CN102816716A - 一株解淀粉芽孢杆菌菌株的胞外多糖代谢产物提取及应用 - Google Patents

Abstract

一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代谢产物提取及应用，其16s rRNA扩增片段经测序后进行NCBI数据库的细菌16s rRNA序列比对，证实该分离株属于解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens，其16s rRNA序列NCBI登录号为JN974457，该菌现保存于中国典型培养物保藏中（CCTCC），具有胞外多糖还原能力、对DPPH自由基的清除、对羟自由基·OH的清除作用、对超氧阴离子O₂ ^-的清除作用、脂质过氧化抑制作用、对人肿瘤细胞增殖的抑制作用，为探寻抗肿瘤药物开拓了新思路及新研究领域。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌菌株的胞外多糖代谢产物提取及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代谢产物提取及应用。 

技术背景

近年来，采用微生物及其产生的抑菌物质来防治农作物真菌病害已成为重要研究方向之一，Caldelra等分离到一株解淀粉芽孢杆菌CCMI 1051(Bacillus amyloliquefaciens)对根霉L-122（Rhizopussp）和哈茨木霉CCMI 783(Trichoderma harzianum)等具有强烈的抑制作用[Annals of micrbilology，2007,57:29-33]。Arrebola等报道解淀粉芽孢杆菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉属真菌的菌丝延伸，Lee等发现缓病类芽孢杆菌WJ5(Paenibacillus lentimorbus)菌株抑制灰霉(Botrytis cinerea)等多种植物致病菌，其抗真菌活性物质分泌于细胞外，并可被正丁醇提取。研究表明：芽孢杆菌及其产生的抑菌物质在植物病害生物防治中具有巨大的应用潜力。 

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，这些代谢产物使得解淀粉芽孢杆菌能够具有广泛地抑制真菌和细菌的活性。王英国等人从堆肥中分离到一株解淀粉芽孢杆菌，其对于尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很强的抑制作用。李潞滨等人从各地大花惠兰种植地采集的土样中筛选出对大花惠兰根腐病病原菌尖孢镰刀菌具有拮抗活性的解淀粉芽孢杆菌ZL725。王奕文等人首次从不同甜瓜果实表 面分离到一株解淀粉芽孢杆菌，对灰葡萄孢、链格孢、尖孢镰刀菌、黑曲霉和粉红单端孢等8种果蔬采后病原真菌显著且广谱的拮抗作用。姜军坡等人从健康牛的粪便中筛选出对大肠杆菌有抑制作用的解淀粉芽孢杆菌BN-9。Sutyak等人从酸奶厂的益生菌乳制品中分离出1株解淀粉芽孢杆菌。其细胞的无菌上清液进行过夜培养后，可以对李斯特菌（Listeria monocytogenes）产生抑菌作用。同时，在临床试验中对阴道加德纳菌和无乳链球菌也有抑制效果，其有效抑菌物质为细菌素。W.S.Wu等人研究了解淀粉芽孢杆菌对秋英科作物细菌病害的潜在防治效果，通过从2处寄主（试验田）（C、T）中分离解淀粉芽孢杆菌进行的拮抗剂治疗活性菌株源性病原体的实验以及温室和田间试验发现6株来自于寄主C与1株来自于寄主T的解淀粉芽孢杆菌能够有效地降低种子和叶片病害的严重性。 

对解淀粉芽孢杆菌代谢产物，尤其是其胞外多糖的抗人肿瘤方面的研究属于首次，抗氧化作用的研究属于首次。多糖抗氧化作用已经成为最为活跃的研究课题之一，通常植物和藻类来源的多糖较为普遍，但近些年来，微生物来源的多糖（胞外多糖）引起广泛关注，尤其是细菌和真菌来源的胞外多糖，因其易于分离纯化而且产量高等优点在工业生产中颇受青睐。 

胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是细菌细胞外含糖结构的总称，包括革兰氏阴性细菌胞膜外的多糖成分和革兰氏阳性菌得肽聚糖，是细菌在特定环境调节下产生的高分子物质。作为细菌的次生代谢产物，胞外多糖对细菌的作用主要有：使细菌群集抵抗吞噬；保护细菌不和抗体结合；形成群集内细菌交替性生长；帮助细菌群体向周围获得足够营养。作为与人类生活紧密相关的一类生物高分子，近年的研究发 现细菌胞外多糖还具有抗氧化、抗辐射、免疫调节、降血糖、降血脂，以及抗肿瘤、抗肝炎病毒等特殊的生物学活性。 

近年来，微生物多糖抗氧化活性的研究报道很多，其在体外可以清除自由基，还具有抗脂质过氧化的能力；在体内则可以提高抗氧化酶的活性，也表现出抗脂质过氧化的能力，还可能与通过调节机体内内源性抗氧化剂的活性相关。另外多糖可以作为一种天然的生物抗氧化剂进行复配，增强对人体健康的保护作用。 

微生物多糖在治疗和/或抑制肿瘤或在肿瘤辅助诊断、预后中应用，包含解淀粉芽孢杆菌的基因重组或组合物及其抑制真菌、细菌、抗氧化作用等生物活性及其应用上，鲜有报道，该研究为探寻抗肿瘤药物提供新思路及新研究领域。 

有报道称部分解淀粉芽孢杆菌具有抑菌性质（包括真菌和细菌），在植物病害生物防治中具有巨大的应用潜力，目前关于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1的胞外多糖抗人肿瘤相关方面的研究未见报道。 

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代谢产物提取及应用，为探寻抗肿瘤药物开拓了新思路及新研究领域。 

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为： 

一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代谢产物，对其16srRNA序列进行PCR扩增片段，测序后进行NCBI数据库的细菌16s rRNA序列比对，证实该分离株属于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，命名为解淀粉芽孢杆菌C-1，其16s rRNA 序列NCBI登录号为JN974457，该菌现保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO:M 2012177。 

一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1产胞外多糖发酵、多糖的提取：C-1菌株在LB+1%葡萄糖的固体培养基上的菌苔呈白色、、湿润、饱满；经过浓缩、沉淀、除蛋白、透析后得到B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖提纯产物，产量为380mg/L，其中的糖蛋白浓度为0.7%。 

一株解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖的体外抗氧化活性：B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖还原能力见表1 

表1 

B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对DPPH自由基的清除作用见表2 

表2 

B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对羟自由基·OH的清除作用见表3 

表3 

B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对超氧阴离子O₂ ^-的清除作用见表4 

表4 

B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对脂质过氧化抑制作用见表5 

表5 

B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对人肿瘤细胞增殖的抑制结果 

见表6和表7 

表6解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖2.5mg/ml对不同人肿瘤细胞生长的抑制率% 

肿瘤细胞种类	7901	A549	7721	MCF7	7402	HELA
							抑制率%	73.2	65.0	64.0	57.7	41.1	78.6

表7解淀粉芽孢杆菌胞外多糖不同浓度对肿瘤细胞7901及HELA的抑制率 

胞外多糖浓度mg/ml	0.07	0.14	0.28	0.56	1.12	2.24
							对7901的抑制率%	12.99	29.47	30.32	31.32	45.11	64.60
对HELA的抑制率%	10.50	22.68	23.46	40.50	43.70	61.87

附图说明

图1a是该菌的显微镜观察图片。 

图1b是该菌16s rRNA序列的NJ进化树。 

图2为解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖作用于SGC7901细胞48h对其凋亡的影响图，图中，Q3：正常细胞；Q4：早凋细胞；Q2：晚凋细胞；Q1：坏死细胞a：阴性对照组；b：0.28mg/mL；c：0.56mg/mL；d：1.12mg/mL。 

图3为解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖作用于SGC7901细胞48h对其周期的影响图，图中，a：阴性对照组；b：0.28mg/mL；c：0.56mg/mL；d：1.12mg/mL。 

具体实施方式

下面结合实例和附图对本发明做详细描述。 

分离来源：从某超市采集的免洗蔬菜拼盘样品，无菌状态下匀浆，秤称取0.5样品，加灭菌的0.1%蛋白胨溶液试管中充分混匀，室温静置5min，取上清1ml与25ml灭菌的溶化的牛肉膏-蛋白胨固体培养基混匀，倾倒平板，37℃培养48h。发现该菌在牛肉膏-蛋白胨固体培养基上生长迅速，菌落光滑、湿润，接触时有粘性，在LB液体试管培养基中培养时，48小时以后出现细胞絮凝现象。 

分离所用培养基：牛肉膏-蛋白胨固体培养基（0.3%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%氯化钠、1.5%琼脂，高压蒸汽灭菌，121℃，20min） 

一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代谢产物，对其16s rRNA序列进行PCR扩增片段，测序后进行NCBI数据库的细菌16s rRNA序列比对，证实该分离株属于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1，命名为解淀粉芽孢杆菌C-1，其16srRNA序列NCBI登录号为JN974457，该菌现保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO:M 2012177，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2012年5月22日。该菌的显微镜观察图片见图1a，其16s rRNA序列的NJ进化树见图1b。 

一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1产胞外多糖发酵、多糖的提取：C-1菌株在LB+1%葡萄糖的固体培养基上的菌苔呈白色、湿润、饱满，见图1a；经过浓缩、沉淀、除蛋白、透析后得到解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖提纯产物，产量为380mg/L，其中的糖蛋白浓度为0.7%。 

一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外多糖的体外抗氧化活性：Bacillus amyloliquefaciensC-1胞外多糖还原能力见表1 

表1 

药物还原力的大小在一定程度上反映了其预防性抗氧化功能的强弱。抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基的，抗氧化性随还原力的增强而增强。因此，可通过测定还原力的大小来反映抗氧化活性的强弱。 

Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外多糖对DPPH自由基的清除作用见表2 

表2 

DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若样品能清除DPPH，则提示样品具有清除羟自由基、烷自由基和过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH自由基有单电子，在517nm处有强吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，加入样品后，在517nm处，测定其对DPPH自由基清除效果。 

Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外多糖对羟自由基·OH的清除作 用见表3 

表3 

羟自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。在反应体系中H202和Fe2+混合发生Fenton反应，产生·OH。其具有很高的反应活性，能被水杨酸有效的捕捉，进而生成有色物质。但若在反应体系中加入具有清除作用的物质，此物质则与水杨酸竞争，使有色产物的生成量减少。 

胞外多糖对超氧阴离子O₂ ^-的清除作用见表4 

表4 

在一定条件下，邻苯三酚自氧化产生O2-，超氧阴离子自由基是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自由基，可以经过一序列反应生成其它的氧自由基。多糖分子上有还原性的半缩醛羟基，能与超氧阴离子自由基发生氧化还原反应，从而终止自由基链式反应。O2-清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标之一。 

脂质过氧化抑制作用见表5 

表5 

脂质过氧化作用主要是指在多不饱和脂肪酸中发生的一种自由基链式反应,·OH自由基是脂质过氧化作用的主要引发剂。 

解淀粉芽孢杆菌对人肿瘤细胞增殖的抑制结果见表6和表7 

表6解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖2.5mg/ml对不同人肿瘤细胞生长的抑制率% 

肿瘤细胞种类	7901	A549	7721	MCF7	7402	HELA
							抑制率%	73.2	65.0	64.0	57.7	41.1	78.6

表7解淀粉芽孢杆菌胞外多糖不同浓度对肿瘤细胞7901及HELA的抑制率 

胞外多糖浓度mg/ml	0.07	0.14	0.28	0.56	1.12	2.24
							对7901的抑制率%	12.99	29.47	30.32	31.32	45.11	64.60
对HELA的抑制率%	10.50	22.68	23.46	40.50	43.70	61.87

下面结合实例对本发明做详细描述。 

1、提取C-1总DNA，并一直为模板，扩增1.5kb 16S rRNA序列，16S rRNA PCR引物为16S-F:5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3'，16S-R:5‘GGT ACC T TG TTA CGA CTT3'。扩增程序为：94℃,4min,1个循环预变性；94℃变性，30sec，58℃退火，30sec，72℃延伸，1min，30个循环；72℃7min。PCR扩增体系为20μl PCR体系中分别加入10mM dNTP 1.6μl，10×Taq酶buffer 2μl，1nM PCR引物各1μl， G-14总DNA模板2-3ng，Taq DNA聚合酶0.2μl，以MiniQ水补足20μl。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，用PCR产物回收试剂盒回收，并送测序公司测序。测序结果与NCBI上公布的细菌16S rRNA序列比对。 

2、将Bacillus amyloliquefaciens C-1单菌落接种至3ml LB液体试管培养基中，30℃，200rpm通气培养8-10小时，2%的转接量转接至产胞外多糖的发酵培养基----LB+1%葡萄糖中通气培养60小时，10000rpm，3min，4℃离心收集培养液上清提取胞外多糖。 

采用旋转蒸发仪将上清液在室温条件下浓缩至原体积的1/10，然后加入3倍体积的95%的冰乙醇，充分混匀，4℃下放置18小时使胞外多糖充分沉淀。8000rpm，10min，4℃离心收集沉淀，此时为粗多糖。粗多糖利采用Sevage法除蛋白后，离心取上清，在截留分子量为8000-14000的透析袋中以灭菌纯水缓冲液透析48小时，每12小时更换1次缓冲液。最后对多糖溶液进行低温冷冻干燥获得Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外多糖干粉。 

Bacillus amyloliquefaciens C-1胞外多糖干粉溶解于无菌水，配置为70mg/L的溶液，备用。 

3、解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖体外抗氧化实验结果 

3-1.C-1胞外多糖还原能力 

测定方法: 

在电子天平上称取20mg EPS粉末，配置成5.0mg/mL的EPS溶液。采用倍比稀释法用双蒸水将此EPS溶液稀释成6种浓度：5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15mg/mL。用维生素C(Vc)做为对照：采用同样方法配制6种浓度的Vc溶液。取12支具塞试管，分别加入1mL不同浓度 的EPS溶液及维生素C溶液；加入2.5mL pH 6.6的磷酸盐缓冲液、2.5mL 1％铁氰化钾溶液；充分混匀；在50℃水浴条件下，反应20min；再加入2.5mL 10％的三氯乙酸，充分混匀；在3000rpm转速下，离心10min；取上清液2.5mL于试管中；然后加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1％FeCl3溶液，充分混匀；在室温条件下，反应5min。取适量各试管中的溶液于比色皿中，用紫外分光光度仪测700nm处的吸光度。 

3-2.胞外多糖对DPPH自由基的清除作用 

测定方法: 

在电子天平上称取20mg EPS粉末，配置成5.0mg/mL的EPS溶液。采用倍比稀释法用双蒸水将此EPS溶液稀释成6种浓度：5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15mg/mL。用维生素C(Vc)做为对照：采用同样方法配制6种浓度的Vc溶液。称取20mg的DPPH用无水乙醇溶解定容至500mL，配制成40mg/L的DPPH溶液。实验分样品组和空白对照组：分别取40mg/l的DPPH溶液2mL，加入13支10mL具塞的试管中；样品组分别加入2mL不同浓度的EPS溶液和维生素C溶液，空白对照组加入2mL双蒸水；充分混匀后，避光、在室温条件下，反应30min。取适量各试管中的溶液于比色皿中，用紫外分光光度仪测517nm处的吸光度。EPS及维生素C清除DPPH自由基的能力由清除率反映，其计算公式如(1)，式中A0为空白对照的平均吸光度值，A1为EPS及维生素C试样的平均吸光度值。 

DPPH自由基清除率(％)=(A0-A1)／A0×100％(1) 

3-3.胞外多糖对羟自由基·OH的清除作用 

测定方法: 

在电子天平上称取20mg EPS粉末，配置成5.0mg/mL的EPS溶液。采 用倍比稀释法用双蒸水将此EPS溶液稀释成6种浓度：5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15mg/mL.用维生素C(Vc)做为对照：采用同样方法配制6种浓度的Vc溶液。实验分样品组和空白对照组：样品组分别取EPS溶液及维生素溶液2mL于12支具塞试管，空白对照组加入2mL双蒸水于1支试管；依次加入2mL 6mmol/l的FeSO4溶液，充分混匀；在分别加入2mL 6mmol/L的H2O2溶液，充分混匀；室温条件下，静置反应30min。取适量各试管中的溶液于比色皿中，用紫外分光光度仪测510nm处的吸光度。EPS及维生素C清除羟自由基的能力的由清除率反映，其计算公式如(2)，式中A0为空白对照的平均吸光度值,A1为EPS及维生素C试样的平均吸光度值。 

羟自由基清除率(％)=(A0﹣A1）/A0×100％(2) 

3-4.胞外多糖对超氧阴离子O2-的清除作用 

测定方法: 

在电子天平上称取20mg EPS粉末，配置成5.0mg/mL的EPS溶液。采用倍比稀释法用双蒸水将此EPS溶液稀释成6种浓度：5.0、2.5、1.25、0.6、0.3、0.15mg/mL.用维生素C(Vc)做为对照：采用同样方法配制6种浓度的Vc溶液。实验分样品组和空白对照组：取4.5mL0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)于13支10mL具塞的试管中,置于25℃水浴中预热25min；样品组分别加入1mL不同浓度的EPS溶液及维生素C溶液，空白对照组加入1mL双蒸水；再分别加入0.4mL25mmol/L邻苯三酚溶液,充分混匀；在25℃水浴条件下，反应5min，然后分别加入8mol/l的HCl 1mL以终止反应。取适量各试管中的溶液于比色皿中，用紫外分光光度仪测299nm处的吸光度。EPS及维生素C清除超氧阴离子的能力的由清除率反映，其计算公式如(3)，式中A0 为空白对照的平均吸光度值，A1为EPS及维生素C试样的平均吸光度值。 

超氧阴离子的清除率(％)=(A0﹣A1)／A0×100％(3) 

3-5.脂质过氧化抑制作用 

测定方法: 

以卵黄脂蛋白为底物的模型LPO反应体系包括:0.2mL 1:40稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH 7.450.1mol/L的PBS配成,用前先磁力搅拌10min、0.2mL 25mmol/L的FeSO4·7H2O溶液、100μL一定浓度的EPS溶液用PBS，溶液补足2.0mL。对照管除不加EPS溶液外其它试剂同前并提前加入0.5mL 20%TCA溶液。试验开始将上述两种试管同时置37℃水浴中振荡15min,取出后,样品试管加入20%TCA溶液0.5mL,静置10min后,与对照管于3500rpm离心10min,取上清液,分别加入1.0mL硫代巴比妥酸(TBA 0.8%)溶液,加塞，于100℃水浴15min,取出冷却。以空白管调零(空白以2.0mL PBS溶液代替),测定A532,样品EPS对卵黄脂蛋白LPO的抑制率(%)。表示为(4)。 

EPS(%)=(1-样品A532/对照A532)×100% 

4、肿瘤细胞培养及抑制率检测： 

1）乳腺癌MCF7、肝癌7721、7402、胃癌7901、肺癌A549、HELA六种细胞均购自美国ATCC细胞库，于含10%胎牛血清的1640培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。 

2）将生长状态良好，于对数期生长的MCF7、7721、7402、7901、A549、HELA细胞以10⁵接种于96孔板，过夜待细胞自然贴壁。将上述细胞中加入0.5mg/ml浓度的球形芽孢杆菌晶体蛋白提取物，然后将细胞置37℃、5%CO₂中培养48h。 

3）MTT法测定细胞生长：培养48h后,待测孔每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续培养4h。终止培养后，小心吸尽待测孔中培养液，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶体充分溶解，于酶标仪490nm波长处测定吸光度。每组设5个平行孔，每组实验均重复三次。 

细胞生长的抑制率（%）=（1-细胞的存活率）×100% 

5、采用流式细胞术检测解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖对肿瘤细胞周期、凋亡的影响 

1）1500rpm离心10min收集细胞； 

2）弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上； 

3）进行流式细胞仪检测前，1500rpm离心10min收集固定后的细胞； 

4）PBS洗涤一次，1500rpm离心10min收集细胞； 

5）将细胞重悬于含100ug/ml RNaseA和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min； 

细胞凋亡率的分析，使用0.28mg/mL、0.56mg/mL、1.12mg/mL解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖作用SGC7901细胞48小时之后，使用AnnexinV-FITC/PI双染进行凋亡分析，考察凋亡细胞所占的比例。考察提取物对胃细胞系SGC7901凋亡诱导的情况。流式细胞仪测定的结果显示散点图各区分别代表如下的含义：Q3（Annexin-/PI-）为正常活细胞；Q4（Annexin+/PI-）为早期凋亡细胞；Q1（Annexin+/PI+）为晚 期凋亡细胞；Q2（Annexin-/PI+）为机械性损伤细胞以及坏死的细胞。 

细胞周期检测，使用0.28mg/mL、0.56mg/mL、1.12mg/mL解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖作用SGC7901细胞48小时之后，使用PI单染进行周期分析，考察提取物对细胞周期各时期所占的比例的影响。 

本发明首次发现该类多糖对人恶性肿瘤细胞具有一定抑制作用。通过野生型解淀粉芽孢杆菌的分批发酵，对其细胞进行裂解离心等处理，获得其代谢产物解淀粉芽孢杆菌胞外多糖，首次将该多糖应用于抗人肿瘤细胞的实验中。 

对人肿瘤细胞系的初步筛选，选择数种人肿瘤细胞系，以一定浓度进行初步筛选，发现该蛋白对人肝癌细胞7901及宫颈癌细胞HELA具有较高的抑制率，分别为78%、73%。对抑制率较高的肿瘤细胞进一步检测，选择芽孢杆菌晶体蛋白不同浓度对肿瘤细胞7901及HELA的抑制率，实验发现，7901及HELA肿瘤细胞对其代谢产物芽孢杆菌晶体蛋白具有一定的浓度依赖性。 

如图2所示，阴性对照组早凋与晚凋的细胞共计4.8%。小浓度给药组（0.28mg/mL）早凋与晚凋的细胞共计28.4%，与阴性对照组相比有所增多。中浓度给药组(0.56mg/mL)给药处理后，凋亡率为38.0%。大浓度给药组(1.12mg/mL)凋亡率为52.8%，与阴性对照组相比均有显著性差异。 

如图3所示，解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖作用SGC7901细胞48小时之后，使用PI单染进行周期分析，考察提取物对细胞周期各时期所占的比例的影响，解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖对胃癌细胞系SGC7901没有显著性影响。 

将球形芽杆孢菌产生的毒素蛋白首次应用于新的领域即用于抗人 肿瘤细胞的研究上。随着肿瘤死亡率的不断升高，癌症已经严重的威胁到了人类的健康和生命，抗肿瘤药物的寻求与发现是亟待解决的重要问题。近年来，从天然物质中获取抗肿瘤成分备受瞩目，本研究从野生球形芽杆孢菌菌株的代谢产物晶体蛋白中探讨分析并发现抗肿瘤物质，拓展寻求发现抗肿瘤药物的范围，提出新的研究思路及新的研究领域。 

Claims (8)

1.一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens C-1，其特征在于：对其16s rRNA序列进行PCR扩增片段，测序后进行NCBI数据库的细菌16s rRNA序列比对，证实该分离株属于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，命名为解淀粉芽孢杆菌C-1，其16s rRNA序列NCBI登录号为JN974457，该菌现保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO:M 2012177。

2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：产胞外多糖发酵、多糖的提取，G-14菌株在LB+1%葡萄糖的固体培养基上的菌苔呈白色、湿润、饱满；经过浓缩、沉淀、除蛋白、透析后得到B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖提纯产物，产量为380mg/L，其中的糖蛋白浓度为0.7%。

3.根据权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖还原能力见表1

表1

4.根据权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对DPPH自由基的清除作用见表2

表2

5.根据权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：B.amyloliquefaciens C-1胞外多糖对羟自由基·OH的清除作用见表3

表3

6.根据权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：胞外多糖对超氧阴离子O₂ ^-的清除作用见表4

表4

7.根据权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：脂质过氧化抑制作用见表5

表5

8.根据权利要求1所述一株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens C-1，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌对人肿瘤细胞增殖的抑制结果见表6和表7

表6解淀粉芽孢杆菌提纯的胞外多糖2.5mg/ml对不同人肿瘤细胞生长的抑制率%

  肿瘤细胞种类   7901   A549   7721   MCF7   7402   HELA   抑制率%   73.2   65.0   64.0   57.7   41.1   78.6

表7解淀粉芽孢杆菌胞外多糖不同浓度对肿瘤细胞7901及HELA的抑制率

  胞外多糖浓度mg/ml   0.07   0.14   0.28   0.56   1.12   2.24   对7901的抑制率%   12.99   29.47   30.32   31.32   45.11   64.60   对HELA的抑制率%   10.50   22.68   23.46   40.50   43.70   61.87

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