和麸皮以及粉碎的松树组织，包括木质部分、树叶和果实，所述支持生长的物质的量为0.2-15g干物质/L。加入培养基中的这种支持生长的物质应为能通过100目(mesh)，或优选200目(在Tyler标准中)筛孔的精细颗粒。这些支持生长的物质颗粒可作为真菌团聚体更稳定生长的核心。
本发明人当然已进行了广泛筛选试验，以排除来自各种植物的其它支持生长的物质，包括细颗粒形式的玉米(Indian corn)的茎和叶、米糠、大麦谷粒及桑椹的叶子和其它部分，结论是，所述支持生长效应和稳定效应特异性针对粉碎的甘蔗、甘蔗渣、麸皮以及松树组织。
当在上述液体培养基中实施本发明培养担子菌纲真菌如蘑菇属真菌的方法时，第一步是在含有上述各种成分的液体培养基中接种真菌菌体，优选接种真菌的菌丝体。
导致本发明的最意外的发现是，通过向上述液体培养基中加压吹入富含氧的空气，致使溶解氧浓度为至少7mg O2/L液体培养基，从而在富氧条件下实施本发明的培养方法，可大大促进蘑菇属真菌的生长并获得稳定性。为了实现溶解氧的这一浓度，吹进液体培养基中的富氧空气含有至少30％体积的氧气，或优选30-90％体积的氧气，且富氧空气被加以0.12-0.5MPa(绝对值)的压力。富氧空气的吹气速率当然比较重要，应至少0.01L/min/L液体培养基。吹气速率没有特定的上限，但考虑到由生物反应器的出气管排出的薄雾逐渐消散，吹气速率优选为0.01-1.0L/min/L液体培养基。显然，吹入液体培养基中的富氧空气必须是无菌的，例如使其通过适当滤膜以使该液体培养基被各种(可能抑制所需担子菌纲真菌稳定生长的)微生物污染的危险性减至最小。
为了获得最佳培养效果，培养蘑菇属真菌的温度当然十分重要。担子菌纲真菌的培养温度通常应为20-30℃，应在该范围内针对具体真菌物种选择最佳培养温度。当温度太低或太高时，真菌的生长速率降低，这是不利的当满足以上各种因素的要求时，在分批方法中培养蘑菇属真菌可在两至三天内完成。
这里应注意，真菌快速生长的结果是，真菌菌体对碳源营养的同化作用产生大量二氧化碳气体。除非气相中二氧化碳被充分除去，真菌菌体的生长会由于液体培养基的pH值降低而被抑制，所述pH值有时降至3.5或更低，这种pH值的降低是真菌菌丝体的酸性外分泌造成的，其伴有由于液体培养基上层气相中氧分压的降低所致的溶解氧浓度的降低。
以下通过参照附图举例说明本发明的培养方法以及用于该方法的生物反应器。
图1是一种生物反应器系统，其包括一个由可承受压力的柱体1构成的培养容器，在该容器1的下部有带分流器5A的进气管5，出气管6与该容器1的上部相连，带有浆叶的搅拌器7由顶部的发动机M驱动从而温和搅拌液体培养基2。富氧空气被压缩机3加压通过进气管5吹进液体培养基2，其间在压力控制器8所调节的特定压力下通过除菌滤膜4除菌。容器1中液体培养基2上层的气相压力通过一个恒压阀在与出气管6相连的排气压力调节器6A的控制下进行调控。任选使一部分排出的空气回流到进气管道，从而与输入的新鲜空气混合。
图2是另一种实施本发明方法的生物反应器系统，该系统配备有二氧化碳浓度控制器9，通过送风机12驱散过量二氧化碳，还有一个氧气调节器10与氧浓度控制器11相连。容器1中液体培养基2上层通过排气管6排出的富氧空气又通过送风机12循环至进气管5，并在控制器9中除去部分二氧化碳气体。
图3是又一种实施本发明方法的生物反应器系统。当在培养基2中接种担子菌纲真菌菌丝体时，有时会出现以下情况，即由于吹入富氧空气导致产生培养基2的薄雾，其含有所培养的真菌的菌丝体，这些薄雾可随空气的排出而排出，导致菌丝体沉积在该系统的各个部位，包括除菌滤膜4，排气阀，管道内壁等，使这些部位被阻塞，从而中断培养。为避免这种情况，给生物反应起系统配备一个湿旋流器13，分隔在旋流器13中并沉积的菌丝体用送入其中的液体洗脱至该旋流器13的锥部。含有如此洗下的菌丝体的洗脱液被排到旋流器13的底部，由与之相连的接收池14接收，液体从这里通过泵P1以压力控制器16所控制的压力被送回到反应容器1。通过仔细设计和操作，可将担子菌纲真菌的培养过程不间断的持续四天或甚至更长的时间。
图4是适于本发明的连续方法的生物反应器系统，其中真菌培养产生的二氧化碳气体通过运行二氧化碳吸收器18而除去。所含二氧化碳浓度已降低的那些空气经由一个二氧化碳浓缩控制器9回到培养系统。进气管5周围绕着套管19，该套管能使其内部的培养基向上流动，从而在缺乏机械搅拌装置如搅拌器的情况下提高真菌团聚体的生长速率。在经由管道23添加营养成分的制备池22中所制备的液体培养基2经显微滤膜或超滤膜20、21循环后除去悬浮的真菌菌丝体。
下文借用实施例详述本发明的方法，其中以蘑菇属真菌作为担子菌纲真菌的一个代表物种。
实施例1
在容积为1升的耐压柱状不锈钢生物反应器容器中装载1升液体培养基，每升该液体培养基中含60g纯蔗糖、10g硝酸铵、5g磷酸钠、2.5g水合硫酸镁MgSO4·7H2O、5g磷酸氢二钾K2HPO4和0.2g水合硫酸亚铁FeSO4·7H2O。
在如此制备的液体培养基中接种相当于3mg蘑菇属真菌菌丝体干重的、污染了放线菌的真菌，于25℃温和搅拌3天以获得相当于25g真菌颗粒干重的产物。
从如此获得的大量颗粒中挑出两个无真实细菌可观察到之固有着色的真菌颗粒，在干净的长形工作台上粉碎。将1升另一种液体培养基与该粉碎的真菌颗粒一起接种，分批培养，其中所述另一种液体培养基在每升中含有60g粗制甘蔗糖(其相当于58g蔗糖)、10g粉碎的甘蔗干粉(其颗粒细度能通过200目的筛孔)、12g硝酸铵、4g磷酸钠、2.5g水合硫酸镁、0.2g水合硫酸亚铁和5g磷酸氢二钾(溶于或分散于每升该液体培养基中)。在相同条件下将该分批过程重复一次后，将真菌菌丝体在常规营养琼脂培养基中培养以获得不含杂质的真菌菌体颗粒。
类似的无污染蘑菇属颗粒可通过在相同的液体培养基中接种污染了放线菌但已用刀刮去被放线菌污染的着色部分的原始颗粒而获得。
实施例2
在与图3所示旋流器相连的1升容积的耐压不锈钢生物反应器容器中装载1升第一种液体培养基，即培养基A，其在每升中含有60g纯蔗糖、10g硝酸铵、5g磷酸钠、2.5g水合硫酸镁、0.2g水合硫酸亚铁和7g磷酸氢二钾(溶于其中)。
在另一个1升容积的耐压不锈钢生物反应器容器中装载1升第二种培养基，即培养基B，其在每升中含有50g粗制甘蔗糖、15g甘蔗渣干粉(其颗粒细度能通过200目的筛孔)、12g硝酸铵、4g磷酸钠、2.5g水合硫酸镁、0.2g水合硫酸亚铁和6g磷酸氢二钾(溶于或分散于每升该液体培养基中)。
分别在培养基A和B中接种实施例1所得无污染的蘑菇属真菌颗粒，于25℃温和搅拌培养，并以0.8L/min的速度向培养基中吹进含30-35％体积之氧气的富氧空气。将吹进液体培养基的富氧空气的压力控制在：最初24小时将向上流的压力保持在0.12-0.15MPa(绝对值)，在第2-4天保持在0.15-0.30MPa(绝对值)，而向下流的压力始终保持在0.10-0.13MPa(绝对值)。
在液体培养基(A)和(B)中培养5天后所得真菌团聚体(干物质)的量分别示于图5的曲线A和B。图5中曲线A显示未用搅拌器驱动搅拌的液体培养基(A)中所得结果。图5中曲线C显示在与液体培养基(A)基本相同、但以等量葡萄糖取代蔗糖的常规液体培养基中培养所得的结果。
实施例3
用液体培养基(B)重复实施例2中蘑菇属真菌的培养过程。培养24小时后，该液体表面覆盖了大量泡沫，将它们撇出并保留。用新鲜的液体培养基(B)以实施例2的相同方式进行另一轮蘑菇属真菌培养，培养3小时后，液体培养基与储备(reserve)在上层占该液体培养基10％体积的泡沫混合，以继续再培养多达5天。
该轮培养所得结果与图5中曲线B所示基本相同，表明泡沫可抑制真细菌和真菌的抗微生物活性。
实施例4
以如实施例1所述的相同方式，在配备有图3所示旋流器的生物反应器或不含旋流器的相同生物反应器中实施蘑菇属真菌的相同培养过程4天。分析以被所排出空气携带的方式由生物反应器流出的液体中，伴随薄雾而出的蘑菇属菌丝体的含量，得到图6中实线所示的结果，图中虚线分别指加或不加旋流器的培养所得结果。如该图所示，薄雾中蘑菇属菌丝体的含量当配备有旋流器时一直未超过0.1g干重/L液体，而未配备旋流器时，菌丝体含量达到0.4g干重/L液体。

Claims (9)

1.一种在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其包括以下步骤：
(a)在含有能提供氮、磷酸和钾的无机营养盐的液体培养基中接种真菌菌体；
(b)将该液体培养基与粗制甘蔗糖混合，所述甘蔗糖的量相当于每升液体培养基50-70g纯蔗糖；
(c)将该液体培养基与不溶于水的支持生长的物质混合，所述支持生长的物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、松树组织和麸皮，其量为每升液体培养基0.2-15g干重；
(d)使该液体培养基在20-30℃一直搅拌；
(e)在0.12-0.5MPa的压力下，以至少0.01升/min/升液体培养基的速率，向该液体培养基中通以富含氧的空气，该富氧空气中至少30％的体积为氧气。
2.权利要求1的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其中在步骤(c)中加入液体培养基的不溶于水的支持生长之物质为颗粒大小能通过100目筛孔的粉末形式。
3.权利要求2的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其中在步骤(c)中加入液体培养基的不溶于水的支持生长之物质为颗粒大小能通过200目筛孔的粉末形式。
4.权利要求1的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其中步骤(e)中吹进液体培养基的富氧空气含有30-90％体积的氧气。
5.权利要求1的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其中步骤(e)中向液体培养基吹进富氧空气的速率为0.01-1.0升/min/升液体培养基。
6.权利要求1的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其进一步包括以下步骤：
(f)控制液体培养基上层气相中二氧化碳的浓度。
7.一种在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的生物反应器，其包含：
(A)一个可承受压力的容器，其用于容纳液体培养基；
(B)一个进气管，其能以0.12-0.5MPa的超大气压力将富含氧的空气吹入液体培养基；
(C)一个出气管，其具有将可承受压力之容器内的压力调节在0.12-0.5MPa范围内的装置；和
(D)一种装置，其能对所述可承受压力之容器内容纳的液体培养基进行搅拌。
8.权利要求7的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的生物反应器，其进一步包括：
(E)一种装置，其能对所述可承受压力之容器内容纳的液体培养基上层气相中二氧化碳的浓度进行调节。
9.权利要求7的在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的生物反应器，其进一步包括：
(F)一种与出气管相连的旋流器，其用于除去排出富氧空气时所带出的薄雾。
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