CN114814041A - 一种采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，本申请中采用液质联用仪对替米沙坦中4’‑溴甲基联苯‑2‑甲酸甲酯和4,4’‑二溴甲基联苯‑2‑甲酸甲酯进行检测，其相对液相色谱具有更低的定量限和检测限，因而本申请中的方法能够更好的实现替米沙坦溴代烷烃的检测。根据本申请中的实施例中具体验证方法可以得知，检测限溶液中各杂质峰信噪比均大于3，4’‑溴甲基联苯‑2‑甲酸甲酯定量限为1.78ppm，4,4’‑二溴甲基联苯‑2‑甲酸甲酯定量限为1.75ppm；定量限溶液中各杂质峰信噪比均大于10，且六针定量限溶液中各杂质峰面积的RSD均小于15%；说明本申请中的方法灵敏度高，精密度好。
Description
技术领域
本申请涉及有机杂质检测技术领域，尤其是涉及一种采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法。
背景技术
替米沙坦是一种抗高血压药，已被FDA批准的沙坦类药物。它属于血管紧张素II受体拮抗剂，具有维持心血管系统正常调节功能，减少高血压引起的器官损害的优点。与其它降压药相比，替米沙坦具有最佳的疗效和较低的毒性，可用于控制血压平衡。
替米沙坦其中之一的关键中间体为4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯，简称KY00；4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯(简称KY00杂质Ⅰ)是KY00反应副产物，基本信息见下表， KY00和KY00杂质Ⅰ的结构中含致突变的警示结构——卤代烷烃。KY00的Ames试验结果呈阳性，具有致突变性，KY00杂质Ⅰ的Ames试验结果未查到，但结构与KY00相似。目前，该两种杂质均未查到具体的致癌性数据，可根据毒理学关注阈值计算可接受摄入量为 1.5μg/天。替米沙坦日最大服用剂量为80mg，则KY00和KY00杂质Ⅰ在替米沙坦中的含量不得过18.75ppm。
替米沙坦溴代烷烃——KY00和KY00杂质Ⅰ
目前，关于替米沙坦的毒性杂质的检测中，并没有系统的根据遗传毒性杂质的检测要求对 KY00和KY00杂质I进行检测，现有的方法主要是按照非遗传毒性杂质的要求，对KY00 进行检测，对KY00杂质I检测是没有的，这对替米沙坦生物安全性是存在一定的隐患。
为了保证替米沙坦的安全性和质量可控性，发明人认为开发一种具有低检测限、高精密度的替米沙坦中溴代烷烃的检测方法，对保证替米沙坦的安全性是很有必要的。
发明内容
为了更好的保证替米沙坦的安全性，本申请提供一种采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，该方法可以同时检测替米沙坦中的4’-溴甲基联苯-2- 甲酸甲酯(KY00)和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯(KY00杂质Ⅰ)，具有灵敏度高，精密度好的特点。
本申请提供的一种采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，包括以下步骤：
1)精密称取对照品4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯(KY00)和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯(KY00杂质Ⅰ)，接着在同一个容量瓶中，配置成对照品储备液；
2)将步骤1)中配置的对照品储备液分别按照标准曲线所需的对照品浓度进行稀释，得到标准曲线对照品溶液；
3)将步骤2)中的标准曲线对照品溶液注入到UPLC-MS/MS液质联用仪中，按照以下测试条件，进行测试，根据测试结果，分别得到4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的标准曲线；
其中，测试条件如下：
色谱条件：
色谱柱采用Phenomenex C18，流动相采用0.1％甲酸水为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱条件为：
质谱条件为：
采用电喷雾电离源，使用正离子扫描模式，监测模式为多反应监测(MRM)，化合物的监测离子对为：
4)将替米沙坦样品以甲醇为溶剂配置成样品溶液，然后将样品溶液按照步骤3)中的测试方法和条件进行测试，根据标准曲线即可得到样品溶液中4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’ -二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的浓度。
通过采用上述技术方案，本申请利用KY00和KY00杂质Ⅰ在质谱中采集时间的差异，同时测量两种杂质组分。更重要的是，在RSD小于15％的条件下，本申请方法中对KY00 的定量限可以达到1.78ppm，检测限可以达到0.89ppm；对KY00杂质Ⅰ的定量限可以达到1.75ppm，检测限可以达到0.87ppm，因而本申请的方法对KY00和KY00杂质Ⅰ检测的灵敏度和精密度都非常高，可以更好的实现替米沙坦中溴代烷烃的检测。
作为优选，所述步骤1)中，对照品储备液配置采用甲醇作为溶剂，对照品储备液中4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的浓度均为34～36ng/mL。
通过采用上述技术方案，本申请中采用甲醇作为溶剂，主要是甲醇对两种杂质组分都有一定的溶解度，而且替米沙坦也可以微溶于甲醇中，甲醇也是液质联用仪中常用的流动相，因而采用甲醇作为溶剂可以更好实现两种杂质组分的检测，采用上述的对照品储备液浓度可以实现精准称量的同时，可以配置较低浓度的标准曲线对照品溶液，保证标准曲线对照品溶液浓度的精准性。
作为优选，所述步骤2)中，标准曲线对照品溶液是采用对照品储备液分别依次稀释 20倍、12.5倍、10倍、8.3倍、6.67倍和5倍，获得5个标准曲线对照品溶液，再然后采用稀释了20倍的标准曲线对照品溶液进一步进行稀释5倍，获得稀释100倍标准曲线对照品溶液。
作为优选，所述步骤3)中，色谱条件还包括：流速为0.3～0.5mL/min，柱温为 30～40℃，进样器温度为3～5℃；
作为优选，所述步骤3)中，电喷雾电离源的参数为：干燥气温度300℃，气体流速6L/min，喷雾器45psi，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，正离子毛细管电压3500V，正离子喷嘴电压500V。
通过采用上述技术方案，标准曲线浓度、色谱条件和质谱条件可以更好的实现两种杂质KY00和KY00杂质Ⅰ的精准检测。
作为优选，所述步骤3)中，4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的标准曲线方程为： A＝430.14C-44.56r＝0.9998；4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的标准曲线方程为： A＝347.93C-14.814r＝0.9999；其中C代表浓度，A代表峰面积。
通过采用上述技术方案，本申请中的方法测得的标准曲线有很好的线性关系，相关系数r均达到了0.999以上，可以很好的实现KY00和KY00杂质Ⅰ的检测。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：1)本申请中采用液质联用仪对替米沙坦中KY00和KY00杂质Ⅰ进行检测，其相对液相色谱具有更低的定量限和检测限，因而本申请中的方法能够更好的实现替米沙坦中溴代烷烃的检测。2)根据本申请实施例中的具体验证结果可以得知，检测限溶液中各杂质峰信噪比均大于3；KY00定量限为 1.78ppm，KY00杂质Ⅰ定量限为1.75ppm；定量限溶液中各杂质峰信噪比均大于10，且六针定量限溶液中各杂质峰面积的RSD均小于15％；说明本申请中的方法灵敏度高，精密度好。
附图说明
图1是实施例1中理论浓度为3.6ng/L标准曲线对照品溶液的测试谱图。
图2是实施例1中KY00的标准曲线图。
图3是实施例1中KY00杂质I的标准曲线图。
图4是实施例1中L0101820201101批替米沙坦的测试谱图。
图5是实施例1中80～120％回收率溶液的测试谱图；A:80％，B:100％，C:120％。
图6是实施例1中L0101820201103批替米沙坦的测试谱图。
具体实施方式
在本申请中使用的设备仪器：
在本申请中使用的替米沙坦均为浙江金立源药业有限公司生产。
本申请中液质联用仪的测试条件包括以下部分：
色谱条件:采用Phenomenex C18，4.6×150mm，3μm的色谱柱，以0.1％甲酸水为流动相A，甲醇为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为0.4ml/min，柱温为35℃，进样器温度为4℃，进样体积为1μl。
表1梯度洗脱条件
| 时间(分钟) | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0 | 20 | 80 |
| 10 | 10 | 90 |
| 10.01 | 0 | 100 |
| 15 | 0 | 100 |
| 15.01 | 20 | 80 |
| 18 | 20 | 80 |
质谱条件:采用电喷雾电离源(AJS ESI)，使用正离子扫描模式，监测模式为多反应监测 (MRM)，化合物的监测离子对参见表2和表3。
表2质谱测试条件
表3AJS ESI电喷雾电离源的参数
方法可行性验证实例：
本实例中验证的内容以及标准如表4所示：
表4验证内容和接收标准
S1溶液的配置：
①混合对照品储备液(约为360ng/mL)：分别精密称取KY00对照品(0.03558g)和KY00 杂质Ⅰ对照品(0.03458g)，置同一个100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；其中KY00 355.8ng/mL，KY00杂质Ⅰ345.8ng/mL。
②混合对照品溶液(约为3.6ng/mL)：精密量取溶液①1mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
③供试品溶液：取替米沙坦供试品(L0101820201101批)20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入甲醇超声后溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
④供试品加标溶液：取替米沙坦供试品(L0101820201101批)20mg，精密称定，置100mL量瓶中，加入甲醇超声后溶解，加入混合对照品储备液1mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
⑤定量限溶液：精密量取混合对照品溶液1mL置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
⑥检测限溶液：精密量取混合对照品溶液1mL置20mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
S2系统适用性及专属性试验
照拟定的色谱、质谱条件和方法，精密量取混合对照品溶液和供试品加标溶液分别注入液质联用仪，记录色谱图。混合对照品溶液重复进样6次，并对供试品加标溶液进样1次，得到的结果如表4-1所示：
表4-1系统适用性及专属性试验结果
S3定量限与检测限的测试
照拟定的色谱、质谱条件和方法，精密量取定量限溶液、检测限溶液分别注入液质联用仪，记录色谱图，检测限溶液重复进样3次，定量限溶液重复进样6次。其结果如表4-2和4-3 所示：
表4-2定量限与检测限试验结果
表4-3定量限与检测限精密度试验结果
S3线性关系测试
标准曲线对照品溶液：分别精密称取KY00和KY00杂质Ⅰ对照品适量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释制成每1mL中各约含为0.36、1.8、2.88、3.6、4.32、5.4、7.2ng的溶液。然后将定量稀释的溶液分别注入液质联用仪，记录色谱图，并根据色谱的结果绘制标曲，得到KY00和KY00杂质Ⅰ的相关系数r均大于0.995。
根据以上测试数据，得出的结果如下：
根据系统适用性及专属性试验结果：6针对照品溶液中各杂质峰面积的RSD均小于10％；空白溶液和供试品溶液均不干扰各杂质的检测；供试品加标溶液中各杂质的回收率均在 80％～115％范围内。根据定量限与检测限的测试结果：检测限溶液中各杂质峰信噪比均大于 3；KY00定量限为1.78ppm，KY00杂质Ⅰ定量限为1.75ppm。定量限溶液中各杂质峰信噪比均大于10，且六针定量限溶液中各杂质峰面积的RSD均小于15％。根据线性关系测试结果，KY00和KY00杂质Ⅰ的相关系数r均大于0.995。由以上结果可以说明，采用液质联用仪可以实现对KY00和KY00杂质Ⅰ；而且其相对于液相色谱而言，具有更高的灵敏度和精密度。
实施例1
1)溶液配置：
①标准曲线对照品储备液(约为36ng/mL)：精密称取KY00对照品(0.03569g)和KY00杂质Ⅰ对照品(0.03465g)，置同一个100mL量瓶中，加甲醇超声后溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5mL，置50mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
②标准曲线对照品溶液：分别精密量取标准曲线对照品储备液1mL、0.8mL、1mL、1.2mL、1.5mL、2mL，置20mL、10mL、10mL、10mL、10mL、10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得理论浓度为：1.8ng/mL、2.88ng/mL、3.6ng/mL、4.32ng/mL、5.4ng/mL、 7.2ng/mL的标准曲线对照品溶液；但是因为称量样品的差异，具体两种组分的标准曲线对照品溶液的浓度可见表5和表6。精密量取理论浓度为1.8ng/ml的标准曲线对照品溶液2mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得理论浓度为0.36ng/mL的标准曲线对照品溶液。
③供试品溶液储备溶液(1mg/mL)：精密称取供试品(L0101820201101批)50mg，置50mL量瓶中，加入甲醇超声后溶解并稀释至刻度，摇匀。
④供试品溶液：精密量取供试品溶液储备溶液2mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
⑤80％的回收率溶液：精密量取供试品溶液储备溶液2ml，置10mL量瓶中，精密加入0.8mL溶液①，用甲醇稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
⑥100％的回收率溶液：精密量取供试品溶液储备溶液2ml，置10ml量瓶中，精密加入1mL溶液①，用甲醇稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
⑦120％的回收率溶液：精密量取供试品溶液储备溶液2mL，置10mL量瓶中，精密加入1.2mL溶液①，用甲醇稀释至刻度，摇匀。平行配制三份。
备注：其他批次供试品溶液配制同本底溶液。
1.标准曲线的绘制
照拟定的色谱、质谱条件和方法，精密量取上述标准曲线对照品溶液各1μl，分别注入液质联用仪，记录色谱图。其中理论浓度为3.6ng/mL的标准曲线对照品溶液重复进样6次，其他浓度溶液重复进样2次。以进样浓度C(ng/mL)为横坐标，平均峰面积A为纵坐标，采用最小二乘法并用Excel中回归分析工具进行数据分析。
本实施例中理论为3.6ng/mL的标准曲线对照品溶液的测试谱图如图1所示，从图上可以看出，两种KY00和KY00杂质I组分的吸收峰完全分开的，相互之间是不影响的。
本实施例中标准曲线对照品溶液与峰面积的数据如表5和表6所示，经过拟合其标准曲线分别如图2和图3所示，具体的线性关系可见表7，由结果可知，标准曲线的相关系数r可以达到0.999以上，具有很好线性相关性；从理论浓度为3.6ng/mL标准曲线对照品溶液的平行6次测量数据来看，其峰面积的RSD小于1.5％。
表5为KY00标准曲线对照品溶液的实际浓度和峰面积的数据
表6为KY00杂质I标准曲线对照品溶液的实际浓度和峰面积的数据
表7线性关系试验结果汇总
| 名称 | 回归方程 | 相关系数r | 残差平方和 |
| KY00 | A＝430.14C-44.56 | 0.9998 | 2013.38 |
| KY00杂质Ⅰ | A＝347.93C-14.814 | 0.9999 | 533.120 |
2.加标回收率的测试
照拟定的色谱、质谱条件和方法，精密量取上述供试品溶液、80～120％回收率溶液各1μL，分别注入液质联用仪，记录色谱图；根据测试结果，按标准曲线法计算回收率。
对供试品溶液进行测试，获得的谱图如图4所示，根据谱图数据未检测出杂质KY00和KY00杂质I。
对80～120％回收率溶液进行测试，按标准曲线法计算回收率本实例中加标回收率的测试结果，如表8和9所示，其中80～120％回收率溶液测试的谱图如图5所示：
表8KY00的加标回收率测试结果
表9替米沙坦中KY00杂质Ⅰ回收率结果
从图5中可以看出80～120％回收率溶液溶液是明显有KY00和KY00杂质Ⅰ吸收峰的，且随着浓度的升高其峰值是升高的，说明本申请的方法是可以测试替米沙坦中两种杂质的含量的，在L0101820201101批次替米沙坦中未检出杂质，说明该批样品中本实施例检测限下，基本不含两种杂质。
从表8和表9可以看出，80～120％回收率溶液，KY00和KY00杂质Ⅰ均回收率均分别为101.41％和101.5％，RSD分别为1.05％和0.74％，均在测试允许的范围，也进一步说明L0101820201101批次替米沙坦供试品中在本实施例检测限下，基本不含两种杂质。
3.其他批次产品的测试
①供试品溶液储备溶液(1mg/mL)：精密称取5组不同替米沙坦供试品各50mg，分别置 50ml量瓶中，加入甲醇后超声溶解并稀释至刻度，摇匀。(其中：L0101820201102、L0101820201103、L0101820210501、L0101820210601和L0101820210701是纯化后的产品，L0508420210501、L0508420210601和L0508420210602是粗品)
②供试品溶液：精密量取供试品溶液储备溶液2mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
照拟定的色谱、质谱条件和方法，精密量取上述供试品溶液各1μl，分别注入液质联用仪，记录色谱图；根据测试结果，按标准曲线法计算杂质含量；其结果如表10所示，其中L0101820201103批次的谱图如图6所示。
表10不同批次替米沙坦的测试结果
从表10的结果来看，上述不同批次的替米沙坦产品或粗品中均没有检测出两种杂质。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，包括以下步骤：
1)精密称取对照品4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯，接着在同一个容量瓶中，配置成对照品储备液；
2)将步骤1)中配置的对照品储备液分别按照标准曲线所需的对照品浓度进行稀释，得到标准曲线对照品溶液；
3)将步骤2)中的标准曲线对照品溶液注入到UPLC-MS/MS液质联用仪中，按照以下测试条件进行测试，根据测试结果，分别得到4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的标准曲线；
其中，测试条件如下：
色谱条件：
色谱柱采用Phenomenex C18，流动相采用0.1％甲酸水为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱条件为：
质谱条件为：
采用电喷雾电离源，使用正离子扫描模式，监测模式为多反应监测(MRM)，化合物的监测离子对为：
4)将替米沙坦样品以甲醇为溶剂配置成样品溶液，然后将样品溶液按照步骤3)中的测试方法和条件进行测试，根据标准曲线即可得到样品溶液中4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的浓度。
2.根据权利要求1所述的采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤1)中，对照品储备液配置采用甲醇作为溶剂，对照品储备液中4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯和4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的浓度均为34～36ng/mL。
3.根据权利要求1所述的采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤2)中，标准曲线对照品溶液是采用对照品储备液分别依次稀释20倍、12.5倍、10倍、8.3倍、6.67倍和5倍，获得5个标准曲线对照品溶液，再然后采用稀释了20倍的标准曲线对照品溶液进一步进行稀释5倍，获得稀释100倍标准曲线对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤3)中，色谱条件还包括：流速为0.3～0.5mL/min，柱温为30～40℃，进样器温度为3～5℃。
5.根据权利要求1所述的采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤3)中，电喷雾电离源的参数为：干燥气温度300℃，气体流速6L/min，喷雾器45psi，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，正离子毛细管电压3500V，正离子喷嘴电压500V。
6.根据权利要求1所述的采用液质联用仪检测替米沙坦中溴代烷烃类遗传毒性杂质的方法，其特征在于，所述步骤3)中，4’-溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的标准曲线方程为：A＝430.14C-44.56r＝0.9998；4,4’-二溴甲基联苯-2-甲酸甲酯的标准曲线方程为：A＝347.93C-14.814r＝0.9999；其中C代表浓度，A代表峰面积。
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