CN116875610A - 灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2在防治灰飞虱中的应用，属于农业科学领域，利用RNA技术沉默LsOA2B2基因，对灰飞虱的产卵量及孵化率具有十分明显的抑制作用，表明该基因可以作为RNA干扰技术控制害虫的有效靶点，为今后开展利用RNA干扰技术控制害虫提供可靠依据。

Description

灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2及其应用

技术领域

本发明属于农业科学技术领域，具体涉及到灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2及其应用。

背景技术

灰飞虱是水稻上最重要害虫之一，尤其在我国黄淮和长江三角洲及周边地区发生严重。除通过刺吸韧皮部水稻汁液为害之外，灰飞虱还可作为植物病毒的传播介体，如水稻条纹病毒，引起严重的水稻病害，且植物病毒病所导致的损失远大于直接刺吸为害。生产上，对虫传植物病毒病的防治大多还是依靠杀虫剂控制传毒昆虫进而控制病害的大发生。然而，农药的大量使用不仅会造成农药残留、害虫抗药性、再猖獗等问题，还会威胁环境以及食品安全。因此，急需开发环境友好的防治策略替代传统的化学防治。

近年来，RNA干扰技术逐渐发展起来，被广泛运用于探索基因功能和害虫防治研究。灰飞虱是典型的繁殖力强、生长周期短的害虫。从理论上讲，如果利用RNAi技术将灰飞虱中重要生殖相关基因的表达进行干扰，则会降低害虫的繁殖力，从而减少种群数量，达到控制害虫的目的。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，

所述片段的克隆方法包括，

以灰飞虱cDNA第一条链为模板，设计上下游引物P1、P2，通过RT-PC R方法对其进行扩增，得到基因片段LsOA2B2；

其中，所述上下游引物P1、P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

本发明的另一目的是，克服现有技术中的不足，提供核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

所述dsRNA的合成方法包括，

以章鱼胺受体基因片段LsOA3质粒为模板，设计上下游引物P3、P4进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，测序验证得到序列如SEQ ID NO.4所示的dsRNA，依次进行回收、退火、纯化；

其中，所述上下游引物P3、P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的及其dsRNA在防止灰飞虱中的应用。

作为本发明所述灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用的一种优选方案，其中：所述dsRNA通过注射的方式作用于灰飞虱。

作为本发明所述灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用的一种优选方案，其中：所述dsRNA注射于灰飞虱能够降低灰飞虱产卵量及孵化率。

作为本发明所述灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用的一种优选方案，其中：所述dsRNA的注射浓度为5000～7000ng/μL。

作为本发明所述灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用的一种优选方案，其中：所述dsRNA作用于若虫的注射体积为23nl，作用于成虫的注射体积为36nl。

本发明有益效果：

本发明利用RNA技术沉默LsOA2B2基因，对灰飞虱的产卵量及孵化率具有明显的抑制作用，表明该基因可以作为RNA干扰技术控制害虫的有效靶点；本发明合成的LsOA2B2基因dsRNA相比之前的合成方法上加入了退火纯化的步骤，使合成的dsRNA纯度更高，且合成的浓度更高，干扰效果更好；与之前的基因干扰相比，本发明LsOA2B2基因的RNA干扰对灰飞虱产卵量及孵化率具有更加显著的抑制效果，为今后开展利用RNA干扰技术控制害虫提供可靠依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例1中基因片段的PCR扩增结果图。

图2为本发明实施例2中dsRNA的PCR扩增结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

本实施例提供了一种章鱼胺受体基因LsOA2B2片段的克隆方法，具体为：

1)以灰飞虱cDNA第一条链为模板，根据灰飞虱LsOA3基因设计上下游引物P1、P2，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，通过RT-PCR方法对其进行扩增；

其中，RT-PCR的反应体系(50μL)：25μL 2×Phanta Max Master Mix，2μLcDNA模板，2μL 10μM上游引物P1，2μL 10μM下游引物P2，19μL RNase-free ddH₂O；

反应条件为：95℃变性3min，95℃15sec，57℃15sec，72℃1min30sec，42个循环，72℃延伸5min。

2)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，如图1所示，回收目标DNA片段，通过连接反应转入感受态细胞中，加入LB培养液37℃摇床培养1h后，涂于含有Amp抗生素的LB固体培养基中，37℃培养，过夜；

通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子，用含Amp抗生素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒，通过全自动序列仪进行测序(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2。

实施例2

本实施例提供了一种灰飞虱章鱼胺受体基因LsOA2B2片段的dsRNA的合成及回收方法，具体为：

1)以灰飞虱LsOA2B2基因质粒为模板，根据已验证的灰飞虱致死基因片段序列，设计上下游引物P3、P4，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，通过PCR扩增得到灰飞虱章鱼胺受体基因LsOA2B2片段的dsRNA；

其中，PCR体系为：25μL 2×Phanta Max Master Mix，2μL cDNA模板，2μL10μM上游引物P1，2μL 10μM下游引物P2，19μL RNase-free ddH₂O；

PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸30sec，42个循环；72℃彻底延伸5min。

2)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离并在紫外灯下进行观察，如图2所示，测定其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

3)采用Vazyme公司的Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行回收纯化获得DNA template，用紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 1000)测定DNA浓度；

4)利用T7 RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)试剂盒合成dsRNA，配置反应体系为RiboMAX^TM Express T7 2×Buffer 10μL，DNA Template 1-8μL，RNase-freeddH₂O 0-7μL，Enzyme mix，T7 Express 2μL，共20μL，轻轻吹打混匀，37℃孵育4h；70℃下孵育10min，室温冷却20min，使其退火形成dsRNA；

5)纯化dsRNA并去除其中的cDNA和ssRNA；

将RNase A Solution进行1:200稀释，在上述体系中加入1μL新稀释的RNase ASolution和1μL的RQ1 RNase-Free DNase，37℃孵育30min；

加入0.1倍体积的Sodium Acetate和1倍体积的异丙醇，混匀，冰上5min后，15000×g离心10min，小心倒出上清，并用750μL的冷75％酒精进行洗涤，重复一次，室温风干2min，使用20μL RNase-Free water充分溶解沉淀；

将合成的dsRNA稀释10倍后用紫外分光光度计(Thermo Nanodrop 1000)测定RNA浓度，为了避免反复冻融、影响干扰效果，立即分装至10μL/管冻存于-80℃冰箱备用。

实施例3

本实施例将实施例2合成的dsRNA进行灰飞虱注射后产卵实验，具体为：

使用显微注射针前先用剪刀将针尖修剪至合适长度吸取dsRNA样品，样品浓度为6000ng/μL；

选择羽化48h内未交配的灰飞虱雌虫，用二氧化碳将其麻醉，使用显微注射仪将dsRNA注入雌虫前胸与中胸连接处，每头灰飞虱雌虫注射36nl，对照组注射同样体积的dsGFP，每个处理60头；

将注射后的灰飞虱雌虫接入新鲜水稻苗中饲养24h，选取存活状态较好的灰飞虱雌虫，将雌成虫单独置于含有水稻苗的试管中，配对一只同期羽化未交配的雄虫，使其自行配对产卵，每个处理重复50次；

每隔5天将配对的雌雄虫转入新的试管中继续产卵，如此重复直至雌虫死亡，若在此期间雄成虫死亡，则重新加入雄成虫；每日统计换下试管苗的孵出的若虫数，若连续5天没有若虫孵出，则在体视显微镜下解剖试管，统计未孵出的卵数；

灰飞虱的产卵量是指孵出若虫数与未孵出卵粒数之和，孵化率是指孵出若虫数占总产卵量的比例，结果可见表1和表2。

表1不同处理条件下灰飞虱雌虫产卵量对比

从表1可以看出，注射章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA对灰飞虱雌虫的产卵量具有十分显著的抑制效果。

表2不同处理条件下灰飞虱卵孵化率对比

从表2可以看出，注射章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA对灰飞虱雌虫所产卵的孵化率同样具有极显著的抑制效果。

综上，本发明利用RNA技术沉默LsOA2B2基因，对灰飞虱的产卵量及孵化率具有明显的抑制作用，表明该基因可以作为RNA干扰技术控制害虫的有效靶点；本发明合成的LsOA2B2基因dsRNA相比之前的合成方法上加入了退火纯化的步骤，使合成的dsRNA纯度更高，且合成的浓度更高，干扰效果更好；与之前的基因干扰相比，本发明LsOA2B2基因的RNA干扰对灰飞虱产卵量及孵化率具有更加显著的抑制效果，为今后开展利用RNA干扰技术控制害虫提供可靠依据。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2，其特征在于：所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2，其特征在于：所述片段的克隆方法包括，

包括，以灰飞虱cDNA第一条链为模板，设计上下游引物P1、P2，通过RT-PCR方法对其进行扩增，得到基因片段LsOA2B2；

其中，所述上下游引物P1、P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

3.灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求3所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA，其特征在于：所述的dsRNA靶向沉默灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2。

5.如权利要求3所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA的合成方法包括，

以章鱼胺受体基因片段LsOA2B2质粒为模板，设计上下游引物P3、P4进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，测序验证得到序列如SEQ ID NO.4所示的dsRNA，依次进行回收、退火、纯化；

其中，所述上下游引物P3、P4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

6.如权利要求1所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2在防治灰飞虱中的应用。

7.如权利要求6所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用，其特征在于：所述dsRNA通过注射的方式作用于灰飞虱。

8.如权利要求7所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用，其特征在于：所述dsRNA注射于灰飞虱能够降低灰飞虱产卵量及孵化率。

9.如权利要求8所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用，其特征在于：所述dsRNA的注射浓度为5000～7000ng/μL。

10.如权利要求9所述的灰飞虱章鱼胺受体基因片段LsOA2B2的dsRNA的应用，其特征在于：所述dsRNA注射体积为36nl。