CN114990169A - 一种制备EGCG-3”-Me的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备EGCG‑3”‑Me的方法，属于物质制备技术领域，包括将茶树EGCG‑O‑甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯；多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素；将得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG‑3”‑Me。采用本发明的方法产率高，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于物质制备技术领域，尤其涉及一种制备EGCG-3”-Me的方法。
背景技术
茶叶是全球公认的健康饮料。近年来有研究表明，茶叶中的甲基化儿茶素类成分，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的甲基化衍生物，尤其是(-)-表没食子儿茶素3-O(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG-3”-Me)具有显著的抗过敏功效，特别是对预防和抑制花粉导致的过敏症状尤为显著。因此，EGCG-3”-Me的抗过敏功能是近年来茶叶生物活性功能的研究热点。
富含EGCG-3”-Me的产品受到了消费者的广泛欢迎，目前已初具市场规模。在食品和生物医药领域对EGCG-3”-Me的需求量也日渐增加，所以，EGCG-3”-Me合成的研究具有十分重要的意义。
已有的研究结果表明，除少数茶树资源中含有相对较高的EGCG-3”-Me，其他茶树品种中EGCG-3”-Me含量极低。EGCG-3”-Me已有的合成方法主要包括化学合成法和生物酶法。化学合成法中反应条件苛刻，副产物多且分离提纯难度较大，同时大量有机溶剂和基团保护剂的使用，使得该方法合成的EGCG-3”-Me很难应用于食品领域。体外酶法合成具有酶促合成反应共有的特点，反应条件温和相对较为安全、专一性强且产物单纯，在反应液中EGCG-3”-Me分离简便。但是目前已有的体外酶法合成研究结果表明，实验室条件下，体外表达的茶树EGCG-O-甲基转移酶合成EGCG-3”-Me实验中EGCG转化率较低，底物损失大，产率低，成本高，并不适合用于EGCG-3”-Me的大量生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备EGCG-3”-Me的方法，采用本发明的方法产率高，适合大规模生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种制备EGCG-3”-Me的方法，包括以下步骤：
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L，氯化镁的浓度为2mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L；
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。
优选的，当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度为0.4mmol/L。
优选的，当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/L。
优选的，当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/L。
优选的，所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；
当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.40mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/mL，橘皮素的浓度为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度为1.51mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/mL，橘皮素的浓度为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.56mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.14mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.50mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.01mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.54mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为0.07mg/mL。
优选的，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/mL，橘皮素的浓度为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度为1.12mg/mL。
本发明制备EGCG-3”-Me的机理为：
在一定条件下，茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和多甲氧基黄酮为底物，催化合成EGCG-3”-Me。
附图说明
图1为陈皮甙反应结果HPLC图；
图2为橘皮素反应结果HPLC图；
图3为川陈皮素反应结果HPLC图；
图4为柑橘果实多甲氧基黄酮反应结果HPLC图。
具体实施方式
本发明提供了一种制备EGCG-3”-Me的方法，包括以下步骤：
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L，氯化镁的浓度为2mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L；
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。
在本发明中，所述EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
MATNGEGEQNLRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPEAMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPDDGKILAMDINRDNFEIGLPIIEKAGVAHKIDFREGPALPALDKMIEDGKHHGSFDFIFVDADKDNYINYHKRLIDLVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLELNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRVC。
本发明对所述EGCG-O-甲基转移酶的制备方法没有特殊限定，本领域技术人员按照常规制备方法即可，在本发明具体实施方式中，采用咖啡酰辅酶AO-甲基转移酶基因(GenBank Accession No.DD361102)，通过大肠杆菌表达体系制备茶树EGCG-O-甲基转移酶。
本发明将得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。在本发明中，所述反应后还优选加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，得到EGCG-3”-Me。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度优选为0.4mmol/L。在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度优选为0.4mmol/L。在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.4mmol/L。
在本发明中，所述多甲氧基黄酮优选来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.12mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.40mg/mL；当所述多甲氧基黄酮优选来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.24mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.47mg/mL；当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.28mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.51mg/mL；当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.05mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.47mg/mL；当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.56mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮优选来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.02mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.14mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.06mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.14mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.001mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.54mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.03mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度优选为0.07mg/mL。
在本发明中，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度优选为0.04mg/mL，橘皮素的浓度优选为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度优选为1.12mg/mL。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和川陈皮素为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
选用咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶基因(GenBank Accession No.DD361102)，通过大肠杆菌表达体系制备茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液，制备的茶树EGCG-O-甲基转移酶蛋白序列为：
MATNGEGEQNLRHQEVGHKSLLQSDALYQYILETSVYPREPEAMKELREVTAKHPWNIMTTSADEGQFLNMLLKLINAKNTMEIGVYTGYSLLATALALPDDGKILAMDINRDNFEIGLPIIEKAGVAHKIDFREGPALPALDKMIEDGKHHGSFDFIFVDADKDNYINYHKRLIDLVKVGGLIGYDNTLWNGSVVAPPDAPMRKYVRYYRDFVLELNKALAADPRIEICMLPVGDGITLCRRVC
大肠杆菌体系表达：将含基因片段的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中后接种至LB固体培养基(含氨苄)培养过夜；挑一个转化后重组质粒的单菌落接种于LB液体培养基中(含氨苄)，于37℃过夜培养；取1-2mL过夜培养物，转接于100mL含氨苄的LB液体培养基中，于37℃，180rpm震荡培养1.5-2h至对数生长期；在培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2-1.6mmol/L进行诱导表达，继续分别于37℃，180rpm震荡培养1.5-12h；离心，弃上清，并收集细胞；加入10V/W的蛋白破碎缓冲液(1x PBS)，与大肠杆菌细胞混匀后进行超声波破碎，每处理1s，间隔3s，频率为23％，破碎处理时以不发生气泡，不过热为准，以菌液变清晰为终止标准。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)加入15mL川陈皮素反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L川陈皮素、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为275.68μg/mL，EGCG转化率为89.21％。
实施例2
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和橘皮素为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15mL橘皮素反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L橘皮素、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为278.34μg/mL，EGCG转化率为71.20％。
实施例3
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和陈皮甙为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(浓度1mg/ml)(制备方法同实施例1)加入15mL陈皮甙反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.4mmol/L陈皮甙、0.3mmol/L EGCG、100mmol/L Tri-HCl pH＝7.5)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为305.14μg/mL EGCG转化率为97.15％。
实施例4
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和茶枝柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g茶枝柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茶枝柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到茶枝柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.12mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.40mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL茶枝柑多甲氧基黄酮反应液中(即：含有2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG的茶枝柑多甲氧基黄酮水溶液15mL)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.50μg/mL。
实施例5
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和柠檬多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g柠檬，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g柠檬，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到柠檬多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即柠檬多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.02mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.14mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL柠檬多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL柠檬多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为8.50μg/mL。
实施例6
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和甜橙多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g甜橙，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g甜橙，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到甜橙多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即甜橙多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.50mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL甜橙多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL甜橙多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.25μg/mL。
实施例7
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和温州蜜柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g温州蜜柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g温州蜜柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到温州蜜柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.24mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL温州蜜柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL温州蜜柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.09μg/mL。
实施例8
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和椪柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g椪柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g椪柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到椪柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即椪柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.28mg/mL，橘皮素的浓度为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度为1.51mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL椪柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL椪柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.32μg/mL。
实施例9
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和无核蜜桔多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g无核蜜桔，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g无核蜜桔，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到无核蜜桔多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.001mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.54mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL无核蜜桔多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL无核蜜桔多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为10.21μg/mL。
实施例10
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和沙田柚多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g沙田柚，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沙田柚，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到沙田柚多甲氧基黄酮干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即沙田柚多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.03mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为0.07mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL沙田柚多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL沙田柚多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为2.08μg/mL。
实施例11
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和砂糖橘多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g砂糖橘，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g砂糖橘，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到砂糖橘多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.04mg/mL，橘皮素的浓度为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度为1.12mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL砂糖橘多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL砂糖橘多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为8.06μg/mL。
实施例12
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和沃柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g沃柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g沃柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到沃柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即沃柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.05mg/mL，橘皮素的浓度为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL沃柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL沃柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为11.23μg/mL。
实施例13
茶树EGCG-O-甲基转移酶以EGCG和茂谷柑多甲氧基黄酮为底物催化合成甲基儿茶素EGCG-3”-Me：
取10.0g茂谷柑，80℃条件下加入30mL 60％甲醇水溶液浸提4min，过滤后同样方法再重复一次。采用同样方法共提取30.0g茂谷柑，合并所有提取液后置于旋转蒸发仪中旋蒸至完全干燥，加入纯水溶解后置于-20℃条件下冷冻24小时，随后转入冻干机中冷冻干燥，得到茂谷柑多甲氧基黄酮冻干粉。按照料液比1:150进行溶解保存在-20℃，即茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液(川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.56mg/mL)，备用。
取1mL茶树EGCG-O-甲基转移酶粗酶液(制备方法同实施例1)加入15mL茂谷柑多甲氧基黄酮反应液中(即：2mmol/L MgCl2、2mmol/L二硫苏糖醇、0.3mmol/L EGCG溶解于15mL茂谷柑多甲氧基黄酮水溶液)，35℃条件下，反应1小时，加入0.2mL 1.0mol/L盐酸终止反应，加入25mL乙酸乙酯萃取离心，取上部乙酸乙酯层置旋转蒸发仪中旋蒸至全干，加入1.0mL纯甲醇复溶，HPLC检测EGCG-3”-Me生成量为12.46μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备EGCG-3”-Me的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液混合，得到反应液；
所述底物溶液中含有多甲氧基黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、氯化镁和二硫苏糖醇；所述底物溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为0.3mmol/L，氯化镁的浓度为2mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L；
所述多甲氧基黄酮包括陈皮甙、橘皮素和川陈皮素中的一种或几种；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液的浓度为1mg/mL；
所述茶树EGCG-O-甲基转移酶酶液与底物溶液的体积比为1:15；
2)将所述步骤1)得到的反应液在35℃条件下反应1h，得到EGCG-3”-Me。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮为陈皮甙时，所述底物溶液中陈皮甙的浓度为0.4mmol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮为橘皮素时，所述底物溶液中橘皮素的浓度为0.4mmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮为川陈皮素时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.4mmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑、温州蜜柑、椪柑、沃柑或茂谷柑；
当所述多甲氧基黄酮来源于茶枝柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.12mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.40mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于温州蜜柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.24mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于椪柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.28mg/mL，橘皮素的浓度为0.45mg/mL，陈皮甙的浓度为1.51mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于沃柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.05mg/mL，橘皮素的浓度为0.04mg/mL，陈皮甙的浓度为1.47mg/mL；
当所述多甲氧基黄酮来源于茂谷柑时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.16mg/mL，陈皮甙的浓度为1.56mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于柠檬时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.02mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.14mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于甜橙时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.06mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为1.50mg/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于无核蜜桔时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.001mg/mL，橘皮素的浓度为0.03mg/mL，陈皮甙的浓度为1.54mg/mL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于沙田柚时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.03mg/mL，橘皮素的浓度为0.02mg/mL，陈皮甙的浓度为0.07mg/mL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述多甲氧基黄酮来源于砂糖橘时，所述底物溶液中川陈皮素的浓度为0.04mg/mL，橘皮素的浓度为0.14mg/mL，陈皮甙的浓度为1.12mg/mL。
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