CN115011531A

CN115011531A - 一种解淀粉芽孢杆菌ba-1，溶胞产物及其制备方法，在化妆品中的应用和面霜

Info

Publication number: CN115011531A
Application number: CN202210867095.1A
Authority: CN
Inventors: 李萌; 张永涛; 王昌涛; 赵净沙; 王冬冬; 赵丹; 张佳婵
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2022-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-07-21
Also published as: CN115011531B

Abstract

本申请涉及日用化妆品领域，具体公开了一种解淀粉芽孢杆菌BA‑1，溶胞产物及其制备方法，在化妆品中的应用和面霜。所述解淀粉芽孢杆菌BA‑1分离自黄酒曲中，2021年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23132。利用解淀粉芽孢杆菌BA‑1制备溶胞产物，所述溶胞产物安全性高，能够提高体内多种抗氧化物和抗氧化物酶的数量，可以分别降低活性氧和过氧化物的数量，降低细胞氧化应激损伤的可能性，能够对细胞进行有效地保护，延缓细胞的凋亡和衰老。将溶胞产物用于化妆品中，对人体皮肤无刺激性，具有补水滋养、修复屏障和紧致肌肤等效果。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌BA-1，溶胞产物及其制备方法，在化妆品中的应用和面霜

技术领域

本申请涉及日用化妆品领域，更具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌BA-1，溶胞产物及其制备方法，在化妆品中的应用和面霜。

背景技术

皮肤衰老是人们持续关注的问题，除自然衰老外，外界的刺激会引起皮肤产生氧化应激，加快皮肤的衰老，如长波紫外线UVA的照射是导致皮肤衰老的一个关键因素。经过长波紫外线UVA的照射后会导致皮肤变黑、皱纹增多、弹性下降等诸多问题。在人体中，Nrf2/Keap1和TGF-β/samds是分别调控抗氧化应酶和胶原蛋白相关基因转录表达的信号通路。因此，通过调控Nrf2/Keap1和TGF-β/smads信号通路的传导是缓解皮肤衰老的重要途径。

在延缓皮肤衰老问题上，主要利用的是植物资源中的提取物。近年来，有益菌的代谢活性分子引起了人们的关注，如抗菌肽、抗氧化肽、抗氧化酶和多糖类等。有益菌的代谢活性分子具有一定的延缓皮肤衰老的作用，而微生物活性物质的开发利用相比于植物资源的利用具有更好的应用前景和更低的成本。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，其内富含活性物质，对人畜无毒无害。在解淀粉芽孢杆菌生长过程中，能够代谢生成多种抗菌素和抗氧化酶，具有广泛地抑菌活性，并在一定程度上抑制病原体生物膜的生成。解淀粉芽孢杆菌在农业、畜牧业以及日用工业中的应用较广，但是，在化妆品方面的研究应用中未有涉及。

发明内容

为了提高皮肤抵抗紫外线引起的氧化应激的能力，本申请提供了一种解淀粉芽孢杆菌BA-1，溶胞产物及其制备方法，在化妆品中的应用和面霜。

第一方面，本申请提供了一种解淀粉芽孢杆菌BA-1，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)分离自黄酒曲中，2021年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.23132。

本申请中，解淀粉芽孢杆菌BA-1的分离培养方法包括以下步骤：

(1)取5g黄酒曲接种于100mL YPD培养基中，于24-37℃下培养24-48h，制得菌悬液；

(2)将上述菌悬液置于80℃水浴中加热20-30min，以杀死不能形成芽孢的菌体；

(3)将加热处理过的菌悬液稀释10^-5-10^-7，每个稀释梯度的菌悬液取200μL加入固体培养基，倒置于50-60℃培养箱培养24-48h；

(4)挑取形态规则的菌落，在固体培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落。

菌种的形态学鉴定：解淀粉芽孢杆菌BA-1在平板上的菌落为圆形，白色，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明。

优选地，YPD培养基包括葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L和酵母浸粉10g/L。

优选地，固体培养基包括葡萄糖10.0g/L、磷酸钙5.0g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钾0.2g/L、七水硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.0001g/L、硫酸亚铁0.0001g/L、酵母提取物0.5g/L和琼脂20.0g/L，pH值7.0±0.2，120℃灭菌30min。

第二方面，本申请提供了一种溶胞产物的制备方法，包括以下步骤，

(1)菌种活化：将本申请所述解淀粉芽孢杆菌BA-1进行活化，制得活化菌种；

(2)菌种纯化：将所述活化菌种梯度稀释铺板，获得单菌落菌种；

(3)菌种扩培：将所述单菌落菌种接种在液体培养基中，培养至OD值为(0.5-1.0)，获得种子液；

(4)接菌和摇菌：将所述种子液接种于液体培养基中发酵，获得发酵液；

(5)离心：将所述发酵液进行离心处理，获得菌泥；

(6)破碎：将所述菌泥加入无菌水配制成菌液，利用细胞超声破碎仪进行破碎，将破碎后的菌液加热，离心后收集上清液，即得溶胞产物。

在本申请中，首先从保藏的解淀粉芽孢杆菌BA-1菌株斜面中挑取菌落，将菌落置于装有液体培养基的器皿中，放入摇床中(180rpm)将菌种活化，使保持更高的生活力；再将活化后的菌种进行纯化，目的是获得单菌落菌种；将单菌落菌种接种于装有液体培养基的器皿中，在摇床中进行扩增培养，培养至OD值为(0.5-1.0)，可以制得种子液；按照5％(体积百分比)的接种量，将种子液接种于装有液体培养基的三角瓶中，在摇床中进行发酵，转速为180r/min，发酵24-48h后获得发酵液；将发酵液进行离心处理，目的是将液体与固体进行分离，在4800r/min离心10min，收集菌泥；再向菌泥中加入无菌水配制成菌液，利用细胞超声破碎仪对菌液破碎；最后，将破碎后的菌液于80℃水浴中加热30min，4900rpm离心10min后收集上清液，即为溶胞产物。

在一个实施方案中，所述液体培养基包括葡萄糖10.0g/L、磷酸钙5.0g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钾0.2g/L、七水硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.0001g/L、硫酸亚铁0.0001g/L和酵母提取物0.5g/L，pH值7.0±0.2，120℃灭菌30分钟。

在一个实施方案中，可将液体培养基更换为LB培养基。

在一个实施方案中，溶胞产物的制备过程中，所述菌种活化、所述菌种纯化、所述菌种扩培和所述发酵的温度均为28℃。

第三方面，本申请提供了一种胞产物，通过本申请所述溶胞产物的制备方法制备获得。

在一个实施方案中，所述溶胞产物的浓度为0.31-5％。

在本申请中，所述溶胞产物毒性低，基本无毒副作用，随着溶胞产物的浓度逐渐变大，人皮肤成纤维细胞的存活率呈下降趋势。当溶胞产物的浓度为5.00％时，人皮肤成纤维细胞的存活率为95％。

经过UVA照射后，溶胞产物对人皮肤成纤维细胞具有一定的保护效果，随着溶胞产物的浓度逐渐增大，人皮肤成纤维细胞的存活率逐渐升高。但是，溶胞产物的浓度为1.25％-5.00％时，人皮肤成纤维细胞的存活率基本保持不变，具有同等的保护作用。

在一个实施方案中，所述溶胞产物的浓度为0.31-2.5％。

在人体中，活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激。细胞氧化应激损伤会致使细胞结构和功能发生变化，会加快细胞的凋亡和衰老。此外，过氧化物也同样会导致细胞氧化应激损伤。然而机体中存在多种抗氧化物和抗氧化物酶等，可以清除体内产生的各种活性氧和过氧化物，以阻止活性氧和过氧化物诱导的氧化应激(Oxidative Stress)的产生。

本申请中的溶胞产物能够提高体内多种抗氧化物和抗氧化物酶的数量，可以分别降低活性氧和过氧化物的数量，进而对细胞进行保护。

第四方面，所述溶胞产物在化妆品中的应用。

本申请可以将溶胞产物用于化妆品中，无刺激性且溶血率低，能够提高皮肤抵抗紫外线引起的氧化应激的能力。

第五方面，本申请提供了一种面霜，包括本申请所述的溶胞产物。

将本申请所制得的溶胞产物用于面霜中，所述面霜具有较高的稳定性，且无刺激性。在整体改善、舒缓、补水滋养、修复屏障和紧致肌肤等方面，利用溶胞产物制得的面霜具有持续性的提升。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请采用解淀粉芽孢杆菌BA-1制备溶胞产物，所述溶胞产物毒性低，且对人皮肤成纤维细胞具有一定的保护效果，经过UVA的照射后，使人皮肤成纤维细胞的存活率保持较高水平；

2、本申请中所述溶胞产物能够提高体内多种抗氧化物和抗氧化物酶的数量，可以分别降低活性氧和过氧化物的数量，降低细胞氧化应激损伤的可能性，减缓细胞的凋亡和衰老；3、将所述溶胞产物用于化妆品中，制备成面霜，在整体改善、舒缓、补水滋养、修复屏障和紧致肌肤等方面，面霜具有持续性的提升。

附图说明

图1为溶胞产物对人皮肤成纤维细胞毒性的结果示意图；

图2为溶胞产物对人皮肤成纤维细胞紫外损伤保护作用的结果示意图；

图3、图4为溶胞产物对人皮肤成纤维细胞内活性氧(ROS)影响的结果示意图；

图5为溶胞产物的总抗氧化能力的结果示意图；

图6、图7为溶胞产物分别对超氧化物歧化酶(SOD)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图8、图9为溶胞产物分别对过氧化氢酶(CAT)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图10、图11为溶胞产物分别对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图12、图13为溶胞产物分别对NF-E2相关因子Nrf2的核易位和mRNA表达水平的影响结果示意图；

图14、图15为溶胞产物分别对Kelch Like ECh相关蛋白1(Keap1)含量和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图16、图17为溶胞产物分别对Nrf2/Keap1通路下游抗氧化酶HO-1酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图18、图19为溶胞产物分别对Nrf2/Keap1通路下游抗氧化酶NQO1酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图20、图21为溶胞产物分别对Nrf2/Keap1通路下游抗氧化酶GCLC酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图22、图23为溶胞产物对MMP-1酶活性和mRNA表达水平影响的结果示意图；

图24、图25为溶胞产物分别对I型胶原蛋白(COL-1)含量和mRNA表达水平影响的结果示意图。

图26为溶胞产物分别对生长因子TGF-β/smads信号通路影响的结果示意图；

图27为胞外蛋白的鸡胚尿囊膜刺激性的结果示意图；

图28、图29为胞外蛋白对红细胞溶血实验的溶血曲线和溶血结果示意图；

图30为制得面霜的稳定性评价结果示意图；

图31为制得面霜使用后感官评价结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图1-31和实施例对本申请作进一步详细说明。

原料

本申请中所用原料及设备均可通过市售方式获得，如表1所示。

表1原料来源

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株BA-1的分离制备

解淀粉芽孢杆菌的分离培养方法包括以下步骤：

(1)称取5g黄酒曲接种于100mL YPD培养基中，于37℃下培养24h，得菌悬液；

(2)将所述菌悬液置于80℃水浴中加热20分钟，以杀死不能形成芽孢的菌体；

(3)将加热处理的菌悬液稀释处理，菌悬液稀释10^-5，取稀释后的菌悬液200L置于培养皿中，然后再加入15mL的固体培养基，倒置于55℃培养箱培养36h；

(4)挑取培养皿内形态规则的菌落，在固体培养基上划线培养，进行多次反复的分离纯化，获得单个纯种菌落；解淀粉芽孢杆菌BA-1在平板上的菌落为圆形，白色，表面光滑湿润，边缘整齐，不透明。

其中YPD培养基包括葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L；

其中固体培养基包括葡萄糖10.0g/L、磷酸钙5.0g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钾0.2g/L、七水硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.0001g/L、硫酸亚铁0.0001g/L、酵母提取物0.5g/L和琼脂20.0g/L，pH值为7.0±0.2，120℃灭菌30分钟。

实施例

实施例1

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA-1溶胞产物的制备，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将保藏的解淀粉芽孢杆菌BA-1斜面中挑取菌落，置于250mL的锥形瓶中，再加入20mL的液体培养基，放入摇床中180r/min，将菌种活化，制得活化菌种；

(3)菌种扩培：将所述单菌落菌种接种在液体培养基中，在28℃温度的摇床中培养至OD值为0.8，获得种子液；

(4)接菌和摇菌：按照体积百分比5％的接种量，将5mL的种子液接种于250mL三角瓶中，再加入100mL的液体培养基，在摇床中发酵，转速为180r/min，培养温度为28℃，发酵时间为32h，获得发酵液；

(5)离心：将所述发酵液进行离心处理，在4800r/min下，离心10min，获得菌泥；

(6)破碎：向菌泥中加入20mL无菌水配制成菌液，利用细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号为JY92-IIN)进行破碎20分钟，功率20％，破碎15s、间歇10s。将破碎后的菌液在80℃的水浴中加热30分钟，4900rpm离心10min后收集上清液，即得溶胞产物；

其中液体培养基为葡萄糖10.0g/L、磷酸钙5.0g/L、硫酸铵0.5g/L、氯化钾0.2g/L、七水硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.0001g/L、硫酸亚铁0.0001g/L和酵母提取物0.5g/L，pH值7.0±0.2，120℃灭菌30分钟；

利用DMEM基础培养基对溶胞产物进行倍比稀释，使溶胞产物得浓度为0.31％。

实施例2-5与实施例1的区别如表2所示。

表2实施例2-5与实施例1的区别

组别	浓度
		实施例1	0.31％
实施例2	0.63％
		实施例3	1.25％
实施例4	2.50％
		实施例5	5.00％

性能检测试验

一、解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对成纤维细胞的影响

1、毒性测试

将人皮肤成纤维细胞置于培养瓶中，再加入含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的DMEM培养液，在含5％CO₂的37℃的HeraCell CO₂孵箱中培养2天。毒性测试的加样要求和操作步骤如表3所示，实验在96孔板中进行。检测结果如图1所示。

表3实验加液操作要求

*表3中“-”表示添加量为0μL。

成纤维细胞存活率计算公式(1)如下：

As为实验组的吸光度值；

Ac为对照组的吸光度值；

Ab为空白组的吸光度值。

参照图1，从图中可以看出，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物浓度在0.31％-5.00％时，毒性较低，基本无毒副作用，随着溶胞产物的浓度逐渐变大，人皮肤成纤维细胞的存活率呈下降趋势，溶胞产物的浓度为5.00％时，人皮肤成纤维细胞的存活率为95％。

2、解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对成纤维细胞的保护作用实验

保护作用实验的操作步骤与毒性测试操作步骤基本相同，保护作用实验与毒性测试不同在于毒性测试的第5步骤，保护作用的第5步骤为：培养6h后，在UVA灯下受16J/cm²的UVA总能量诱导；培养箱培养24h，弃去培养基并用PBS洗涤两次。利用公式(1)计算人皮肤成纤维细胞的存活率，具体检测结果如图2所示。

参照图2，从图中可以看出，随着溶胞产物浓度的逐渐增加，人皮肤成纤维细胞的存活率逐渐升高。说明溶胞产物对人皮肤成纤维细胞具有保护能力且逐渐增强。当溶胞产物的浓度为1.25％-5.00％时，人皮肤成纤维细胞的存活率基本保持不变，说明溶胞产物的浓度为1.25％-5.00％，具有同等的保护作用。因此，结合溶胞产物对人皮肤成纤维细胞的保护能力实验结果和毒性实验结果，选取溶胞产物的浓度为0.31％、0.63％和1.25％三个浓度做后续的实验探究。

二、解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对细胞内活性氧含量的影响

活性氧(ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子也可以诱导活性氧的产生，例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激。细胞氧化应激损伤会致使细胞结构和功能发生变化，会加快细胞的凋亡和衰老。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。因此，可以通过细胞内DCF的荧光强度来检测胞外蛋白对清除细胞内活性氧能力的大小。具体实验操作步骤如表4所示，检测结果如图3和图4所示。

表4实验加液及操作要求

*表4中“-”表示添加量为0mL，“/”表示不进行UVA照射。

*表4中VC与溶胞产物均由DMEM溶解/稀释。

参照图3和图4，图中空白组不进行UVA的照射，UVA为模型组的实验结果。从图中可以看出，随着解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的浓度逐渐升高，有荧光的DCF含量逐渐下降，说明去除活性氧的能力逐渐提高。当解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的浓度为0.63％-1.25％时，具有较强的防止活性氧产生的作用。

三、解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的总抗氧化能力

机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(Oxidative Stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS·+，在抗氧化物存在时ABTS·+的产生会被抑制，在414nm或734nm测定ABTS·+的吸光度即可测定并计算出总抗氧化能力。利用总抗氧化能力试剂盒检测解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的总抗氧化能力。人皮肤成纤维细胞裂解液制备的操作步骤如表5所示。

表5细胞裂解液制备

*表5中“-”表示添加量为0mL，“/”表示不进行UVA照射。

*表5中VC与溶胞产物均由DMEM溶解/稀释。

按总抗氧化能力试剂盒(ABTS法)说明要求将ABTS工作液配好避光反应12h，用PBS将ABTS工作液稀释至OD₇₃₄＝0.7±0.05。在96孔板中，将表5中得到的四组细胞裂解液分别加10μL，并每孔加200μL的ABTS工作液，避光反应4min，测定实验组、阳性对照组、空白组和模型组细胞的总抗氧化能力。具体检测结果如图5所示。

参照图5，从图中可以看出，解淀粉芽孢溶胞产物作用于人皮肤成纤维细胞后，人皮肤成纤维细胞的总抗氧化能力表现较强。解淀粉芽孢溶胞产物的浓度为0.31％-1.25％范围内，解淀粉芽孢溶胞产物为0.63％时，总抗氧化能力最低，在解淀粉芽孢溶胞产物为1.25％时，总抗氧化能力最高。

四、溶胞产物对细胞内酶活性及蛋白含量的影响

细胞内的抗氧化物酶是细胞中消除过氧化物的重要防线，保护细胞免受氧化应激的损伤。抗氧化物酶主要包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶。除此之外，Nrf2/Keap1信号通路是抗氧化的调控通路，HO-1即该通路的下游调控因子，也是抗氧化物酶的重要成员。因此，测定细胞内抗氧化物酶的酶活性和Nrf2/Keap1通路中重要因子含量及其基因表达水平对评估抗氧化能力有重要的意义。

细胞外基质(ECM)中的胶原蛋白的减少是皮肤衰老的重要体现，在紫外线或其他环境刺激下，细胞内上调的基质金属蛋白酶(MMPs)会降解ECM，其中基质金属蛋白酶1(MMP-1)主要降解I型胶原蛋白(COL-I)，细胞分泌的胶原蛋白的含量和基质金属蛋白酶的酶活性大小，及其基因表达水平的高低是评估抗衰老性能的重要指标。

实验操作步骤：在总抗氧化能力实验中所制备的裂解的细胞液上进行，按照超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)检测酶活性，HO-1、NQO1、GCLC、MMP-1、Nrf2、Keap1、COL-I的ELISA试剂盒检测蛋白含量。具体检测结果如图6-25所示，图中“空白”表示空白组的实验结果，未进行UVA的照射；“UVA”表示模型组的实验结果；“VC”表示阳性对照组的实验结果；“0.31％-1.25％”表示实验组的实验结果。

参照图6、图7，从图中可以看出，人皮肤成纤维细胞在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的保护作用下，人皮肤成纤维细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)酶活性以及mRNA的表达量明显比模型组要高。说明解淀粉芽孢杆菌溶胞产物可以提高细胞内抗氧化酶，从而增强了细胞抗氧化能力。

参照图8、图9，从图中可以看出，人皮肤成纤维细胞在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的保护作用下，人皮肤成纤维细胞内的过氧化氢酶(CAT)酶活性以及mRNA的表达量明显比模型组要高，尤其在溶胞产物浓度为1.25％时，对过氧化氢酶的作用接近于阳性对照组VC。说明解淀粉芽孢杆菌溶胞产物可以提高细胞内抗氧化酶，从而增强了细胞抗氧化能力。

参照图10、图11，从图中可以看出，人皮肤成纤维细胞在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的保护作用下，人皮肤成纤维细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)酶活性相对于模型组较高，而对GSH-px的mRNA表达量明显比模型组要高。说明解淀粉芽孢杆菌溶胞产物可以提高细胞内抗氧化酶，从而增强了细胞抗氧化能力。

参照图12、图13，从图中可以看出，人皮肤成纤维细胞在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的保护作用下，人皮肤成纤维细胞质内Nrf2的核易位明显变强，以及Nrf2的mRNA表达量显著提高。说明解淀粉芽孢杆菌溶胞产物主要通过促进细胞内Nrf2发生核位移来促进抗氧化酶基因的转录表达。

参照图14、图15，从图中可以看出，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对下调Keap1蛋白含量的作用不明显，但对Keap1的mRNA表达量具有显著的下调作用，尤其在0.31％处相对表达量为0.987。说明Nrf2的核位移增加主要由于上游阻断因子Keap1含量的降低和mRNA的减少。

参照图16、图17，从图中可以看出，人皮肤成纤维细胞在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的作用下，HO-1含量和mRNA表达水平显著提高。进一步验证了Nrf2核位移比率增加从而促进了下游抗氧化酶的基因表达。

参照图18、图19，从图中可以看出，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物在0.31％和0.63％处对NQO1含量的影响不大，在1.25％处对酶活性的提高具有较高的作用，而解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对NQO1的mRNA表达量具有显著的提升作用，相对表达量达到2.0以上。进一步验证了Nrf2核位移比率增加从而促进了下游抗氧化酶的基因表达。

参照图20、图21，从图中可以看出，在UVA诱导下GCLC的含量和mRNA表达量显著下降，而GCLC的表达下调可引起细胞GSH合成减少，活性氧自由基产生增多，从而导致细胞氧化损伤的发生。在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的作用下，GCLC的含量和mRNA表达量有了显著地提升。这说明对保护细胞免受UVA引起的氧化损伤具有很好的保护作用。进一步验证了Nrf2核位移比率增加从而促进了下游抗氧化酶的基因表达。

参照图22、图23，从图中可以看出，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物在0.63％和1.25％时对MMP-1的影响较显著，有效地减少了MMP-1的mRNA表达从而降低了MMP-1的含量。MMP-1的减少，一定程度上有效的避免了细胞外基质的降解。

参照图24、图25，从图中可以看出，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对细胞内I型前胶原蛋白的含量和mRNA表达水平促进作用较为显著。在UVA促进细胞外基质降解的情况下，COL-I的表达一定程度上减缓了该情况，而COL-I的表达促进，主要有图26中所示的TGF-β/Smad通路传导因子的表达水平增加有关，TGF-β/Smad通路的传导促进了COL-I的mRNA表达。

五、溶胞产物对细胞内蛋白表达水平的影响

(1)RNA的提取：

实验步骤：取表4步骤8续孵育18h，弃去培养基并用PBS洗涤两次，获得细胞，使用Trizol试剂(北京索莱宝科技有限公司)裂解完细胞2min后加入0.2mL氯仿，手摇振荡2min；4℃条件下8000r/min离心15min；取上层水相，加入等体积异丙醇(约700μL)，振荡，静置15min；于12000r/min离心10min，去上清，向沉淀中加入l mL 70％乙醇洗涤，于8000r/min离心10min；重复一次乙醇洗涤；室温干燥15min；加入40μL DEPC处理的ddH₂O，溶10min(-80℃冷藏备用)。

(2)cDNA合成：

使用第一链cDNA合成试剂盒(含双链DNA酶)进行cDNA第一链合成反应，向cDNA中加入1000μL ddH₂O，稀释并混合，并在-20℃下保存。并利用Fast Super

qPCRMaster Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。

(3)引物的设计：

根据NCBI发布的序列基因，用PrimerExpress软件设计特异性引物，同时设计管家基因β-actin的特异性引物。具体检测结果如图26所示。

参照图26，从图中可以看出，人皮肤成纤维细胞在解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的保护作用下，细胞内TGF-β、smad2、smad3和smad4的mRNA表达水平极其显著地提升，相应的smad7的mRNA相对表达量极其显著地下降。说明解淀粉芽孢杆菌溶胞产物对胶原蛋白的产生具有较好的促进作用。

综上所述，通过实验一至五的实验结果证明，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物具有较强的抗氧化能力和保护细胞免受氧化应激损伤的作用，且制备条件温和，安全性高。

六、解淀粉芽孢杆菌溶胞产物的安全性评价

1、鸡胚绒毛尿囊膜实验(HET-CAM)

鸡胚绒毛尿囊膜实验(HET-CAM)是一种经典的眼刺激性体外评估方法，适用于对化妆品产品或原料的评价。本申请利用孵化中期的绒毛尿囊膜(CAM)血管膜系统完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与CAM接触，作用一段时间之后通过观察绒毛尿囊膜毒性效应指标(如：出血、凝血和血管融解)的变化，综合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。这些指标反映了血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度。

采用终点评价法进行实验，根据鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度，应计算终点评分(ES)。每组受试物均做六组平行实验，并将各血管反应分值相加，以总分值最高的血管反应得分作为最终分值，以该组中评分最高的值作为反应ES值。根据ES数值按表6对受试物眼刺激性进行分类。

表6HET-CAM终点评估法的眼刺激性预测模型

评分范围	刺激性分类
		<6	无刺激性
6≤S<12	轻度刺激性
		12≤S<15	中度刺激性
≥15	重度刺激性

本申请中受试物包括：阴性对照(0.9％氯化钠)、阳性对照(0.1mol/L氢氧化钠)和解淀粉芽孢杆菌溶胞产物(浓度为5％)。对阴性对照、阳性对照和解淀粉芽孢杆菌溶胞产物加样前后的CAM进行形态学观察和打分，评分记录如表7所示，其中编号1、2、3、4、5、6分别为受试物的平行实验组。根据评分可知解淀粉芽孢杆菌溶胞产物无眼刺激性。鸡胚绒毛尿囊膜实验结果见图27。

表7鸡胚尿囊膜实验评分记录

参照图27，从图中可见解淀粉芽孢杆菌溶胞产物(浓度为5％)作用CAM后无出血现象，可知解淀粉芽孢杆菌溶胞产物无眼刺激性。

2、红细胞溶血实验

红细胞溶血实验(Red blood cell test，RBC)，是兔眼刺激实验(Draize test)的替代方法之一。红细胞被认为是研究生物膜效应最好的生物来源，操作性强且同质性好。RBC实验的基本原理是：通过检测红细胞中血红蛋白的漏出量及蛋白质的变性程度来评价化学品对眼组织的刺激性。国际上也广泛地将RBC实验用于化妆品产品及原料等化学品的眼刺激性研究。

具体步骤如下：

(1)RBC的前处理

血液的获取和运输：

屠宰场取新鲜兔血盛装于聚乙烯塑料容器中，加入抗凝剂柠檬酸缓冲液混匀，抗凝剂柠檬酸缓冲液与新鲜兔血的体积比为1:9。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21-22℃。30分钟内运于实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1h。

RBC的分离：

1)分装稀释：收集新鲜血液(已用柠檬酸抗凝剂处理)用PBS溶液稀释，血液与PBS的体积比为4:10，制得稀释液；

2)离心去杂：在室温下，用1500×g离心上述稀释液10min，吸掉离心后的上清液和淡黄色的白细胞层，然后添加PBS重复上述洗涤离心步骤2-3次(第2次离心时打开酶标仪预热15min)；

3)RBC悬液配制：最后一次离心后，将沉淀的细胞用PBS稀释至浓度约为2％红细胞悬液(约2mL沉淀+98mL PBS)，轻轻摇晃均匀；

4)RBC浓度校准：取0.5mL上述细胞悬液于10mL EP管中，加入蒸馏水稀释至5mL，混匀反应1分钟，用酶标仪在541nm处测量(PBS为空白对照，用红细胞悬液调吸光度)，理想的吸光值应为0.5(±5％)。将处理好的RBC悬液密封于4℃储存。

(2)溶血曲线的测定

1)将实施例1制得的解淀粉芽孢杆菌溶胞产物加PBS稀释，制得样品溶液，样品溶液的浓度分别为5％、2.5％、1.25％、0.63％、0.31％，然后将各浓度梯度样品溶液与RBC悬液按3:1的体积比添加(750μL的样品溶液+250μL的RBC)，混匀；

2)将受试物RBC混合液在室温下摇床孵育60min；

3)将各EP管置于离心机中，10000rpm/min速度下离心1分钟，终止孵育；

4)取上清液，测量540nm处的吸光度值。每个浓度的样品溶液做三个平行，结果取平均值；

5)同时测定对照组：阴性对照(零溶血)：750μL PBS+250μL RBC，设阴性对照的溶血率为0％；阳性对照：750μL 0.1％SDS水+250μL RBC；实验组：750μL样品+250μL RBC。

(3)数据处理

将各组在540nm波长下测得的吸光度OD值与浓度梯度曲线，取线性区作回归线，并将540nm下阴性对照与阳性对照OD值的差值带入回归线方程，得到H50(以在测试体系中的浓度表示)。具体检测结果如图28-29所示。

计算公式(2)如下：

参照图28、29，从图中可以看出，解淀粉芽孢杆菌溶胞产物溶血率低无眼刺激性。

七、解淀粉芽孢杆菌溶胞产物应用于化妆品中

1、将解淀粉芽孢杆菌溶胞产物应用于化妆品中，化妆品为面霜，面霜的基础配方如表8所示。

表8面霜的配方

面霜的配制方法如下：

(1)在50mL烧杯中依次称取A相原料(g)；

(2)在250mL烧杯中，分别称取丁二醇、甘油、黄原胶和EDTA二钠，用玻璃棒手搅分散均匀后加入去离子水(根据配方计算用量)；

(3)分别用玻璃棒手搅加热A、B相原料，升温至80℃后，B相搅拌10分钟，转速100r/min，将A相料液加入B相烧杯中进行均质，均质速度为3500r/min，均质8min(注意：两相均在高温下混合后均质，避免油相析出)；

(4)以转速35r/min搅拌降温至45℃，加入解淀粉芽孢杆菌溶胞产物、香精和甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯，搅拌降温；

(5)搅拌降至室温后称量，装入已经灭菌的样品瓶、贴标签。

2、配方稳定性评价

将本申请制备的面霜装于离心管中，分别在不同条件下，观察面霜的稳定性。条件分别为(1)3000r/min离心30min；(2)4℃保存5天；(3)60℃保存5天；(4)阳光照射的条件下保存5天。制得面霜的稳定性检测结果如图30所示。

参照图30，从图中可以看出，离心管中的固体乳状体系并未出现破乳分层等情况，说明解淀粉芽孢杆菌溶胞产物在面霜的配方体系中具有较高的稳定性。

3、安全性评价

人体斑贴实验(以下简称“斑试”)主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性，对本申请制得的面霜进行人体封闭式斑贴实验。

实验方法如下：1)空白对照：空白滤纸对照。2)阴性对照：去离子水。3)受试者：共30人，男女不限，年龄20至28岁，符合受试者志愿入选标准。4)斑试方法：选用合格的斑试器材，以封闭性斑贴实验方法，将受试物2mg/cm²置于斑试器内，外用低致敏胶带贴敷于受试者背部，24h后去除受试物，于去除后0.5h(待压痕消失后)，24h，48h观察皮肤反应，按表9所示《化妆品卫生规范》皮肤反应分级标准记录其结果。

表9皮肤封闭型斑贴实验皮肤反应分级标准

经过人体斑贴实验的检测，30人中均未出现红斑、水肿等不良反应，一定程度说明了所制得面霜安全性高且无刺激性。

4、感官评价

感官评价方法测试依据于《化妆品安全技术规范》(2015)，对制得的面霜进行受试。

实验方法：1)面霜使用方法：早/晚间洗净面部后取适量面霜均匀涂抹于面部。2)评价人数：30人(有效数据30人)。3)随访时间点：隔一天使用一次，洗净面部后取适量本申请制备的面霜均匀涂抹于面部，分别在1周、2周、3周、4周随访。4)随访评价形式：问卷调查。其中，调查问卷1、2、3、4周都进行打分。5)不良反应：无不良反应。具体评分结果如图31所示。

参照图31，从图中可以看出，将问卷整体划分为6个维度，将不同程度改善的人群和明显改善的人群进行计数分析。结果发现使用面霜1-4周后，除了“改善敏感”维度外，面霜在整体改善、舒缓、补水滋养、修复屏障和紧致肌肤方面具有持续性的提升。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本申请的原理而采用的示例性实施方式，然而本申请并不局限于此。对于本领域内的技术人员而言，在不脱离本申请的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌BA-1，其特征在于，分离自黄酒曲中，2021年08月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23132。

2.一种溶胞产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，

（1）菌种活化：将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌BA-1进行活化，制得活化菌种；

（2）菌种纯化：将所述活化菌种梯度稀释铺板，获得单菌落菌种；

（3）菌种扩培：将所述单菌落菌种接种在液体培养基中，培养至OD值为（0.5-1.0），获得种子液；

（4）接菌和摇菌：将所述种子液接种于液体培养基中发酵，获得发酵液；

（5）离心：将所述发酵液进行离心处理，获得菌泥；

（6）破碎：将所述菌泥加入无菌水配制成菌液，利用细胞超声破碎仪进行破碎，将破碎后的菌液加热，离心后收集上清液，即得溶胞产物。

3.根据权利要求2所述溶胞产物的制备方法，其特征在于，所述液体培养基包括葡萄糖10.0 g/L、磷酸钙5.0 g/L、硫酸铵0.5 g/L、氯化钾0.2 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L、硫酸锰0.0001 g/L、硫酸亚铁0.0001 g/L和酵母提取物0.5 g/L，pH值7.0±0.2，120℃灭菌30分钟。

4.根据权利要求2所述溶胞产物的制备方法，其特征在于，所述菌种活化、所述菌种纯化、所述菌种扩培和所述发酵的温度均为28℃。

5.一种溶胞产物，特征在于，通过权利要求2-4任一项所述溶胞产物的制备方法制备获得。

6.根据权利要求5所述溶胞产物，其特征在于，所述溶胞产物的浓度为0.31-5%。

7.根据权利要求5所述溶胞产物，其特征在于，所述溶胞产物的浓度为0.31-2.5%。

8.一种如权利要求5-7任一项所述溶胞产物在化妆品中的应用。

9.一种面霜，其特征在于，包括权利要求5所述的溶胞产物。