CN114867526B

CN114867526B - 犬白介素-4受体α的抗体

Info

Publication number: CN114867526B
Application number: CN202080088354.XA
Authority: CN
Inventors: M·莫尔塞耶; 张远征
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2025-11-07
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: JP7727632B2; JP2025166118A; CN114929746B; WO2021123089A1; JP2025166111A; BR112022012203A2; AU2020407853A1; CA3160589A1; EP4076653A1; US20230044037A1; MX2022007672A; JP2023506924A; AU2020409583A1; JP7727633B2; BR112022011797A2; EP4077390A1; MX2022007677A; CA3162031A1; JP2023506923A; CN114929746A

Abstract

本发明提供了针对犬IL‑4受体α的抗体，其对犬IL‑4受体α具有高结合亲和力且可以阻断犬IL4和/或IL13与犬IL‑4受体α的结合。本发明还涉及与针对犬IL4受体α的抗体结合的犬IL‑4受体α的表位。本发明还提供了所述抗体用于治疗狗的特应性皮炎的用途。

Description

犬白介素-4受体α的抗体

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2020年4月24日提交的美国临时专利申请序列号63/015,209，2020年4月24日提交的美国临时专利申请序列号63/015,220，2019年12月20日提交的美国临时专利申请序列号62/951,778和2019年12月20日提交的美国临时专利申请序列号62/951,793的优先权，上述所有申请的内容通过全文引入并入本文。

技术领域

本发明涉及犬IL-4受体α的抗体，其对犬IL-4受体α具有高结合亲和力，并且可阻断犬IL-4和/或IL-13与犬IL-4受体α的结合。本发明还涉及本发明的抗体在治疗狗的特应性皮炎中的用途。

背景技术

免疫系统包括由常驻和再循环的特化细胞组成的网络，这些细胞协同地作用以保护宿主免受传染性疾病和癌症的侵害。免疫系统执行此功能的能力在很大程度上取决于白细胞分泌的统称为白介素的一组蛋白质的生物活性。在经过充分研究的白介素中，有四种重要的分子被鉴定为白介素-4(IL-4)、白介素-13(IL-13)，白介素-31(IL-31)和白介素-22(IL-22)。IL-4和IL-13是密切相关的蛋白质，其可由许多细胞类型分泌，包括CD4⁺Th2细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、巨噬细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。IL-4和IL-13显示出许多重叠的功能并且对于T细胞依赖性体液免疫应答的发展是关键的。已知IL-4以高亲和力结合两种受体，即I型和II型IL-4受体。I型IL-4受体由IL-4受体α链和共同γC链组成。II型IL-4受体由IL-4受体α链和IL13受体α1链组成。IL-13结合II型IL-4受体，并结合称为IL-13受体α2的独特受体。IL-13与IL-13受体α2的结合不转导信号，且该受体也以可溶形式分泌。因此，IL-13受体α2通常被称为诱饵受体。虽然IL-4、IL-31和IL-22是产生保护免受细胞外病原体(例如，组织或腔内寄生的寄生虫)侵害所必需的免疫反应发展的关键细胞因子，但这些细胞因子也与人和动物的过敏性疾病(包括特应性皮炎)的发病机制有关。

特应性皮炎(AD)是一种复发性瘙痒和慢性炎性皮肤病，其特征是人体的免疫系统失调和表皮屏障异常。特应性皮炎的病理和免疫学属性已成为广泛研究的主题[Rahman等人Inflammation&Allergy-drug target 10:486-496(2011)和Harskamp等人,Seminar inCutaneous Medicine and Surgery 32:132-139(2013)中综述]。特应性皮炎也是伴侣动物(尤其是狗)的常见疾病，据估计其患病率约为犬科动物种群的10-15％。狗和猫中特应性皮炎的发病机制[Nuttall等人,Veterinary Records 172(8):201-207(2013)综述]与人类中特应性皮炎的发病机制显著相似，包括多种免疫细胞的皮肤浸润和包括IL-4、IL-13和IL-31的优势的CD4⁺Th2极化的细胞因子环境。此外，IL-22与导致表皮增生的过度上皮增殖有关，表皮增生是特应性皮炎的特征。

例如，针对犬IL-31的抗体已被证明对与犬的特应性皮炎相关的瘙痒具有显著效果[US 8,790,651 B2；US 10,093,731B2]。此外，针对人类IL-31受体α(IL31RA)的抗体已经过测试，并发现对人类中的特应性皮炎相关的瘙痒具有显著效果[Ruzicka等人,NewEngland Journal of Medicine,376(9),826–835(2017)]。因此，阻断IL-31与其受体IL31RA的结合导致与特应性皮炎相关的瘙痒的缓解。

已经开发出针对人IL-4受体α(IL-4R_α)的单克隆抗体，并且已经广泛测试了其中这些抗体中的一些对治疗人类特应性皮炎的治疗效果[参见，例如，US2015/0017176 A1]。最近，还公开了阻断犬IL-4与犬IL-4R_α结合的针对犬IL-4R_α的犬源化抗体[US2018/0346580A1，通过引用将其全部并入本文]。由于II型IL-4受体由IL-4受体α链和IL-13受体α1链组成，因此已经获得了针对犬IL-4R_α的抗体，该抗体可以阻断犬IL-4和犬IL-13与II型犬IL-4受体结合，从而用于帮助阻断与特应性皮炎相关的炎症[US2018/0346580A1]。

白介素22(IL-22)，也称为IL-10相关T细胞衍生的诱导因子(IL-TIF)，属于IL-10细胞因子家族。IL-22是在人体中抗CD3刺激后由正常T细胞产生的。注射脂多糖后，各种器官中也会诱导小鼠IL-22表达，这表明IL-22可能参与炎性反应。IL-22特异性结合IL-10R2(也称为IL-10Rβ)和白介素22受体(IL-22R)的异二聚体复合物组成的受体复合物，并通过该受体复合物发出信号[参见Lee等人,Pharmacology Research&Perspectives,1-13页(2018:e00434)]。白介素22受体也称为白介素22R，α1；IL-22RA1；IL-22R1；zcytor11；和CRF2-9[Xu等人,Proc.Nat.Acad.Sci.98(17)9511-9516(2001)；Gelebart和Lai,Atlas ofGenetics and Cytogenetics 14(12):1106-1110(2010)]。IL-22在伤口愈合过程中诱导上皮细胞增殖，且其缺乏可导致不受控的增殖和增强肿瘤发展[Huber等人,Nature 491:259263(2012)]。IL-22在几种肝癌细胞系中已显示激活STAT-1和STAT-3并上调急性期蛋白的产生。白介素22和IL-22R的抗体通过阻断IL-22与IL-22R的相互作用且因此阻断导致上皮增殖的相关信号传导途径来起到抗增殖剂的作用。

然而，尽管最近在治疗特应性皮炎方面取得了成功，但目前所采用的疗法都没有产生伴随着对皮肤炎症的显著效果及皮肤屏障功能改善的快速起效的抗瘙痒作用。因此，需要设计可以解决特应性皮炎的一种或多种症状的更好的疗法。

本文对任何参考文献的引用不应解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”获得。

发明内容

本发明提供了针对犬IL4Rα(IL4R_α)的新的犬源化抗体，其在具体的实施方案中是分离的，其具有比现有技术中的那些抗体优异的性质，例如比现有技术的抗犬IL-4受体α抗体更紧密的结合。在具体的实施方案中，本发明提供了以特异性结合犬白介素-4受体α的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其包含含有一组三个重链互补决定区(CDR)的重链：CDR重链1(HCDR1)、CDR重链2(HCDR2)和CDR重链3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列，并且HCDR3包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在相关实施方案中，以特异性结合犬白介素-4受体α(IL4R_α)的哺乳动物抗体或其抗原结合片段还包含含有一组三个轻链CDR的轻链：CDR轻链1(LCDR1)、CDR轻链2(LCDR2)和CDR轻链3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，并且所述LCDR3包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在优选的实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬IL4R_α并阻断犬IL4R_α与犬白介素-4(cIL-4)的结合。在相关实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬IL-4R_α并阻断犬IL-4R_α与犬白介素-13(cIL-13)的结合。在其它实施方案中，哺乳动物抗体或其抗原结合片段结合犬IL-4R_α并阻断犬IL-4R_α与cIL4和与cIL-13的结合。

在具体的实施方案中，犬IL4Rα的哺乳动物抗体是鼠抗体。在相关的实施方案中，犬IL4Rα的哺乳动物抗体是犬源化的鼠抗体。在特定的实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D cFc的重链，但天然存在的IgG1-D铰链区被包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的铰链区取代。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D cFc的重链，但天然存在的IgG1-D铰链区被含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的铰链区取代。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D cFc的重链，但天然存在的IgG1-D铰链区被含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的铰链区替代。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有IgG-D cFc的重链，但天然存在的IgG1-D铰链区被含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的铰链区替代。

在具体的实施方案中，犬源化抗体包含含有修饰的犬IgG-B(IgG1bm)的重链，所述修饰的犬IgG-B(IgG1bm)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在某些实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：40的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：41的重链。在其它实施方案中，犬源化抗体包含含有氨基酸序列SEQ IDNO：42的重链。在具体的实施方案中，犬源化抗体还包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：39的轻链。在可选的实施方案中，犬源化抗体还包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：44的轻链。

在特定的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO：46。在更具体的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段结合犬IL4R_α的以下氨基酸残基中的一个、两个或全部三个：SEQ ID NO：5的K₉₇、H₁₁₂、T₁₁₃。在相关的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO：47。在更具体的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段结合犬IL4R_α的以下氨基酸残基中的一个、两个、三个、四个或全部五个：SEQ ID NO：5的S₁₆₄、T₁₆₅、S₁₇₁、Y₁₇₂、S₁₇₃和R₁₇₅。在更具体的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段结合SEQID NO：46和SEQ ID NO：47。在这种类型的更具体的实施方案中，犬源化抗体或其抗原结合片段结合犬IL4R_α的以下氨基酸残基中的一个、两个或全部三个：SEQ ID NO：5的K₉₇、H₁₁₂、T₁₁₃和/或结合犬IL4R_α的以下氨基酸残基的一个、两个、三个、四个或所有五个：SEQ ID NO：5的S₁₆₄、T₁₆₅、S₁₇₁、Y₁₇₂、S₁₇₃和R₁₇₅。

本发明还提供了编码CDR、犬源化抗体或其抗原结合片段的重链和/或犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸，包括分离的核酸。此外，本发明提供了包含这种核酸的表达载体，以及包含这种表达载体的宿主细胞。

此外，本发明提供了包含本发明的犬源化抗体及其抗原结合片段以及药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。本发明还提供了治疗特应性皮炎的方法，包括将上述组合物中的一种施用于患有特应性皮炎的犬科动物。在具体的实施方案中，本发明提供了帮助阻断与特应性皮炎相关的炎症的方法，包括向有此需要的犬科动物施用治疗有效量的本发明的药物组合物。

本发明的这些和其他方面将通过参考以下的附图说明和具体实施方式得到更好的理解。

附图说明

图1显示两种不同的犬源化单克隆抗犬白介素-4受体α抗体，称为c4H3[参见，WO2016/156588]和c146E2-H3L3，评价了它们抑制STAT-6磷酸化的能力。数据显示，在犬白介素-4存在下，两种抗体均导致STAT-6磷酸化的剂量依赖性抑制。在不存在IL-4Rα(IL-4R_α)抗体的情况下的IL-4对照显示在图的右上部分。

图2显示两种不同的犬源化单克隆抗犬白介素-4受体α抗体，称为c4H3[参见，WO2016/156588]和c146E2-H3L3，评价了它们抑制STAT-6磷酸化的能力。数据显示，在犬白介素-13存在下，两种抗体均导致STAT-6磷酸化的剂量依赖性抑制。在不存在IL-4Rα(IL-4R_α)抗体的情况下的IL-13对照显示于图的右上部分。

图3显示通过ELISA评估的含有λ或κ轻链的犬源化抗犬IL4R_α抗体的结合。结果显示含有λ轻链的犬源化抗犬IL4R_α抗体(c146C1L1-H1、c146C1L1-H2和c146C1L1-H3)与犬IL4R_α以及含有相同CDR但具有κ轻链的犬源化抗犬IL4R_α抗体(c146E2-H3L3)结合。146mc是小鼠-犬嵌合抗体阳性对照，和Iso-Ctr(阴性对照)是不相关的犬源化抗体。

图4显示在犬IL-4R_α上c146E2-H3L3抗体的包含氨基酸序列SEQ ID NO：46和SEQID NO：47的表位。

具体实施方式

作为对特应性皮炎更好疗法需要的回应，本发明提供可实现对与特应性皮炎相关的皮肤炎症的显著作用的犬源化抗体、具有犬源化抗体的制剂和方法。

缩写

贯穿本发明的具体实施方式和实施例，将使用以下缩写：

ADCC抗体依赖性细胞毒性

CDC补体依赖性细胞毒性

CDR免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义

EC50导致50％效力或结合的浓度

ELISA酶联免疫吸附试验

FR抗体框架区：不包括CDR区的免疫球蛋白可变区

IC50导致50％抑制的浓度

IgG免疫球蛋白G

Kabat由Elvin A.Kabat开创的免疫球蛋白比对和编号系统[Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版。Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)]

mAb单克隆抗体(也称为Mab或MAb)

V区不同抗体之间序列可变的IgG链的片段。它在轻链中延伸至Kabat残基109和在重链中的113。

VH免疫球蛋白重链可变区

VL免疫球蛋白轻链可变区

VK免疫球蛋白κ轻链可变区

定义

为了更容易理解本发明，某些技术和科学术语具体定义如下。除非在本文其他地方特殊定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。

如本文所用，包括所附权利要求，诸如“一”、“一个”和“该”的词的单数形式包括它们对应的复数引用，除非上下文另有明确规定。

“施用”和“处理”，当它应用于动物(例如犬科动物受试者、细胞、组织、器官或生物流体)时，是指外源性药物、治疗、诊断试剂或组合物与动物(例如犬科动物受试者、细胞、组织、器官或生物流体)接触。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体与细胞接触。

“施用”和“处理”还意指例如通过试剂、诊断、结合化合物或通过另一种细胞进行的体外和离体处理。术语“受试者”包括任何有机体，优选动物，更优选哺乳动物(例如，犬科动物、猫科动物或人)并且最优选犬科动物。

“治疗”或“处理”是指将治疗剂(如含有本发明的任何抗体的组合物)内部或外部施用于例如具有一种或多种症状或被怀疑患有该药剂具有治疗活性的病症的犬科动物受试者或患者。

通常，药剂以有效减轻和/或改善治疗的受试者或群体中的一种或多种疾病/病症症状的量施用，无论是通过任何临床可测量度诱导此类症状的消退或抑制此类症状的进展。有效缓解任何特定疾病/病症症状的治疗剂的量(也称为“治疗有效量”)可以根据诸如患者(例如，犬科动物)的疾病/病症状态、年龄和体重，以及药物组合物在受试者中引起期望反应的能力的因素而变化。可以通过兽医或其他熟练的医疗保健提供者通常使用的任何临床评估来评估疾病/病症症状是否已经减轻或改善，以评估该症状的严重性或进展状态。尽管本发明的实施方案(例如，治疗方法或制品)可能不能有效地减轻每个受试者的目标疾病/病症症状，但它应该减轻具有统计学显著数量的受试者的目标疾病/病症症状，如由本领域已知的任何统计检验确定的，如Student’st检验、卡方检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验。

“治疗”在应用于人类、兽医(例如犬科动物)或研究对象时，是指治疗性处理以及研究和诊断应用。“治疗”在应用于人类、兽医(例如犬科动物)或研究对象，或细胞、组织或器官时，包括本发明的抗体与例如，犬科动物或其他动物受试者、细胞、组织、生理区室(physiological compartment)或生理流体的接触。

如本文所用，除非另有说明，术语“犬科动物”包括所有家狗(domestic dogs)、牧羊犬(Canis lupus familiaris)或家犬(Canis familiaris)。

如本文所用，术语“猫科动物”是指猫科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和家养成员，包括家猫、纯种和/或杂种伴侣猫、展示猫、实验猫、克隆猫和野猫(wild cats)或流浪猫(feral cats)。

如本文所用，术语“犬框架”是指犬抗体的重链和轻链的除了本文定义为CDR残基的高变区残基以外的氨基酸序列。关于犬源化抗体，在大多数实施方案中，天然犬CDR的氨基酸序列被两条链中相应的外源CDR(例如，来自小鼠抗体的CDR)替换。任选地，犬抗体的重链和/或轻链可以包含一些外源非CDR残基，例如，以保持犬抗体内外源CDR的构象，和/或改变Fc功能，如以下示例和/或在US10,106,607B2中公开，特此通过引用将其全部并入本文。

缩写为“Fc”的“片段可结晶区(Fragment crystallizable region)”对应于与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的CH3-CH2部分。Tang等人首先描述了四种犬IgG中每一种的犬片段可结晶区(cFc)[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)；另见,Bergeron等人,Vet.Immunol.Immunopathol.157:31-41(2014)和US10,106,607B2]。

如本文所用，犬Fc(cFc)“IgG-Bm”是在IgG-B的SEQ ID NO：10的氨基酸序列中包含两(2)个氨基酸残基置换D31A和N63A(见下文)且没有c-末端赖氨酸(“K”)的犬IgG-B Fc。SEQ ID NO：10的位置31处的天冬氨酸残基(D)和SEQ ID NO：10的位置63的天冬酰胺残基(N)在IgG-Bm中被丙氨酸残基(A)置换。这两个氨基酸残基置换用于显著降低天然存在的犬IgG-B的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)[参见US10,106,607 B2，其内容通过引用整体并入本文]。还设想了对IgG-Bm的进一步氨基酸置换，这与可在IgG-B中进行的那些相似，并且可以包括有利于在双特异性抗体中形成异二聚体的氨基酸置换。IgG-B的氨基酸序列，SEQ ID NO：45是：

下面提供了IgG-Bm的氨基酸序列，SEQ ID NO：10。

LGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVALDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG

如本文所用，例如在抗体的氨基酸序列中用另一个氨基酸残基“置换氨基酸残基”等同于用另一个氨基酸残基“替代氨基酸残基”并且表示氨基酸序列中特定位置的特定氨基酸残基已被不同的氨基酸残基替代(或置换)。可以特别设计此类置换，即通过例如重组DNA技术在氨基酸序列的特定位置处有目的地用丝氨酸替代丙氨酸。或者，抗体的特定氨基酸残基或氨基酸残基串可以通过更天然的选择过程用一个或多个氨基酸残基替代，例如基于细胞产生的抗体结合该抗原上给定区域(例如，含有表位或其部分的区域)的能力，和/或使抗体包含保留与它所取代的CDR相同的规范结构的特定CDR。此类置换/替代可导致“变体”CDR和/或变体抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体。抗体可以是单体、二聚体或更大的多聚体。因此，它以最广泛的意义使用，且特别地涵盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、犬源化抗体、完全犬抗体、嵌合抗体和骆驼源化的单域抗体。“亲本抗体”是通过将免疫系统暴露于抗原而获得的抗体，然后修饰抗体用于预期用途，例如将抗体犬源化以用作犬治疗性抗体。

如本文所用，如在标准结合测定(例如，ELISA或流式细胞术)中所确定的，“阻断”或“阻止”或“封闭”例如犬受体与其结合伴体(配体)的结合的本发明的抗体是(部分或完全)阻断犬受体与其犬配体的结合的抗体，反之亦然。

通常，当犬抗原结合活性以摩尔为基础表示时，本发明的抗体或抗原结合片段保留其活性的至少10％(当与亲本抗体相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的犬抗原结合亲和力。还意在本发明的抗体或抗原结合片段可以包括不显著改变其生物学活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。

“分离的抗体”是指纯化状态，且在这种情况下是指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或例如细胞碎片和生长培养基的其他物质。一般而言，术语“分离的”并非意指完全不存在此类物质或不存在水、缓冲剂或盐，除非它们以实质上干扰本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一和第二抗体来自不同的物种。[US4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)]。通常，可变结构域从来自实验动物(例如啮齿动物)的抗体(亲本抗体)获得，而恒定结构域序列从动物受试者抗体(例如人或犬)获得，因此产生的嵌合抗体与亲本(例如啮齿动物)抗体相比，分别在人类或犬科动物受试者中引起不良免疫反应的可能性较小。

如本文所用，术语“犬源化抗体”是指包含来自犬和非犬(例如，鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，犬源化抗体将包含基本上所有的至少一个或多个，通常两个可变结构域(其中所有或基本上所有高变环对应于非犬免疫球蛋白的那些(例如，包含如下例示的6个CDR))，并且所有或基本上所有框架(FR)区(并且通常所有或基本上所有剩余框架)是犬免疫球蛋白序列的那些。如本文所例示的，犬源化抗体包含来自鼠抗犬抗原抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR以及犬框架或修饰的犬框架。修饰的犬框架包含一个或多个如本文所例示的氨基酸变化，其进一步优化犬源化抗体的有效性，例如增加其与其犬抗原的结合和/或其阻断该犬抗原与犬抗原的天然结合伴体结合的能力。

每个轻/重链对的可变区配对形成抗体结合位点。因此，一般而言，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位点通常是相同的。通常，重链和轻链的可变结构域包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其位于相对保守的框架区(FR)内。CDR通常通过框架区对齐，从而能够与特定表位结合。通常，从N端到C端，轻链和重链可变结构域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常，氨基酸对于每个结构域的分配是根据Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978)；Kabat等人,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)或Chothia等人,Nature 342:878-883(1989)]的定义。

如本文所用，术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链可变域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3)[参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)，按序列定义抗体的CDR区域；另见Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，通过结构定义抗体的CDR区域]。如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除了本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

狗IgG有四种已知的IgG重链亚型，且称为IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D。两种已知的轻链亚型称为λ和κ。在本发明的具体实施方案中，除了结合和犬免疫细胞的激活外，本发明的针对其抗原的犬或犬源化抗体最佳地具有两种属性：

1.缺乏例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应子功能，和

2.使用工业标准技术如基于蛋白质A色谱的技术易于大规模纯化。

天然存在的犬IgG同种型都不满足这两个标准。例如，IgG-B可以使用蛋白A纯化，但具有高水平的ADCC活性。另一方面，IgG-A与蛋白A弱结合，但也显示出ADCC活性。此外，IgG-C和IgG-D都不能在蛋白A柱上纯化，尽管IgG-D没有显示ADCC活性。(IgG-C存在相当大的ADCC活性)。本发明解决这些问题的一种方式是通过提供对本发明抗原特异性的修饰的本发明的犬IgG-B抗体，其缺乏诸如ADCC的效应子功能并且可以使用工业标准蛋白A色谱法容易地纯化。

如本文所用，“抗炎抗体”是可以在动物中充当抗炎剂的抗体，所述动物包括例如人、犬科动物和/或猫科动物的哺乳动物，特别是关于特应性皮炎。在特定实施方案中，抗炎抗体结合IL-4/IL-3信号传导途径中的特定蛋白质，例如IL-4或受体IL-4R_α。抗炎抗体与其相应抗原(例如，IL-4或IL-4R_α)的结合抑制了例如IL-4与IL 4R_α的结合，并干扰和/或阻止该途径的信号传导，从而干扰或预防与特应性皮炎相关的慢性炎症。

如本文所用，“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽序列之间在它们最佳比对时的序列相似性。当两个比较序列两者中的一个位置都被相同的碱基或氨基酸残基占据时，例如，如果两个DNA分子中每一个的一个位置被腺嘌呤占据，那么该分子在该位置是同源的。同源性百分比是两个序列共享的同源位置数除以比较的位置总数×100。例如，如果两个序列的10个位置中有6个在序列最佳比对时匹配或同源，则这两个序列是60％同源的。通常，当两个序列比对以获得最大百分比同源性时进行比较。序列同一性是指当两条序列最佳比对时，两条多肽的氨基酸在等同位置处相同的程度。

如本文所用，当两个序列的氨基酸残基相同时，一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列100％“相同”。因此，当两个氨基酸序列的50％的氨基酸残基相同时，氨基酸序列与第二氨基酸序列50％“相同”。序列比较是在给定蛋白(例如，被比较的蛋白或多肽的一部分)所包含的连续氨基酸残基段上进行的。在特定实施方案中，考虑到否则可能改变两个氨基酸序列之间的对应性的选定缺失或插入。序列相似性包括相同的残基和不相同的、生化相关的氨基酸。生化相关氨基酸具有相似性质且可以是可互换使用的。

“保守修饰的变体”或“保守置换”是指用具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代蛋白质中的氨基酸，使得在不改变蛋白质的生物活性的情况下通常可以进行该改变。一般而言，本领域技术人员认识到，多肽非必需区中的单个氨基酸置换不会显著改变生物活性[参见，例如，Watson等人，MolecularBiology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,p.224(4th Ed.；1987)]。此外，结构或功能相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物活性。示例性的保守置换列于紧接下方的表A中。

表A

示例性的保守氨基酸置换

本发明还涵盖本发明抗体的功能保守变体。如本文所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被改变而不改变所需特性(例如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。此类变体包括但不限于用具有相似特性的氨基酸替换氨基酸，例如上表A的保守氨基酸置换。

“分离的核酸分子”是指基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源，或其某些组合，其与自然界中发现分离的多核苷酸的全部或部分多核苷酸不相关，或与天然不与其连接的多核苷酸连接。出于本公开的目的，应当理解“包含(特定核苷酸序列)的核酸分子”不包括完整的染色体。“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子除了指定序列外，还可以包括多达十个或甚至多达二十个或更多个其他蛋白或其部分或片段的编码序列，或者可以包括可操作地连接的调控序列，其控制所述核酸序列的编码区的表达，和/或可以包括载体序列。

本发明提供本发明的分离的犬源化抗体，该抗体用于治疗病症，例如治疗犬的特应性皮炎的使用方法。在犬科动物中，有四个IgG重链，称为A、B、C和D。这些重链代表了犬IgG的四个不同亚类，称为IgG-A(或IgGA)、IgG-B(或IgGB)、IgG-C(或IgGC)和IgG-D(或IgGD)。两条重链中的每一条都由一个可变结构域(VH)和三个称为CH-1、CH-2和CH-3的恒定结构域组成。CH-1结构域通过称为“铰链”或可选地“铰链区”的氨基酸序列连接到CH-2结构域。

这4条重链的核酸和氨基酸序列首先由Tang等人鉴定[Vet.Immunol.Immunopathol.80:259-270(2001)]。这些重链的氨基酸和核酸序列也可从GenBank数据库中获得。例如，IgGA重链的氨基酸序列的登录号为AAL35301.1，IgGB的登录号为AAL35302.1，IgGC的登录号为AAL35303.1，和IgGD的登录号为(AAL35304.1)。犬抗体还包含两种类型的轻链，κ和λ。这些轻链的DNA和氨基酸序列可以从GenBank数据库中获得。例如，κ轻链氨基酸序列的登录号为ABY57289.1，和λ轻链的登录号为ABY 55569.1。

在本发明中，四种犬IgG Fc片段中每一种的氨基酸序列是基于由Tang等，同上确定的CH1和CH2结构域的确定边界。结合犬IL-4R_α的犬源化鼠抗犬抗体包括但不限于：本发明的抗体，其包含犬IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D重链和/或犬κ或λ轻链以及鼠抗犬IL-4R_αCDR。因此，本发明提供了本发明的分离的犬源化鼠抗犬抗体，其与犬IL-4R_α结合并阻断犬IL-4R_α与其天然结合伴体犬IL-4和/或IL-13的结合。

因此，本发明进一步提供了犬源化鼠抗体和使用本发明的抗体治疗病症的方法，例如，治疗犬的特应性皮炎。

本发明进一步提供了全长犬重链，其可以与相应的轻链匹配以制备犬源化抗体。因此，本发明进一步提供本发明的犬源化鼠抗犬抗原抗体(包括分离的犬源化鼠抗犬抗体)，以及本发明的抗体在治疗病症中的使用方法，例如治疗犬的特应性皮炎。

本发明还提供本发明的抗体，其包含犬片段可结晶区域(cFc区)，其中cFc被遗传修饰以增强、减少或消除一种或多种效应子功能。在本发明的一个方面，遗传修饰的cFc降低或消除了一种或多种效应子功能。在本发明的另一个方面，遗传修饰的cFc增强了一种或多种效应子功能。在某些实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGB Fc区。在另一个这样的实施方案中，遗传修饰的cFc区是遗传修饰的犬IgGC Fc区。在一个具体实施方案中，效应子功能是增强、降低或消除的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在另一个实施方案中，效应子功能是增强、降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在又一个实施方案中，cFc区被遗传修饰以增加、减少或消除ADCC和CDC两者。

为了产生缺乏效应子功能的犬IgG的变体，产生了许多突变的犬IgGB重链。这些变体可以在重链氨基酸序列的Fc部分中包括以下单个或组合的置换中的一个或多个：P4A、D31A、N63A、G64P、T65A、A93G和P95A。将变体重链(即，包含此类氨基酸置换)克隆到表达质粒中，并与包含编码轻链的基因的质粒一起转染到HEK 293细胞中。评估从HEK 293细胞表达和纯化的完整抗体与Fc_γRI和C1q的结合，以评估它们介导免疫效应子功能的潜力。[参见US 10,106,607 B2，其内容通过引用整体并入本文。]

本发明还提供修饰的犬IgG-D，其代替其天然IgG-D铰链区，它们包含来自以下的铰链区：

IgG-A:FNECRCTDTPPCPVPEP SEQ ID NO:6

IgG-B:PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM SEQ ID NO:7；或

IgG-C:AKECECKCNCNNCPCPGCGL SEQ ID NO:8。

或者，IgGD铰链区可以通过用脯氨酸残基替换丝氨酸残基来遗传修饰，即(替代天然存在的丝氨酸残基的脯氨酸残基(P)加下划线并为粗体)。此类修饰可导致缺乏Fab臂交换的犬IgG-D。可以使用重组DNA技术的标准方法构建修饰的犬IgG-D[例如，Maniatis等人，Molecular Cloning,ALaboratory Manual(1982)]。为了构建这些变体，可以修饰编码犬IgG-D的氨基酸序列的核酸，以便其编码修饰的IgG-D。然后将修饰的核酸序列克隆到表达质粒中用于蛋白质表达。

如本文所述的犬源化鼠抗犬抗体的六个互补决定区(CDR)可包含犬抗体κ轻链和犬抗体重链IgG，所述犬抗体κ轻链包含鼠轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述犬抗体重链IgG包含鼠重链HCDR1、HCDR2和HCDR3。

核酸

本发明还包括编码本发明的抗体的核酸(参见例如以下实施例)。

本发明还包括编码免疫球蛋白多肽的核酸，当通过BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与本文提供的犬源化抗体的氨基酸序列至少约70％相同、优选至少约80％相同、更优选至少约90％相同和最优选至少约95％相同(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，除了未变化的CDR，其中选择算法的参数以给出相应序列在相应参考序列的整个长度上的最大匹配。本发明进一步提供了编码免疫球蛋白多肽的核酸，当使用BLAST算法进行比较时，所述免疫球蛋白多肽包含与任何参考氨基酸序列至少约70％相似、优选至少约80％相似、更优选至少约90％相似和最优选至少约95％相似(例如，95％、96％、97％、98％、99％、100％)的氨基酸序列，其中选择算法的参数以给出相应序列在相应参考序列的整个长度上的最大匹配，也包括在本发明中。

如本文所用，核苷酸和氨基酸序列同一性百分比可使用C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519)、Vector NTI(Informax,Inc.MD),Oxford Molecular Group PLC(1996)和具有比对默认参数和用于同一性的默认参数的Clustal W算法确定。这些商业上可用的程序也可用于使用相同或类似的默认参数来确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级Blast搜索，例如，使用默认参数的GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆积程序(pileup program)。

以下参考文献与常用于序列分析的BLAST算法有关：BLAST ALGORITHMS：Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Gish,W.等人，Nature Genet.3：266-272(1993)；Madden,T.L.等人，Meth.Enzymol.266:131-141(1996)；Altschul,S.F.等人，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997)；Zhang,J.等人，Genome Res.7:649-656(1997)；Wootton,J.C.等人,Comput.Chem.17:149-163(1993)；Hancock,J.M.等人,Comput.Appl.Biosci.10:67-70(1994)；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等人,"A model of evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequenceand Structure,vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,(1978)；Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人,"Matrices fordetecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,vol.5,suppl.3."(1978),M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358(1978),Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,J.Mol.Biol.219:555-565(1991)；States,D.J.等人,Methods 3:66-70(1991)；Henikoff,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919(1992)；Altschul,S.F.等人,J.Mol.Evol.36:290-300(1993)；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(1990)；Karlin,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(1993)；Dembo,A.等人,Ann.Prob.22:2022-2039(1994)；和Altschul,S.F."Evaluating thestatistical significance of multiple distinct local alignments."inTheoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai,ed.),pp.1-14,Plenum,New York(1997)。

本发明的抗体可以通过本领域已知的方法重组产生。可用作表达本文公开的抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系在本领域中是众所周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系。尤其，这些细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其他细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优先的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。当将编码重链或其抗原结合部分或其片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地，允许抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中来产生抗体。

可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。此外，可以使用许多已知技术增强从生产细胞系表达本发明的抗体(或其中的其他部分)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。结合欧洲专利号0 216 846、0256 055和0 323 997以及欧洲专利申请号89303964.4对GS系统进行了整体或部分讨论。

一般而言，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有在细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白特有的糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体构成本发明，与抗体可能具有的糖基化模式无关。类似地，在特定实施方案中，具有仅包含非岩藻糖基化的N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体已被证明在体外和体内通常比其岩藻糖基化的对应物表现出更强的功效[参见例如，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775]。

犬IL-4受体α受体

编码预测的全长犬IL-4受体α链(SEQ ID NO：1)的cDNA通过搜索Genbank数据库(登录号XM_547077.4；还参见US7，208，579B2)确定。该预测的cDNA编码823个氨基酸(SEQID NO：2)，包括25个氨基酸的前导序列，并被鉴定为登录号XP_547077.3。成熟的预测犬IL-4受体α链蛋白(SEQ ID NO：4)与人IL-4受体α链(登录号NP_000409.1)共有65％同一性，且与猪IL-4受体α链(登录号NP_999505.1)共有70％同一性。成熟的预测犬IL-4受体α链蛋白由确定为SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码。预测的成熟IL-4受体α链与人IL-4受体α链的已知序列的比较鉴定了成熟犬IL-4受体α链蛋白的细胞外结构域(ECD)，并命名为SEQ ID NO：5。这先前已经全部在[US2018/0346580；通过引用将其全部内容并入本文]中描述。

具有信号序列的犬IL-4受体α链全长DNA[SEQ ID NO：1]

犬IL-4受体α全长蛋白质[SEQ ID NO：2]，信号序列为粗体

没有信号序列的犬IL-4受体α成熟全长蛋白质[SEQ ID NO：4]

没有信号序列的犬IL-4受体α成熟全长DNA[SEQ ID NO：3]

gtgaaggtgctgcacgagcccagctgcttcagcgactacatcagcaccagcgtgtgccagtggaagatggaccaccccaccaactgcagcgccgagctgagactgagctaccagctggacttcatgggcagcgagaaccacacctgcgtgcccgagaacagagaggacagcgtgtgcgtgtgcagcatgcccatcgacgacgccgtggaggccgacgtgtaccagctggacctgtgggccggccagcagctgctgtggagcggcagcttccagcccagcaagcacgtgaagcccagaacccccggcaacctgaccgtgcaccccaacatcagccacacctggctgctgatgtggaccaacccctaccccaccgagaaccacctgcacagcgagctgacctacatggtgaacgtgagcaacgacaacgaccccgaggacttcaaggtgtacaacgtgacctacatgggccccaccctgagactggccgccagcaccctgaagagcggcgccagctacagcgccagagtgagagcctgggcccagacctacaacagcacctggagcgactggagccccagcaccacctggctgaactactacgagccctgggagcagcacctgcccctgggcgtgagcatcagctgcctggtgatcctggccatctgcctgagctgctacttcagcatcatcaagatcaagaagggctggtgggaccagatccccaaccccgcccacagccccctggtggccatcgtgatccaggacagccaggtgagcctgtggggcaagagaagcagaggccaggagcccgccaagtgcccccactggaagacctgcctgaccaagctgctgccctgcctgctggagcacggcctgggcagagaggaggagagccccaagaccgccaagaacggccccctgcagggccccggcaagcccgcctggtgccccgtggaggtgagcaagaccatcctgtggcccgagagcatcagcgtggtgcagtgcgtggagctgagcgaggcccccgtggacaacgaggaggaggaggaggtggaggaggacaagagaagcctgtgccccagcctggagggcagcggcggcagcttccaggagggcagagagggcatcgtggccagactgaccgagagcctgttcctggacctgctgggcggcgagaacggcggcttctgcccccagggcctggaggagagctgcctgcccccccccagcggcagcgtgggcgcccagatgccctgggcccagttccccagagccggccccagagccgcccccgagggccccgagcagcccagaagacccgagagcgccctgcaggccagccccacccagagcgccggcagcagcgccttccccgagcccccccccgtggtgaccgacaaccccgcctacagaagcttcggcagcttcctgggccagagcagcgaccccggcgacggcgacagcgaccccgagctggccgacagacccggcgaggccgaccccggcatccccagcgccccccagccccccgagccccccgccgccctgcagcccgagcccgagagctgggagcagatcctgagacagagcgtgctgcagcacagagccgcccccgcccccggccccggccccggcagcggctacagagagttcacctgcgccgtgaagcagggcagcgcccccgacgccggcggccccggcttcggccccagcggcgaggccggctacaaggccttctgcagcctgctgcccggcggcgccacctgccccggcaccagcggcggcgaggccggcagcggcgagggcggctacaagcccttccagagcctgacccccggctgccccggcgcccccacccccgtgcccgtgcccctgttcaccttcggcctggacaccgagccccccggcagcccccaggacagcctgggcgccggcagcagccccgagcacctgggcgtggagcccgccggcaaggaggaggacagcagaaagaccctgctggcccccgagcaggccaccgaccccctgagagacgacctggccagcagcatcgtgtacagcgccctgacctgccacctgtgcggccacctgaagcagtggcacgaccaggaggagagaggcaaggcccacatcgtgcccagcccctgctgcggctgctgctgcggcgacagaagcagcctgctgctgagccccctgagagcccccaacgtgctgcccggcggcgtgctgctggaggccagcctgagccccgccagcctggtgcccagcggcgtgagcaaggagggcaagagcagccccttcagccagcccgccagcagcagcgcccagagcagcagccagacccccaagaagctggccgtgctgagcaccgagcccacctgcatgagcgccagc

犬IL-4受体α链细胞外结构域[SEQ ID NO：5]

抗体蛋白质工程

抗体还可包含轻链恒定区，例如犬轻链恒定区，例如λ或κ犬轻链恒定区或其变体。作为示例而非限制，犬重链恒定区可以来自IgG-B或修饰的cFc，例如本文使用的IgG-Bm[参见US 10,106,607 B2，在此通过引用整体并入]，并且犬轻链恒定区可以来自κ。

抗体可以被工程化以包括对亲本(即小鼠)单克隆抗体可变域内的犬框架和/或犬框架残基的修饰，例如：以改善抗体的特性。

药物组合物和施用

为了制备包含本发明的抗体的药物或无菌组合物，可以将这些抗体与药学上可接受的载体或赋形剂混合[参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences andU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)]。

治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉末、浆液、水溶液或悬浮液的形式混合来制备[参见，例如，Hardman等人(2001)Goodman andGilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams和Wilkins,New York,NY；Avis等人(eds.)(1993)Pharmaceutical DosageForms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY]。在一个实施方案中，将本发明的抗体在pH 5-6的乙酸钠溶液中稀释至适当浓度，并添加NaCl或蔗糖以获得张力。可以添加额外的试剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以增强稳定性。

单独或与另一种药剂联合施用，抗体组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定，例如，用于确定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数(LD₅₀/ED₅₀)。在特定方面，表现出高治疗指数的抗体是需要的。从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定用于犬科动物的剂量范围。此类化合物的剂量优选地位于包括几乎没有毒性或没有毒性的ED₅₀在内的循环浓度的范围内。剂量可以在这个范围内变化，取决于所使用的剂型和施用途径。

施用方式可以变化。合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。在具体的实施方案中，本发明的抗体可以通过侵入性途径例如通过注射施用。在本发明的进一步实施方案中，本发明的抗体或其药物组合物静脉内、皮下、肌内、动脉内或通过吸入、气溶胶递送施用。通过非侵入性途径(例如，口服；例如，在丸剂、胶囊或片剂中)施用也在本发明的范围内。

组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，本发明的药物组合物可以通过用皮下注射针(包括例如预填充注射器或自动注射器)注射来施用。本文公开的药物组合物也可以用无针皮下注射装置施用；例如美国专利号：6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。

本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。众所周知的施用药物组合物的植入物和模块的示例包括：美国专利第4,487,603号，其公开了一种用于以受控的速度分配药物的可植入的微型输注泵；美国专利第4,447,233号，其公开了一种用于以精确的输液速度递送药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量植入式输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统。许多其他这样的植入物、递送系统和模块对于本领域技术人员来说是众所周知的。

或者，可以局部而非全身方式施用本发明的抗体，通常以贮库或持续释放制剂的形式。

施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体的血清或组织周转率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性以及靶细胞在生物基质中的可及性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体以改善目标疾病/病症状态，同时最小化不良副作用。因此，递送的生物制剂的量部分取决于特定的治疗性抗体以及所治疗病症的严重性。提供选择治疗性抗体适当剂量的指导[参见，例如,Wawrzynczak Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；Kresina(ed.)Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,NY(1991)；Bach(ed.)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY(1993)；Baert等人New Engl.J.Med.348:601-608(2003)；Milgrom等人New Engl.J.Med.341:1966-1973(1999)；Slamon等人New Engl.J.Med.344:783-792(2001)；Beniaminovitz等人NewEngl.J.Med.342:613-619(2000)；Ghosh等人New Engl.J.Med.348:24-32(2003)；Lipsky等人New Engl.J.Med.343:1594-1602(2000)]。

确定合适的剂量由兽医进行，例如，使用本领域已知或疑似影响治疗的参数或因素。通常，剂量从比最佳剂量稍低的量开始，然后以小增量增加，直到相对于任何负面副作用实现所需或最佳效果。重要的诊断量度包括那些症状的量度。

本文提供的抗体可以通过连续输注或通过例如每天、每周1-7次、每周、每两周、每月、双月、每季度、每半年、每年等施用的剂量来提供。可以通过例如，静脉内、皮下、局部、口服、经鼻、直肠、肌肉内、脑内、脊柱内或通过吸入提供剂量。总每周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[参见，例如，Yang等人NewEngl.J.Med.349:427-434(2003)；Herold等人New Engl.J.Med.346:1692-1698(2002)；Liu等人J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456(1999)；Portielji等人CancerImmunol.Immunother.52:133-144(2003)]。还可以提供剂量以在犬的血清中实现本发明的抗体的预定目标浓度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其他实施方案中，本发明的抗体以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者每周、每两周、“每4周”、每月、每两个月或每季度皮下或静脉内施用。

如本文所用，“抑制”或“治疗”或“处理”包括延迟与病症相关的症状的发生和/或降低此类病症的症状的严重性。该术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状、预防额外的症状以及改善或预防这些症状的基础原因。这些术语还包括改善现有的不受控制的或不需要的症状、预防额外的症状以及改善或预防这些症状的基础原因。因此，这些术语表示对患有疾病、病状和/或症状或具有发生此类疾病、疾病或症状的可能的脊椎动物受试者(例如，犬科动物)产生了有益的结果。

如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指当单独或与另外的治疗剂组合施用细胞、组织或受试者(例如犬科动物)时有效地引起疾病或病症的一种或多种症状或此类疾病或病症的进展的可测量的改善的本发明的抗体的量。治疗有效剂量进一步指足以导致至少部分症状改善，例如治疗、治愈、预防或改善相关医疗状况，或增加此类病症的治疗、治愈、预防或改善率的抗体的量。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论是联合、连续还是同时施用。有效量的治疗剂将产生诊断量度或参数的改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％，最优选至少50％。在使用主观指标来评估病情严重程度的情况下，有效量也可以产生主观指标的改善。

实施例

实施例1

抗IL-4受体α抗体

一般材料和方法：

重组蛋白是通过将选定蛋白质的氨基酸序列提供给商业制造商(ATUM，Newark，California)而获得的，后者又选择了编码该氨基酸序列的适当核苷酸序列。核苷酸序列也可以从公共可用的DNA数据库中获得，例如然后，商业制造商化学合成核酸，其然后由ATUM克隆到表达质粒(pD2610-v10；可从AUTM获得)中，以产生相应的重组蛋白。将质粒置于HEK-293细胞或CHO细胞中以表达重组蛋白，其然后通过常规方法分离。

Balb/c小鼠在17天期间免疫多次(每次10μg)。免疫抗原是犬IL-4Rα链细胞外结构域(ECD)-人Fc融合蛋白。免疫后，从每只小鼠收集血清并测试与犬IL-4受体α链ECD HIS-标记的蛋白质的反应性。具有最高血清抗IL-4受体α链ECD滴度的小鼠脾细胞与骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞系融合。融合后约2周，通过ELISA测试来自推定杂交瘤细胞的上清液对IL-4受体α链ECD HIS-标记蛋白质的反应性。在ELISA中产生强阳性信号的杂交瘤通过有限稀释亚克隆，并再次测试与犬IL-4受体α链ECD HIS-标记的蛋白质的反应性。

抗犬IL-4受体α抗体包括抗体c152H11VL3-cCLk-s/c152H11VH3-cIgGBm和抗体c146E2VL3-cCLk-s/c146E2VH3-cIgGBm。下面在表1A和1B中提供了这两种抗体的六(6)个CDR(三个单独的轻链(LC)和三个重链(HC)序列)的组。表1A提供了编码表1B中所列的12个CDR的氨基酸序列的核酸。这些犬源化抗体的全长轻链和重链的氨基酸序列紧接在下表1B中提供。

IL-4Rα抗体CDR核酸和氨基酸序列

表1A

表1B

c152H11VL3-cCLk-s(κ轻链)：[SEQ ID NO：35]

c152H11VH1-cIgGBm(重链)：[SEQ ID NO：36]

c152H11VH2-cIgGBm(重链)：[SEQ ID NO：37]

c152H11VH3-cIgGBm(重链)：[SEQ ID NO：38]

c146E2VL3-cCLk-s(κ轻链)：[SEQ ID NO：39]

c146E2VH1-cIgGBm(重链)：[SEQ ID NO：40]

c146E2VH2-cIgGBm(重链)：[SEQ ID NO：41]

c146E2VH3-cIgGBm(重链)：[SEQ ID NO：42]

此外，犬IL-4受体α抗体的轻链也用如下提供的λ轻链构建。

c152H11LV1-cCl(λ轻链)[SEQ ID NO：43]

c146E2LV1-cCl(λ轻链)[SEQ ID NO：44]

实施例2

STAT-6抑制

如下测试了针对犬IL-4受体α的抗体抑制DH82细胞中STAT-6磷酸化的能力：

材料

1.活跃生长的DH82细胞

2.DH82细胞生长培养基(302003^TM，Eagle's Minimum EssentialMedium，提供热灭活胎牛血清至最终浓度为15％w/v)

3.AlphaLISA p-STAT6(Tyr641)检测试剂盒：Perkin Elmer目录号:ALSU-PST6-A-HV

4.重组犬IL-4：R&D Systems，目录号:752-CL/CF

5.重组犬IL-13：R&D Systems，目录号:5894-CL/CF

6.Perkin Elmer Envision

a.犬源化抗犬IL-4R_α单克隆抗体

b.c146E2-H3L3

c.来自US2018/0346580的4H3犬源化抗体

如下测试针对犬IL-4受体α的抗体抑制DH82细胞中STAT-6磷酸化的能力：

方法

1.两个组织培养板接种每孔8x10⁴个DH82细胞(200μL，密度为4x10⁵细胞/mL)，并在37℃下孵育过夜。

2.将测试抗体预稀释至500μg/mL，然后在DH82细胞生长培养基(Cell GrowthMedia)中连续3倍稀释。从细胞培养板中除去培养基，将50μL/孔的连续稀释的测试样品转移到每个板中。

3.将犬IL-4在DH82细胞生长培养基中稀释至5ng/mL，并将50μL加入到一个板的每个孔中。将犬IL-13在DH82细胞生长培养基中稀释至10ng/mL，并将50μL添加到第二个板的每个孔中。将板在37℃下孵育15分钟。

4.从板中取出培养基，向板中加入每孔100μL来自AlphaLISA p-STAT-6检测试剂盒的新鲜制备的1x裂解缓冲液。板在室温下在板振荡器上以350rpm搅拌10分钟。

5.Acceptor Mix由AlphaLISA p-STAT6检测试剂盒制备，且每孔15μL添加到96孔1/2Area Plates中的30μL细胞裂解物中。将板密封，以350rpm搅拌2分钟，然后在室温下孵育2小时。

6.Donor Mix由AlphaLISA p-STAT6检测试剂盒在柔和的实验室照明下制备，且每个板中加入每孔15μL。将板密封，用箔覆盖，以350rpm搅拌2分钟，然后在室温下孵育2小时。

7.在Perkin Elmer EnVison上使用AlphaScreen设置阅读板。

评估了命名为c4H3[WO2016/156588；US2018/0346580]和c146E2-H3L3的两种不同的犬源化抗犬IL-4R_α单克隆抗体通过阻断犬IL-4或犬IL-13与犬IL-4R_α的结合来抑制αSTAT-6磷酸化的能力。图1中显示的数据表明，在IL-4存在下，两种抗体均导致STAT-6磷酸化的剂量依赖性抑制，但出人意料地，c146E2-H3L3比现有技术的抗犬IL-4受体α抗体c4H3[WO2016/156588]更紧密地结合。不存在IL-4Rα(IL-4R_α)抗体的情况下的IL-4对照显示在图的右上部分。图2中显示的数据也表明，在IL-13存在下，两种抗体均导致STAT-6磷酸化的剂量依赖性抑制，其中c146E2-H3L3再次比现有技术的抗犬IL-4受体α抗体c4H3更紧密地结合。在不存在IL-4Rα(IL-4R_α)抗体的情况下的IL-13对照显示在图的右上部分。图3显示用λ轻链替换κ轻链对c146E2-H3L3与IL-4Rα的结合没有影响。

实施例3

表位作图

抗体与其同源蛋白质抗原的相互作用是通过抗体的特定氨基酸(互补位)与靶抗原的特定氨基酸(表位)的结合介导的。表位是引起免疫球蛋白特异性反应的抗原决定簇。表位由抗原表面上的一组氨基酸组成。感兴趣的蛋白质可以含有几个被不同抗体识别的表位。抗体识别的表位分类为线性或构象表位。线性表位通过蛋白质中氨基酸的连续序列的延伸形成，而构象表位由在一级氨基酸序列中不连续(例如，远离)但在三维蛋白质折叠时聚集在一起的氨基酸组成。

表位作图是指鉴定在其靶抗原上被抗体识别的氨基酸序列(即表位)的过程。鉴定靶抗原上由单克隆抗体(mAb)识别的表位具有重要应用。例如，它可以帮助开发新的治疗剂、诊断剂和疫苗。表位作图还可以帮助选择优化的治疗性mAb并帮助阐明它们的作用机制。关于IL-4受体α的表位信息也可以阐明独特的表位，并定义疫苗的保护性或病原性作用。表位鉴定也可导致基于所鉴定的肽表位与载体蛋白或其它免疫刺激剂的化学或遗传偶联开发亚单位疫苗。

表位作图可以使用多克隆或单克隆抗体进行，并且根据表位的疑似性质(即线性vs构象)，使用几种方法进行表位鉴定。线性表位作图更直接，且相对更容易进行。为此，用于线性表位作图的商业服务通常采用肽扫描。在这种情况下，化学合成靶蛋白的一组重叠的短肽序列并测试它们结合感兴趣的抗体的能力。该策略快速，高通量，并且执行起来相对便宜。另一方面，不连续表位的作图在技术上更具挑战性，并且需要更专门的技术，例如单克隆抗体与其靶蛋白一起的X射线共晶体学、氢-氘(H/D)交换、与酶消化偶联的质谱以及本领域技术人员已知的几种其它方法。

使用质谱对犬IL-4受体α表位的作图：

一种用于鉴定抗犬IL-4受体αmAb识别的表位的基于化学交联、质谱检测和共价标记的方法[位于999Broadway，Suite 305，Saugus，MA 01906－4510USA的CovalXInstruments Incorporated]。

在先前的研究中将该技术应用于犬IL-4受体α链的表位作图表明mAb识别存在于犬IL-4受体α的细胞外结构域内的特定肽表位[US2018/0346580]。对图4所示犬IL4受体α的c146E2-H3L3抗体进行的类似分析鉴定了氨基酸序列SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47作为与先前鉴定的表位具有合理相似性的表位。此外，如图4所示，氨基酸残基K₉₇、H₁₁₂、T₁₁₃、S₁₆₄、T₁₆₅、S₁₇₁、Y₁₇₂、S₁₇₃和R₁₇₅被鉴定为特定的接触点[氨基酸残基编号参见例如SEQ ID NO：5]。

序列表表格

Claims

1.一种分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其结合犬白介素-4受体α(IL4R_α)，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含三个互补决定区(CDR)：CDR重链1(HCDR1)、CDR重链2(HCDR2)和CDR重链3(HCDR3)，和其中所述VL包含三个CDR：CDR轻链1(LCDR1)、CDR轻链2(LCDR2)和CDR轻链3(LCDR3)；其中

(i)所述HCDR1由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成；

(ii)所述HCDR2由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；

(iii)所述HCDR3由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成；

(iv)所述LCDR1由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成；

(v)所述LCDR2由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成；以及

(vi)所述LCDR3由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合犬IL4R_α并阻断犬IL4R_α与犬白介素-4的结合。

3.根据权利要求1或2所述的分离的哺乳动物抗体或其抗原结合片段，其为犬源化抗体或其犬源化抗原结合片段。

4.根据权利要求3所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含铰链区，所述铰链区包含选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有修饰的犬IgG-B(IgG-Bm)的重链，其中所述IgG-Bm包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述重链包含选自SEQID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的轻链。

8.根据权利要求7所述的犬源化抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含SEQ IDNO：44的氨基酸序列。

9.一种核酸组合物，其包含：

(a)编码根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列；和

(b)编码根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列。

10.一种表达载体，其包含编码根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列；和编码根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列。

11.一种表达载体系统，其包含：

(a)包含编码根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列的第一表达载体；和

(b)包含编码根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列的第二表达载体。

12.一种宿主细胞，其包含根据权利要求10所述的表达载体或根据权利要求11所述的表达载体系统。

13.一种药物组合物，其包含根据权利要求3、4、5、6、7和8中任一项所述的犬源化抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂。

14.根据权利要求13所述的药物组合物在制备用于帮助阻断与特应性皮炎相关的炎症的药物中的用途。