CN1098744A

CN1098744A - 脱氧核糖核酸

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Publication number: CN1098744A
Application number: CN94106151A
Authority: CN
Inventors: P·H·施赖埃尔; K·施滕策尔; G·阿当; E·迈斯
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1995-02-15
Also published as: AU6191494A; IL109774A; ZA943730B; EP0626449A2; EP0626449A3; AU679969B2; US5973135A; US5569823A; IL109774A0; JPH06343469A; DE4317845A1; CA2124272A1

Abstract

本发明涉及新的重组脱氧核糖核酸(DNA)、含有该重组DNA的载体和宿主生物体、含有该重组 DNA并且具有增大的抗有害生物体和植物病害的抗性的转基因植物，其中该重组DNA的特征在于它们是由下列各成分或含有在各种情况下都具有相同功效的一个DNA的成分结合而成，或者含有所述组分：

(a)来源于梅痘病毒(PPV)的RNA的一个双链 cDNA片段(“片段A”)，以及

(b)来源于蕃茄斑萎病毒(TSWV)的S RNA的一个双链cDNA片段(“片段B”)，为了结合的需要，除了含有可任选存在的其它DNA片段外，还可含有在植物细胞中有活性的一个启动子。

Description

本发明涉及新的重组脱氧核糖核酸（DNA），涉及含有这些重组DNA的载体及宿主有机体，以及涉及含有该重组DNA并且对有害生物体及植物病害显示出加强抗性的转基因植物。

对许多病毒而言，已经证明，当将结构基因或非结构基因从这些病毒中分离出来并且以适当的方式诱导这些基因使之在转基因植物中表达时，它们使所述植物产生增强的对同源病毒感染的抗性或者使之减毒和/或使症状表现速度减慢。利用烟草花叶病毒（TMV）的外壳蛋白的例子首先证实了这一结论（EP-A2-0223452;Beachy et al.，1985;and Powell Abel et al.，1986）。TMV属于烟草花叶病毒（Tobamovirus）属并且有比较简单的结构，对其遗传信息而言，该病毒与许多其他植物病毒一样，有一条具有正链信息的单链RNA分子（单链正意义RNA基因组）。该遗传信息包装于一个由许多相同亚单位组成的外壳中。在这之后，可以证明类似的方案应用于蕃茄斑萎病毒（TSMV）也是成功的，该病毒是一种本质上不相同的病毒，并且属于本雅病毒科的Tospovirus属（EP-A1-0426195：Gielen et al.，1991;De Haan et al.，1992）。Tospovirus属的分类学特征是形态为直径约100nm的球形颗粒，并且有一个分为三部分的单链RNA基因组，该基因组是一种核蛋白复合物（壳包核酸），在其外面包裹一个脂类外壳。该脂类外壳包含了糖蛋白。

所述由三部分组成的基因组具有二种意义或负链信息（负或二种意义极性的单链RNA分子，De Haan et al.，1990）。对于这种情况，转基因植物产生的抗性是基于将tospovirus，蕃茄斑萎病毒（＝TSMV）的N结构基因转移到植物中，并且在该植物中表达所述基因。所述N基因产物是上面提及的核蛋白复合物的一种成份。

就TMV外壳蛋白而言可以证明其对近缘烟草花叶病毒的明显的交叉抗性（例如，Tumer et al.，1987），而对TSMV和N基因的表达而言至今未知有这样的交叉抗性（De Haan et al.，1992;Mackenzie和Ellis，1992;Sheng-Zi et al.，1992）。

已经找到了新的重组脱氧核糖核酸（DNA），特征在于其组成成分为或含有下列成份的结合物或有一种在各种情况下具有同等效果的DNA的成份的结合物：

a）一种双链cDNA片段，它来源于梅痘病毒（PPV）的RNA（“片段A”），和

b）一种双链cDNA片段，它来源于蕃茄斑萎病毒（TSMV）的S RNA（“片段B”），为了便于结合，除了含有可任选存在的其他的DNA片段外，还含有一种在植物细胞中具活性的启动子。

此外，已发现了在其基因组中整合了新的重组DNA（并表达该DNA）的转基因植物对有害有机体和植物病害显示出增加的抗性。

该转基因植物还，并且尤其，表现出不仅对同源性的TSW病毒分离物（从其中衍生出片段B）有增加的抗性，而且对其他的tospovirus种类也有增加的抗性。这一发现令人惊奇，因为由本领域的工艺水平已制备的并且来源于天然存在的病毒基因的重组脱氧核糖核酸在相应的转基因植物中没有如此广泛的作用（De Haan et al.，1992;Mackenzie and Ellis，1992）。除此之外，特别令人惊奇的是，可以观察到对不属于Tospovirus属的病毒的增加的抗性。

在本发明的重组DNA中，片段B总位于（即以3′方向）片段A之后，两个片段相互直接连接或借助于另一个DNA片段（“片段C”）连接。在植物中有活性的一种启动子置于片段A的上游，这样本发明的DNA代表一个完整的转录单位。对于这种情况，片段B后面还跟随一个3′非转译DNA，它直接与片段B连接或借助另一个DNA片段（“片段D”）相连接。该3′非转译DNA含有一个转录终止序列（TTS）和一个聚腺苷酸化位点。

术语“转录终止序列”是指一种序列，该序列决定由一种特定的聚合酶从一种作模板的特定的DNA序列进行的DNA合成反应的结束。就使用于转基因植物中的“嵌合基因”而言，可以使用，例如，胭脂碱合成酶基因（Zambryski et al.，1983）、章鱼碱合成酶基因（Herrera-Estrella et al.，1983）或CaMV的35S转录物（花椰菜花叶病毒）（Pietrzak et al.，1986）的TTS。

另外，术语“聚腺苷酸化位点”或“聚腺苷酸化信号”优选地表示一种由六个核苷酸（例如AAUAAA）组成的序列，该序列作用于一级转录物的精确加工过程以及在一级转录物的3′末端转录后的“多聚-A序列”的合成。

因此，从这一点可以得出，一个完全的转录单位有下列DNA排列：

（5′）启动子-片段A-任选包括：片段C-片段B-任选包括：片段D-3′非转译DNA（3′）

以这种方式排列的DNA是本发明的一部分。下面所述的重组DNA排列同样是本发明的一个组成部分：

（5′）启动子-任选包括：片段C-片段B-任选包括：片段D-3′非转译DNA（3′），以及

片段A-任选包括：片段C-片段B-任选包括：片段D（3′），以及

（5′）启动子-片段A-任选包括：片段C-片段B（3′）

片段A是一种来源于梅痘病毒（PPV）的RNA的双链cDNA，术语“来源于”是指该cDNA是一种以互补于病毒RNA的形式存在的DNA。

由SEQ ID NO：7复制出的DNA优选地用作为片段A。

片段B是源于S RNA、优选的是源于蕃茄斑萎病毒（TSWV）（优选其L3分离物）的N结构基因的一种双链cDNA。术语“源于”是指该cDNA是一种以互补于病毒RNA的形式存在的DNA。由SEQ ID NO：11复制出的DNA优选地用作为片段B。

片段A和B可以直接或优选地通过一个双链DNA片段C而相互连接在一起。可以用合成的DNA片段作为片段C，应对这样的DNA片段进行选择，选择出的片段在任何特定的阅读框架中不含有终止密码子，并且该片段能连接片段A和B，使它们形成一个未中断的开放式阅读框架，该框架起始于片段A，在片段B的末端结束，并以这种方式编码一种多肽。

优选的片段C含有最多至134个核苷酸。特别优选的片段C含有2-68个核苷酸。由SEQ ID NO：9复制出的合成的DNA序列最优选地用作为片段C。该片段以特定的优选方式将起始于片段A的开放式阅读框架与片段B的框架相连接。

所有在植物中有活性的那些启动子都适合用作为能定位于片段A上游的启动子。在这些启动子中，特别值得提及的是选择那些受聚合酶Ⅱ控制的启动子，受聚合酶Ⅲ控制的那些启动子也可以使用。特别要提及的还可以选择来源于植物病原体病毒的启动子。在这些启动子中，花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子是特别优选的。其序列可由SEQ ID NO：3复制产生。优选的是将该启动子直接连接到片段A上。

所有能在植物中引起聚腺苷酸化和转录终止的合适区域都可用作为3′非转译DNA。该DNA含有一个聚腺苷酸化位点和一个TTS信号并且跟随片段B，任选插入片段D。优先选择来源于植物病原体的3′非转译DNA序列。特别优选的是使用其序列SEQ ID NO：4中描绘的3′非转译CaMV 35S DNA。

在各种情况下，可以用含有有相同效果的DNA的相应片段代替本发明重组DNA中的上面描述的片段。在有相同效果的DNA中，其中的一个或多个碱基，或者1个或多个密码子可以丢失或由其他碱基或密码子代替，但是也可仅将该片段改变至基本上保存其效果的程度，即本发明的片段结合后导致植物抗有害生物体和植物病害的抗性增强。任何在严谨条件下能与根据SEQ ID NO：1-13的单链DNA进行杂交并且与其余片段结合后引起植物的抗性获得所需增加的DNA都可认作为具有相同效果的DNA。优选的“有相同效果”的DNA是一种能源生出相同多肽或“其相同效果”的多肽的DNA，如源于SEQ ID NO：1、5、7、9和11的DNA序列（也参照SEQ ID：2、6、8、10和12的蛋白质序列）。在这种情况下，“源生”是指将一种DNA转录为RNA，该RNA可转译为蛋白质。有相同效果的多肽是指其总的一级序列有相同效果的多肽，因此这可以是交换了单个氨基酸但不以失去所需的抗性增加的方式改变二级、三级或四级结构。也可以用根据SEQ ID NO：7和11的DNA作为探针以便从用于从本发明中的梅痘病毒或tospoviruses中分离合适的其他片段。利用这些探针，也可以常规方式检测载体或植物基因组中的片段。

根据本发明，优选的重组DNA至少含有具有SEQ ID NO：7或11的序列的片段A或B之一，或含有一个具有相同效应的相应DNA。

根据本发明，特别优选的重组DNA含有具有SEQ ID NO：7和11的序列的片段A和片段B，或含有一种具有相同效果的相应DNA。

根据本发明，最优选的重组DNA有SEQ ID NO：1的序列，包括有相同效果的相应DNA。具有SEQ ID NO：5序列的重组DNA或具有相同效果的一种相应DNA最优选地作为一个完全转录单位。

采用常规方法，借助于SEQ ID NO：1-13的信息可以获得可用于本发明的DNA片段，也可以获得根据本发明的DNA。除此之外，从德国微生物和细胞培养物收集处（DSM）的编号为PL-1080（pPPV-NAT5′-4）和PL-1081（pTSWL3-308）的寄存物可获得可用于本发明的梅痘病毒（PPV）基团组的cDNA片段以及TSW病毒的S RNA基因组的cDNA片段。从DSM编号为PL-1029和PL-1033（参见DSM目录表，植物病毒组，Messeweg 11/12，W-3300 Braunschweig，Federal Republic of Germany）的寄存物同样可以获得CaMV的“Strassburg分离物”和CM1841分离物（ATCC NO.45031）的不同的cDNA。

遵循国际承认的有关用于专利程序的微生物寄存的布达佩斯条约的规章，已将由大肠杆菌携带的质粒PL-1080和PL-1081寄存于德国微生物收集处（DSM），Mascheroder Weg lb，D-3300

Braunschweig，Federal Republic of Germany：

DSM参考名称	登记编号	寄存日期
			BY－1080（含有PL－1080）	DSM 8276	07.05.1993
BY－1081（含有PL－1081）	DSM 8277	07.05.1993

本发明所述的重组DNA不存在于自然界中。使用前面描述中涉及的信息，尤其是使用SEQ ID NO：1-13，借助于常规分子生物学方法（Sambrook et al.，1989），本领域内熟练技术人员能够获得这些DNA。

本发明还涉及含有本发明重组DNA的新载体，特别是质粒或噬菌体。例如（如下文中描述）质粒pSLTSWVL 3和pXLTSWVL3。本发明还涉及含有本发明的重组DNA、优选地是整合到质粒中的重组DNA的新的宿主生物体，尤其是微生物。常规使用的大肠杆菌和根癌土壤杆菌特别适合于用作为这样的微生物。可作为实例提及的是根癌土壤杆菌XLTSWVL3菌株，这将在下文中进行详细描述，该菌株含有质粒pXLTSWVL3。

使用前面描述中包含的信息，特别是使用SEQ ID NO：1-13，借助于常规分子生物学方法，本领域内技术人员能够获得所述载体及微生物菌株。

将本发明所述的重组DNA插入植物基因组，结果导致这些转基因植物呈现出更高的抗有害生物体及植物病害的抗性。

转化植物的增大的抗性对于农业和林业、对于观赏植物和药用植物的栽培、以及对于植物育种都具有重要性。在植物细胞、例如用于分离药物学上可利用的物质的植物细胞的栽培时，获得有效的显示出抗微生物病虫害、尤其是抗真菌和病毒的感染的增大的抗性的植物细胞也是有利的。

因此，本发明还涉及制备具有抗有害生物体和植物病害的增大抗性的转基因植物细胞（包括原生质体）和植物（包括植物各部分和种子）的方法，该方法特征在于：

（a）将本发明的DNA一次性或多次地引导入植物细胞（包括原生质体）的基因组，以及，如果合适，

（b）从转化的植物细胞（包括原生质体）再生出完整的转化植株，并且如果合适，将植株繁殖，并且如果合适，

（c）从由该方法产生的母代转基因植株中，或从由亲代植株获得的繁殖子代中分离出所需的植物各部分（包括种子），以及

（d）如果合适，将转基因植物的基因组与其他植物基因组结合，并且繁殖后代，从而生产更多的植株。

根据已知的工序和方法，以常规方式完成上述的方法步骤（a）、（b）和（c）

同样本发明包括含有一个或多个本发明DNA复制体的转基因植物细胞（包括原生质体）和植物（包括植物各部分和种子），以及包括可由上面所述方法制备的转化植物细胞和植物。

（a）将本发明的重组DNA用于增加植物抗有害生物体和植物病害的抗性，

（b）将本发明的重组DNA用于生产具有增大的抗有害生物体和植物病害的抗性的植物细胞、植物、植物各部分和植物繁殖材料，以及

（c）将本发明的转基因植物（包括植株各部分及植物种子）用于生产繁殖材料和生产新的植物以及其繁殖材料，

上述三点也是本发明的部分发明内容。

分别含有根据SEQ ID NO：2或6的蛋白质，或者如果合适，分别含有截去了氨基末端的根据SEQ ID NO：2或6的蛋白质的植物（包括植物细胞，植物各部分和繁殖材料）也是本发明的一部分。

可利用多种方法将本发明的重组DNA插入到植物或植物细胞的遗传物质中。DNA的转移可用常规已知方法来实现，本领域内熟练的技术人员能够毫不困难地确定在各种情况下应使用的合适方法。将要用于转化植物的本发明所述的DNA必须含有一个在植物中有活性的合适的启动子以及一个3′非转译区。根据SEQ ID NO：5的重组DNA特别合适。

根癌土壤杆菌的Ti质粒适用于作为一种应用范围宽的特别有利的载体，用于将外源DNA转移到双子叶植物和单子叶植物的基因组。将本发明的DNA，与DNA调节序列一起插入到合适Ti质粒的T DNA（例如，Zambryski et al，1983）中，并且通过感染植物，感染植物各部分或植物组织，例如，叶片、主茎干、下胚轴、子叶、分生组织或由其衍生的组织，例如次级胚状体和愈伤组织，或通过将原生质体与根癌土壤杆菌共培养而转移该DNA。

另一种方法是在多阳离子或钙盐和聚乙二醇存在下将DNA在植物原生质体（例如，Hain et al.，1985;Krens et al.，1982;Paszkowski et al.，1984）中培养。

通过使用电场（electroporation）（例如，Fromm et al.，1986）也能够额外地促进DNA的摄取。

采用借助于植物花粉的已知方式，用已携带DNA并由物理方法加速的颗粒轰击过的花粉也可以将DNA导入（参照EP-A-0270356）。

按已知方法，使用合适的营养培养基（例如Nagy和Maliga 1976）再生出植株。

在本发明方法（根据EP-A 116718的方法）的一个优选实施方案中，例如，将本发明所述的重组DNA以离体形式克隆至一种合适的中间载体大肠杆菌载体，例如pGV700或pGV710（参照EP-A 116718）中或优选的是克隆至该载体的含有一种附加的报道基因（reportergene）例如nptⅡ（Herrera-Estrella et al.1983）或hpt（Vanden Elzen et al.1986）的衍生物中。

采用常规方法（例如Van Haute et al.1983）将以这种方法构建的质粒转移到例如含有pGV3850或其衍生物（Zambryski et al.1983）的根癌土壤杆菌中。另一种可选方法是，将本发明所述DNA克隆于一种双载体例如pCV001或pCV002（例如Koncz and Sohell 1986）中，然后按加上所述转移到一种合适的土壤杆菌菌株（Koncz and Sohell 1986）中。最后将得到的含有可转移到植物中的形式的重组DNA的土壤杆菌菌株用于植物转化。

在另一个优选的实施方案中，按常规方法（例如Hain et al 1985），通过基因直接转移，将重组DNA转移到植物原生质体中，如果合适，将它与另一种含有植物细胞报道基因，例如，卡那霉素抗性（例如Herrera-Estrella et al.1983）或潮霉素抗性（Van den Elzen，1986）基因，优选pLGV neo 2103（Hain et al.，1985）、pMON 129（Fraley R.T.et al.，Proc.National Acad.Sci.USA 80，4803（1983））、pAK 1003、pAK 2004（Valten J.et al.，EMBO Journ.Vol.3，2723（1984））或pGSST neo 3（pGSST3）（EP-A-189707）的质粒一起转移。在本文中，质粒可以环状形式存在，但线性形式质粒是优选的。如果使用含有一种报道基因的质粒，然后检查卡那霉素抗性原生质体中重组DNA的表达。另一种可选的情况（无报道基因），检测得到的愈伤组织中重组DNA的表达（使用常规的筛选方法）。

可以根据已知方法，例如通过转化叶片（例如Horsoh et al.1985），通过将再生植物原生质体或细胞培养物与根癌土壤杆菌（例如Marton et al.1979，Hain et al.1985）共培养，或通过直接DNA转染法，可制备转基因植物或植物细胞。通过选择报道基因的表达，例如体外使卡那霉素硫酸盐磷酸化（Reiss et al.1984;Schreier et al.1985）方法，或者通过胭脂碱合成酶的表达（根据Aerts et al.1983）或通过采用Northern印迹分析和Western印迹分析检测本发明重组DNA的表达而检测得到的转化植株。也可由已知方法，利用特异的抗体（Adam et al.1987，1991）检测转化植株中的重组DNA基因产物。

根据常规方式，利用适合于各种情况的营养培养基培养转化植物细胞并再生为完整植株。

含有本发明的DNA并是本发明组成部分的转化植物细胞和转化植株显示出相当高程度的对有害生物体及植物病害，尤其是对线虫、植物病原真菌和病毒的抗性。

关于本发明，术语“植物”是指整个植株，以及植物各部分如叶、种子、块茎和插条等等。“植物细胞”包括原生质体、细胞系、植物愈伤组织等等。“繁殖材料”是指植物、植物各部分，如种子、块茎和插条，以及可用于繁殖转基因植株和植物细胞的植物细胞，并且因此“繁殖材料”同样也是本发明的一部分。

事实上，所有的植物都包含于那些能通过掺入（转化）本发明的重组DNA而获得了增大的抗病虫害的抗性的植物。当然，对于栽培植物，如林业植物，例如云杉、枞树、Douglas枞、松树、落叶松、山毛榉和橡树，以及能提供营养和原材料的植物，例如谷类（特别是小麦、黑麦、大麦、燕麦、小米、水稻和玉米）、马铃薯、豆科植物（如豆子以及，特别是苜蓿和黄豆）、蔬菜（尤其是甘蓝品系以及蕃茄），水果（尤其是苹果、梨、樱桃、葡萄、柑橘、菠萝和香蕉）、油棕榈、茶、可可以及咖啡灌木、烟草、剑麻和棉花，以及对于药用植物，如萝芙木属和洋地黄，对于产生抗性有特定的要求。马铃薯、蕃茄、豆科植物和Curcubitaceae是特别优选的。

本发明中提到的根据本发明方法获得的抗病虫害（有害生物体和能引起植物病害的生物体）的增强抗性中所述病虫害是指所有动物病虫害，如昆虫、螨类和线虫，和微生物病虫害如植物病原真菌、细菌和病毒。选择出来特别介绍的是损害植物的线虫和微生物虫害，尤其是植物病原真菌及病毒。

有害的昆虫包括，尤其是下列目中的昆虫：直翅目、革翅目、等翅目、缨翅目、异翅目、同翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目和双翅目。

有害的螨虫包括（尤其是）下列属的螨虫：跗线螨属、全爪螨属以及叶螨属。

寄生于植物的线虫包括下列属的线虫：草地垫刃线虫属、Radopholus similis、Ditylenchus dipsaci、Tylenchulus semipenetrans、异皮线虫属，Globodera spp.、根结线虫属、滑刃线虫属、Longidorus spp.、Xiphinemn spp.、Trichodorus spp.。

微生物病虫害包括（尤其是）植物病原真菌：根肿菌纲、卵菌亚纲、壶菌纲、接合菌亚纲、子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲。

植物病原细菌包括（尤其是）假单孢菌科、根瘤菌科、肠杆菌科、棒状杆菌科和链霉菌科。

病毒疾病包括（尤其是）花叶病、矮化的和黄化的病毒病;以及由tospovirus引起的病毒病。

在上面列举的属名内包括的病毒病、真菌病和细菌病的某些致病因子举例如下，而不仅限于这些。

大麦黄矮病毒（BYDV）、马铃薯病毒Y（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、西瓜花叶病毒（WMV）、桔树根枯病病毒（TNV）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草坏死病毒（TNV）、菜坏死黄色叶脉病毒（BNYVV）以及，尤其是，蕃茄斑萎病毒（TSWV），所有tospoviruses、烟草花叶病毒（TMV）以及其他烟草花叶病毒，以及烟草脆裂病毒和其他tobraviruses。

黄单胞菌属内各个种，例如，田野黄单胞菌、稻黄单胞菌;

假单胞菌属内各个种，例如丁香假单胞菌、黄瓜角斑病假单胞菌;

欧文氏杆菌属内各个种，例如，解淀粉欧文氏杆菌;

腐霉属内各个种，例如，终极腐霉;

疫霉属内各个种，例如，蔓延疫霉;

假霜霉属内各个种，例如，葎草假霜霉或古巴假霜霉;

单轴霉属内各个种，例如，葡萄生单轴霉;

霜霉属内各个种，例如豌豆霜霉或芸苔霜霉;

白粉菌属内各个种，例如禾白粉菌;

单丝壳属内各个种，例如苍耳单丝壳菌;

柄球菌属内各个种，例如苹果白粉病柄球菌;

黑心菌属内各个种，例如苹果黑心菌;

核腔菌属内各个种，例如圆核腔菌或麦类核腔菌（分生孢子形式：Drechslera，syn：长蠕孢属）;

旋孢霉属内各个种，例如禾旋孢霉（分生孢子形式：Drechslera，syn：长蠕孢属）;

单胞锈菌属内各个种，例如疣顶单胞锈菌;

柄锈菌属内各个种，例如隐匿柄锈菌属;

腥黑粉菌属内各个种，例如小麦网腥黑粉菌;

黑粉菌属内各个种，例如裸黑粉菌或燕麦黑粉菌;

藻膜革菌属内各个种，例如佐佐木氏藻膜革菌;

Pyricularia species，例如，Pyricularia oryzae;

镰孢属内各个种，例如大刀镰孢菌;

葡萄孢属内各个种，例如灰色葡萄孢;

壳针孢属内各个种，例如颖枯壳针孢;

小球腔菌属内各个种，例如，Leptosphaeria nodorum;

尾孢属内各个种，例如Cercospora canescens;

链格孢属内各个种，例如甘蓝链格孢;

Pseudocercosporella species，例如，Pseudocercosporella herpotrichoides.

另外，可以列举灰色长蠕孢。

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Schreier P.et al.，EMBO J4（1985），25-32

Sheng-Zi et al.Phytopathology 82（1992），1223-1229

Steinecke et al.，EMBO J11（1992），1525-1530

Toepfer R.，Matzeit V.，Gronenborn B.，Schell J.and Steinbiss H.H.（1987）Nucl.Acid Res.15，5890

Tumer N.E.，O′Connell K.M.，Nelson R.S.，Sanders P.R.，Beachy R.N.，Fraley R.T.and Shah D.M.（1987）EMBO J6，1181-1188

Van den Elzen P.J.M.et al.，Plant Mol.Biol.5（1985），299-302

Van Haute E.et al.，EMBO J2（1983），411-418

Velten J.et al.，EMBO J12（1984），2723-2730

Zambryski et al.，EMBO J.2（1983），2143-2150.

下列实施例目的在于更清楚地描述本发明：

1.构建重组DNA并转移至土壤杆菌中：

正如已经解释过的，本发明涉及一种新的重组DNA，尤其是一种重组嵌合基因（SEQ ID NO：1），所述DNA处于一种启动子控制下并含有一个3′末端序列。作为实例（Toepfer et al.1987和EP-A2-0223452）本文中使用CaMV35S启动子（5′区）（SEQ ID NO：3）以及CaMV35S转录物的3′非转译区（SEQ ID NO：4）。这里使用的整个实例显示于SEQ ID NO：5中。本发明的DNA（嵌合基因）（SEQ ID NO：1）由以特定序列连接在一起的几个片段组成。它是由来源于梅痘病毒（PPV）的RNA（Maiss et al.，1989）的一个152碱基对的双链cDNA片段组成。该片段对应于病毒RNA序列的1-152位点（SEQ ID NO：7）（Maiss et al.，1989）。在该片段中，起始于一个开放式阅读框架，它通过一个合成的cDNA片段（SEQ ID NO：9）连接至TSWV N基团的L3分离物的S RNA的cDNA片段（Maiss et al.;1991）（SEQ ID NO：11）上。通过这种连接产生一个开放式阅读框架，它有未中断的总体长度为956个碱基并且在“SEQ ID NO：1”的992位点处结束。借助于一个合成序列（SEQ ID NO：13）将得到的TSWV的3′非转译区的S RNA的cDNA序列（SEQ ID NO：11）连接到CaMV的35S转录物的3′区（SEQ ID NO：4）（Tōpfer et al.;1987）上。

使用熟知的并在Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989上详细描述的方法完成上述构建过程。

详细步骤描述如下。将通过商业途径购买的质粒pCaMVCN（Pharmacia）的长度为454个碱基对的HindⅢ/-BamHⅠ片段克隆到可通过商业途径获得的质粒pT7T3 19U（Pharmacia）并将得到的质粒称为pT7T3 35S。用SalⅠ切割该新的质粒并填充其突伸末端，然后用EcoRⅠ切割该DNA。然后将来自质粒pPPV-NAT 5′4（Maiss et al.，1989;Maiss et al.1992）的DraⅠ/EcoRⅠ片段（长度为572个碱基对）克隆到刚才制备的质粒上。该片段含有PPV的5′末端的一个cDNA拷贝。将该新的质粒称为p35S 5′.16。

使用与非编码链互补的合成寡核苷酸

5′-TGTGTTGAGTTTTTATATTTTCCTCTCCAAATGAAA-3′（SEQ ID NO：14）采用体外诱变方法，将CaMV35S启动子序列（5′-…AGAGG-3′）（SEQ ID NO：15）的3′-末端粘附到PPV序列的cDNA的量终的5′末端（5′-AAAATAT…-3′）（SEQ ID NO：16）。将得到的新质粒命名为p35S。从该质粒上分离出长度为568个碱基对的HincⅡ片段，并克隆至可由商业途径获得的pT7T3 19U质粒，在克隆前已将该质粒用SmaⅠ和HincⅡ切割。得到的质粒命名为pT7T3 19UPPVL。用EcoRV和SalⅠ切割该质粒，分离出长度为239个碱基对的片段。将该片段克隆到pRT101（Tōpfer et al.1987）的EcoRV，XhoⅠ裂解位点。得到的质粒称为pSL。

从质粒pTSWV-L3/308（Maiss et al.;1991）中分离出BamHⅠ/HindⅢ片段。填充其末端，将它插入到pRT101载体（Tōpfer et al.1987）的SmaⅠ切割位点处。将含有正确定向的插入片段的质粒称为pSTSWVL 3。从该质粒中分离出长度为868个碱基对的RsaⅠ/-BamHⅠ片段，并克隆到上面介绍的已用SmaⅠ和BamHⅠ切割过的载体pSL中。由此产生的新质粒命名为pSLTSWVL3。利用HindⅢ从后面这个质粒中分离出长度为1716个碱基对并且包含整个嵌合基因和CaMV（35S）的5′和3′非转译区的一个片段。将该片段克隆到质粒pXL222（Landsmann et al.1988）中，该质粒已用HindⅢ切割。得到的质粒称为pXLTSWVL3。将该质粒（pXLTSWVL3）转移或转染到根癌土壤杆菌菌株LBA4404（Hoekema et al.1983）中。将该新的土壤杆菌菌株称为XLTSWVL3。

2.生产转基因植物，并检测这些植物中的嵌合基因的表达

用土壤杆菌菌株XLTSWVL3转化植物细胞或植物各部分。

使用一个标记物和选择性基因，即在同时转移的卡那霉素抗性基因，在含有卡那霉素的培养基上选择转基因植物。根据它们表达嵌合基因的能力选出二十一个单个的待选植株。这种选择过程首先包括在mRNA水平上测定基因表达。为了这个目的，利用逆转录酶和合成的寡核苷酸5′-GTC AGT GGC TCC AAT CCT GTC TGA AG-3′（SEQ ID NO：17）将从转基因植物中分离的整个RNA转译为cDNA，并且借助于第二个合成的寡核苷酸5′-TGT GGA GAA TTC GAG CTC GGA AC-3′（SEQ ID NO：18）以及聚合酶链反应（PCR，Mullis and Faloona，1987），扩增所存在的嵌合基因的mRNA，并鉴别为一个长度为328个碱基对的片段。

接着使用一个特异性抗体（ELISA）检测已用前面描述的方法和手段检测到基因表达的二十一个转基因植物中产生的嵌合基因产物（Adam et al.，1987;1991）。侍选株XL4、XL8、XL11、XL14、XL15和XL19显示有一个清晰的可检测信号并且选择这些株进行起始的、增进资料的植物病理学实验。

详细地说，植物的转化按如下所述进行。

2.1土壤杆菌转化

为了转化烟草用其叶片进行试验（Horsch et al.，1985）。为了实现该目的，在将烟草组织在10mM MgSO₄和20ml MS培养基（Murashige and Skoog，1965）中于26℃培养60小时后将其无菌发芽培养物的长为约2-3cm的叶片用打孔器打成直径约1cm的叶片，然后将其与经过24小时培养的土壤杆菌培养物一起培养。然后在含有1000μg/ml头孢氨噻的MS培养基中将叶片洗涤3次，然后将这些叶片铺在含有0.5μg/ml NAA（萘乙酸）、0.2μg/ml BAP（苯甲基氨基嘌呤）以及2%蔗糖（“愈伤组织诱导培养基”）以及合适选择性试剂（例如硫酸卡那霉素）的MS平板培养基上，在26℃培养。在各种诱导因素条件下培养2周后，将叶片转移到新鲜的愈伤组织诱导培养基上。一旦能够分辨出小的愈伤组织后，将它们转移到芽诱导培养基上，该培养基相应于愈伤组织诱导培养基，但含有0.2μg/ml NAA以及0.5μg/ml BAP。一旦再生芽达到2-3cm长，为了诱导根，将其转移到含1%蔗糖但无激素的MS培养基上，并在24-26℃（光（1000-3000lux）照12小时，黑暗12小时）无菌条件下培养。培养4-6周后，将发芽培养物转移到新鲜培养基上，生长为植株，然后在温室中合适条件下栽培该植物。

为了转化马铃薯植物，将剪切好的叶片在土壤杆菌悬浮液中培养后，进一步在黑暗中培养2天。然后将叶片在含有1.6%葡萄糖、5mg/l NAA、0.1mg/l BAP和500mg/l头孢氨噻和合适的选择性试剂的MS平板培养基上，光照16小时的条件下培养8天。然后将叶片转移到含1.6%葡萄糖、2.0mg/l玉米素核糖核苷，0.02mg/l NAA，0.02mg/l GA₃（赤霉素）和500mg/l头孢氨噻的MS平板培养基上。一旦叶片已培养14天后，将它们转移到新鲜培养基平板上。约6-7周后开始出现第一批愈伤组织。将已出现的芽转移到放置了含有3%蔗糖和0.5mg/ml羧苄青霉素的MS培养基的250ml玻璃烧瓶中。约14天后出现了第一批根。然后在温室里合适条件下栽培植株。

基本上按照上面介绍的方法转化蕃茄。

采用标准方法从得到的植株中分离DNA（Dellaporta et al.，1983）和RNA（Goodall et al.，1990和Chomczynski和Sacchi，1987）。通过DNA分析（“Southern印迹分析”）可以测定转移基因的完整性及数目，以及通过RNA分析（依据Vankan和Filipowicz，1988;Goodall and Filipowiez，1989;Steinecke et al.，1992的“RNase Protection”）。测定转录的数量。

2.2原生质体分离和PEG介导的转化

将无菌培养的4-8周龄的烟草SR1叶切下，用蒸馏水清洗，并置于0.05%SDS溶液中，以防细菌污染。用无菌水洗涤二次，从而除去SDS，然后将叶在K3培养基（500mg/l头孢氨噻、1mg/l NAA、0.2mg/l激动素）中平衡10分钟。将中央主脉除去后，将叶子切为大小1-2cm²的叶片。为了分离叶肉原生质体，将叶片加至装有30毫升含有纤维素酶和mazerozyme的酶溶液（1.5%纤维素酶，0.5% mazerozyme溶于K3培养基中）的1升无菌烧瓶中，并将其置于微真空中保持10分钟。接着在27℃黑暗培养16小时后，以75rpm振动混合物30分钟。然后将该原生质体悬液通过孔径宽度为250和100μm的钢筛过筛，将滤液平均分配于12ml离心管内，并在Hettich Universal 2S离心机内以650rpm离心5分钟。用一个100μm玻璃毛细管将较低相与沉淀一起吸出，用10ml K3培养基洗涤原生质体，在重复离心（如上所述）后再一次吸出培养基。随后，在W5培养基（154mM NaCl、125mM CaCl₂×H₂O、5mM葡萄糖、5mM KCl，pH5.6）中培养原生质体，在Fuchs-Rosenthal计数室中计数，然后将其留在W5培养基中维持30分钟。通过在650rpm离心5分钟而分离开原生质体，将沉淀重悬于MaMg溶液（450mM甘露醇，15mM MgCl₂，0.1%MES，pH5.6）中，将悬浮液浓度调至1-3×10⁶个原生质体/ml。然后可以直接转染原生质体或将其在冰箱中贮存4小时。

为了进行转化，将原生质体在水浴中，45℃热休克5分钟，其间偶尔转动一下，然后立即将其置于冰/水中保持45秒而冷却至室温。随后，将0.35ml体积的原生质体悬液等分到10ml离心管中并然后向每个管中加入50μl的DNA溶液。10分钟后再向离心管中滴加0.35ml的PEG溶液（100mM Ca（NO₃）₂×4H₂O、400mM甘露醇、40%PEG 4000，pH7-9），再维持20分钟，在此期将所有样品转动5分钟，然后将转染样品转移到培养皿中。在滴加入4ml的K3培养基后，在27℃黑暗中将原生质体培养6-48小时。保温后将原生质体加到已装满用于洗涤的海水的12ml离心管中，然后以650rpm离心3分钟。将上清液移走至剩下1ml，然后将原生质体重新悬浮并转移到Eppendorf管中。在13000rpm（Biofuge）离心1分钟并小心地移走上清液后，将原生质体溶解于恰当的提取缓冲液中。

成功地将本发明的DNA导入到由上述方法制备的原生质体中。

3.本发明的转基因植物增加抗性的实施例

3.1.抗植物病原真菌的抗性增加

将例2（上述）中列出的转基因烟草植物XL4、XL8、XL11、XL14、XL15和XL19进行自花授粉，选择XL4的子代进行下面试验。用植物病原真菌灰色葡萄孢作为检测病原体。

（a）试验描述

在温室，23℃和70-80%相对大气湿度条件下使烟草植物生长，直至试验开始。根据需要，供给其水及肥料。为了接种，将病原菌的孢子悬浮液喷在6-8周龄的植物的叶片上直至湿透叶子。随后，将植物在有利于病原菌的条件，即20℃和100%相对大气湿度的条件下保温。4天后，根据感染叶片面积以百分数计确定叶片的健康状况。分清叶片生长期（叶1期＝最老叶，叶6期＝最嫩叶）。

（b）测试结果

植株（每种情况各47株）	1－3期叶	4－6期叶	平均
				烟草（野生型）；感染叶面积％	22.4	24.0	23.2
转基因植物；感染叶面积％	14.3	17.1	15.7
				侵染降低百分数（％）（基于Abbott)	36.3	29.0	32.5

3.2抗病毒抗性的增加

将列于例2（上文）中的转基因烟草植株XL4、XL8、XL11、XL14、XL15和XL19自花授粉，选择XL4和XL8的纯合子代（XL4.24和XL8.28）进行下面的试验。

以各种tospovirus，以及其他科的病毒作为试验用病原体。

（a）试验描述

将烟草植株在温室中23℃和70-80%相对大气湿度条件下生长，直至试验开始时使用。按照需要供应水和肥料。

从已经用TSWV分离物L3（DSM NO：PVO182）感染3周的烟草植株（Nicotiana rustica L.）上采集显示有明显病毒症状的初次感染叶片的3克叶材料;然后将叶放在研钵中在30ml标准缓冲液（0.1M Na-K磷酸盐缓冲液，pH7.0，含有0.2%聚乙烯吡咯烷酮MW10000和0.2%（W/V）Na₂SO₄）中均匀化。使用时将该叶材料处理成二种形式，即未稀释的原材料及用标准缓冲液稀释的1∶25稀释液，然后在各种情况下通过机械磨擦叶片的办法以每片叶为0.1ml上述叶材料的量施给约8-10周龄的试验植株的3片叶的每片叶上。这些试验植株曾经用研磨料（金钢砂，600目）磨擦过，并且一旦已进行接种即将它们用自来水漂洗。

在接种后从第5天开始，在14天的时期内，按照等级评价方案，肉眼观察评估植株上产生的症状。在感染叶片上和通过内吸作用在非感染叶片上出现了感染症状。

等级0＝无症状

等级1＝轻微症状，在叶片上有菌环状点（坏死）

等级2＝严重症状，脉纹显黄色，花叶，顶梢枯死的症状。

利用等级数值引出平均等级数值，然后将该级别与对照植株的等级数值相比较。

为了进一步对植株的抗性进行定量，使用一种三抗体夹心（TAS）ELISA方法测定TSWV抗原的量。为了该目的，用每井孔0.1ml的多克隆抗血清（DSM NO.，AS-0105，2μg/ml）包被Greiner微滴平板（655001型）。将初次感染和继发性感染的试验植株的叶进行挤压，使用标准的ELISA缓冲液将其挤压出的汁液制成1∶30和1∶500两种稀释液。然后对于各种情况，将各种样品（0.1ml）上样到该平板的3个井孔中，然后将平板在4℃保温过夜。在平板已用PBS-吐温洗涤三次后，向每个孔中加入1∶1000稀释的两种单克隆抗体4F2和2B6（Adam et al.，1991）的0.1ml溶液，将平板置于37℃时保温3小时。在用PBS吐温将平板洗涤三次后，向每个孔中加入以1∶1000稀释的兔抗-小鼠IgG结合物（DAK Diagnostica GmbH，NO.：D314）的0.1ml溶液，并将平板在37℃时保温3小时。用PBS吐温将该平板洗涤三次后，加入底物对-硝基苯基磷酸盐（1mg/ml），并且在30分钟及1小时后，用光度计检测450nm处消光值。利用该消光值确定平均消光值，然后将该平均值与对照测量值进行比较。结果证明转基因植物没有症状而对照植物显示有严重症状。除此以外，发现转基因植物中TSWV抗原的量（根据单克隆抗体（Mab 2B6）反应而检测）明显地低于对照植株的量。

（b）试验结果

植株（各种情况都为4×10）	症状严重性	注释
			烟草（野生型）	2	对照植株仅生长到转基因植株的一半高度
转基因XL4.24	0
		转基因XL8.28	0

用其他各种tospovirus分离物转染的XL4.24转基因植株的生物试验

（a）试验描述

栽培转基因植株XL4的纯合子代（XL4.24）直至它们长成4叶期。

随机地将植株收集成组，每组20株，并用机械磨损方法将从感染了各种tospoviruses的烟草植株得到的匀浆接种到植株上。使用下列病毒分离物进行接种：TSWV-花生＝SA05（DSM NO.PV-0205）;INSV（DSM NO.PV-0280）;INSV（DSM NO.PV-0281）。用作为分离接种物的植株已先接种了10-14天。并且根据电子显微镜观察结果，这些植株未受其他病毒污染。为了制备接种物，使用标准DSM接种缓冲液（DSM植物病毒目录），匀浆化方法是用研钵和研棒以及以1∶30（g/ml）比例完成的。用无菌玻璃抹刀将接种物抹在已用金钢砂（600目）擦过的试验植株叶上。每个试验植株的两片最老的次级叶片被接种。接种后，将感染叶片用自来水漂洗。然后在上面介绍的培养条件下培养这些植株，并且每天观察评估症状。作为对照，非转化的烟草以同样方式进行生长并且同样接种各种病毒分离物。

在接种以后一周和三周时由两个观察者观察实验并将结果最后按等级划分。当评估值有差异时，取较不利的数值。结果概括于表1中。在成功地进行感染后，TSMV花生（SA-05）分离物在感染叶片上引起局部坏死并且产物严重的全株症状，包括叶片畸形和新形成的、通过内吸作用感染的叶片的坏死，而两种INSV分离物仅使接种叶片形成局部坏死，而不出现向新形成的叶片的内吸扩散现象。对于TSWV-花生来说，当进行等级评估时，将通过内吸作用感染的试验植株和那些仅显示局部初级症状的植株都当作是进行了成功感染。因为经验告诉我们在后一种情况中全株症状的出现是延迟的且随时间推移将会出现这种全株症状。对于两种INSV分离物来说，仅仅当出现局部初级症状时即作为成功感染的证据。

表1：检测转基因烟草XL4系（XL4.24）对TSWV-花生和其他各种INSV分离物的抗性;

使用不属于本雅病毒分离物XL 4.24转基因植株进行生物检测

（a）试验描述

种植转基因植株XL4的纯合子代（XL4.24），直到它们生长到四叶期。

随机收集植株将它们按20株为一组进行分组，并且采用机械方法将来自感染了各种病毒的烟草植株的匀浆物接种到植株上。使用下列的病毒分离物进行接种：TMV（DSM No.PV-0055）和烟草脆裂病毒（DSM No.PV-0043）。用于分离接种物的植株已先接种了10-14天，并且基于电子显微镜观察结果，没有被其他病毒污染。为了制备接种物，使用标准DSM接种缓冲液（DSM植物病毒目录），并用研钵和研棒，按1∶30（g/ml）的比例将接种物匀浆化。使用无菌玻璃抹刀将接种物抹在试验植株叶上，该叶片已用金刚砂（600目）摩擦。对各个试验植株的两个最老的次级叶片接种。接种之后，将感染的叶片用自来水漂洗。随后在上面介绍的培养条件下培养植株并且每天观察评估症状。作为对照，非转化的烟草植株按同样方法生长并且用各种分离物进行接种。

接种后在一周和三周时由两名观察者观察实验并将结果最后按等级划分;假如评估数不相同，取较不利的数值。用两类病毒感染时在对照植物的初次感染的叶上产生局部坏死，该对照植物用TRV感染时还产生严重的全株症状。对于TMV来说，在转基因XL4.24植株中观察到的局部损伤明显降低。对于烟草脆裂病毒，对照植株中有14%仅在初次感染的叶上产生坏死，而86%还显示有全株症状。与之相反，28%的转基因植株完全没有感染，而36%仅有初级坏死，并且仅36%的植株还有全株症状。

⒊3 对植物病原线虫的抗性的提高

（a）试验描述

在温室中23℃和70-80%相对大气温度的条件下生长转基因烟草植株（XL4）直到试验开始。在移植幼苗后，在土壤中栽培植株，以便确保一个发育特别完好的根系统。根据需要供给水和肥料。用吸管吸取存活的刚孵化的Meloidogyne incognita（LⅡ）的幼虫以每100ml土壤体积约300个幼虫的比例均匀地播在土壤表面而对约15cm高的植株进行接种。在接种后4周通过测定每个根系统上虫瘿数而进行等级评定。

与野生型植株相比，转基因植株显示出抗线虫的增大的抗性。

在本说明书中，除另有说明，%数值是指重量百分数，并除另有说明，稀释度是指体积的份数（例如1∶25）。

序列表

（1）一般资料

（ⅰ）申请人

（A）姓名：Bayer AG

（B）街道：Bayerwerk

（C）城市：Leverkusen

（E）国家：德国

（F）邮编：5090

（G）电话号码：0214/30 61285

（H）传真：0214/30 3482

（Ⅰ）电传：85 101-265 by d

（ⅱ）申请名称：脱氧核糖核酸

（ⅲ）序列数：18

（ⅳ）计算机可读形式：

（A）工具类型：floppy disk

（B）计算机：IBM PC兼容

（C）操作系统：PC-DOS/MS-DOS

（D）软件：PatentIn Release＃1.0，Version ＃ 1.25（EPA）

（2）SEQ ID NO：1的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：1040个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：CDS

（B）长度：36..989

（xi）序列描述：SEQ ID NO：1：

（2）SEQ ID NO：2的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：318个碱基对

（B）类型：氨基酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：2：

（2）SEQ ID NO：3的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：439个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：3：

（2）SEQ ID NO：4的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：226个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：4：

（2）SEQ ID NO：5的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：1722个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：CDS

（B）长度：475..1428

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：5：

（2）SEQ ID NO：6的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：318个碱基对

（B）类型：氨基酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：6：

（2）SEQ ID NO：7的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：152个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：CDS

（B）长度：36..152

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：7：

（2）SEQ ID NO：8的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：39个碱基对

（B）类型：氨基酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：8：

（2）SEQ ID NO：9的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：38个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：CDS

（B）长度：1..36

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：9：

AGA ATT CGA GCT CGG TAC CCA CCC GAT CCT CTA GAG TC 38.

Arg Ile Arg Ala Arg Tyr Pro Pro Asp Pro Leu Glu

1 5 10

（2）SEQ ID NO：10的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：12个碱基对

（B）类型：氨基酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：10：

Arg Ile Arg Ala Arg Tyr Pro Pro Asp Pro Leu Glu

1 5 10

（2）SEQ ID NO：11的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：850个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅸ）特征：

（A）名称/关键词：CDS

（B）长度：2..799

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：11：

（2）SEQ ID NO：12的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：266个碱基对

（B）类型：氨基酸

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：蛋白质

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：12：

（2）SEQ ID NO：13的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：17个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：13：

GGGGATCCTC TAGAGTC 17

（2）SEQ ID NO：14的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：36个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：14：

TGTGTTGAGT TTTTATATTT TCCTCTCCAA AIGAAA 36.

（2）SEQ ID NO：15的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：5个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：15：

AGAGG 5

（2）SEQ ID NO：16的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：7个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：16：

AAAATAT 7

（2）SEQ ID NO：17的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：26个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：17：

GTCAGTGGCT CCAATCCTGT CTGAAG 26.

（2）SEQ ID NO：18的资料：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：23个碱基对

（B）类型：核酸

（C）股数：单股

（D）几何结构：线性

（ⅱ）分子类型：DNA（基因组）

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：18：

TGTCGAGAAT TCGAGCTCGG TAC 23.

Claims

1、重组脱氧核糖核酸(DNA)，其特征在于它们是由下列组分结合而成，或含有这些组分：

(a)来源于梅痘病毒(PPV)的RNA的双链cDNA片段(“片段A”)，以及

(b)来源于蕃茄斑萎病毒(TSWV)的N结构基因的SRNA的双链cDNA片段(“片段B”)，为了结合的需要，除了含有可任选存在的其他DNA片段外，还可含有在植物细胞中有活性的一个启动子，该启动子能调节重组DNA片段的转录。

2、根据权利要求1的DNA，其中片段B定位于片段A之后（即在3′方向）。

3、根据权利要求1的DNA，其中片段A是一种具有列于SEQ ID NO：7中的序列的DNA，或是一种有相同效果的DNA。

4、根据权利要求1的DNA，其中片段B是一种具有列于SEQ ID NO：11中的序列的DNA，或是一种具有相同效果的DNA。

5、根据权利要求1的DNA，它含有列于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11中的DNA片段的结合物或者含有相同效果的DNA结合物，或是由这样一种结合物构成的。

6、根据权利要求1的DNA，它含有一种在植物体中有活性的启动子。

7、根据权利要求1的DNA，它含有一种具有CaMV 35S启动子序列的DNA或具有相同效果的一种DNA作为启动子。

8、根据权利要求1的DNA，其中片段A和B通过一个有最多至134个碱基对的合成cDNA片段（“片段C”）相连接，其中后一片段将起始于片段A的开放式阅读框架连接到片段B上。

9、根据权利要求1的DNA，其中A和B cDNA片段通过有根据SEQ ID NO：9的序列的合成DNA片段或通过有相同效果的一个DNA相连接。

10、根据权利要求1的DNA，其中在片段B之后，它含有一个具有1-30个碱基对的双链DNA片段（“片段D”）或具有相同效果的一个DNA。

11、根据权利要求1的DNA，其中在片段B之后，它含有一个根据SEQ ID NO：13的双链DNA片段，或有相同效果的一个DNA。

12、根据权利要求1的DNA，它含有一个3′非转译DNA，该DNA或者直接接在片段B之后或者通过一个双链DNA片段（片段D）连接到片段B上。

13、根据权利要求1的DNA，它含有一个3′非转译DNA，该DNA或者直接连接在片段B之后或者通过一个双链DNA片段（片段D），即具有根据SEQ ID NO：4的序列的3′非转译DNA而连接到片段B上。

14、根据权利要求1的DNA，它是由具有列于SEQ ID NO：1中的序列的DNA组成，或由具有相同效果的DNA组成，或含有该序列。

15、根据权利要求1的DNA，它是由具有列于SEQ ID NO：5的序列的DNA组成，或由具有相同效果的DNA组成，或含有该序列。

16、病毒或原核DNA，它含有权利要求1所述的DNA。

17、植物的DNA，它含有权利要求1所述的DNA。

18、含有权利要求1所述的DNA的载体。

19、含有权利要求1所述DNA的宿主生物体。

20、权利要求1所述重组DNA的应用，用于生产具有增大的抗有害生物体或植物病害的抗性的植物、植物各部分和植物细胞（包括繁殖材料）。

21、制备转基因植物细胞和植物的方法，其特征在于使用常规方法将权利要求1所述的重组DNA插入到植物细胞或植物的基因组中。植物细胞可任意再生得到植物，植物可任意地进行繁殖，以及可任意生产更多的植物，转基因植物的基因组与后续植物的基因组相结合，并且繁殖子代。

22、含有权利要求1所述重组DNA的转基因植物细胞、植物体和其各部分，以及繁殖材料。

23、含有根据SEQ ID NO：2或6的蛋白质的转基因植物细胞、植物体和其各部分，以及繁殖材料。