CN114946836A

CN114946836A - 一种微组织无血清冻存液及其应用

Info

Publication number: CN114946836A
Application number: CN202210574174.3A
Authority: CN
Inventors: 王嘉; 李胜; 陆政昊
Original assignee: Guagnzhou Jingke Biotech Co ltd; Chengdu Nuoyeide Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Chengdu Nuoyeide Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-05-25
Also published as: CN114946836B

Abstract

本发明公开了一种微组织无血清冻存液及其应用，冻存液的组分包括十二烷基磺酸钠、DMSO、细胞外冷冻保护剂、非还原性糖、蛋白聚糖类大分子、凋亡抑制剂、ROS抑制剂和抗氧化剂。本发明的无血清冻存液，降低了血清的污染风险和血清中未知成分因子对微组织的生长的影响，提高了微组织的复苏率，冻存复苏率均达到90%以上，还能保证微组织结构与功能的完整性，加入的凋亡抑制剂还能抑制冻存诱导的复苏后凋亡。

Description

一种微组织无血清冻存液及其应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种微组织无血清冻存液及其应用。

背景技术

传统的二维细胞系无法很好的重现细胞在体内的生理和生物力学特征，聚集态生长的细胞，可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间，细胞与周围基质之间的相互作用和空间位置形态。而其本身又能做到与体内分化的组织器官具有相似的生理反应，与来源组织具有极高的相似性。聚集态生长细胞的应用也很广泛，可以用于药物的体外筛选、毒副作用筛选、模拟疾病、基因组学研究和细胞疗法以及再生医学等多个领域。聚集态生长细胞的方式方法种类繁多，包括水凝胶中培养的类器官、细胞聚集作用的细胞球、3D培养支架培养体系等。这些方法都有一个共同特征，细胞会以尺寸为10um-1mm的聚集状态的形式生长，能够更好的模拟生物体内细胞存活的微环境和空间形态。我们将此类细胞称为微组织，微组织不仅包括尺寸在10um-1mm的聚集态生长的细胞还包括厚度小于1mm的组织薄片等。

与冻存传统单层细胞相比，冻存该类多团块，以聚集状态生长的微组织最大的难点在于冻存液不能有效的渗透到微组织的内部，只能有效的保护微组织的外层细胞，而不能有效保护微组织内层细胞，导致在冻存过程中微组织内部细胞死亡，破坏了微组织的结构；其次，此类微组织细胞间相互作用，若有单细胞脱离了细胞团块会引起细胞失巢凋亡，也让冻存的难度增加。

目前，并没有专门针对该类微组织的冻存方案，科研人员在冻存该类微组织通常是使用细胞系冻存液或组织冻存液，但这两种方案都有各自的缺点。

（1）使用传统的DMSO+FBS胎牛血清细胞冻存液，这种方案虽然能够有效冻存细胞系，但对于具有复杂3维结构的微组织冻存效果不佳。另一方面，冻存液中添加了成分不明的血清，可能会携带动物源性病毒，且可能会影响培养体系中的培养成分，会对细胞带来不可预知的影响。

（2）使用冻存组织用的玻璃化方案，添加高浓度的细胞冷冻保护剂，快速冷冻使细胞悬液玻璃化，形成保持细胞原本状态的玻璃态。该方法虽然复苏后活率较高，但冻存前需用平衡液平衡，复苏前还需一定浓度梯度的复苏液缓冲，程序繁琐；且高浓度的冷冻保护剂会对细胞产生较强的毒性，影响细胞的活性。

研究报道，低温冻存会诱导激活细胞凋亡途径的死亡，解冻后细胞凋亡途径被激活，细胞凋亡可以通过外在和内在途径介导。以往的研究表明，冷冻损伤诱导的细胞死亡是由内源性或线粒体凋亡途径引起的。此外，活性氧通过线粒体途径在诱导细胞凋亡中也发挥重要作用。目前的冻存液，并没有针对冻存引起的细胞凋亡采取应对措施，这会使得细胞复苏后因冻存诱导的凋亡产生大量损耗。

综上所述，现存冻存液在细胞冻存过程中不能有效保护微组织内部的细胞，复苏后不能保证结构和功能的完整性；此外，添加血清的冻存液还会引入外源性风险；玻璃化冻存液冻存程序繁琐且含高浓度的渗透性保护剂，会对细胞产生毒性。因此，我们需要开发一种适用于以聚集态生长的细胞微组织的冻存液，能够有效的冻存类器官、细胞球、组织薄片等微组织并保证复苏后其结构和功能不会丢失；此外，该冻存液还不能引入成分未知的外源性物质，不含高浓度的渗透性保护剂，且冻存程序要简单便捷，同时，还要抑制细胞失巢凋亡和复苏后产生冻存诱导的凋亡，提高细胞的活率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种微组织无血清冻存液及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种微组织无血清冻存液，其包括如下组分：

十二烷基磺酸钠：0.1 wt%～2.5wt%

二甲基亚砜：5 v/v %～10v/v%

细胞外冷冻保护剂：5 wt %～10 wt%

非还原性糖：0.1 M～0.5 M

蛋白聚糖类大分子：0.1 wt %～2 wt %

凋亡抑制剂：0.1～30μM

ROS抑制剂：0.1～10μM

抗氧化剂：0.5 wt %～1 wt %。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，各组分的含量如下：

十二烷基磺酸钠：0. 5 wt %～2 wt %

二甲基亚砜：5%～10v/v%

细胞外冷冻保护剂：5 wt %～10 wt %

非还原性糖：0.2M～0.4M

蛋白聚糖类大分子：0.5 wt %～1 wt%

凋亡抑制剂：5～20μM

ROS抑制剂：1～10μM

抗氧化剂：0.5 wt %～1 wt %。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述细胞外冷冻保护剂为羟乙基淀粉；和/或

所述非还原性糖选自海藻糖、蔗糖、果糖中的至少一种；和/或

所述蛋白聚糖类大分子选自透明质酸、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素中的至少一种；和/或

所述凋亡抑制剂选自TGF-β 受体抑制剂如A83- 01、p-38 MAPK抑制剂如SB202190、z-vad-fmk、Q-VD-Oph、Pinacidil中的至少一种；和/或

所述ROS抑制剂选自中Acetylcysteine、Ensulizole、SEA0400、Cynarin、GSK2795039的至少一种；和/或

所述抗氧化剂选自维生素E、褪黑素、谷胱甘肽、维生素C中的至少一种。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，各组分的含量如下：

十二烷基磺酸钠：0.5 wt%～2wt%

二甲基亚砜：5 v/v %～10v/v%

细胞外冷冻保护剂羟乙基淀粉：5 wt %～10 wt %

非还原性糖海藻糖：0.2M～0.4M

硫酸乙酰肝素：0.5 wt %～1 wt %

凋亡抑制剂A83- 01：5～20μM

ROS抑制剂Acetylcysteine：1～10μM

抗氧化剂谷胱甘肽：0.5 wt %～1 wt %。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，微组织无血清冻存液的溶剂为DPBS缓冲溶液或无血清基础培养基。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述无血清基础培养基选自DMEM/F-12培养基、DMEM/Basic培养基和1640培养基中的一种。

本发明的第二个方面，提供：

一种微组织的冻存方法，包括如下步骤：

S1) 收集培养得到的微组织；

S2) 向微组织中加入缓冲液或无血清培养基，离心后取沉淀；

S3) 向沉淀中加入本发明第一个方面所述的微组织无血清冻存液，并转移至程序性降温盒冻存。

在一些冻存方法的实例中，冻存时，降温速率为0.5～3 ℃/min。

在一些冻存方法的实例中，所述微组织的粒径为10～1000 μm。

在一些冻存方法的实例中，所述微组织在所述微组织无血清冻存液中的密度为1～10 ×10⁶/mL。

本发明的有益效果是：

本发明一些实例的微组织无血清冻存液，具有如下优势：

1)未添加动物血清及蛋白，避免了外源性物质的引入，降低了血清的污染风险和血清中未知成分因子对微组织的生长的影响。

2)在DMSO(二甲基亚砜)作为细胞内冷冻保护剂的基础上，添加了非渗透性的细胞外冷冻保护剂，降低冰点和细胞外电解质浓度，从细胞内和细胞外同时降低低温对细胞造成的损伤。DMSO的浓度远低于玻璃化冻存液中浓度，降低了其对细胞的毒性。

3)该冻存液添加了含量较大冷冻保护剂，冻存液有较高的渗透压，还加入了十二烷基磺酸钠改善细胞膜的通透性，有利于冷冻保护剂向微组织内部渗透，能够在冷冻过程中有效保护三维结构微组织的外层和内层细胞，且复苏后能够保持原有的特性和结构。且冻存液中还添加了非还原性糖，可以保护细胞免受溶质损伤。

4)冻存液中加入了稳定的非还原性糖，可以强力的束缚水分子，和膜脂质共同拥有结合水甚至替代生物膜结合水的功能，可以在低温状态下保护细胞内的蛋白质、脂类、糖类、核酸等成分不受破坏，同时还能调节溶液的性状。

5)加入了蛋白聚糖类聚合物，蛋白聚糖是构成细胞外基质的主要成分之一，可以直接参与细胞内外电解质交流的调控，调节渗透压，促进细胞修复，主要包括透明质酸、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素等。

6) 添加了细胞凋亡抑制剂，抑制微组织细胞的失巢凋亡和冻存诱导的凋亡

7)可有效提高细胞复苏后的活率。

8)添加了ROS抑制剂和抗氧化剂，降低了低温冻存诱导的ROS途径的细胞凋亡。

本发明的冻存液，提高了微组织的复苏率，冻存复苏率均达到90%以上，还能保证微组织结构与功能的完整性，加入的凋亡抑制剂还能抑制冻存诱导的复苏后凋亡。

附图说明

图1～图5分别是使用冻存液1-5(实施例2～6)冻存后复苏的类器官，依次为乳腺类器官、肾癌类器官、膀胱类器官、小肠类器官和肺类器官。

图6～图8分别是使用对比冻存液1-3(对比例1～3)冻存后复苏的类器官，分别为乳腺类器官、膀胱类器官和乳腺类器官。

图9是发明冻存液冻存的类器官和对比冻存液冻存的类器官的凋亡情况。

图10是流式细胞术检测CD133，CD44，CD24三个肿瘤干细胞标志物的表达情况。

图11是干细胞相关基因SOX2，OCT4以及Wnt信号通路关键调控基因β-Catenin的表达水平的变化情况。

图12是发明冻存液冻存的细胞系和对比冻存液冻存的细胞系的贴壁情况。

具体实施方式

本发明的第一个方面，提供：

一种微组织无血清冻存液，其包括如下组分：

十二烷基磺酸钠：0.1 wt%～2.5wt%

二甲基亚砜：5 v/v %～10v/v%

细胞外冷冻保护剂：5 wt %～10 wt%

非还原性糖：0.1 M～0.5 M

蛋白聚糖类大分子：0.1 wt %～2 wt %

凋亡抑制剂：0.1～30μM

ROS抑制剂：0.1～10μM

抗氧化剂：0.5 wt %～1 wt %。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，各组分的含量如下：

十二烷基磺酸钠：0. 5 wt %～2 wt %

二甲基亚砜：5%～10v/v%

细胞外冷冻保护剂：5 wt %～10 wt %

非还原性糖：0.2M～0.4M

蛋白聚糖类大分子：0.5 wt %～1 wt%

凋亡抑制剂：5～20μM

ROS抑制剂：1～10μM

抗氧化剂：0.5 wt %～1 wt %。

实验数据表明，这一组成下的微组织无血清冻存液，具有更好的保护效果。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述细胞外冷冻保护剂为羟乙基淀粉。实验数据表明，羟乙基淀粉具有更好的保护效果。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述非还原性糖选自海藻糖、蔗糖、果糖中的至少一种。实验数据表明，这些非还原性糖可以更好地束缚水分子，具有更好的保护效果。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述蛋白聚糖类大分子选自透明质酸、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素中的至少一种。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述凋亡抑制剂选自TGF-β 受体抑制剂如A83- 01、p-38 MAPK抑制剂如SB202190、z-vad-fmk、Q-VD-Oph、Pinacidil中的至少一种。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述ROS抑制剂选自中Acetylcysteine、Ensulizole、SEA0400、Cynarin、GSK2795039的至少一种。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，所述抗氧化剂选自维生素E、褪黑素、谷胱甘肽、维生素C中的至少一种。

在一些微组织无血清冻存液的实例中，各组分的含量如下：

十二烷基磺酸钠：0.5 wt%～2wt%

二甲基亚砜：5 v/v %～10v/v%

细胞外冷冻保护剂羟乙基淀粉：5 wt %～10 wt %

非还原性糖海藻糖：0.2M～0.4M

硫酸乙酰肝素：0.5 wt %～1 wt %

凋亡抑制剂A83- 01：5～20μM

ROS抑制剂Acetylcysteine：1～10μM

抗氧化剂谷胱甘肽：0.5 wt %～1 wt %。

本发明的第二个方面，提供：

一种微组织的冻存方法，包括如下步骤：

S1) 收集培养得到的微组织；

S2) 向微组织中加入缓冲液或无血清培养基，离心后取沉淀；

通过向微组织中加入缓冲液或无血清培养基，离心后取沉淀，可以实现清洗微组织的目的，排除微组织培养过中的血清成分的影响。优选的，清洗微组织的缓冲液或无血清培养基与微组织无血清冻存液所使用的溶剂相同。

冻存后的微组织可转移至液氮罐长期保存。

降温速度可以根据需要进行调整。在一些冻存方法的实例中，冻存时，降温速率为0.5～3 ℃/min。

在一些冻存方法的实例中，所述微组织的粒径为10～1000 μm。

在一些冻存方法的实例中，所述微组织在所述微组织无血清冻存液中的密度为1～10 ×10⁶/mL。这一比例下，可以达到更好地保护效果。

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：无血清冻存液的配制

冻存液1：

按照十二烷基磺酸钠1.5%、二甲基亚砜5%(v/v)、羟乙基淀粉7%、海藻糖0.4M、透明质酸0.1%-2%、A83-01 1μM、Acetylcysteine 10μM、谷胱甘肽 1%，用溶剂DMEM/F-12培养基混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

冻存液2：

按照十二烷基磺酸钠1.5%、二甲基亚砜6%(v/v)、羟乙基淀粉7%、海藻糖0.4M、透明质酸0.1%-2%、SB202190 10 uM、Acetylcysteine 10μM、维生素E 1%，用溶剂DMEM/F-12培养基混匀混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

冻存液3：

按照十二烷基磺酸钠1.5%、二甲基亚砜7%(v/v)、羟乙基淀粉7%、蔗糖0.3M、硫酸乙酰肝素0.1%-2%、A83-01 1 uM、Ensulizole 15μM、维生素C 1%，用溶剂DMEM/F-12培养基混匀混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

冻存液4：

按照十二烷基磺酸钠1.5%、二甲基亚砜8%(v/v)、羟乙基淀粉7%、蔗糖0.4M、透明质酸0.1%-2%、A83-01 1 uM、GSK2795039 20μM、谷胱甘肽 1%，用溶剂DMEM/F-12培养基混匀混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

冻存液5：

按照十二烷基磺酸钠1.5%、二甲基亚砜9%(v/v)、羟乙基淀粉7%、果糖0.3M、透明质酸0.1%-2%、z-vad-fmk 10 uM、Acetylcysteine 10μM、谷胱甘肽 1%，用溶剂DMEM/Basic培养基混匀混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

对比冻存液1：

二甲基亚砜10%、90%FBS混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

对比冻存液2：

市售用于普通细胞系冻存的无血清冻存液。

对比冻存液3：

按照十二烷基磺酸钠1.5%、二甲基亚砜5%(v/v)、羟乙基淀粉7%、海藻糖0.4M、透明质酸0.1%-2%、谷胱甘肽 1%，用溶剂DMEM/F-12培养基混匀，并用0.22um的滤头过滤除菌。

实施例2：三维培养体系乳腺癌类器官的冻存

采用实施例1中冻存液1，具体步骤为：

S1) 乳腺癌类器官培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL TrypLE消化5-7min，收集类器官悬液至15mL离心管中；

S2) 向类器官悬液中加入7mL的DPBS缓冲溶液终止消化，300g离心5min；

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中冻存液1重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

S4) 冻存管标记好类器官编号、冻存日期后，放入程序性梯度降温盒置于-80℃冰箱，12-24h后移入液氮罐。

实施例3：三维培养体系肾癌类器官的冻存

采用实施例1中冻存液2，具体步骤为：

S1) 肾类器官培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL TrypLE消化5-7min，收集类器官悬液至15mL离心管中；

S2) 向类器官悬液中加入7mL的DPBS缓冲溶液终止消化，150g离心5min；

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中冻存液2重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

实施例4：三维培养体系膀胱癌类器官的冻存

S1) 采用实施例1中冻存液3，具体步骤为：

S2) 膀胱癌类器官培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL TrypLE消化5-7min，收集类器官悬液至15mL离心管中；

S3) 向类器官悬液中加入7mL的DPBS缓冲溶液终止消化，150g离心5min；

S4) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中冻存液3重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

S5) 冻存管标记好类器官编号、冻存日期后，放入程序性梯度降温盒置于-80℃冰箱，12-24h后移入液氮罐。

实施例5：三维培养体系小肠类器官的冻存

采用实施例1中冻存液4，具体步骤为：

S1) 小肠类器官培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL TrypLE消化5-7min，收集类器官悬液至15mL离心管中；

S2) 向类器官悬液中加入7mL的DPBS缓冲溶液终止消化，300离心5min；

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中冻存液4重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

实施例6：三维培养体系肺癌类器官的冻存

采用实施例1中冻存液5，具体步骤为：

S1) 肺癌类器官培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL TrypLE消化5-7min，收集类器官悬液至15mL离心管中；

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中冻存液5重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

对比例1：三维培养体系乳腺癌类器官的冻存

采用实施例1中对比冻存液1，具体步骤为：

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中对比冻存液1重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

对比例2：三维培养体系膀胱类器官的冻存

采用实施例1中对比冻存液2，具体步骤为：

S1) 膀胱癌类器官培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL TrypLE消化5-7min，收集类器官悬液至15mL离心管中；

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中对比冻存液2重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

对比例3：三维培养体系膀胱类器官的冻存

采用实施例1中对比冻存液3，具体步骤为：

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中对比冻存液3重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

实施例7：

冻存的类器官复苏，将实施例2-8中冻存的类器官按以下步骤复苏：

S1) 将冻存的类器官从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴锅中加热直至融解；

S2) 将融解后的类器官悬液转移至15mL离心管中，缓慢滴入预热的10 mL培养基(2min内滴加完毕)，分成三份标记为A，B，C三组，300g离心5min；

S3) 将A组离心后悬液弃去上清，加入适量Matrigel(Corning® Matrigel®)重悬，以每孔25uL悬液接种于48孔板内，转入37℃，5%CO₂培养箱培养24h用于后续凋亡检测；

S4) 将B组离心后弃去上清，加入适量Matrigel重悬，以每孔25uL悬液接种于48孔板内，转入37℃，5%CO₂培养箱培养3-5天用于后续拍照观察；

S5) 将C组悬液离心后弃去上清，用含5%的培养基重选后，以1000 cells/well的密度接种于96孔板内，培养3-5天用于后续活性测试。

实施例8：复苏类器官的活性测试

按以下步骤进行：

S1) 实施例7中C组类器官培养3-5天后(具体时间因类器官种类而异)，吸出部分培养基，使孔中剩余体积为50uL；

S2) 每孔加入50uL的CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay(Promega)检测液，避光常温孵育15min，用酶标仪检测发光值并计算各个类器官的成活率。

表1冻存液冻存类器官活性对比结果

从表1可以看出，本发明五种冻存液冻存后的类器官复苏后活率均大于90%，其中冻存液1和冻存液2的效果显著优于对比冻存液1、对比冻存液2、对比冻存液3。

实施例9：复苏类器官拍照观察

将实施例7中B组类器官培养3-5天后，置于显微镜明场下观察类器官生长状况并拍照。

图1～图5分别是使用冻存液1-5(实施例2～6)冻存后复苏的类器官，依次为乳腺类器官、肾癌类器官、膀胱类器官、小肠类器官和肺类器官。可以看到，使用发明冻存液冻存的类器官复苏后生长状况良好，直接观察未观察到凋亡现象，类器官结构完整。

图6～图8分别是使用对比冻存液1-3(对比例1～3)冻存后复苏的类器官，分别为乳腺类器官、膀胱类器官和乳腺类器官。可以看到，对比冻存液冻存的类器官复苏后状态一般，且可以观察到明显的类器官结构丢失，结构表面有较多单细胞因细胞凋亡而脱离。

实施例10：复苏类器官的凋亡测试

复苏类器官的凋亡测试，按以下步骤进行：

S1) 实施例7中A组48孔板内培养基吸出，每孔加入500-600uL细胞收集液，收集类器官并离心（300g，5min）；

S2) 弃去上清，用预冷的FPBS清洗沉淀3次，转移类器官至流式检测管中，离心弃去上清（300g，5min，4℃）；

S3) 根据Annexin V-FITC/ PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒（Procell，P-CA-201）说明书，依次加入Annexin V 和PI对类器官进行染色，常温避光孵育30min，上流式细胞仪检测类器官凋亡情况。

图9分别为发明冻存液冻存的类器官和对比冻存液冻存的类器官的凋亡情况，图中CPA1、CPA2分别为实施例1中冻存液1和冻存液2。结果显示：对比冻存液冻存的类器官复苏后出现凋亡，而发明冻存液没有出现凋亡，表明发明冻存液确实能有效抑制冻存引起的细胞凋亡。值得注意的是仅缺少凋亡抑制剂和ROS抑制剂的对比冻存液3类器官也会出现明显凋亡。

各冻存液冻存类器官复苏后的凋亡情况如表2所示。

表2、不同冻存液冻存类器官复苏后的凋亡情况

由表2的数据可以看出，冻存液1～5的类器官在复苏后，均未发现有有凋亡情况，冻存效果优于对比冻存液1～3。

实施例11：复苏类器官的干性分析

按以下步骤进行：

S1) 使用实施例1中的冻存液1、10%FBS冻存液、对比例1的冻存液冻存乳腺癌类器官，冻存1周后复苏类器官，培养至第二代时收集类器官；

S2) 将收集的部分细胞用流式细胞术检测CD133，CD44，CD24三个肿瘤干细胞标志物的表达情况。

结果如图10所示，使用冻存液1冻存的类器官良好保持干性特征CD133+/CD44+/CD24-，而其余两种冻存方式的标志物表达水平均有所降低。

将收集的类器官使用Q-PCR检测干细胞相关基因SOX2，OCT4以及Wnt信号通路关键调控基因β-Catenin的表达水平的变化情况。如图11所示，使用冻存液1的类器官无明显变化，而对比例1和对比例2的干性相关基因均下调。

实施例12：

MDA-MB-468乳腺细胞球的冻存，包含以下步骤：

S1) 细胞球培养至可冻存状态，吸出培养基后加入1mL消化液消化3-5min，收集细胞悬液至15mL离心管中；

S3) 小心吸去上清，尽量吸走所有剩余缓冲液，加入1-2mL实施例1中冻存液1-5及对比冻存液1-2重悬细胞并转移到1.5mL冻存管；

乳腺细胞球的复苏，包含以下步骤：

S1) 将冻存的细胞球从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴锅中加热直至融解；

S2) 将融解后的细胞球悬液转移至15mL离心管中，并加入10倍体积的DPBS稀释，300g离心5min；

S3) 弃去上清，加入适量体积的细胞球培养基重悬细胞球，并将一部分转移至培养皿内；

S4) 剩余部分细胞悬液，以1000 cells/well 每孔接种于96孔板内，用于活率检测；

S5) 培养24h-48h后显微镜下观察生长状态并拍照；

S6) 96孔板培养3天后，吸出部分培养基，使孔中剩余体积为50uL；

S7) 每孔加入50uL的CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay(Promega)检测液，避光常温孵育15min，用酶标仪检测发光值并计算各个类器官的成活率。

结果如表3所示。

表3、细胞球冻存液对比实验结果

由表3的结果可以看出，冻存液1、冻存液2和冻存液5的效果显著好于对比冻存液1～3。

实施例13：MDA-MB-231细胞系冻存测试

S1) 将MDA-MB-231细胞培养至汇集度达到80%-90%时，收集细胞计活细胞数并均分成7等份，1200/min离心3分钟，弃去上清保留沉淀；

S2) 用1mL的实施例1中配制好的发明冻存液1-5和对比冻存液重悬细胞沉淀，转移至冻存管；

S3) 在冻存管上标记好样本编号、冻存液批号、冻存日期等相关信息；

S4) 将冻存管放入程序性梯度降温盒，放入-80℃冰箱8-12h后移入液氮罐；

S5) 在液氮罐储存3-10天后，取出冻存的MDA-MB-231细胞，立即放入37℃恒温水浴锅中解冻直至融解；

S6) 向融解的细胞液中加入4倍体积的完全培养基稀释，1200r/min离心3min，弃去上清；

S7) 加入5mL培养基重悬细胞，混匀后吸取0.5mL加入等体积的0.4%的台盼蓝溶液，显微镜下计活细胞数。并计算损耗率：

计数结果如表4所示。

表4、复苏后的的细胞计数结果

将剩余细胞计数后接种于6孔板和96孔板中继续培养24h，每一种冻存液设置3个复孔。

将6孔板培养的细胞置于显微镜下观察细胞的贴壁能力，如图12所示。图中CPA1～3分别为实施例中冻存液1、冻存液2和冻存液3。图中可以看出使用冻存液1～3冻存的细胞复苏后的贴壁能力明显强于对比冻存液1～3。对比冻存液1～3冻存的细胞复苏后，贴壁率较低，且出现细胞凋亡现象。

将96孔板培养的细胞用CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay检测活性，结果如表5所示。

表5 细胞复苏后活率统计

结果表明，发明冻存液不仅能有效冻存类器官，细胞球等微组织，还能有效冻存细胞系。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种微组织无血清冻存液，其特征在于：其包括如下组分：

十二烷基磺酸钠：0.1 wt%～2.5wt%

二甲基亚砜：5 v/v %～10v/v%

细胞外冷冻保护剂：5 wt %～10 wt%

非还原性糖：0.1 M～0.5 M

蛋白聚糖类大分子：0.1 wt %～2 wt %

凋亡抑制剂：0.1～30μM

ROS抑制剂：0.1～10μM

抗氧化剂：0.5 wt %～1 wt %。

2.根据权利要求1所述的微组织无血清冻存液，其特征在于：各组分的含量如下：

十二烷基磺酸钠：0. 5 wt %～2 wt %

二甲基亚砜：5%～10v/v%

细胞外冷冻保护剂：5 wt %～10 wt %

非还原性糖：0.2M～0.4M

蛋白聚糖类大分子：0.5 wt %～1 wt%

凋亡抑制剂：5～20μM

ROS抑制剂：1～10μM

抗氧化剂：0.5 wt %～1 wt %。

3.根据权利要求1或2所述的微组织无血清冻存液，其特征在于：所述细胞外冷冻保护剂为羟乙基淀粉；和/或

4.根据权利要求3所述的微组织无血清冻存液，其特征在于：各组分的含量如下：

十二烷基磺酸钠：0.5 wt%～2wt%

二甲基亚砜：5 v/v %～10v/v%

细胞外冷冻保护剂羟乙基淀粉：5 wt %～10 wt %

非还原性糖海藻糖：0.2M～0.4M

硫酸乙酰肝素：0.5 wt %～1 wt %

凋亡抑制剂A83- 01：5～20μM

ROS抑制剂Acetylcysteine：1～10μM

抗氧化剂谷胱甘肽：0.5 wt %～1 wt %。

5.根据权利要求1或2所述的微组织无血清冻存液，其特征在于：微组织无血清冻存液的溶剂为DPBS缓冲溶液或无血清基础培养基。

6.根据权利要求5所述的微组织无血清冻存液，其特征在于：所述无血清基础培养基选自DMEM/F-12培养基、DMEM/Basic培养基和1640培养基中的一种。

7.一种微组织的冻存方法，包括如下步骤：

收集培养得到的微组织；

向微组织中加入缓冲液或无血清培养基，离心后取沉淀；

向沉淀中加入权利要求1～6任一项所述的微组织无血清冻存液，并转移至程序性降温盒冻存。

8.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于：冻存时，降温速率为0.5～3 ℃/min。

9.根据权利要求7所述的冻存方法，其特征在于：所述微组织的粒径为10～1000 μm。

10.根据权利要求7～9任一项所述的冻存方法，其特征在于：所述微组织在所述微组织无血清冻存液中的密度为1～10 ×10⁶/mL。