CN114317568A - 蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用。蟋蟀CDA1和CDA2基因的获取：通过巢式PCR获得目的基因，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，有目的条带的菌液送测序。蟋蟀CDA1和CDA2基因合成的dsRNA以及在害虫防治中的应用：设计带有T7启动子的上游引物和下游引物，通过PCR扩增，切胶回收获得合双链RNA的模板，体外转录合成dsRNA，蟋蟀注射dsRNA后，出现死亡，大量延迟发育表型，其卵的孵化率也明显降低的现象。

Description

蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用。

背景技术

dsRNA在生物体内普遍存在，自然环境中易于降解，具有物种专一性、无毒、无害、残留时间短等显著优点。因此RNA干扰是绿色环保的抗病虫技术，对作物病虫害防控展现了巨大的应用前景。RNAi抗虫技术是一种新型绿色无公害的害虫防治方法，它以害虫生长发育或重要行为过程中特异性的关键基因为靶标，利用人工合成的双链RNA沉默这些基因的表达，通过影响害虫的发育和繁殖，降低虫口密度，达到害虫防控的效果。RNAi抗虫技术中的关键是获得目标昆虫关键基因，并据此制备关键基因的双链RNA。

昆虫浆膜表皮是胚胎在卵期的重要保护层之一，昆虫在卵期处于相对静止的状态，需要依靠发育过程中所生成的各种保护层保护其免受外界压力的胁迫。昆虫浆膜包裹胚胎并分泌浆膜表皮，浆膜表皮具有维持卵的正常发育并且可以进行气体、水分或部分无机物的内外交换，并具有抵抗强氧化剂，抵抗干燥等功能。因此，本发明利用RNAi技术影响浆膜表皮对卵的保护，从而在卵期降低蟋蟀的密度，对于害虫防治具有重要的现实意义。

昆虫几丁质去乙酰基酶基因1(CDA1)和几丁质去乙酰基酶基因2(CDA2)本身基因存在较大区别。表现在：1、序列不同，二者蛋白质相似性为63％，核酸相似性为76％；2、作用时间不同，CDA1在蟋蟀发育早期起作用，而CDA2主要在蟋蟀胚胎发育晚期起作用。

发明内容

针对上述问题本发明提供了一种蟋蟀CDA1和CDA2基因的获得方法、dsRNA的合成方法及其在害虫防治中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种蟋蟀CDA1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种蟋蟀CDA2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述蟋蟀CDA1和CDA2基因的获得方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：利用clone manager各设计两对引物如下：

蟋蟀CDA1基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQID NO.8所示；

蟋蟀CDA2基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQID NO.12所示；

(2)模板制备：参照TaKaRa Trizol试剂盒提取总RNA，然后反转录成cDNA，从而得到PCR扩增所需模板；

(3)PCR扩增：通过巢式PCR扩增获得目的基因，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，有目的条带的菌液送测序，测序结果正确的菌株保存于-80℃。

所述蟋蟀CDA1和CDA2基因片段合成的dsRNA。

所述dsRNA的合成方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：CDA1合成dsRNA的引物序列如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物如SEQ ID NO.14所示；

CDA2合成dsRNA的引物序列如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物如SEQ ID NO.16所示；

(2)模板制备：采用步骤(1)设计的引物，以蟋蟀基因片段为模板进行PCR扩增，切胶回收即可得到所需模板；

(3)dsRNA合成：步骤(2)得到的模板依照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA。

使用显微注射仪将dsRNA分别在早期(产卵后4小时)和相对晚期(产卵后2天)从卵孔端注射到蟋蟀的卵内，同时观察其表型。结果显示注射dsRNA之后，在早期注射，注射CDA1的在胚胎发育早期就大量死亡，存活率几乎为零，CDA2则仍有23％的存活率，在相对晚期注射，注射CDA1主要表现为延迟发育，有少量的死亡，而注射CDA2则表现出大量死亡现象。

合成的dsRNA对蟋蟀卵死亡及延迟发育原因研究：将注射dsGFP的卵设为对照组，注射dsCDAs的卵设为处理组，分别用显微注射将dsGFP和dsCDAs从早期和相对晚期从卵孔端注入，采用HE染色的方法观察浆膜表皮变化。结果表明，与对照组相比，注射dsCDA1的蟋蟀浆膜表皮的厚度压实程度几乎无影响，注射dsCDA2的蟋蟀浆膜表皮不在紧实，浆膜表皮会变厚且松散，dsCDA1早期的大量致死可能是受其它方面的影响。

所述dsRNA在害虫防治中的应用。

与现有技术相比本发明具有以下优点：蟋蟀注射dsRNA后，出现死亡，大量延迟发育表型，其卵的孵化率也明显降低的现象。可根据二者基因作用时间的不同来对其应用，本发明能够从卵期降低蟋蟀的密度，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

附图说明

图1为蟋蟀CDAs基因cDNA的PCR扩增检测图，其中M所示为DL1000DNAMarker，1所示为蟋蟀CDA1，2所示为蟋蟀CDA2基因片段；

图2为基因沉默效率检测图，dsGFP为对照组和dsCDA1和dsCDA2为实验组；

图3为基因沉默后对蟋蟀浆膜表皮的影响，CDA1对浆膜表皮的影响较小，而CDA2作用相对较大，通过HE染色观察到浆膜表皮松散，不能对蟋蟀卵起到很好的保护作用；

图4为在早期注射合成的dsRNA对蟋蟀卵发育的影响，注射CDA1的在胚胎发育早期就大量死亡，存活率几乎为零，CDA2则仍有存活；

图5为在晚期注射合成的dsRNA对蟋蟀卵发育的影响，注射CDA1主要表现为延迟发育，有少量的死亡，而注射CDA2则表现出大量死亡现象。

具体实施方式

实施例1

一种蟋蟀CDA1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种蟋蟀CDA2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述蟋蟀CDA1和CDA2基因的获得方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：利用clone manager各设计两对引物如下：

蟋蟀CDA1基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQID NO.8所示；

蟋蟀CDA2基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQID NO.12所示；

(2)模板制备：参照TaKaRa Trizol试剂盒提取总RNA，然后反转录成cDNA，从而得到PCR扩增所需模板；

(3)PCR扩增：通过巢式PCR扩增获得目的基因，琼脂糖凝胶进行检测如图1所示，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，测序结果正确的菌株保存于-80℃。

实施例2

所述蟋蟀CDA1和CDA2基因片段合成的dsRNA。

所述dsRNA的合成方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：CDA1合成dsRNA的引物序列如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物如SEQ ID NO.14所示；

CDA2合成dsRNA的引物序列如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物如SEQ ID NO.16所示；

(2)模板制备：采用步骤(1)设计的引物，以蟋蟀基因片段为模板进行PCR扩增，切胶回收即可得到所需模板；

(3)dsRNA合成：步骤(2)得到的模板依照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA。使用NaNoDrop2000(Thermoscientific)对其进行定量，最终使其浓度达到3μg/μL，用于后期的显微注射，将其保存于-80℃冰箱中。

实施例3

蟋蟀基因片段合成dsRNA对蟋蟀卵浆膜表皮的影响

1.dsRNA的注射

选取正常发育的2d的卵进行显微注射，分别注射dsGFP和dsRNA(dsCDAs)，注射浓度为3μg/μL的dsRNA，其中将注射dsGFP对照组，注射dsCDAs的设立为实验组，注射之后在含琼脂糖的培养皿中培养。

2.基因沉默效率检测

蟋蟀的卵在2d注射，24h后进行沉默效率检测。采用TaKaRaTrizol试剂盒提取RNA，反转录成cDNA。采用RT-qPCR检测其沉默效率，选用的内参基因为RPL32，结果显示，与对照组比较，实验组中目的基因的mRNA表达量显著降低(图2)。

3.RNAi对蟋蟀浆膜表皮及卵发育的影响

将合成的dsGFP和dsCDAs分别注射进入蟋蟀卵内，结果表明，CDA1对浆膜表皮的影响较小，而CDA2作用相对较大，注射CDA2后，通过HE染色观察到浆膜表皮松散，不能对蟋蟀卵起到很好的保护作用。同时，在早期注射合成的dsRNA，注射CDA1的在胚胎发育早期就大量死亡，存活率几乎为零，CDA2则仍有23％的存活率(图4),在晚期注射合成的dsRNA，注射CDA1主要表现为延迟发育，有少量的死亡，而注射CDA2则表现出大量死亡现象(图5)。

序列表

SEQ ID NO.1：

GCCTTACTGCTAGTGAGTGTCGGTTTGCGGGATGACTCGCAGCCGGGTGTGTGTTTTCGCGGCGGCGGCGCTATGCTTCGCTTTCCTGTGCCAGCCCCAGCCGGGAGCGGCGCAGGAGGAGACGAAGAAGGAGGAGAGCTTCGAGGTGGAGCTCTGCAAGGACAAGGACGCCGGCGAGTGGTTCCGCCTGGTGGCCGGCGAAGGTGACAACTGCCGAGACGTCATCCAGTGCACGTCGTCGGGGCTGCAGGCCATCCGCTGCCCTGCCGGCCTCTACTTCGACATCGAGAAGCAGACGTGCGACTGGAAGGACGCCGTCAAGAACTGCAAACTCAAGAACAAGGAGCGCAAGGTGAAGCCGCTGCTCTACACCGACGAGCCGCTCTGCCAGGACGGCTTCCTGGCTTGCGGCGACGGCGCGTGTATCGAGCGGGGCCTGTTCTGCAACGGGGAGAAGGACTGCAACGACGGCTCCGATGAGAACACCTGCGACAATGAGAACGACCCCAACCGCGCGCCGCCCTGCGACCCGGCCGTGTGCGTGCTGCCCGACTGCTTCTGCTCCGAGGACGGCACCACCATCCCCGGGGACCTGCCTGCGTCCGAAGTGCCCCAGATGATCACCATCACCTTCGACGACGCCATCAACAACAACAACATCGAGCTCTACAAGGAGATCTTCAACGGCAAGCGCAAGAACCCCAACGGCTGCGAGATCAAGGCCACCTTCTTCGTGTCGCACAAGTACTCCAACTATTCGGCCGTGCAGGAGACTCACCGCAAGGGCCACGAGATCGCCGTCCACTCCATCACGCACAACGACGATGAACAGTTCTGGAGCAATGCCACCGTCGATGACTGGGCCAAAGAAATGGCGGGCACTCGTATCATCATCGAGAAGTTCGCCAACATCACCGACAACAGCATCGTAGGCGTGCGCGCACCCTACCTGCGCGTGGGCGGCAACAACCAGTTCACCATGATGGAGGAGCAGGCCTTCCTCTACGACTCCACCATCACCGCGCCGCTCTCCAACCCGCCCCTCTGGCCCTACACCATGTACTTCCGCATGCCCCACCGCTGCCACGGCAACCTGCAGCACTGCCCCACGCGCTCGCACGCCGTGTGGGAGATGGTGATGAACGAGTTGGACCGGCGCGAGGACCCGCAGTTCGACGAGTACCTGCCCGGCTGCGCTATGGTGGACTCGTGCTCCAACATCCTGACTGGCGACCAGTTCTACAACTTCCTCAACCACAACTTCAACAGGCATTACAACAAGAACCGCGCGCCCCTCGGCCTCTACTTCCACGCGGCCTGGCTCAAGAACAACCCCGAGTTCCTCGACGCCTTCCTCTACTGGATCGACGAGGTGCTGGAGAACTACAAGGACGTGTACTTCGTGACGATGACGCAGGTCATCCAGTGGATCCAGAACCCGCGCACCATCCAGGAGGTGAAGAACTTCGAGCCGTGGACGGAGAAGTGCGTGGTGACGGGACGGCCAGCCTGCTGGGTGCCGCACTCGTGCAAGCTCACCAGCAAGGAGCTGCCGGGCGAGACAATCAACCTGCAGACTTGCGTGCGGTGCCCCAACAACTACCCCTGGATCAACGACCCGACCGGCGACGGGTTCTTCTAAGTCAGCGATCTCAGCCCCTCGGGGCGGCCCNNNNNNNNNNCACCCCCCTCCCGCACACCTGAGCGAAGTTCCTGAGCCGGCCGCCTCCCGCGCCAGCGCCACCGCTCGCTCGCCCCCTCCCTCTTGGCGTTTCGGCCAGCATCGCGCTCCTAGCACAGTTTCGTAAGCCATTCAAAGCGAAAACAAATCACTTCTGAGAGGGAAAGGACAGATCACATTTTTAAGATGAAAATTCGGTTGCATTTACTCAACTCGTGTGACCTCTCCAGAGGACTCGGCCGCCCTTCTGCCGGCGGCGGCGGTAGTCAAAATCCGGTCGGGGACCGCATCCGCGGCCCCGCGCTTCTAAGCTAAGACTCCAGACCTGTATAGAAATATGTTGTGAAAAAGTTAATAAAACTTGCTCTAAACATCTGTATTGTTTTGTTGTTACCTGAATGTTCCATATCGTCTGTATGTGTATATGCGCTAATAAAGTAATTATAATGTGCGAAAACCTAA

SEQ ID NO.2：

MTRSRVCVFAAAALCFAFLCQPQPGAAQEETKKEESFEVELCKDKDAGEWFRLVAGEGDNCRDVIQCTSSGLQAIRCPAGLYFDIEKQTCDWKDAVKNCKLKNKERKVKPLLYTDEPLCQDGFLACGDGACIERGLFCNGEKDCNDGSDENTCDNENDPNRAPPCDPAVCVLPDCFCSEDGTTIPGDLPASEVPQMITITFDDAINNNNIELYKEIFNGKRKNPNGCEIKATFFVSHKYSNYSAVQETHRKGHEIAVHSITHNDDEQFWSNATVDDWAKEMAGTRIIIEKFANITDNSIVGVRAPYLRVGGNNQFTMMEEQAFLYDSTITAPLSNPPLWPYTMYFRMPHRCHGNLQHCPTRSHAVWEMVMNELDRREDPQFDEYLPGCAMVDSCSNILTGDQFYNFLNHNFNRHYNKNRAPLGLYFHAAWLKNNPEFLDAFLYWIDEVLENYKDVYFVTMTQVIQWIQNPRTIQEVKNFEPWTEKCVVTGRPACWVPHSCKLTSKELPGETINLQTCVRCPNNYPWINDPTGDGFF

SEQ ID NO.3：

GCGCGGCGGCCGCCGCCGCCGCCATATAAAATAAAAAGGCGGTCGCGCGCGCCTCTCGGGCCGAGACGACGTCCGACCGCCGCCTCCGCCAACGCCGCCATGACACGCACCTCGCTCTGCCTGCTGCTGCTCGCCCTGGGCGTCGCGGCCGCAGTGCGCGTGAAGCGCCAGGACGACGACCTGGAATCGGACGACCAGTCGGTGGACGAGCTGTGTGAGAACCGCCCGCCCGACGAGTACTTCCGCCTCAGCACGGACGGCGACTGCCGCGACGTCGTCAGGTGCGACCAGGCCGGAGAGAACGGCATCACCCGGCTGGCGTCGGTGAGGTGCCCCAACGGCTTAGCTTTTGATATAGATCGACAGACGTGTGATTGGAGAACCAATGTTAAAAACTGTGATAGAGTAGAAAAGCCGCGCAAGGTGCTGCCAATCCTCAAGACAGACGAGCCGCGCTGCCCCGAGGGCAAGCTGTCCTGCGGCAACGGCGAGTGCATCGACAAGGAGCTCTTCTGCAACGACAAGCCCGACTGCAAAGACGAGTCTGACGAGAATGCCTGCACCGTGGACCTGGACCCCAACCGCGCGCCCGACTGCGACCCCACGCAGTGCGTGCTGCCCGACTGCTTCTGCTCCGCCGACGGCACCCGCATCCCCGGCAGCATCGAGCCCAACCAGGTTCCTCAAATGATCACCATCACCTTCAACGGCGCCGCTAACGTGGACAACATCGACCTGTACGAGGAGATCTTCAACGGCCAGCGCCAGAACCCCAACGGCTGCCAGATCCGAGGCACCTTCTTTGTCTCGCACAAGTACACCAACTACTCGGCCGTGCAGGACCTGCACCGCCGCGGCCACGAGATCGGCGTCTTCTCCCTCACGCACAAGGACGACCCCAACTACTGGACGCAGGGCTCGTACGACGACTGGCTGGCCGAGATGGCGGGCGCGCGCCTCATCATCGAGCGCTTCGCCAACATCACCGACGGCTCCATCATCGGCATGCGCGCGCCCTACCTGCGCGTGGGCGGCAACAAGCAGTTCGAGATGATGGCCGACCAGTTCTTCGTGTACGACGCGTCCATCACGGCGCCGCTGGGCCGCGTGCCCATCTGGCCGTACACGCTCTACTTCCGCATGCCGCACAAGTGCAACGGCAACGCCCACAACTGCCCCAGCCGTAGCCACCCCGTGTGGGAGATGGTGATGAACGAGCTGGACCGCAGGGACGACCCCACCTTCGACGAGTCGCTACCCGGCTGCCACATGGTGGACTCGTGCTCCAACATCCAGAGCGGCGACCAGTTTGCGCGCCTGCTGCGCCACAACTTCAACCGCCACTTCAACTCCAACCGCGCACCGCTCGGCCTGCACTTCCACGCGTCCTGGCTCAAGAGCAAGAAGGAGTACAAGGACGAGCTCATCCGCTTCATCGAGGAGATGCTGGACCGCAACGACGTCTACTTCGTCACCATGTTGCAGGTGATCCAGTGGATGCAGAACCCGACGGAGTTGACGGCGCTGCGCGACTTCCAAGAGTGGAAGGAGAAGTGCGACGTGAAGGGGCAACCCTACTGCTCGCTGCCCAACGCCTGCCCGCTCACCACTCGCGAGCTGCCTGGAGAGACCCTGCGCCTCTTCACCTGCATGGAGTGCCCCAACAACTACCCCTGGATCCTCGACCCCACGGGCGACGGCTTCTCGGTCAAGAAGTAAGCCCTCCTCCCTCTCCCCTTCCCCCTCCTCAACCCCCACCCCCCACCCGGCCTCGCCGCGCGTGAGGCGTCGGCCGCCCCAGTGCCAGCGGCTGCATTCACACAAAATTACCTGCATGAGTAGTAAACTGTTAATCTAGTCTCTCTGTTCAAATATTCAAACTCGCACTCCACAAACGCATATTTATGCAGGACCTTTGAATAGTGCTCTCTAGTACTTTTTCTATTTTCCATTGCCGAGACACGGCGTCACAAGGGATGGGCGAGCTGTTGTATTATACTTTTTGCACTGGGGAGGAAAACAAAGCCATCCGAAATTTTTCATTAGAGCCTCGACATAAATTACTTGTCTGTGCCCCGAATTTCCGTTGCTGATGAGCAAGAGAACTGTGGTGGCTTCCTACAAAGAGACTTATGAGTGGTACACGAAATCAATGTGTTTTGTTGTGGATGGATGTGATGAAGACTAAATTAATTGATATTGTAACAAAAACAAAATAAAGTTGTTATA

SEQ ID NO.4：

MTRTSLCLLLLALGVAAAVRVKRQDDDLESDDQSVDELCENRPPDEYFRLSTDGDCRDVVRCDQAGENGITRLASVRCPNGLAFDIDRQTCDWRTNVKNCDRVEKPRKVLPILKTDEPRCPEGKLSCGNGECIDKELFCNDKPDCKDESDENACTVDLDPNRAPDCDPTQCVLPDCFCSADGTRIPGSIEPNQVPQMITITFNGAANVDNIDLYEEIFNGQRQNPNGCQIRGTFFVSHKYTNYSAVQDLHRRGHEIGVFSLTHKDDPNYWTQGSYDDWLAEMAGARLIIERFANITDGSIIGMRAPYLRVGGNKQFEMMADQFFVYDASITAPLGRVPIWPYTLYFRMPHKCNGNAHNCPSRSHPVWEMVMNELDRRDDPTFDESLPGCHMVDSCSNIQSGDQFARLLRHNFNRHFNSNRAPLGLHFHASWLKSKKEYKDELIRFIEEMLDRNDVYFVTMLQVIQWMQNPTELTALRDFQEWKEKCDVKGQPYCSLPNACPLTTRELPGETLRLFTCMECPNNYPWILDPTGDGFSVKK

SEQ ID NO.5：

CTATGCTTCGCTTTCCTGTG

SEQ ID NO.6：

TCTCATTGTCGCAGGTGTTC

SEQ ID NO.7：

TGGAGCTCTGCAAGGACAAG

SEQ ID NO.8：

TCTCATTGTCGCAGGTGTTC

SEQ ID NO.9：

CAGGACGACGACCTGGAATC

SEQ ID NO.10：

CAGGCATTCTCGTCAGACTC

SEQ ID NO.11：

TCCACGGTGCAGGCATTCTC

SEQ ID NO.12：

CAGGCATTCTCGTCAGACTC

SEQ ID NO.13：

TAATACGACTCACTATAGGGTGGAGCTCTGCAAGGACAAG

SEQ ID NO.14：

TAATACGACTCACTATAGGGTCTCATTGTCGCAGGTGTTC

SEQ ID NO.15：

TAATACGACTCACTATAGGGCAGGACGACGACCTGGAATC

SEQ ID NO.16：

TAATACGACTCACTATAGGGCAGGCATTCTCGTCAGACTC

序列表

<110> 山西大学

<120> 蟋蟀CDA1和CDA2基因的dsRNA合成方法及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2143

<212> DNA

<213> 蟋蟀(Gryllus bimaculatus)

<400> 1

gccttactgc tagtgagtgt cggtttgcgg gatgactcgc agccgggtgt gtgttttcgc 60

ggcggcggcg ctatgcttcg ctttcctgtg ccagccccag ccgggagcgg cgcaggagga 120

gacgaagaag gaggagagct tcgaggtgga gctctgcaag gacaaggacg ccggcgagtg 180

gttccgcctg gtggccggcg aaggtgacaa ctgccgagac gtcatccagt gcacgtcgtc 240

ggggctgcag gccatccgct gccctgccgg cctctacttc gacatcgaga agcagacgtg 300

cgactggaag gacgccgtca agaactgcaa actcaagaac aaggagcgca aggtgaagcc 360

gctgctctac accgacgagc cgctctgcca ggacggcttc ctggcttgcg gcgacggcgc 420

gtgtatcgag cggggcctgt tctgcaacgg ggagaaggac tgcaacgacg gctccgatga 480

gaacacctgc gacaatgaga acgaccccaa ccgcgcgccg ccctgcgacc cggccgtgtg 540

cgtgctgccc gactgcttct gctccgagga cggcaccacc atccccgggg acctgcctgc 600

gtccgaagtg ccccagatga tcaccatcac cttcgacgac gccatcaaca acaacaacat 660

cgagctctac aaggagatct tcaacggcaa gcgcaagaac cccaacggct gcgagatcaa 720

ggccaccttc ttcgtgtcgc acaagtactc caactattcg gccgtgcagg agactcaccg 780

caagggccac gagatcgccg tccactccat cacgcacaac gacgatgaac agttctggag 840

caatgccacc gtcgatgact gggccaaaga aatggcgggc actcgtatca tcatcgagaa 900

gttcgccaac atcaccgaca acagcatcgt aggcgtgcgc gcaccctacc tgcgcgtggg 960

cggcaacaac cagttcacca tgatggagga gcaggccttc ctctacgact ccaccatcac 1020

cgcgccgctc tccaacccgc ccctctggcc ctacaccatg tacttccgca tgccccaccg 1080

ctgccacggc aacctgcagc actgccccac gcgctcgcac gccgtgtggg agatggtgat 1140

gaacgagttg gaccggcgcg aggacccgca gttcgacgag tacctgcccg gctgcgctat 1200

ggtggactcg tgctccaaca tcctgactgg cgaccagttc tacaacttcc tcaaccacaa 1260

cttcaacagg cattacaaca agaaccgcgc gcccctcggc ctctacttcc acgcggcctg 1320

gctcaagaac aaccccgagt tcctcgacgc cttcctctac tggatcgacg aggtgctgga 1380

gaactacaag gacgtgtact tcgtgacgat gacgcaggtc atccagtgga tccagaaccc 1440

gcgcaccatc caggaggtga agaacttcga gccgtggacg gagaagtgcg tggtgacggg 1500

acggccagcc tgctgggtgc cgcactcgtg caagctcacc agcaaggagc tgccgggcga 1560

gacaatcaac ctgcagactt gcgtgcggtg ccccaacaac tacccctgga tcaacgaccc 1620

gaccggcgac gggttcttct aagtcagcga tctcagcccc tcggggcggc ccnnnnnnnn 1680

nncacccccc tcccgcacac ctgagcgaag ttcctgagcc ggccgcctcc cgcgccagcg 1740

ccaccgctcg ctcgccccct ccctcttggc gtttcggcca gcatcgcgct cctagcacag 1800

tttcgtaagc cattcaaagc gaaaacaaat cacttctgag agggaaagga cagatcacat 1860

ttttaagatg aaaattcggt tgcatttact caactcgtgt gacctctcca gaggactcgg 1920

ccgcccttct gccggcggcg gcggtagtca aaatccggtc ggggaccgca tccgcggccc 1980

cgcgcttcta agctaagact ccagacctgt atagaaatat gttgtgaaaa agttaataaa 2040

acttgctcta aacatctgta ttgttttgtt gttacctgaa tgttccatat cgtctgtatg 2100

tgtatatgcg ctaataaagt aattataatg tgcgaaaacc taa 2143

<210> 2

<211> 536

<212> PRT

<213> 蟋蟀(Gryllus bimaculatus)

<400> 2

Met Thr Arg Ser Arg Val Cys Val Phe Ala Ala Ala Ala Leu Cys Phe

1 5 10 15

Ala Phe Leu Cys Gln Pro Gln Pro Gly Ala Ala Gln Glu Glu Thr Lys

20 25 30

Lys Glu Glu Ser Phe Glu Val Glu Leu Cys Lys Asp Lys Asp Ala Gly

35 40 45

Glu Trp Phe Arg Leu Val Ala Gly Glu Gly Asp Asn Cys Arg Asp Val

50 55 60

Ile Gln Cys Thr Ser Ser Gly Leu Gln Ala Ile Arg Cys Pro Ala Gly

65 70 75 80

Leu Tyr Phe Asp Ile Glu Lys Gln Thr Cys Asp Trp Lys Asp Ala Val

85 90 95

Lys Asn Cys Lys Leu Lys Asn Lys Glu Arg Lys Val Lys Pro Leu Leu

100 105 110

Tyr Thr Asp Glu Pro Leu Cys Gln Asp Gly Phe Leu Ala Cys Gly Asp

115 120 125

Gly Ala Cys Ile Glu Arg Gly Leu Phe Cys Asn Gly Glu Lys Asp Cys

130 135 140

Asn Asp Gly Ser Asp Glu Asn Thr Cys Asp Asn Glu Asn Asp Pro Asn

145 150 155 160

Arg Ala Pro Pro Cys Asp Pro Ala Val Cys Val Leu Pro Asp Cys Phe

165 170 175

Cys Ser Glu Asp Gly Thr Thr Ile Pro Gly Asp Leu Pro Ala Ser Glu

180 185 190

Val Pro Gln Met Ile Thr Ile Thr Phe Asp Asp Ala Ile Asn Asn Asn

195 200 205

Asn Ile Glu Leu Tyr Lys Glu Ile Phe Asn Gly Lys Arg Lys Asn Pro

210 215 220

Asn Gly Cys Glu Ile Lys Ala Thr Phe Phe Val Ser His Lys Tyr Ser

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Ala Val Gln Glu Thr His Arg Lys Gly His Glu Ile Ala

245 250 255

Val His Ser Ile Thr His Asn Asp Asp Glu Gln Phe Trp Ser Asn Ala

260 265 270

Thr Val Asp Asp Trp Ala Lys Glu Met Ala Gly Thr Arg Ile Ile Ile

275 280 285

Glu Lys Phe Ala Asn Ile Thr Asp Asn Ser Ile Val Gly Val Arg Ala

290 295 300

Pro Tyr Leu Arg Val Gly Gly Asn Asn Gln Phe Thr Met Met Glu Glu

305 310 315 320

Gln Ala Phe Leu Tyr Asp Ser Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ser Asn Pro

325 330 335

Pro Leu Trp Pro Tyr Thr Met Tyr Phe Arg Met Pro His Arg Cys His

340 345 350

Gly Asn Leu Gln His Cys Pro Thr Arg Ser His Ala Val Trp Glu Met

355 360 365

Val Met Asn Glu Leu Asp Arg Arg Glu Asp Pro Gln Phe Asp Glu Tyr

370 375 380

Leu Pro Gly Cys Ala Met Val Asp Ser Cys Ser Asn Ile Leu Thr Gly

385 390 395 400

Asp Gln Phe Tyr Asn Phe Leu Asn His Asn Phe Asn Arg His Tyr Asn

405 410 415

Lys Asn Arg Ala Pro Leu Gly Leu Tyr Phe His Ala Ala Trp Leu Lys

420 425 430

Asn Asn Pro Glu Phe Leu Asp Ala Phe Leu Tyr Trp Ile Asp Glu Val

435 440 445

Leu Glu Asn Tyr Lys Asp Val Tyr Phe Val Thr Met Thr Gln Val Ile

450 455 460

Gln Trp Ile Gln Asn Pro Arg Thr Ile Gln Glu Val Lys Asn Phe Glu

465 470 475 480

Pro Trp Thr Glu Lys Cys Val Val Thr Gly Arg Pro Ala Cys Trp Val

485 490 495

Pro His Ser Cys Lys Leu Thr Ser Lys Glu Leu Pro Gly Glu Thr Ile

500 505 510

Asn Leu Gln Thr Cys Val Arg Cys Pro Asn Asn Tyr Pro Trp Ile Asn

515 520 525

Asp Pro Thr Gly Asp Gly Phe Phe

530 535

<210> 3

<211> 2229

<212> DNA

<213> 蟋蟀(Gryllus bimaculatus)

<400> 3

gcgcggcggc cgccgccgcc gccatataaa ataaaaaggc ggtcgcgcgc gcctctcggg 60

ccgagacgac gtccgaccgc cgcctccgcc aacgccgcca tgacacgcac ctcgctctgc 120

ctgctgctgc tcgccctggg cgtcgcggcc gcagtgcgcg tgaagcgcca ggacgacgac 180

ctggaatcgg acgaccagtc ggtggacgag ctgtgtgaga accgcccgcc cgacgagtac 240

ttccgcctca gcacggacgg cgactgccgc gacgtcgtca ggtgcgacca ggccggagag 300

aacggcatca cccggctggc gtcggtgagg tgccccaacg gcttagcttt tgatatagat 360

cgacagacgt gtgattggag aaccaatgtt aaaaactgtg atagagtaga aaagccgcgc 420

aaggtgctgc caatcctcaa gacagacgag ccgcgctgcc ccgagggcaa gctgtcctgc 480

ggcaacggcg agtgcatcga caaggagctc ttctgcaacg acaagcccga ctgcaaagac 540

gagtctgacg agaatgcctg caccgtggac ctggacccca accgcgcgcc cgactgcgac 600

cccacgcagt gcgtgctgcc cgactgcttc tgctccgccg acggcacccg catccccggc 660

agcatcgagc ccaaccaggt tcctcaaatg atcaccatca ccttcaacgg cgccgctaac 720

gtggacaaca tcgacctgta cgaggagatc ttcaacggcc agcgccagaa ccccaacggc 780

tgccagatcc gaggcacctt ctttgtctcg cacaagtaca ccaactactc ggccgtgcag 840

gacctgcacc gccgcggcca cgagatcggc gtcttctccc tcacgcacaa ggacgacccc 900

aactactgga cgcagggctc gtacgacgac tggctggccg agatggcggg cgcgcgcctc 960

atcatcgagc gcttcgccaa catcaccgac ggctccatca tcggcatgcg cgcgccctac 1020

ctgcgcgtgg gcggcaacaa gcagttcgag atgatggccg accagttctt cgtgtacgac 1080

gcgtccatca cggcgccgct gggccgcgtg cccatctggc cgtacacgct ctacttccgc 1140

atgccgcaca agtgcaacgg caacgcccac aactgcccca gccgtagcca ccccgtgtgg 1200

gagatggtga tgaacgagct ggaccgcagg gacgacccca ccttcgacga gtcgctaccc 1260

ggctgccaca tggtggactc gtgctccaac atccagagcg gcgaccagtt tgcgcgcctg 1320

ctgcgccaca acttcaaccg ccacttcaac tccaaccgcg caccgctcgg cctgcacttc 1380

cacgcgtcct ggctcaagag caagaaggag tacaaggacg agctcatccg cttcatcgag 1440

gagatgctgg accgcaacga cgtctacttc gtcaccatgt tgcaggtgat ccagtggatg 1500

cagaacccga cggagttgac ggcgctgcgc gacttccaag agtggaagga gaagtgcgac 1560

gtgaaggggc aaccctactg ctcgctgccc aacgcctgcc cgctcaccac tcgcgagctg 1620

cctggagaga ccctgcgcct cttcacctgc atggagtgcc ccaacaacta cccctggatc 1680

ctcgacccca cgggcgacgg cttctcggtc aagaagtaag ccctcctccc tctccccttc 1740

cccctcctca acccccaccc cccacccggc ctcgccgcgc gtgaggcgtc ggccgcccca 1800

gtgccagcgg ctgcattcac acaaaattac ctgcatgagt agtaaactgt taatctagtc 1860

tctctgttca aatattcaaa ctcgcactcc acaaacgcat atttatgcag gacctttgaa 1920

tagtgctctc tagtactttt tctattttcc attgccgaga cacggcgtca caagggatgg 1980

gcgagctgtt gtattatact ttttgcactg gggaggaaaa caaagccatc cgaaattttt 2040

cattagagcc tcgacataaa ttacttgtct gtgccccgaa tttccgttgc tgatgagcaa 2100

gagaactgtg gtggcttcct acaaagagac ttatgagtgg tacacgaaat caatgtgttt 2160

tgttgtggat ggatgtgatg aagactaaat taattgatat tgtaacaaaa acaaaataaa 2220

gttgttata 2229

<210> 4

<211> 539

<212> PRT

<213> 蟋蟀(Gryllus bimaculatus)

<400> 4

Met Thr Arg Thr Ser Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Val Arg Val Lys Arg Gln Asp Asp Asp Leu Glu Ser Asp Asp

20 25 30

Gln Ser Val Asp Glu Leu Cys Glu Asn Arg Pro Pro Asp Glu Tyr Phe

35 40 45

Arg Leu Ser Thr Asp Gly Asp Cys Arg Asp Val Val Arg Cys Asp Gln

50 55 60

Ala Gly Glu Asn Gly Ile Thr Arg Leu Ala Ser Val Arg Cys Pro Asn

65 70 75 80

Gly Leu Ala Phe Asp Ile Asp Arg Gln Thr Cys Asp Trp Arg Thr Asn

85 90 95

Val Lys Asn Cys Asp Arg Val Glu Lys Pro Arg Lys Val Leu Pro Ile

100 105 110

Leu Lys Thr Asp Glu Pro Arg Cys Pro Glu Gly Lys Leu Ser Cys Gly

115 120 125

Asn Gly Glu Cys Ile Asp Lys Glu Leu Phe Cys Asn Asp Lys Pro Asp

130 135 140

Cys Lys Asp Glu Ser Asp Glu Asn Ala Cys Thr Val Asp Leu Asp Pro

145 150 155 160

Asn Arg Ala Pro Asp Cys Asp Pro Thr Gln Cys Val Leu Pro Asp Cys

165 170 175

Phe Cys Ser Ala Asp Gly Thr Arg Ile Pro Gly Ser Ile Glu Pro Asn

180 185 190

Gln Val Pro Gln Met Ile Thr Ile Thr Phe Asn Gly Ala Ala Asn Val

195 200 205

Asp Asn Ile Asp Leu Tyr Glu Glu Ile Phe Asn Gly Gln Arg Gln Asn

210 215 220

Pro Asn Gly Cys Gln Ile Arg Gly Thr Phe Phe Val Ser His Lys Tyr

225 230 235 240

Thr Asn Tyr Ser Ala Val Gln Asp Leu His Arg Arg Gly His Glu Ile

245 250 255

Gly Val Phe Ser Leu Thr His Lys Asp Asp Pro Asn Tyr Trp Thr Gln

260 265 270

Gly Ser Tyr Asp Asp Trp Leu Ala Glu Met Ala Gly Ala Arg Leu Ile

275 280 285

Ile Glu Arg Phe Ala Asn Ile Thr Asp Gly Ser Ile Ile Gly Met Arg

290 295 300

Ala Pro Tyr Leu Arg Val Gly Gly Asn Lys Gln Phe Glu Met Met Ala

305 310 315 320

Asp Gln Phe Phe Val Tyr Asp Ala Ser Ile Thr Ala Pro Leu Gly Arg

325 330 335

Val Pro Ile Trp Pro Tyr Thr Leu Tyr Phe Arg Met Pro His Lys Cys

340 345 350

Asn Gly Asn Ala His Asn Cys Pro Ser Arg Ser His Pro Val Trp Glu

355 360 365

Met Val Met Asn Glu Leu Asp Arg Arg Asp Asp Pro Thr Phe Asp Glu

370 375 380

Ser Leu Pro Gly Cys His Met Val Asp Ser Cys Ser Asn Ile Gln Ser

385 390 395 400

Gly Asp Gln Phe Ala Arg Leu Leu Arg His Asn Phe Asn Arg His Phe

405 410 415

Asn Ser Asn Arg Ala Pro Leu Gly Leu His Phe His Ala Ser Trp Leu

420 425 430

Lys Ser Lys Lys Glu Tyr Lys Asp Glu Leu Ile Arg Phe Ile Glu Glu

435 440 445

Met Leu Asp Arg Asn Asp Val Tyr Phe Val Thr Met Leu Gln Val Ile

450 455 460

Gln Trp Met Gln Asn Pro Thr Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Phe Gln

465 470 475 480

Glu Trp Lys Glu Lys Cys Asp Val Lys Gly Gln Pro Tyr Cys Ser Leu

485 490 495

Pro Asn Ala Cys Pro Leu Thr Thr Arg Glu Leu Pro Gly Glu Thr Leu

500 505 510

Arg Leu Phe Thr Cys Met Glu Cys Pro Asn Asn Tyr Pro Trp Ile Leu

515 520 525

Asp Pro Thr Gly Asp Gly Phe Ser Val Lys Lys

530 535

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctatgcttcg ctttcctgtg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctcattgtc gcaggtgttc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggagctctg caaggacaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctcattgtc gcaggtgttc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggacgacg acctggaatc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggcattct cgtcagactc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tccacggtgc aggcattctc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caggcattct cgtcagactc 20

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

taatacgact cactataggg tggagctctg caaggacaag 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg tctcattgtc gcaggtgttc 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taatacgact cactataggg caggacgacg acctggaatc 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg caggcattct cgtcagactc 40

Claims (5)

1.一种蟋蟀CDA1和CDA2基因，其特征在于，所述CDA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CDA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述蟋蟀CDA1和CDA2基因的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物设计：利用clone manager各设计两对引物如下：

蟋蟀CDA1基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQID NO.6所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ IDNO.8所示；

蟋蟀CDA2基因：第一对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQID NO.10所示，第二对引物的上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ IDNO.12所示；

(2)模板制备：参照TaKaRa Trizol试剂盒提取总RNA，然后反转录成cDNA，从而得到PCR扩增所需模板；

(3)PCR扩增：通过巢式PCR扩增获得目的基因，将目的基因与T载体连接，转入感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取白斑到LB液体培养基中，进行菌液PCR，有目的条带的菌液送测序。

3.权利要求1所述蟋蟀CDA1和CDA2基因合成的dsRNA。

4.权利要求3所述dsRNA的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)引物设计：CDA1合成dsRNA的引物序列如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物如SEQ ID NO.14所示；

CDA2合成dsRNA的引物序列如下：

上游引物序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物如SEQ ID NO.16所示；

(2)模板制备：采用步骤(1)设计的引物，以蟋蟀基因片段为模板进行PCR扩增，切胶回收即可得到所需模板；

(3)dsRNA合成：步骤(2)得到的模板依照T7RiboMAXTMExpressRNAi System(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA。

5.权利要求3所述dsRNA在害虫防治中的应用。

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