CN114480167A

CN114480167A - 乳酸乳球菌md-622及其应用

Info

Publication number: CN114480167A
Application number: CN202111586675.5A
Authority: CN
Inventors: 刘庆军; 沈鹤霄; 张帆; 李国龙; 刘慧敏; 彭文聪; 熊云; 王峰
Original assignee: Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Current assignee: Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114480167B

Abstract

本发明提供一种乳酸乳杆菌MD‑622及其应用。该乳酸乳杆菌MD‑622能促进产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，具有促进人体肠道消化的潜在能力。另外，本发明乳酸乳杆菌MD‑622还能在一定程度上促进胚胎干细胞的生长发育。

Description

乳酸乳球菌MD-622及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种乳酸乳球菌MD-622及其应用。

背景技术

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是原核微生物，归属于厚壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，乳球菌属，同时是乳酸菌属中的一种重要模式菌。

L.lactis广泛存在于乳制品和植物产品中，在食品工业中应用广泛，对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物(generally regards as safe， GRAS)。然而，乳酸乳球菌的实际种类比较多，很多乳酸乳球菌及其作用还没有被认识并加以利用。

发明内容

基于此，有必要提供一种乳酸乳球菌MD-622及其应用，该乳酸乳球菌 MD-622能够促进体内产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，改善肠道不适症状，还能在一定程度上促进胚胎干细胞生长发育。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种一种乳酸乳球菌MD-622，已于2021年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23902，保藏单位地址：中国北京。

所述乳酸乳球菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在其中一些实施例中，所述乳酸乳球菌的培养条件为：MRS培养基， pH6.2～6.6。

在其中一些实施例中，所述乳酸乳球菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶。

本发明还提供一种含上述乳酸乳球菌MD-622及其分泌产物或者代谢产物的组合物。

本发明还提供上述乳酸乳球菌MD-622在制备益生菌剂产品中的应用。所述益生菌剂产品为肠道疾病改善用的药品、功能食品或者保健品，或者所述益生菌剂产品为促进胚胎干细胞生长发育的药品、功能食品或者保健品。

本发明还提供一种益生菌剂，包含上述乳酸乳球菌MD-622以及辅料。

本发明还提供一种益生菌剂，包含上述乳酸乳球菌MD-622的分泌产物。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明通过大量探究试验筛选获得了一种乳酸乳球菌 MD-622，该菌株能够促进体内产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，改善肠道健康，还能在一定程度上促进胚胎干细胞的生长发育。

附图说明

图1是乳酸乳球菌MD-622的菌落照片。

图2为乳酸乳球菌MD-622的产酶测试图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

关键试剂组成：

MRS培养基：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖 20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸三铵2g/L、醋酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、琼脂15g/L、吐温801.0g/L，pH值6.2±0.2。

实施例1筛选乳酸菌

取25岁左右健康成人粪便，蒸馏水稀释处理，涂布于MRS培养基(乳酸细菌培养基)中，37℃倒置培养，挑选培养基上具有不同形态的单菌落进行划线，继续纯化培养，分离得到编号为5b4m2、cb18m1、PS128、XS10M8、 XS14M1、XS14M5的菌株。

实施例2产酶活性试验

分别对菌种5b4m2、cb18m1、PS128、XS10M8、XS14M1、XS14M5进行产酶活性试验：

(1)将上述菌种分别接种含10g/L脱脂奶粉、10g/L蛋白胨、15g/L琼脂粉的蛋白酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用蛋白酶水解圈法检测培养液中的蛋白酶产生情况。

统计结果见下表：

不同菌产蛋白酶的情况统计表(N＝3)

(2)将上述菌种分别接种含13mM Tris-HCL、75mM NaCl、1.3mM CaCl₂(pH8.0)、琼脂15g/L、10mg/L罗丹明B、聚乙烯橄榄油乳化液31.25mL，的脂肪酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用脂肪酶透明圈法检测培养液中的脂肪酶产生情况。

统计结果见下表：

不同菌产脂肪酶的情况统计表(N＝3)

备注：“—”代表无透明圈。

(3)将上述菌种分别接种含5g/L酵母浸膏、15g/L可溶性淀粉、15g/L 琼脂粉的淀粉酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用淀粉酶水解圈法检测培养液中的淀粉酶产生情况。

统计结果见下表：

不同菌产淀粉酶的情况统计表(N＝3)

备注：“—”代表无，“+”代表有。

(4)将上述菌种分别接种含酵母膏5g/L、羧甲基纤维素5g/L、琼脂粉 15g/L的纤维素酶筛选培养基中，于37℃培养。进一步采用纤维素酶水解圈法检测培养液中的纤维素酶产生情况。

统计结果见下表：

不同菌产纤维素酶的情况统计表(N＝3)

备注：“—”代表无，“+”代表有。

经过上述检测发现，仅cb18m1菌种均可以同时产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶。详见图2所示。

将cb18m1菌株进行送检鉴定，测试cb18m1菌种的16s序列为 5_TSS20211101-027-00230：

ggggcgtgtgctatgatgcagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggt gagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaacttta aacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaa aggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaa actcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtga agaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggta actacccagaaagggacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggattta ttgggcgtaaagcgagcgcaggtggtttattaagtctggtgtaaaaggcagtggctcaaccattgtatgcattggaaa ctggtagacttgagtgcaggagaggagagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaggaaca ccggtggcgaaagcggctctctggcctgtaactgacactgaggctcgaaagcgtggggagcaaacaggattagat accctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctagatgtagggagctataagttctctgtatcgcagctaacgcaat aagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtg gagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactcgtgctattcctagagatagga agttccttcgggacacgggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc aacgagcgcaacccctattgttagttgccatcattaagttgggcactctaacgagactgccggtgataaaccggagg aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgag tcgcgagacagtgatgtttagctaatctcttaaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagt cggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacac cacgggagttgggagtacccgaagtaggttgcctaaccgcaaggagggcgctcctaagtagaccgattg(SEQ IN NO.1)。

结合菌落形态及16S序列将该cb18m1菌种命名为乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)MD-622。

将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MD-622于2021年11月15日送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，菌种培养物的培养条件、检测存活条件为：均于乳酸细菌培养基(MRS)中，pH 6.2-6.6，在 37℃恒温培养箱静置过夜培养。建议超低温冻结长期保藏。

实施例3毒力实验及安全性检测

将cb18m1菌株送检，进行毒理试验及安全性检测试验，结果表明：cb18m1菌株培养物不会危及人类健康或动、植物病原或污染环境。

实施例4

培养骨细胞(C3H10T1/2):将C3H1OT1/2细胞株在37℃、5％CO₂的环境下，用含10％胎牛血清与100U/mL青霉素和100μg/mL的链霉素的DMEM 高糖培养基进行培养。

将待测灭活菌株乳酸乳球菌菌株用MRS液体培养基连续活化3代，用无菌PBS缓冲液洗涤细菌，调整密度为3×10⁸mL。按2％体积量向MRS液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵；1周后，取发酵液以4 000r/min离心30min，对上清用0.2μm的微孔滤膜过滤器过滤除。

实验组：使用待灭活乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MD-622上清液刺激骨细胞C3H10T1/2。

空白组是采用与实验组相同体积的2.0％甲醛进行刺激。

用MTT法检测细胞生长情况，方法步骤为：测定取对数生长期 C3H1OT1/2细胞随机分为试验组和对照组，均按5×10⁵/mL的密度接种于96 孔板中，每孔均加入RPMI-4640细胞培养液(含10％胎牛血清)100μL，于 37℃、5％CO₂条件下培养24h，去除上清。

实验组组加入发酵液200μL，发酵液与细胞培养液按1:4体积比。

对照组加入PBS缓冲液200μL(与细胞培养液体积比同上)，继续培养 72h后，每孔加入四氮唑蓝MTT溶液10μL，4h后洗弃上清、加二甲基亚砜150μL，每组至少6个平行孔，用酶标仅测定570nm波长处各组的光密度(OD)值。

换算，结果统计见下表：

骨细胞C3H10T1/2生长率统计表

编号	名称	骨细胞C3H10T1/2生长率(％)
			CK	细胞	100.00％
空白	Ctrl	111.43％
			cb18m1	乳酸乳杆菌	81.72％

由上表可以看出，cb18m1乳酸乳杆菌对骨细胞C3H10T1/2生长有抑制作用。

实施例5

培养小鼠胚胎干细胞CE3：采用90％DMEM(高糖)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素、1％链霉素的培养液培养胚胎干细胞。

将待测灭活菌株乳酸乳球菌菌株用MRS液体培养基连续活化3代,用无菌PBS缓冲液洗涤细菌，调整密度为3×10⁸mL。按2％体积量向MRS液体培养基接种，摇匀、密闭封口，37℃气浴恒温振荡器中发酵；1周后，取发酵液以4 000r/min离心30min，对上清用0.2μm的微孔滤膜过滤器过滤除。

使用待测灭活菌株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MD-622上清液刺激，用MTT法检测胚胎细胞生长的方法步骤为：

测定取对数生长期CE3细胞随机分为试验组和对照组，均按5×10⁵/mL 的密度接种于96孔板中，每孔均加入RPMI-4640细胞培养液(含10％胎牛血清)100μL，于37℃、5％CO₂条件下培养24h，去除上清。

换算，结果统计见下表：

胚胎干细胞CE3生长率统计表

编号	名称	胚胎干细胞CE3生长率(％)
			CK	细胞	100.00％
空白	Ctrl	95.73％
			cb18m1	乳酸乳杆菌	126.54％

由上表可以看出，cb18m1乳酸乳杆菌对胚胎干细胞CE3生长发育有促进作用。

实施例6

本实施例提供一种含乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MD-622的益生菌剂，包含乳酸乳球菌MD-622及制剂辅料。

综上所述，本发明通过大量探究试验筛选获得了一种乳酸乳球菌 MD-622，该菌株能够促进体内产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶，改善肠道健康，还能在一定程度上促进胚胎干细胞的生长发育。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 美益添生物医药（武汉）有限公司

<120> 乳酸乳杆菌MD-622及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggcgtgtg ctatgatgca gttgagcgct gaaggttggt acttgtaccg actggatgag 60

cagcgaacgg gtgagtaacg cgtggggaat ctgcctttga gcgggggaca acatttggaa 120

acgaatgcta ataccgcata aaaactttaa acacaagttt taagtttgaa agatgcaatt 180

gcatcactca aagatgatcc cgcgttgtat tagctagttg gtgaggtaaa ggctcaccaa 240

ggcgatgata catagccgac ctgagagggt gatcggccac attgggactg agacacggcc 300

caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttcggcaa tggacgaaag tctgaccgag 360

caacgccgcg tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaaac tctgttggta gagaagaacg 420

ttggtgagag tggaaagctc atcaagtgac ggtaactacc cagaaaggga cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtc ccgagcgttg tccggattta ttgggcgtaa 540

agcgagcgca ggtggtttat taagtctggt gtaaaaggca gtggctcaac cattgtatgc 600

attggaaact ggtagacttg agtgcaggag aggagagtgg aattccatgt gtagcggtga 660

aatgcgtaga tatatggagg aacaccggtg gcgaaagcgg ctctctggcc tgtaactgac 720

actgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780

aacgatgagt gctagatgta gggagctata agttctctgt atcgcagcta acgcaataag 840

cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 900

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 960

catactcgtg ctattcctag agataggaag ttccttcggg acacgggata caggtggtgc 1020

atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080

ctattgttag ttgccatcat taagttgggc actctaacga gactgccggt gataaaccgg 1140

aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1200

acaatggatg gtacaacgag tcgcgagaca gtgatgttta gctaatctct taaaaccatt 1260

ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg 1320

gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1380

ggagttggga gtacccgaag taggttgcct aaccgcaagg agggcgctcc taagtagacc 1440

gattg 1445

Claims

1.一种乳酸乳球菌MD-622，已于2021年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23902。

2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌MD-622，其特征在于，所述乳酸乳球菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌MD-622，其特征在于，所述乳酸乳球菌的培养条件为：MRS培养基，pH6.2～6.6。

4.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌MD-622，其特征在于，所述乳酸乳球菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶。

5.一种含权利要求1至4任一项所述的乳酸乳球菌MD-622的组合物。

6.权利要求1至4任一项所述的乳酸乳球菌MD-622及其分泌产物或者代谢产物在制备益生菌剂产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述益生菌剂产品为肠道疾病改善用的药品、功能食品或者保健品，或者所述益生菌剂产品为促进胚胎干细胞生长发育的药品、功能食品或者保健品。

8.一种益生菌剂，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述的乳酸乳球菌MD-622、权利要求5所述的组合物。

9.根据权利要求8所述的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括辅料。