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CN1145695C - 抗真菌蛋白 - Google Patents

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Abstract

抗真菌肽类，它包含与Rs-AFP2抗真菌蛋白序列的21～51位点的连绕氨基酸残基排列相同的至少六个氨基酸残基或基本同源蛋白序列。这些肽类可用于农业，制药或防腐中对抗真菌疾病。

Description

抗真菌蛋白
本发明涉及抗真菌蛋白、其生产和应用方法以及编码抗真菌蛋白的DNA序列。
在此文中，抗真菌蛋白定义为具抗真菌活性的蛋白或肽。活性包含如：部分抑制或死亡等一系列拮抗作用。
从一些植物种类中已分离出许多具抗植物病原真菌的抗真菌蛋白。我们以前描述了一类能从萝卜和其它植物种类中分离的抗真菌蛋白，这些蛋白在以下出版物中有描述，现在此附上作为参考：国际专利申请公开号WO93/05153，1993年3月18日公开；Terras FRG et al，1992，生化杂志，267：15301-15309；Terras et al，1993，FEBSlett，316：233-240；Terras et al，1995，植物细胞，7：573-588.这些抗真菌蛋白包括来源于萝卜的Rs-AEP1(抗真菌蛋白1)，Rs-AEP2，Rs-AEP3，Rs-AEP4及其同源蛋白如，来源于蔓菁的Bn-AEP1，和Bn-AEP2，来源于芜菁的Br-AFP1和Br-AFP2，来源于欧白芥的Sa-AFP1和Sa-AFP2，来源于拟南芥的At-AFP1，来源于光滑大丽花的Dm-AFP1和Dm-AFP2，来源于Cnincus benedictus的Cb-AFP1和Cb-AFP2，来源于香豌豆(Lathyrus cicera)的Lc-AFP1，来源于蝶豆的Ct-AFP1和Ct-AFP2。这些抗真菌蛋白特异性地抑制一定范围的真菌，可在农业、制药或防腐中用作杀真菌剂。
有建议说这类抗真菌蛋白应命名为植物防御素(defensin)(Terras F.R.G.et al 1995，植物细胞，7 573-583)，这类蛋白都有一个具有保守的胱氨酸和甘氨酸的类似基元(Broedaert W F et al 1995植物生理学108 1353-1358)。
图1表示蛋白质Rs-AFP1，及基本同源蛋白Rs-AFP2，Rs-AFP3，Rs-AFP4，Br-AFP1，Br-AFP2，Bn-AFP1，Bn-AFP2，Sa-AFP1，Sa-AFP2，At-AFP1，它们都是高度碱性和富含半胱氨酸的小的5Kda多肽。图1对氨基酸残基的位置：进行了编码Rs-ARP3序列开始处的短横(-)表示为了最大限度的排序而引入的一个间隔。Br-AFP1，Br-AFP2，Bn-AFP1，Bn-AFP2，Sa-AFP1，Sa-AFP2，At-AFP1的序列不完全：只表示出N-末端序列。在Bn-AFP2序列中的？表示一个非标准氨基酸，它的序列不能确定，被认为是一个标准氨基酸残基的转译后修饰。
更多的抗真菌植物防御素的实例在1995年7月6日公开的，在此引入为参考的国际专利申请公开号WO95/18229，中有描述。这些实例包括Hs-AFP1，一种能从矾根属种子中分离到的抗真菌蛋白；Ah-AMP1，一种能从欧洲七叶树种子中分离到的抗微生物蛋白。这些抗真菌蛋白特异性地抑制一定范围的真菌，可在农业、制药或防腐中用作杀真菌剂。
图9表示蛋白质Hs-AFP1和Ah-AMP1的氨基酸序列，图9对氨基酸残基的位置进行了编码。Hs-AFP1序列表明有48％与Rs-AFP1序列相同。Ah-AMP1序列表明有54％与Rs-AFP1序列相同。Hs-AFP1有52％与Ah-AMP1氨基酸序列相同。
这两种能从萝卜种子中分离的抗真菌蛋白同种型Rs-AFP1和Rs-AFP2的一级结构只在两个位置有差别，即：在位点5处，Rs-AFP1中为谷氨酸(E)，而在Rs-AFP2中为谷氨酰胺(Q)，在位点27处，Rs-AFP1中为天冬氨酸(N)，而在Rs-AFP2中为精氨酸(R)代替。结果在生理pH下，Rs-AFP2具有较高的净正电荷(+2)。尽管两种Rs-AFP在氨基酸序列上有94％相同，但Rs-AFP2对各种真菌的活性比Rs-AFP1高2～3倍并表现较高的盐耐受。蛋白质Rs-AFP3和Rs-AFP4在局部真菌感染后的萝卜叶中发现。这些诱导产生的叶蛋白与Rs-AFP1和Rs-AFP2同源，并且在体外表现类似的抗真菌活性。
编码Rs-AFP1的cDNA编码一个具有信号肽和后续的成熟蛋白的前蛋白。cDNA的序列在图2表示。啤酒糖酵母可用作生产和表达Rs-AFP2的载体(Vilas Alves et al，FEBS Lett，1994，348：228-232)。将蛋白N-末端与酵母结合因子α1(MFα1)的前原(prepro)序列相融合而进行表达可以通过酵母对植物来源的野生型Rs-AFP2进行正确的加工和分泌。Rs-AFP2蛋白浓度高达500μg/ml也不会对酵母有不良影响。
我们在Rs-AFPs和相关植物防御素的结构基础上提供新的潜在抗真菌肽类。关于本发明的第一个特色是提供了一种抗真菌肽，它包括与图1中Rs-AFP2抗真菌蛋白序列的21～51位点的连续氨基酸残基排列相同的至少六个氨基酸残基或基本同源蛋白序列。
与Rs-AFP2蛋白基本同源的蛋白包括图1表示的Rs-AFP1，Rs-AFP2，Rs-AFP3，Rs-AFP4，Br-AFP1，Br-AFP2，Bn-AFP1，Bn-AFP2，Sa-AFP1，Sa-AFP2，At-AFP1，和图9表示的Hs-AFP2，Ah-AMP1和DM-AMP1。基本同源蛋白质的氨基酸序列具有与图1和图9中表示序列至少40％相同，较优选的至少60％相同，最优选的至少80％相同。
本发明的抗真菌肽特别包括从Rs-AFP2及其基本同源的蛋白的β-2链/转角/β-3链区衍生的肽。本发明优选的抗真菌肽包括6聚体，9聚体，12聚体，13聚体，14聚体，15聚体，16聚体，17聚体，18聚体，19聚体，20聚体，尤其是在附带的实施例，特别是实施例11及图10-13的图和表中所述的18聚体，19聚体和20聚体肽类。
本发明的抗真菌肽包括以下肽类：
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的21～35位点15个氨基酸残基排列相同的15个氨基酸残基。序列为：CKNQCIRLEKARHGS：
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的25～39位点15个连续氨基酸残基排列相同的15个氨基酸残基。序列为：CIRLEKARHGSCNYV；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的29～43位点15个连续氨基酸残基排列相同的15个氨基酸残基。序列为：EKARHGSCNYVFPAH；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的33～47位点15个连续氨基酸残基排列相同的15个氨基酸残基。序列为：HGSCNYVFPAHKCIC；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的36～45位点10个连续氨基酸残基排列相同的10个氨基酸残基。序列为：CNYVFPAHKC；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的40～45位点6个连续氨基酸残基排列相同的6个氨基酸残基。序列为：FPAHKC；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的42～47位点6个连续氨基酸残基排列相同的6个氨基酸残基。序列为：AHKCIC；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的43～48位点6个连续氨基酸残基排列相同的6个氨基酸残基。序列为：HKCICY；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的24～32位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：QCIRLEKAR；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的25～33位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：CIRLEKARH；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的32～40位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：RHGSCNYVF；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的36～44位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：CNYVFPAHK；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的40～48位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：FPAHKCICY；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的41～49位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：PAHKCICYF；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的42～50位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：AHKCICYFP；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的43～51位点9个连续氨基酸残基排列相同的9个氨基酸残基。序列为：HKCICYFPC；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的25～36位点12个连续氨基酸残基排列相同的12个氨基酸残基。序列为：CIRLEKARHGSC；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的29～40位点12个连续氨基酸残基排列相同的12个氨基酸残基。序列为：EKARHGSCNYVF；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的30～41位点12个连续氨基酸残基排列相同的12个氨基酸残基。序列为：KARHGSCNYVFP；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的32～43位点12个连续氨基酸残基排列相同的12个氨基酸残基。序列为：RHGSCNYVFPAH；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的33～44位点12个连续氨基酸残基排列相同的12个氨基酸残基。序列为：HGSCNYVFPAHK；
一种抗真菌肽，包含与图1中表示的Rs-AFP2序列的31～49位点19个连续氨基酸残基排列相同的19个氨基酸残基。序列为：ARHGSCNYVFPAHKCTCYF。
我们发现以Rs-AFP2为基础的肽中，在位点27为精氨酸残基和位点40为苯丙氨酸残基；在位点30为赖氨酸残基和位点43为组氨酸残或在位点32为精氨酸残基和位点44为赖氨酸残基特别有利。我们还发现以Rs-AFP2序列为基础的抗真菌肽具选自位点30为赖氨酸残基，位点31为丙氨酸残；位点32为精氨酸残基或位点33为苯丙氨酸的N-末端氨基酸，和包含位点48为酪氨酸残基或位点49为苯丙氨酸的C-末端氨基酸特别有活性。这些抗真菌肽形成了本发明的另一个实施方案。
本发明还提供了一种抗真菌肽，它包含与图9中表示的Ah-AMP1序列或Hs-AMP1序列的30～48位点连续氨基酸残基排列相同的6个氨基酸残基。这样的抗真菌肽，包括一个包含与图9中表示的Ah-AMP1序列的30～48位点19个连续氨基酸残基排列相同的19个氨基酸残基的多肽。序列为：ASHGACHKRENHWKCFCYF。本发明还包括一个包含与图9中表示的Dm-AMP1序列的30～48位点之间19个氨基酸残基的多肽。序列为：AAHGACHVRNGKHMCFCYF。
从这儿所指Rs-AFP植物防御素的区域衍生的肽表现出抗真菌活性。这样的肽也许比全长的植物防御素容易合成却保留抗真菌活性。编码这些肽的DNA序列也许更适合转化到生物宿主中。
本发明的抗真菌肽可以从它的已知氨基酸序列采用标准肽合成仪化学合成而生产，或在合适的生物中通过重组DNA的表达而产生。抗真菌肽可用作杀真菌剂，并且在农业或制药或其它方面应用。抗真菌肽可与本发明的一种或多种抗真菌蛋白或一种或多种其它抗真菌肽结合使用。例如：一种抗真菌组合物包含上面提到的15聚体肽类中一种加上Rs-AFP1或Rs-AFP2蛋白会表现提高了的活性。
它的一级结构知识使之能够通过采用标准肽合成仪进行化学合成而生产抗真菌肽或其部分。它也使编码抗真菌肽的DNA构建体的产生成为可能。
本发明进一步提供编码本发明的一种抗真菌肽的DNA序列。此DNA序列可从已知的氨基酸序列预知并且编码此肽的DNA可通过标准核苷酸合成仪合成。
编码抗真菌肽的DNA序列与合适的调控序列(如启动子，终止子，转移肽等)结合而插入一个DNA构建物或载体。在许多应用中，编码抗真菌肽的DNA插入表达另一种蛋白质的编码区以形成一种融合蛋白，或替换一种蛋白质的一个结构域使那种蛋白质具抗真菌活性。此DNA序列可置于一个同源或异源的启动子控制下，启动子可以是组成型或诱导型(例如：环境条件，病原的存在，化学物质的存在等刺激)。转移肽可与抗真菌蛋白同源或异源，并筛选以保证分泌到需要的细胞器或细胞外空间。与需要的抗真菌蛋白自然连接的转移肽较优。这样的DNA构建物会被克隆或转化到容许编码的肽或此肽的活性部分表达的生物系统中。合适的生物系统包括微生物(例如：细菌如大肠杆菌，假单胞菌和内寄生菌如木质棍状杆菌犬齿亚种；酵母；病毒；细菌噬菌体；等)。培养的细胞(如昆虫细胞，哺乳动物细胞)和植物。有时，表达的肽接着被分离和提取供使用。
本发明的抗真菌肽在对抗植物真菌疾病中很有用。本发明进一步提供将真菌暴露给本发明的一种抗真菌肽的对抗真菌的方法。抗真菌肽能以组合物形式使用。
在制药应用中，抗真菌肽(包括它的任何衍生产物)可用作杀真菌剂以治疗哺乳动物的感染(例如，抗酵母，如：抗假丝酵母)。
本发明的一种抗真菌肽(包括它的任何衍生产物)还可用作防腐剂(例如：食品添加剂)
在农业应用中，抗真菌肽在作物的植株生长中或作物收获后保护中提高作物的抗病和耐病。接触此多肽的病使原受到抑制。抗真菌肽可消除已在植物中建立的病原或保护植物避免将来的病原袭击。此肽的消除作用特别有利。
将植物病原接触抗真菌蛋白可通过许多方法实现，例如：
(a)分离的肽可采用标准农业技术(如：喷洒)施用到植物部分，或土壤及其它植物根周围的生长基质，或播种前的植物种子。
此肽可从植物组织提取或化学合成，或从遗传修饰表达该肽的微生物中提取。此肽可以以组合物形式施用与周围或植物生长基质。组合物包含在固体或液体稀释剂和任选的佐剂如表面活性剂的混合物中的肽。固体组合物可以是可分散的粉末，小颗粒或颗粒。
(b)一种组合物，包含遗传修饰以表达该抗真菌肽的的微生物，它可被施用于植物或植物生长的土壤。
(c)一种遗传修饰以表达抗真菌肽的内寄生菌，它可被导入植物组织(如，通过植物种子处理方法)。
内寄生菌是指能进入与植物宿主的非病原性内共生关系的微生物。在作物遗传国际公司的一系列专利申请中有一个内寄生菌促进植物保护的方法(例如：I国际申请公开号WO90/13224，欧洲专利公开号EP-125468，国际申请专利号WO91/10363，国际申请公开号WO87/03303)。内寄生菌可以在遗传修饰后生产农业化学物质。国际专利申请公开号WO94/16076(ZENECA)中描述使用内寄生菌在遗传修饰后表达植物来源的抗真菌肽。
(d)可将编码抗真菌肽的DNA导入到植物基因组，这存多肽就可在植物体内表达(此DNA可以是cDNA，基因组DNA或通过标准核酸合成仪合成的DNA)。
将植物病原体接触一种包含一种抗真菌肽加上一种抗真菌蛋白的组合物，可以通过按上述传递肽一样传递该蛋白质而实现。例如：上述的两种15聚体肽类加上RS-AFP1或AS-AFP2可同时施用到植物部分或在植物体内同时表达。
植物细胞可按各种已知的方法(土壤杆菌Ti质粒，电穿孔，显微注射，显微注射枪)被重组DNA构建物转化。合适的转化植物细胞再增殖成完整植物，此植物中新的核酸物质稳定的整合在基因组中。转化的单子叶植物或双子叶植物都可通过此法获得，而后者常更容易增殖。一些原始转化物的后代能够继承获得编码抗真菌肽的重组DNA。
本发明进一步提供一种具提高了的真菌病原抗性并包含表达本发明的抗真菌肽的重组DNA的植物。这样的一株植物可用作标准植物杂交培养中的亲本以获得提高了真菌抗性的杂交株和株系。
重组DNA较优的为异源DNA，它可通过转化导入植物或它的祖先中。重组DNA编码一种表达后运送到病原侵染位点(如叶子)的抗真菌肽。此DNA也可编码抗真菌肽的活性亚单位。
病原可以是在植物内或附近生长的任何真菌。在本文中，提高抗性是指与野生型植物相比促进了对真菌病原的耐受性。抗性可在轻微提高对病原影响的耐受(病原部分受抑制)到完全抗性范围内变化，因而植物可不受存在的病原的影响(病原强烈抑制或被杀死)。对某一病原或对广谱病原抗性水平的提高都可以提高抗性。表现提高了抗性的转基因植物(或从此来源的植物)可在以后的植物转化或杂交中挑选。
抗真菌肽在转基因植物或其后代中表达，真菌就会在在植物上病原侵染位点接触肽。特别是，施用合适的调控序列，肽可在体内最有效的时间和地点产生。例如：肽在植物的一部分中表达，通常肽在此处不大量表达，而对疾病的抗性却很重要(如叶子)。
产生的基因修饰植物实例包括大田作物，谷类，水果和蔬菜，canola，向日葵，烟草，甜菜，棉花，大豆，玉米，小麦，大麦，水稻，高粱，西红柿，芒果，桃子，苹果，梨子，草莓，香蕉，甜瓜，马铃薯，萝卜，莴苣，白菜，洋葱。
我们惊奇地发现本发明的肽与全长的Rs-AFP2混合后可观察到协同作用。即观察到混合物的抗真菌活性比这个蛋白质或肽自己的活性好。
本发明的另一特色提供一种抗真菌组合物，其中包含本发明的一种多肽和Rs-AFP2或Rs-AFP1。
本发明也包括编码抗真菌肽和Rs-AFP2或Rs-AFP1的DNA构建物，以及在药物，农业，防腐的抗真菌组合物中所用的所述肽混合物的应用。
本发明将仅参照附图，进行举例说明。
图1表示一些植物防御素的氨基酸序列。
图2表示编码Rs-AFP1的cDNA核苷酸序列。
图3表示15聚体Rs-AFP2肽类的氨基酸序列。
图4是说明Rs-AFP2肽中6、9、12聚体肽类的图。
图5中图表示以Rs-AFP2肽为基础的6、9、12聚体肽类的抗真菌活性。
图6是总结以Rs-AFP2肽为基础的活性6、9、12和15聚体肽类的图。
图7中图表示以Rs-AFP1肽为基础的6、9、12聚体肽类的抗真菌活性。
图8是总结所有以Rs-AFP1肽为基础的活性6、9、12聚体肽类的图。
图9表示Hs-AFP1，Ah-AMP1和DM-AMP1蛋白质的氨基酸序列。
图10a是总结以Rs-AFP2肽为基础的活性13、14、15聚体肽类的图。
图10b是总结以Rs-AFP2肽为基础的活性16、17、18聚体肽类的图。
图10c是总结以Rs-AFP2肽为基础的活性19、20聚体肽类的图。
图11a中图表示以Rs-AFP2肽为基础的具相同的Ile26-Ala31 N-末端残基的13～20聚体肽类的抗真菌活性。
图11b中图表示以Rs-AFP2肽为基础的具相同的Arg32-Asn37 N-末端残基的13～20聚体肽类的抗真菌活性。
图12a中图表示以Rs-AFP2肽为基础的具相同的Tyr38-His43 C-末端残基的13～20聚体肽类的抗真菌活性。
图12b中图表示以Rs-AFP2肽为基础的具相同的Lys44-Phe49 C-末端残基的13～20聚体肽类的抗真菌活性。
图13是对在Rs-AFP2的Ile26-Phe49区域内重叠的13～20聚体肽类的分析结果。
                         实施例1
合成肽的生产
断裂肽通过PEPSCAN方法合成。MPS肽用Multiple PeptideSynthesis合成。所有的多肽都通过一个乙酰基团封闭氨基末端残基和一个碳酰胺(Carboxamide)基团封闭羧基末端残基。
PEPSCAN-断裂(C-末端β-丙氨酸-酰胺)。放射接技的聚乙烯针(pins)被氨基基团官能化。羟基乙使用与二环己基碳化二亚胺(DCC)偶联，在洗涤Boc-β-丙氨酸后，用DCC与作为催化剂的二甲基氨基吡啶(DMAP)偶联。在有针的块上，10个AFP2的重叠15聚体肽类同时合成。采用Fmoc-氨基酸并与DCC/羟基苯并三唑(HOBt)偶联过夜为偶联方法。这些肽使用三氟乙酸/酚/苯硫基甲烷/水/乙二硫醇。10/0.75/0.5/0.5/0.25(断裂混合物B)去保护，然后洗涤，干燥，最后用氨从针(pins)上切下。此过程产生约1mg具C-末端β-丙氨酸酰胺的肽。
PEPSCAN-断裂(C-末端氨基)。放射枝接的聚乙烯针与羟基基团作用。用DCC和DMAP作为剂偶联Boc-β-A。Boc基团用TFA移去，采用DCC/HOBt方法偶联Fmoc-2，4-二甲氧基-4’(羧基甲基氧基)-二苯甲氨(Rink连接物)接着，AFP2的46个6聚体肽类，43个9聚体肽类，40个12聚体肽类在上述的有96针的块上合成。在洗涤，干燥后，肽去保护，并用混合物B切下，断裂混合物，用乙醚蒸发，提取两次，并从水中冷冻干燥两次。此过程产生约1mg具C-末端酰胺的肽。
Multiple Peptide Synthesis我们使用Hamilton Microlab2200以15～30μl的量同时合成40种肽。Hamilton Microlab2200设置为输送洗涤溶液和试剂到有20～40个有多肽合成的树脂的并有滤膜的4ml独立的柱子的架子中。这些柱子在每一步后用真空抽吸。偶联循环采用以Fmoc/2-(1H-苯丙三唑-(基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸盐(HBTU)化学(Fields et al，Peptide Redearch 4，1991 95-101)为基础的双偶联步骤。肽用1.5ml混合物B在两小时内去保护和切下，接着加入己烷/乙醚1/1沉淀两次。沉淀进行干燥并从水/乙腈中冷冻干燥。
(a)以Rs-AFP2蛋白质为基础的重叠15聚体肽类
以Rs-AFP2蛋白质的一级序列为基础合成一系列10个断裂和MPS肽。MPS肽的序列在图3中表示；对应于具额外的C-末端具额外的C-末端对应MPS肽的断裂肽β-丙氨酸(只在第一次PEPSCAN片断合成是用一个额外的连接物)每个肽包含与Rs-AFP2序列的氨基酸排列相同的15个连续氨基酸残基。
肽1具有RS-AFP2的1～15氨基酸位点的序列。
肽2具有RS-AFP2的5～19氨基酸位点的序列。
肽3具有RS-AFP2的9～23氨基酸位点的序列。
肽4具有RS-AFP2的13～27氨基酸位点的序列。
肽5具有RS-AFP2的17～31氨基酸位点的序列。
肽6具有RS-AFP2的21～35氨基酸位点的序列。
肽7具有RS-AFP2的25～39氨基酸位点的序列。
肽8具有RS-AFP2的29～43氨基酸位点的序列。
肽9具有RS-AFP2的33～47氨基酸位点的序列。
肽10具有RS-AFP2的37～51氨基酸位点的序列。
(b)以Rs-AFP2蛋白质为基础的重叠6，9和12聚体肽类
以Rs-AFP2蛋白质的一级序列为基础采用PEPDCAN法合成三个系列断裂多肽。
在第一个系列中，各肽包括与Rs-AFP2氨基酸排列相同的六个连续氨基酸残。这套46个6聚体肽类(标为1～46)覆盖整个Rs-AFP2序列。例如：肽1具有Rs-AFP2的1～6氨基酸位点的序列。肽2具有RS-AFP2的2～7氨基酸位点的序列。肽3具有RS-AFP2的3～8氨基酸位点的序列。肽45具有RS-AFP2的45～50氨基酸位点的序列。肽46具有Rs-AFP2的46～51氨基酸位点的序列。
在第二个系列中，各肽包括与Rs-AFP2氨基酸排列相同的9个连续氨基酸残。这套43个9聚体肽类(标为47～89)覆盖整个Rs-AFP2序列。例如：肽47具有Rs-AFP2的1～9氨基酸位点的序列。肽48具有Rs-AFP2的2～10氨基酸位点的序列。肽49具有Rs-AFP2的3～11氨基酸位点的序列。肽88具有Rs-AFP2的42～50氨基酸位点的序列。肽89具有RS-AFP2的43～51氨基酸位点的序列。
在第三个系列中，各肽包括与Rs-AFP2氨基酸排列相同的12个连续的氨基酸残。这套40个12聚体肽类(标为90～129)覆盖整个Rs-AFP2序列。例如：肽90具有Rs-AFP2的1～12氨基酸位点的序列。肽91具有RsAFP2的2～13氨基酸位点的序列。肽92具有Rs-AFP2的3～14氨基酸位点的序列。肽128具有Rs-AFP2的39-50氨基酸位点的序列。肽129具有Rs-AFP2的40～51氨基酸位点的序列。
图4是以Rs-AFP2蛋白质为基础的重叠6，9和12聚体肽类系列的直观表示。
(c)以Rs-AFP1从蛋白质为基础的重叠6，9和12聚体肽类
以Rs-AFP1蛋白质的一级序列为基础采用PEPDCAN法合成三个系列断裂肽。
在第一个系列中，各肽包括与Rs-AFP1氨基酸排列相同的六个连续的氨基酸残。这套46个6聚体肽类(标为1～46)覆盖整个Rs-AFP1序列。例如：肽1具有Rs-AFP1的1～6氨基酸位点的序列。肽2具有Rs-AFP1的2～7氨基酸位点的序列。肽3具有RS-AFP1的3～8氨基酸位点的序列。肽45具有RS-AFP1的45～50氨基酸位点的序列。肽46具有Rs-AFP1的46～51氨基酸位点的序列。
在第二个系列中，各肽包括与Rs-AFP1氨基酸排列相同的9个连续氨基酸残。这套43个9聚体肽类(标为47～89)覆盖整个Rs-AFP1序列。例如：肽47具有Rs-AFP1的1～9氨基酸位点的序列。肽48具有Rs-AFP1的2～10氨基酸位点的序列。肽49具有Rs-AFP1的3～11氨基酸位点的序列。肽88具有Rs-AFP1的42～50氨基酸位点的序列。肽89具有RS-AFP1的43～51氨基酸位点的序列。
在第三个系列中，各肽包括与Rs-AFP1氨基酸排列相同的12个连续氨基酸残。这套40个12聚体肽类(标为90～129)覆盖整个Rs-AFP1序列。例如：肽90具有Rs-AFP1的1～12氨基酸位点的序列。肽91具有RsAFP1的2～13氨基酸位点的序列。肽92具有Rs-AFP2的3～14氨基酸位点的序列。肽128具有Rs-AFP2的39～50氨基酸位点的序列。肽129具有Rs-AFP1的40～51氨基酸位点的序列。
(d)以Rs-AFP2蛋白质为基础的环1肽
合成另一种环状Rs-AFP2蛋白质为基础的MPS肽。环1肽包含与Rs-AFP2的36位点的半胱氨酸残基和45位点半胱氨酸残基之间的序列相同的10个连续氨基酸残基。环1肽具以下序列：CNYVFPAHKC。此肽通过这两个半胱氨酸环化。
(e)以Rs-AFP2蛋白质为基础的19聚体肽类
合成另二种MPS肽。
肽G1由19个氨基酸残基组成并具有与Rs-AFP2蛋白31～49位点一级序列相同的序列，多肽G1的序列组成ARHGSCNYVFPAHKCICYF。
肽G2由19个氨基酸残基组成并具以Rs-AFP2蛋白31～49位点一级序列为基础的序列。为防止多肽的二聚化或环化，半胱氨酸被α-氨基丁酸取代(用标识B标定)。α-氨基丁酸是有由-CH2-CH3组成的侧链的衍生物，不能形成二硫键。多肽G2的序列：ARHGSBNYVFPAHKBIBYF。
(f)以Ah-AMP1蛋白质为基础的肽J1
合成另一种MPS肽。肽J1由19个氨基酸残基组成并具以图9中Ah-AMP1蛋白30～48位点一级序列为基础的序列。为防止多肽的二聚化或环化，半胱氨酸被α-氨基丁酸取代(用标识B标定)。
肽J1的序列：ASHGABHKRENHWKBFBYF。
(g)多肽的处理与保存
不溶于水的肽被溶于50％乙腈：50％乙腈被加入到肽中以形成一种储存溶液，它可进一步用水稀释后进行真菌生长测定。真菌的生长在最大测试浓度(在测试孔中20％v/v)的乙腈存在下不受影响。
断裂15聚体肽类在无菌mili-Q水中溶解，最终浓度5mg/ml。MPS15聚体肽类溶解的最终浓度4～10mg/ml，对那些不溶于水的肽采用乙腈为溶剂。Rs-AFP1肽断裂的6，9，和12聚体肽类在20％乙腈中溶解，最终浓度2mg/ml。Rs-AFP1肽断裂的6，9，和12聚体肽类除标记1～83的肽溶解在20％乙腈中，标记3，4，5，25，47，52，64，69，70，73，74，77，85和93在20％乙腈中溶解外都溶于无菌水，最终浓度2mg/ml。Rs-AFP1和Rs-AFP2肽在称重前冷冻干燥。环1MPS肽在水中完全溶解，溶解浓度2mg/ml。
使用脱气的水和溶液以避免多肽的氧化。乙腈用氮气脱氧；水被煮沸20分钟以脱气。多肽溶液在-20℃保存，并且在氮气环境下以避免氧化。冷冻的肽在打开容器(小瓶)前要保温至室温以避免吸水。
                        实施例2
抗真菌活性的生物测定：方法学
使用了以下真菌菌株：
甘蓝黑斑病链格孢(MUCL20297)，豌豆壳二孢(MUCL30164)，灰葡萄孢(MUCL30158)，大刀镰孢(IMI180420)和大丽花轮枝孢(MUCL19210)。真菌除大刀镰孢和大丽花轮枝孢在黑暗中生长外都在白色荧光下，室温中的6个麦琼脂平板上生长。收获孢子的时间10～25天，依菌株而定。孢子按以下收集。向每个平皿中加入5～10ml无菌milli-Q水，并用无菌小铲刮琼脂表面以获得含菌丝和孢子的悬液。此悬液通过无菌玻璃棉塞漏斗过滤，含孢子的滤液收集在无菌聚丙烯离心管中。甘蓝黑斑病链格孢的孢子因为厌水特性而悬浮在1.2％的无菌Tween20(Merk，822184)中。孢子悬液采用2400×g离心15分钟并用小体积的无菌milli-Q水悬浮来洗涤两次。孢子的浓度用计数板测定，然后调整至4×107个/ml.，孢子悬液的等分试样转移到无菌小管，并加入等体积的50％无菌甘油(Merk，4091)，这样获得25％甘油中最终浓度为2×107/ml的孢子悬液。将此储液小心混合，孢子悬液以100μl等分转移到无菌小管中，-80℃保存。
抗真菌活性通过Broekaert et al描述的分光光度法(1990。FEMSMicrobiol Lett，69：55-60)测定。测定的实施如下：在每个无菌平底96孔微滴定板的各孔中加入20μl测试液和80μl真菌孢子悬液(2×104〕。孢子悬液通过用半浓度的土豆葡萄糖肉汤以1∶1000稀释储备液(在25％甘油中107孢子/ml)而制备。每个测试包含一个8孔含20μl无菌milli-Q水和80μl孢子悬液的阳性对照。微滴定板在室温下需氧培养(盖上盖)，对所有测试生物保持黑暗条件。
在培养30分钟后(当孢子沉在孔底)在微平板阅读器595nm处测光密度。继续培养微滴定板直至对照微培养光密度为0.250～0.500。这约需72小时(大丽花轮枝孢要96小时)。生长抑制的百分比(％GI)估计为在595nm下对照微培养的校正了的光吸收减去测试微培养的校正了的光吸收后与对照微培养的校正了的光吸收的比值的100倍。校正了的光吸收值等于在595nm下72或96小时后物的光吸收减去30分钟后595nm下的光吸收。
％GI＝[(A对照-A测试)/A对照]×100
其中A对照＝(A72/96小时-A30分钟)对照
A测试＝(A72/96小时-A30分钟)测试
IC50值是指在培养72或96小时后产生50％生长抑制的浓度。最小抑制浓度(MIC)对应在培养72或96小时后产生100％生长抑制的最低浓度。
生物测定中使用的不同培养基的组成在下面给出：
6麦琼脂(six cereal agar)(6CA)
20g Bambix(Nutricia)，15g Agar Technical(OxoidL13)，1L milli-Q水，121℃灭菌15分钟。
SMF
285mg(2.5mM K+)K2HPO4.3H2O，12.5mg(50μM Mg2+)MgSO4.7H2O，7.3mg(50μM Ca2+)CaCl22H2O，1.14mg(5μM Fe2+)FeSO4.7H2O，0.023mg(0.1μM Co2+)CoCl2.6H2O，0.024mg(0.1μMCu2+)CuSO4·5H2O，0.24mg(2μMNa+)Na2MoO4·2H2O，0.03mg(0.5μM)H3BO3，0.01mg(0.1μM K+)KI，0.14mg(0.5μM Zn2+)ZnSO4.7H2O，0.01mg(0.1μMMn2+)MnSO4.1H2O，10g葡萄糖，1g天冬酰氨，20mg甲硫氨酸，20mg肌醇，2mg生物素(biotine)，10mg硫胺素-HCl，2mg piridoxine，11 milli-Q水，通过0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存。
SMF+
SMF培养基补充1mM Ca2+和50mM K+.
半浓度土豆葡萄糖肉汤(1/2PDB)
12g PDB(Difco 0549-01-7)，1L milli-Q水，121℃灭菌15分钟。
1/16浓度土豆葡萄糖肉汤(1/16PDB)
1.5g PDB(Difco 0549-01-7)，1L milli-Q水，121℃灭菌15分钟。
                            实例3
15聚体肽类的抗真菌活性
这些断裂肽用大刀镰孢测试它们的抗真菌活性，每个肽以从500μg/ml至3.9μg/ml两倍稀释系列进行测试，每个测试要有重复。表1的结果为显微分析和光密度测定的综合。只有肽6，7，8，和9表现明显的抗真菌活性，最小抑制浓度(MIC)值分别30μg/ml(肽6)，60μg/mll(肽7)，15μg/mll(肽8和9)，因为这些肽部分可溶，开始测试浓度是大约的，所以MIC值也是大约的。
MPS肽用五种不同的真菌菌株测试：甘蓝黑斑病链格孢，豌豆壳二孢，灰葡萄孢，大刀镰孢和大丽花轮枝孢。每个多肽以从500μg/ml至3.9μg/ml两倍稀释系列进行测试。这些测试用大刀镰孢做五次，而其它真菌做一次。所有测试都使用相同的储备干肽，但肽溶液不同，每种使用的溶液最多三个测试。表1的结果对应各个测试的平均值：测试之间的变易性为二阶的。不同真菌对存在的肽的敏感性不一样，大丽花轮枝孢。最敏感，灰葡萄孢最不敏感。但是在所有的测试生物中，肽6，7，8，9是最好的抗真菌肽，它们的MIC值依据真菌不同在31.5～250μg/ml之间变化。
肽6，7，8，9分别包含与图1中Rs-AFP2序列的21～47位点的15个氨基酸残基排列相同的15个连续氨基酸残基。这些测试说明肽6，7，8，9具抗真菌活性。
                            表1
               大刀镰孢                   MIC值(μg/ml)
肽     断裂多肽     MPS      甘蓝黑斑   碗豆壳   灰葡    大丽花
                              病链格孢    二孢    萄孢    轮技孢
1        250        250-500     250      ＞500    ＞500    250
2        ＞500      ＞500       ＞500    ＞500    ＞500    ＞500
3        ＞500      250         ＞500    ＞500    500      500
4        ＞500      125         500      ＞500    250      125
5        250-500    125-250     125      500      500      250
6        31.25      62.5        62.5     125      250      31.25
7        31.25-     62.5        62.5     250      250      31.25
         62.5
8        15.625     31.25-62.5  31.25    125      250      31.25
9        15.625     31.25-62.5  62.5     250      250      31.25
10       125-250    500         ＞500    ＞500    ＞500    250
Rs-      10         5-10        10       20-40    ＞40     10
AFP2
实施例4
Rs-AFP2肽的6，9，12聚体肽类的抗真菌活性
Rs-AFP2断裂肽的6，9，12聚体肽类用大刀镰孢测试它们的抗真菌活性，每个多肽采用1/2PDB培养基以从400μg/ml至3.1μg/ml两倍稀释系列进行测试。Rs-AFP2在所有板上以从40μg/ml至0.31μg/ml两倍稀释系列作为阳性对照，对6聚体肽类(标为1～46)和9聚体肽类(标为47～89)，每个测试要有两个重复，对12聚体肽类(标为90～129)。表2，3和4只表示活性肽的结果。
                     表2：六聚体肽类
肽              最小抑制浓度       50％抑制浓度
                  (μg/ml)           (μg/ml)
1                   400                268
32                  400                297
32                  400                279
40                  100                72
42                  100                83
43                  50                 28
                  表3：九聚体肽类
肽               最少抑制浓度      50％抑制浓度
                   (μg/ml)          (μg/ml)
65                   200               144
66                   150               105
70                   100               78
71                   100               66
74                   400               270
76                   300               162
77                   300               189
78                   400               284
82                   100               77
83                   250               175
84                   400               175
85                   200               121
86                   400               144
87                   50                39
88                   50                35
89                   400               242
                   表4：十二聚体肽类
肽                 最少抑制浓度        50％抑制浓度
                     (μg/ml)            (μg/ml)
106                    200                 116
108                    150                 150
109                    200                 106
110                    150                 148
111                    200                 126
112                    200                 149
113                    200                 127
114                    100                 74
115                    300                 203
116                    400                 202
117                  ＞400                 327
118                    200                 154
119                    50                  37
120                    200                 139
121                    50                  33
122                    50                  30
123                    300                 280
124                    200                 135
125                    400                 265
126                    300                 201
128                  ＞400
图5图表示以Rs-AFP2为基础的6，9，12聚体肽类的抗真菌活性结果。活性肽在IC50值(μg/ml)的图表中对应给每系列肽的标数用竖条表示。在9聚体肽类的图中，肽按N-末端氨基酸标数，因而，例如图5，9聚体肽类图中的肽1对应表3中肽47，图59聚体肽类图中的肽43对应表3中肽89。
类似的，在12聚体肽类的图中，多肽按N-末端氨基酸标数，例如图5 12聚体肽类图表中的肽1对应表4中肽90，图5 12聚体肽类图中的肽39对应表4中肽128。
图6是总结全部活性6聚体肽类，9聚体肽类，和12聚体肽类的图。多肽再一次按N-末端氨基酸标数。每一种活性肽都已按IC50值分类，如下：
在6聚体肽类，肽1，31和32的IC50值在100～300μg/ml，而肽40，42，43的IC50值在低于100μg/ml。
在9聚体肽类，肽19，20，28，30～32，37～40和43的IC50值在100～300μg/ml，而肽24，25，36，41和42的IC50值在低于100μg/ml(与表3中的70，71，82，87和88等价)。
在12聚体肽类，肽28和29的IC50值在300～400μg/ml，肽17，20～24，26，27，31和34～37的IC50值在100～300μg/ml而肽25，30，32和33的IC50值在低于100μg/ml(与表4中的114，119，121和122等价)。
图6也表示了活性15聚体肽类。肽1(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点1)，肽5(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点17)，肽10(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点37)，的IC50值在100～300μg/ml。肽6(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点21)，肽7(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点25)，肽8(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点29)，肽9(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点33)的IC50值在低于100μg/ml。
多肽抗真菌活性会因为生长培养基中无机盐(1mM CaCl2或50mM KCl)的存在而下降。尽管它的敏感性好象随采用的测试真菌变化很大，阳离子对Rs-AFPs的抑制作用以前已有报导(Rerras et al，1992，生物化学杂志267：1-9)。
实施例5
Rs-AFP1肽的6，9，12聚体肽类的抗真菌活性
Rs-AFP1断裂肽的6，9，12聚体肽类用大刀镰孢和豌豆壳二孢测试它们的抗真菌活性，每个多肽采用1/2PDB培养基以从400μg/ml至3.1μg/ml两倍稀释系列进行测试。Rs-AFP2在所有板上以从40μg/ml至0.31μg/ml两倍稀释系列作为阳性对照，用大刀镰孢的测试要两份重复，用豌豆壳二孢做一次，MIC和IC50为2或3个实验的平均值，结果是显微分析和光密度测定的综合。表5，6和7只表示活性肽的结果。6聚体肽类标为1～46，9肽类标为47～89，12聚体肽类标为90～129
                  表5：六聚体肽类
肽           大刀镰孢                    豌豆壳二孢
        最少抑制浓 50％抑制浓度     最低抑制浓    50％抑制浓度
        度(μg/ml)   (μg/ml)       度(μg/ml)      (μg/ml)
31         400         266              -              -
42         100         61              400            267
43         75          38            ＞400            340
44       ＞400         376           ＞400            400
                  表6：九聚体肽类
肽           大刀镰孢                    豌豆壳二孢
       最少抑制浓  50％抑制浓度     最低抑制浓    50％抑制浓度
       度(μg/ml)    (μg/ml)       度(μg/ml)      (μg/ml)
74       ＞400         370              -              -
76         250         169           ＞400            342
77         300         193             200            143
78         100         69              100            70
82         150         113             400            265
83         400         330              -              -
84         250         145              -              -
85         200         121             400            184
86         250         196             200            80
87         37.5        28              50             31
88         37.5        21              25             18
89         400         233             100            70
                      表7：十二聚体肽类
肽          大刀镰孢        豌豆壳二孢
           最少抑制浓       50％抑制浓度   最低抑制浓  50％抑制浓度
           度(μg/ml)        (μg/ml)      度(μg/ml)    (μg/ml)
110           400               223            -            -
113           400               362            -            -
114           400               328          ＞400          318
116           400               359            -            -
117           400               347            400          293
118           100               63             200          91
119           50                44             100          66
120           150               105            200          126
121           50                38             100          55
122           50                35             100          74
123           300               266          ＞400          349
124           300               213          ＞400          318
125         ＞400               350            400          281
126           300               189            400          298
127         ＞400               354            400          302
128         ＞400               320            400          181
129           -                 -              400          311
图7图示以Rs-AFP1为基础的6，9，12聚体肽类用大刀镰孢测试的抗真菌活性结果。活性肽在IC50值(μg/ml)的图中对应给每系列多肽的标数用竖条表示出。在9聚体肽类的图中，多肽按N-末端氨基酸标数，例如图7 9聚体肽类图中的肽1对应表6中肽47，图5 9聚体肽类图表中的肽43对应表6中肽89。
类似的，在12聚体肽类的图表中，肽按N-末端氨基酸标数，例如图7 12聚体肽类图表中的肽1对应表7中肽90，图7 12聚体肽类图表中的肽39对应表7中肽128。
图8是总结用大刀镰孢测试的全部活性6聚体肽类，9聚体肽类，和12聚体肽类的图。肽再一次按N-末端氨基酸标数。每一种活性肽都已按IC50值分类，如下：
在6聚体肽类，肽44的IC50值在300～400μg/ml，肽31的IC50值在100～300μg/ml，而肽42，43的IC50值低于100μg/ml。
在9聚体肽类，肽28和37的IC50值在300～400μg/ml，肽30，31，36，38～40和43的IC50值在100～300μg/ml，而肽32，41和42的IC50值在低于100μg/ml(与表6中的78，87和88等价)。用豌豆壳二孢时另两个9肽类的IC50值在低于100μg/ml：肽40(与表6中的86等价)和肽43(与表6中的89等价)
在12聚体肽类，肽24～28，36，38和39的IC50值在300～400μg/ml，肽21，31，34，35和37的IC50值在100～300μg/ml而肽29，30，32和33的IC50值在低于100μg/ml(与表7中的118，119，121和122等价)。
图8也表出了以活性Rs-AFP2为基础的15聚体肽类作为对比。肽1(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点1)，肽5(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点17)，肽10(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点37)，的IC50值在100～300μg/ml。肽6(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点21)，肽7(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点25)，肽8(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点29)，肽9(N-末端氨基酸对应Rs-AFP2序列的位点33)的IC50值低于100μg/ml。
实施例6
以Rs-AFP2蛋白质为基础的环1肽的抗真菌活性
环1肽由10个氨基酸残基组成，序列如下：CNYVFPAHKC。两个半胱氨酸被环化。表8表示环1肽与以Rs-AFP2多肽为基础的15聚体肽类比较的抗真菌活性(MIC值)。表9表示环1肽与最有活性的15聚体肽类的活性相比较的抗真菌活性(MIC值)。活性用大刀镰孢在1/16thPDB中测定。
                        表8
 肽                  抗真菌活性  最小抑制浓度μg/ml
 1                                180
 2                              ＞330
 3                                180
 4                                150
 5                                180
 6                                45
 7                                45
 8                                22.5
 9                                17.5
 10                               100
 环1                              2.5
                    表9
 肽                  抗真菌活性最小抑制浓度μg/ml
 6                                12
 7                                5
 8                                6
 9                                10
 环1                              4
实施例7
Rs-AFP2蛋白质为基础的19聚体肽类G1和G2以及以Ah-AMP1蛋白质为基础的19聚体肽类J1的抗真菌活性
肽G1由19个氨基酸残基组成，序列如下：ARHGSCNYVFPAHKCICYF。此肽以对最具活性的12聚体肽类和15聚体肽类在此氨基酸范围(stretch)内及对应Rd-AFP1的三维模型(Fant F.et al(19940第十二届欧洲实验NMR会议)的β-链/β-转角/β-链区内的氨基酸范围的观察为基础而构想出的，肽G2由19个氨基酸残基组成，序列如下：ARHGSBNYVFPAHKBIBYF，其中标记“B”代表α-氨基丁酸残基。肽J1由19个氨基酸残基组成，序列如下：ASHGSBNYVFPAHKBIBYF，其中标记“B”代表α-氨基丁酸残基。
抗真菌活性测试在1/2PDB和1/16PDB上各进行一次。表10给出了MIC和IC50值。
                       表10
     培养基：1/2PDB              培养基：1/16PDB
肽   最小抑制浓度  50％抑制浓度   最小抑制浓度  50％抑制浓度
     (μg/ml)      (μg/ml)       (μg/ml)      (μg/ml)
G1      25           19             12.5          10
G2      25           17             12.5          10
J1      12.5         9              6.25          5
G1中用α-氨基丁酸代替半胱氨酸残基以产生肽G2不影响活性。肽J1甚至比肽G1和G2更有活性。
实施例8
Rs-AFP2与15聚体肽类的组合的抗真菌活性
对15聚体肽类对Rs-AFP2蛋白质的抗真菌活性的影响能力进行了测试。在20μg/ml～0.15μg/ml的Rs-AFP2两倍稀释系列中加入亚抑制浓度(20μg/ml)。对照系列只加水。目标真菌是大刀镰孢，生长培养基是SMF。为了排除多肽对微滴定板孔的不同结合的影响，板用牛血清白蛋白封闭。表11表示与Rs-AFP2的抗真菌活性比较的Rs-AFP2/多肽组合的相对抗真菌比活性，相对活性是指Rs-AFP2的MIC被Rs-AFP2/多肽组合的MIC除后值的100倍。数据是以重复测试为基础的。
                         表11
加入的肽            相对抗真菌比活性
   -                      100
   1                      310
   2                      120
   3                      180
   4                      180
   5                      180
   6                      300
        7                  350
        8                  470
        9                  450
        10                 250
除了肽2，肽的存在会使Rs-AFP2的抗真菌活性上升。使抗真菌活性上升最强的为1，6，7，8，9和(低一些程度)10。这些肽有力的提高了Rs-AFP2的活性3～5倍。当在类似测试中加入Rs-AFP1时，这些肽产生一个可比较的抗真菌活性的提高。
抗真菌活性的测试表明在大多数情况下与单独使用Rs-AFP或多肽的活性相比，Rs-AFP2/多肽组合物具更高的活性。这个上升的活性可能是因为蛋白质和多肽之间协同作用的促进。例如：蛋白质/肽异源寡聚体会形成一种具更高活性的复合体。在以前有过相关但不相同的脊椎动物的抗微生物多肽之间协同相互作用的报导(Mor et al，1994，生物化学，269，31635-31641)。同样，Rs-AFP蛋白质和合成的肽具不同的作用方式，因而它们在不同的位点的同时作用产生协同的抗真菌作用。
实施例9
在无菌离子存在时15聚体肽类的抗真菌活性。
为了估计Rs-AFP2衍生的15聚体肽类对存在盐类的敏感性，用大刀镰孢进行抗真菌活性测试时，在生长培养基中加入不同浓度的一种二价(Ca2+)和一种一价(K+)阳离子。表12表示以肽1～10和Rs-AFP2的MIC值表达的结果。
对于在1/2PDB上具较弱的抗真菌活性的肽1～5和10，在加入的所有测试浓度盐类都使抗真菌活性几乎完全丧失。加入10mM KCl对更大活性的的肽6～8没有大的影响。尽管活性肽9比肽1～5和10更有活性，在它的MIC值有显著提高(30～250μg/ml)。在50mM KCl存在时，肽6和7的MIC值提高了2倍，而肽8和9的MIC值分别提高了大约16和8倍。加入CaCl2有更大的影响。当在生长培养基中加入的CaCl2浓度达1mM时，尽管肽6和7在250μg/ml浓度仍抑制测试真菌的生长，大多数肽失去它们的活性。在5mM CaCl2时，没有一种肽在500μg/ml以下浓度仍具活性。
                           表12
       最小抑制浓度(μg/ml)
       补充有如下物质的1/2PDB
肽          10mM KCl  50mM KCl  1mM CaCl2  5mM CaCl2  50mM KCl：
                                                           1mM CaCl2
1      250      500      ＞500     ＞500       ＞500        ＞500
2    ＞500    ＞500      ＞500     ＞500       ＞500        ＞500
3      250    ＞500      ＞500       500         500          500
4      125      500        500       500         500          500
5      250      500        500       500         500          500
6      60       60         125       250         500          250
7      60       60         125       250         500          500
8      30       60         500       500       ＞500        ＞500
9      30       250        250       500         500          500
10     250      500        500       500         500          500
AFP2   3        3          3         6           6            6
实施例10
在培养基1/2PDB，SMF+，pH5和SMF+pH7(MPS多肽)中Rs-AFP，Ah-AMP1和Dm-AMP1的线性环肽的比较
Rs-AFP，Ah-AMP1和Dm-AMP1的几种β2-β3环肽在一个实验中进行了测试和比较。在1/2PDB上，各种Rs-AFP具类似活性(表13)
用α-氨基丁酸代替半胱氨酸残基会导致活性下降。对应Rs-AFP的Lys30，在N-末端在一个额外的赖氨酸残基能进一步降低高离子强度对抗真菌活性的影响。
表13.在培养基1/2 PDB，SMF+pH5和SMF+pH7上，来自Rs-AFP2 Ah-AMP1和Dm-AMP1的β2-β3环肽的抗真菌活性
  编码肽 序列                    50％抑制浓度
    1/2 PDB     SMF+pH5     SMF+pH7
 G1Rs-AFP   ARHGSCNYVFPAHKCICYF     17.6±1.1     17.5±2.3     12.5±0.4
 G2Rs-AFP   ARHGSBNYVFPAHKBIBYF     16.0±1.2     50.0±6.0     ＞400
 N1Rs-AFP   KARHGSBNYVFPAHKBIBYF     14.0±6.2     27.0±7.7     142.6±13.6
 J1Ah-AMP1   ASHGABHKRENHWKBIBYF     9.1±0.6     47±33     173.4±0.2
 N5Dm-AMP1   AAHGABHVRNGKHMBFBYF     8.0±0.4     20.9±1.8     24.2±0.2
    Rs-AFP2     3.3±0.0     5.2±1.2     6.1±1.3
大刀镰孢(2×104孢子/ml)；重复测试；B＝α-氨基丁酸
在1/2PDB上，Ah-AMP1和Dm-AMP1环肽表现出与对应的Rs-AFP部分如G2相比高出两倍的活性。另外，盐类的影响Ah-AMP1比G2小，其中Dm-AMP1的活性即使在SMF+pH7上也只轻微下降。
实施例11
在培养基1/2PDB，SMF+，pH5和SMF+pH7(MPS多肽)中来自Rs-AFP2原始氨基酸序列Ile26～Phe49的重叠13～20聚体肽类的抗真菌活性。
Rs-AFP的最有活性区位于β2-链/转角/β3-链区。为更祥细调查此区中氨基酸对开展活性的作用，合成了一系列重叠的13～20聚体肽类，并用大刀镰孢进行测试。在此系列中，用α-氨基丁酸代替半胱氨酸残基。
在图10a(13～15聚体肽类)，图10b(16～18聚体肽类)和图10c(19和20聚体肽类)中的图表示重叠13～20聚体肽类的结果。在13和14聚体肽类系列中可看到两个活性区：一个围绕His33-Gly34-Ser35序列，另一个围绕Tyr38-Val39-Phe40.，尽管IC50值随肽的大小和组成而不同，在15聚体肽类中只有一个活性区有此活性。
在图11a和b中，所有的具相同N-末端氨基酸的13～20聚体肽类进行分类。所有的具相同C-末端氨基酸残基的肽类分类如图12a和12b所示。在C-或N-末端侧分别加上特定的氨基酸能将无活性肽转化成很有活性的肽，如在6聚体肽类的His33-Tyr48加上Arg32。对此评价的总结在图13表示。在13～20聚体肽类的Ile26～Phe49，His33存在活性较小。同样肽的Ile26～Val39活性也较小。活性肽的最低要求为Arg27和Phe40，Arg30或His43，或Arg32和Lys44的存在。非常具活性的多肽以Lys30，Ala31，Arg32或His33开始，以Tyr48h或Phe49结束。
在SMF+pH5和pH7培养基中肽的活性基本都下降。然而，如表14所示，一些长一些的多肽在更高的离子强度和pH值仍有活性。另外，Phe49和Ala31，Arg32，His33的存在是必须的。在1/2PDB培养基上，比较摩尔数时，这些18～20聚体肽类只比Rs-AFP2小5～8级(factor)。
表14在培养基1/2PDN，SMF+，pH5和SMF+pH7(MPS多肽)中Rs-AFP2为基础的同以Phe49为C-末端氨基酸残基的18，19和20肽类的抗真菌活性。
编码/肽 序列RHGSBNYVFPAHKBIBYF  50％抑制浓度(μg/ml)
 1/2PDB  SMF+pH5  SMF+pH7
 P01 ARHGSBNYVFPAHKBIBYF  8.9  69±34  133±6
 Q01 KARHGSBNYVFPAHKBIBYF  5.6  102±2  159±5
 Q06  4.8  31±17  62±8
 2.5±0.8  7.2±0.6  3.7±0.6
用大刀镰孢(2×104孢子/ml)；重复测试；除1/2PDB：在第一次测试中肽稀释到12.5μg/ml，一个不足以获得IC50值的浓度。
B＝α-氨基丁酸

Claims (11)

1.一种抗真菌肽，其由与图1中表示Rs-AFP2序列的21～51位点的氨基酸残基排列相同的至少六个连续氨基酸残基组成。
2.权利要求1的抗真菌肽，其中所说的肽包含位点27的精氨酸残基和位点40的苯丙氨酸残基；位点30的赖氨酸残基和位点43的组氨酸残基或位点32的精氨酸残基和位点44的赖氨酸残基。
3.权利要求1的抗真菌肽，其中所说的肽包含位点30的赖氨酸残基、位点31的丙氨酸残基、位点32的精氨酸残基或位点33的组氨酸残基作为N-末端氨基酸残基；位点48的酪氨酸残基或位点49的苯丙氨酸残基作为C-末端氨基酸残基。
4.编码权利要求1的抗真菌肽的重组DNA序列。
5.权利要求4的重组DNA序列，另外还包括编码Rs-AFP1或Rs-AFP2的DNA序列。
6.含有权利要求4的DNA序列的载体。
7.一种生产植物的方法，所述植物具有提高的对真菌病原的抗性，所述方法包括：
1)用权利要求6的载体转化植物细胞；
2)将转化的细胞再生为具有提高的对真菌病原的抗性的完整植物。
8.一种抗真菌组合物，其含有权利要求1的肽。
9.权利要求8的抗真菌组合物，其还含有Rs-AFP1或Rs-AFP2。
10.一种在植物中抗真菌或细菌的方法，它包括将真菌或细菌与权利要求1的肽接触。
11.一种在植物中抗真菌或细菌的方法，它包括将真菌或细菌与权利要求8的组合物接触。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9525474D0 (en) * 1995-12-13 1996-02-14 Zeneca Ltd Antifungal proteins
GB9714564D0 (en) * 1997-07-10 1997-09-17 Zeneca Ltd Composition
US7119262B1 (en) 1997-07-31 2006-10-10 Sanford Scientific, Inc. Production of transgenic poinsettia
US6855865B2 (en) 1999-05-07 2005-02-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acids encoding plant defensins and methods of use thereof
EP1849868B1 (en) * 1999-05-07 2009-12-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant defensins
GB9911933D0 (en) * 1999-05-21 1999-07-21 Zeneca Ltd Composition
GB9918155D0 (en) * 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Proteins and peptides
GB9918156D0 (en) * 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Synthetic peptides
WO2001098540A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 San Diego State University Foundation Recombination modulators and methods for their production and use
US8129349B2 (en) * 2000-10-27 2012-03-06 The Regents Of The University Of California Treatment of disease by inducing cell apoptosis
EP1366168B1 (en) * 2001-02-08 2011-05-18 Hexima Limited Plant-derived molecules and genetic sequences encoding same and uses therefor
EP2270187A3 (en) 2001-06-22 2011-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Defensin polynucleotides and methods of use
EP1730180A4 (en) * 2004-02-24 2008-06-18 Commw Scient Ind Res Org Antifungal peptides
BRPI0712168A2 (pt) * 2006-05-25 2012-03-13 Hexima Ltd veìculo de expressão de multigenes, vetor de expressão de veìculo de expressão de multigenes, célula de planta, planta trnsgênica, vetor de transformação de planta, métodos de expressar concorrentemente duas a oito proteìnas e de expressar concorrentemente 3 a 8 protéinas em uma célula de planta
WO2008128289A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-30 Hexima Limited Modified plant defensin
AR075257A1 (es) * 2008-02-01 2011-03-23 Hexima Ltd Sistema de proteccion de plantas contra la infeccion por agentes patogenos
AU2013202034B2 (en) * 2008-02-01 2014-01-16 Hexima Limited Anti Fungal Methods
CN102131393A (zh) * 2008-08-05 2011-07-20 赫希玛有限公司 植物抗病原体系统
US9889184B2 (en) 2008-08-05 2018-02-13 Hexima Limited Anti-pathogen systems
WO2012106759A1 (en) 2011-02-07 2012-08-16 Hexima Limited Modified plant defensins useful as anti-pathogenic agents
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP2015516143A (ja) 2012-04-02 2015-06-08 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． ヒト疾患に関連するタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
WO2013151666A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
JP6457945B2 (ja) * 2012-11-23 2019-01-23 ヘキシマ リミテッドＨｅｘｉｍａ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗病原体方法
US11168131B2 (en) 2015-11-10 2021-11-09 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
JP7303110B2 (ja) 2017-01-18 2023-07-04 ビステラ， インコーポレイテッド 抗体分子－薬物コンジュゲートおよびその使用
CA3178465A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
CN111690035A (zh) * 2020-06-05 2020-09-22 广州颜如玉生物科技有限公司 一种提高抗菌肽产量的方法
WO2023245169A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Vestaron Corporation Antimicrobial peptide combinations

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01502475A (ja) 1985-11-20 1989-08-31 クロップ　ジェネティクス　インターナショナル　コーポレイション 農薬生産性内共生微生物およびその製法および使用法
EP0470182A4 (en) 1989-04-28 1992-09-16 Crop Genetics International Corporation Method of endophyte-enhanced protection of plants
WO1991010363A1 (en) 1990-01-16 1991-07-25 Crop Genetics International Corporation Agricultural-chemical-producing endosymbiotic microorganisms
NZ244091A (en) 1991-08-29 1994-10-26 Zeneca Ltd Biocidal proteins derived from plants, their manufacture, coding sequences and uses
GB9300281D0 (en) 1993-01-08 1993-03-03 Zeneca Ltd Antimicrobial-protein-producing endosymbiotic micro-organisms
GB9326424D0 (en) 1993-12-24 1994-02-23 Zeneca Ltd Biocidal proteins
GB9404807D0 (en) 1994-03-11 1994-04-27 Zeneca Ltd Biocidal proteins
IL114697A0 (en) * 1994-07-22 1995-11-27 Demeter Biotech Ltd Polypeptides comprising ubiquitin-lytic peptide fusion protein products deriving therefrom their preparation and use

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Publication number Publication date
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