CN114075297A

CN114075297A - 用于检测细胞内fxr蛋白sumo化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法

Info

Publication number: CN114075297A
Application number: CN202111365465.3A
Authority: CN
Inventors: 郝海平; 王洪; 王康; 王广基; 崔双
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114075297B

Abstract

本发明公开了用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法。该融合蛋白组包括融合蛋白YNF和融合蛋白YCS，所述融合蛋白YNF由荧光蛋白片段YN、连接肽和FXR组成，融合蛋白YCS由荧光蛋白片段YC、连接肽和SUMO1Δ组成。通过向细胞系中瞬时转染表达上述融合蛋白组的重组载体质粒组，本发明所述BiFC体系能通过可视化或酶标仪检测荧光信号，在活细胞状态下对细胞中FXR蛋白的SUMO化修饰进行表征，从而实现对FXR蛋白SUMO化修饰的方便快速的检测，同时也为FXR蛋白SUMO化修饰抑制的快速筛选提供了一种可行性方法。

Description

用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术，特别涉及用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法。

背景技术

法尼醇X受体(FXR，NR1H4)是核受体超家族的一员，胆汁酸是其在生物体内的内源性配体。大量研究表明它在调节胆汁酸代谢，脂质代谢和糖代谢中发挥重要功能，同时它与能量平衡，炎症与免疫，肝纤维化以及肝脏再生密切相关。FXR发挥其生理功能的一个重要途径即是受配体激动，进入细胞核调控某些基因的转录活性，产生转录激活或转录抑制作用进而调控一系列信号通路。

FXR的生理学功能受多个蛋白质翻译后修饰的调控，研究表明小泛素样修饰因子(SUMO)能够对FXR进行翻译后修饰，其中SUMO1与FXR结合后会抑制FXR与靶基因启动子的结合，从而影响FXR的转录调控活性，使其对下游靶基因的激活作用下降。另有研究表明，在肝纤维化动物模型中，肝星状细胞(HSC)中FXR的SUMO化水平显著上升，单独给予FXR激动剂进行治疗无显著效果，当连用SUMO化抑制剂后，FXR激动剂治疗肝脏纤维化的效果显著。由此可见，快速有效的筛选鉴定FXR蛋白SUMO化抑制剂意义重大。

目前对于SUMO化抑制剂的筛选鉴定方法主要是在体外蛋白反应体系以及体内过表达SUMO 蛋白，然后通过Westemblot进行鉴定，无法进行快速大量的筛选工作。

双分子荧光互补技术(BiFC)是一种能够快捷且直观判断两种目的蛋白相互作用的技术，其原理是将荧光蛋白分割成两段无荧光片段N-fragment和C-fragment分别与两个目的蛋白形成融合蛋白，当两个目的蛋白发生相互作用时，在空间位置上将两个荧光蛋白片段相互靠近，进而融合形成一个完整的荧光蛋白构象，此时在相应激发光的照射下则能够产生荧光。不发生相互作用的两个蛋白不会靠的很近，使得两个荧光蛋白片段在空间上相离，故不会融合在一起。目前已有报道可用于 BiFC检测的荧光蛋白有YFP、Venus、Citrine等等，分割位点为氨基酸序列155或173处。另外， BiFC体系具有广泛的适用性，在哺乳动物细胞、植物细胞以及线虫中均能够较好的用于检测蛋白相互作用。相比于一些传统的检测蛋白质相互作用的技术，如免疫共沉淀技术(Co-IP)、GST融合蛋白pull-down技术、酵母双杂交系统(Y2H)等，BiFC体系能进行活细胞检测且检测方法简便快捷，适合用于开发高通量筛选体系。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、DNA分子组。

本发明的另一目的是提供一种用BiFC体系检测影响细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的物质的方法。

技术方案：所述用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组，由融合蛋白YNF 和融合蛋白YCS组成；其中融合蛋白YNF由FXR和位于其N末端的荧光蛋白片段YN组成；融合蛋白YCS由SUMO1Δ和位于其N末端的荧光蛋白片段YC组成；上述SUMO1Δ是SUMO1蛋白的一个变异体，即在完整的SUMOl蛋白的C末端截去4个氨基酸得到1-97位氨基酸的活化蛋白分子 SUMO1Δ。

进一步地，上述融合蛋白组中，所述融合蛋白YNF从N末端起依次为荧光蛋白片段YN、连接肽、FXR氨基酸序列；所述融合蛋白YCS从N末端起依次为荧光蛋白片段YC、连接肽、SUMO1Δ 氨基酸序列。上述融合蛋白组中，所述荧光蛋白片段YN、YC均来自于同一荧光蛋白；其中荧光蛋白片段YN由黄色荧光蛋白YFP从N末端起1-155位氨基酸所组成；荧光蛋白片段YC由黄色荧光蛋白EYFP从N末端起156-239位氨基酸所组成。上述各蛋白，FXR蛋白对应的氨基酸序列具体为序列表中序列2(序列1为其对应的核酸序列))；SUMO1Δ蛋白对应的氨基酸序列具体为序列表中序列4；EYFP蛋白对应的氨基酸序列具体为序列表中序列6；连接肽蛋白对应的氨基酸序列具体为序列表中序列8；融合蛋白YNF对应的氨基酸序列具体为序列表中序列10；融合蛋白YCS对应的氨基酸序列具体为序列表中序列16。

一种融合蛋白的DNA分子组。由融合蛋白YNF和融合蛋白YCS对应的核酸编码序列组成；具体的，融合蛋白YNF对应的DNA分子核苷酸序列为序列表中的序列9，融合蛋白YCS对应的DNA 分子核苷酸序列为序列表中的序列15。

一种相应DNA分子的重组载体质粒组。所述重组载体质粒组，由分别表达融合蛋白YNF和融合蛋白YCS的重组质粒组成；所述表达融合蛋白YNF的重组质粒具体为将融合蛋白YNF对应的 DNA分子核苷酸序列插入载体质粒所组成；所述表达融合蛋白YCS的重组质粒具体为将融合蛋白 YCS对应的DNA分子核苷酸序列插入载体质粒所组成；所述载体质粒具体为pcDNA3.1(+)。

一种用于检测细胞中FXR蛋白发生SUMO化修饰的方法，将上述表达融合蛋白YNF的重组载体质粒和表达融合蛋白YCS的重组载体质粒经瞬时转染，导入到宿主细胞中，经实验处理并培养后检测细胞中黄色荧光的强度，若无明显荧光产生，则未发生SUMO化修饰，若能观察到明显的黄色荧光，则表示该细胞中FXR发生了SUMO化修饰，从而实现可视化检测FXR是否发生了SUMO化修饰并且能对其进行亚细胞定位。

一种使用BiFC体系评价某物质影响FXR蛋白SUMO化修饰程度的物质的方法，为向目标细胞中转染上述重组载体质粒组，得到表达融合蛋白组的细胞，将待检测物质作用于细胞，最后检测细胞中荧光信号的强度；若处理后的细胞相比于对照组细胞荧光信号强度下降，则表示该待测物质能下调FXR蛋白的SUMO化修饰；若处理后的细胞相比于对照组细胞荧光信号强度上升，则表示该待测物质能上调FXR蛋白的SUMO化修饰；上述待测物质可为小分子化合物或生物大分子如蛋白、核酸等；上述物质处理细胞的方式，若为小分子化合物，则为将化合物加入到细胞培养基中进行培养；若为蛋白或核酸，则为将含有该蛋白对应编码基因的载体质粒或核酸通过转染导入细胞中。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：本发明所构建的该BiFC体系能直观快速的反应FXR蛋白是否发生SUMO化修饰，并且能够用于FXR蛋白SUMO化修饰抑制抑制剂的快速评价体系，具体的为将BiFC体系载体质粒转染进入细胞中，可直接进行活细胞直接检测。相比于传统的检测FXR蛋白SUMO化修饰强度的方法如Co-IP、GST融合蛋白pull-down技术等，本发明提供的方法不用对细胞进行后处理提取蛋白等操作，在完成处理培养之后可直接进行活细胞成像或经酶标仪进行检测，快速的得到荧光信号数据，直观反应FXR蛋白的SUMO化修饰强度，简便快捷。同时，在荧光成像的基础上，还能对FXR蛋白的SUMO化修饰在时间和空间两个维度上同时进行观察检测，为对FXR蛋白的SUMO化修饰的研究提供了一种更加简洁直观的方法。

附图说明

图1为FXR-SUMO1 BiFC体系相互作用的原理示意图，A、B分别代表SUMO1和FXR并与相应得荧光蛋白片段连接；

图2为两荧光片段与FXR和SUMO1的不同组合连接方式以及重组质粒构造，YNF代表YFP 的N端片段与FXR相连，YCF代表YFP的C端片段与FXR相连，YCS代表YFP的C端片段与SUMO1相连，YNS代表YFP的N端片段与SUMO1相连；

图3为筛选合适的目的蛋白与荧光蛋白片段组合方式的荧光图片及数据结果，A图表示只有 YNF+YCS组合具有明显荧光，B图表示单一荧光片段几乎不产生荧光，C图表示YNF+YCS组合融合蛋白组合荧光强度显著强于其它组合；

图4为YNF+YCS组合融合蛋白的重组质粒组合在HEK293T细胞中以不同比例或转染量进行瞬时转染的荧光强度变化；

图5为以Ginkgolicacid为SUMO化抑制剂阳性化合物处理转染了该BiFC体系的HEK293T细胞，分别通过荧光显微镜和酶标仪检测荧光强度的变化；

图6为通过多个浓度处理细胞得出Ginkgolicacid在该BiFC体系中抑制FXR蛋白SUMO化的 IC₅₀值。

具体实施方式

1、融合蛋白组合物以及尤其构建的BiFC体系

FXR的GenBank号及提交时间为NP_001193908，2021.8.27

SUMO1的GenBank号及提交时间为NM_003352.8，2021.8.31

FXR-SUMO1 BiFC体系相互作用的原理如图1所示，A、B别代表SUMO1和FXR 并与相应得荧光蛋白片段连接，靠近后融合形成完整且构象正常的荧光蛋白。

1.1设计不同融合蛋白组合

查阅文献，选取EYFP作为该体系的荧光蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列6所示，对应的编码基因脱氧核苷酸序列如序列表中序列5所示。一般的，将 EYFP从氨基酸链编号155处断开形成两段蛋白，片段YN(黄色荧光蛋白N端起1-155个氨基酸)，片段YC(黄色荧光蛋白N端起156-240个氨基酸)，使用这两个片段分别与目的蛋白一起克隆构建融合蛋白。

根据FXR和SUMO1蛋白的空间结构和作用方式，FXR发生SUMO化的位点为122、275两个位点，选择将荧光蛋白连接到FXR蛋白的N端。SUMO1在发生修饰前会经历一部活化的步骤，在其C端的4个氨基酸别剪切掉，暴露GG 碳末端与目的蛋白的赖氨酸相连接而形成修饰，故选择将荧光蛋白连接在 SUMO1的N端。并且，根据上述SUMO1作用机理，将构建的重组SUMO1蛋白C末端的HSTV4个氨基酸去除，从而得到一个不需经历活化过程就能直接进行修饰的SUMO1变异体SUMO1Δ，其对应核苷酸序列如序列表中序列2所示，对应氨基酸序列如序列表中序列3所示。

根据上述条件，共可得到4个融合蛋白YNF、YNS、YCF、YCS(其中YN、 YC代表相应的荧光蛋白片段，如上所述，F表示FXR，S表示SUMO1Δ，具体如图2A所示)和两种组合YNF+YCS、YNS+YCF。

组合1：YNF+YCS，由融合蛋白YNF和YCS组成。

融合蛋白YNF的氨基酸序列如序列表中序列10所示，其中从N端起1-155位氨基酸为YN的氨基酸序列，156-170位氨基酸位连接肽的氨基酸序列，171-646位氨基酸为FXR的氨基酸序列。其对应的脱氧核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中从5‘端起1-465位核酸为YN编码区，466-510为核酸为连接肽编码区， 511-1941位核酸为FXR编码区。

融合蛋白YCS的氨基酸序列如序列表中序列16所示，其中从N端起1-84位氨基酸为YC的氨基酸序列，85-99位氨基酸为连接肽的氨基酸序列，100-196位氨基酸为SUMO1Δ的氨基酸序列。其对应的脱氧核苷酸序列如序列表中序列15所示，其中从5‘端起1-252位核酸为YC编码区，253-297位核酸为连接肽编码区， 298-588位核酸为SUMO1Δ的编码区。

组合2：YNS+YCF，由融合蛋白YNS和YCF组成。

融合蛋白YNS的氨基酸序列如序列表中序列12所示，其中从N端起1-155位氨基酸为YN的氨基酸序列，156-170位氨基酸位连接肽的氨基酸序列，171-267位氨基酸为SUMO1Δ的氨基酸序列。其对应的脱氧核苷酸序列如序列表中序列11 所示，其中从5‘端起1-465位核酸为YN编码区，466-510为核酸为连接肽编码区，511-801位氨基酸为SUMO1Δ的氨基酸序列。

融合蛋白YCF的氨基酸序列如序列表中序列14所示，其中从N端起1-84位氨基酸为YC的氨基酸序列，85-99位氨基酸为连接肽的氨基酸序列，100-575位氨基酸为FXR的氨基酸序列。其对应的脱氧核苷酸序列如序列表中序列13所示，其中从5‘端起1-252位核酸为YC编码区，253-297位核酸为连接肽编码区， 298-1728位核酸为FXR编码区。

1.2将相应融合蛋白的基因接入质粒载体

上述融合蛋白对应的编码基因通过PCR扩增，然后经生物学技术插入到 pcDNA3.1(+)质粒相应的酶切位点中，各融合蛋白对应的重组载体组合物均可在真核细胞中表达出目的蛋白。

各重组载体具体如下：

重组载体一：pcDNA3.1(+)-YNF，对应将序列表中序列9所示的融合蛋白YNF 的编码基因序列插入到pcDNA3.1(+)载体的Nhe I和Not I酶切位点间，从而得到表达YNF融合蛋白的重组载体。

重组载体二：pcDNA3.1(+)-YCS，对应将序列表中序列15所示的融合蛋白YCS 的编码基因序列插入到pcDNA3.1(+)载体的Nhe I和Not I酶切位点间，从而得到表达YCS融合蛋白的重组载体。

重组载体三：pcDNA3.1(+)-YNS，对应将序列表中序列11所示的融合蛋白YNS 的编码基因序列插入到pcDNA3.1(+)载体的Nhe I和Not I酶切位点间，从而得到表达YNS融合蛋白的重组载体。

重组载体四：pcDNA3.1(+)-YCF，对应将序列表中序列13所示的融合蛋白YCF 的编码基因序列插入到pcDNA3.1(+)载体的Nhe I和Not I酶切位点间，从而得到表达YCF融合蛋白的重组载体。

重组载体一和二，三和四分别组成两组载体组合物。

上述重组质粒的基本构造关系如图2B所示。

1.3筛选合适的BiFC体系融合蛋白组合

如上所述，本例中不同的融合蛋白有两种组合，根据文献报道，这种不同的荧光蛋白片段与不同的目的蛋白相连接对重新形成完整的荧光蛋白有一定的影响，甚至不能形成完整的荧光的蛋白。使用HEK293T细胞作为工具细胞，向该细胞中瞬时转染上述质粒。

Ctrl：转染空载质粒pcDNA3.1(+)

YCF+YNF：转染pcDNA3.1(+)-YNF和pcDNA3.1(+)-YCF重组质粒

YCF+YNS：转染pcDNA3.1(+)-YCF和pcDNA3.1(+)-YNS重组质粒

YNF+YCS：转染pcDNA3.1(+)-YNF和pcDNA3.1(+)-YCS重组质粒

细胞在细胞板中培养24h，融合度达到约60-70％，使用Lipofectamine 3000 脂质体转染试剂进行瞬时转染，其中lipo3000∶DNA＝2∶1，于无血清、双抗培养基中进行，6h后将培养基更换成含10％FBS的培养基，约30h后检测荧光信号。使用激光共聚焦显微镜观察荧光，使用488nm激光源作为激发光，检测波长范围为513-800nm，结果如图3A所示。其中YCF+YNS组无明显荧光，而YNF+YCS 能观察到明显荧光，说明只有当黄色荧光蛋白的YN片段与FXR蛋白连接，YC 片段与SUMO1蛋白连接时才会在二者互作时形成完整的荧光蛋白产生荧光。 YCF+YNF组无明显荧光产生，说明在两个目的蛋白不发生相互作用时，荧光蛋白的两个片段不会融合成完整的荧光蛋白，同时也表明该BiFC体系的背景信号很低。

完整的荧光蛋白能受相应激发光的激发发射荧光，而将荧光蛋白如前述分成两部分之后，两单独的部分不具有荧光蛋白的性质，在使用相应波长的激光激发时不会产生荧光。在本例中使用YCS、YNS两个融合蛋白分别代表荧光蛋白的两个部分用以表征但体荧光蛋白的一部分不会产生明显荧光，使用HEK293T细胞作为工具细胞，向该细胞中分别瞬时转染前述包含荧光蛋白单体的融合蛋白质粒pcDNA3.1(+)-YNF和pcDNA3.1(+)-YCS，并以前述已经验证能够形成完整荧光蛋白的质粒组合pcDNA3.1(+)-YNF和pcDNA3.1(+)-YCS作为阳性参照。

Ctrl：转染空载质粒pcDNA3.1(+)

YNF：转染pcDNA3.1(+)-YNF重组质粒

YCS：转染pcDNA3.1(+)-YCS重组质粒

YNF+YCS：转染pcDNA3.1(+)-YNF和pcDNA3.1(+)-YCS重组质粒

细胞在细胞板中培养24h，融合度达到约60-70％，使用Lipofectamine 3000 脂质体转染试剂进行瞬时转染，其中lipo3000∶DNA＝2∶1，于无血清、双抗培养基中进行，6h后将培养基更换成含10％FBS的培养基，约30h后检测荧光信号。使用激光共聚焦显微镜观察荧光，使用488nm激光源作为激发光，检测波长范围为51 3-800nm，如图3B所示。

结果显示，YNF和YCS组均无明显荧光，说明单体荧光蛋白片段无荧光产生，同时结合前面YCF+YNF组的结果，进一步表征了本BiFC体系具有很低的背景信号。

对与上述各个分组荧光信号，使用多功能酶标仪检测荧光信号的强度 (512nm激发，538nm发射)，如图3C所示，结果显示与前述结果相符。

综合前述结果，可以看出除YNF+YCS组外，其它组合或组别只有少量的本底信号值，只有YNF+YCS组在相应激发光下才具有明显荧光，说明YNF+YCS 时该BiFC体系中的最优融合蛋白组合。

1.4优化相应融合蛋白组对应质粒在细胞中的转染量和转染比例

为使该BiFC体系在蛋白互作抑制剂筛选中具有较好的应用性，应使其在发生蛋白互作时荧光强度尽可能更强。对于一般的BiFC体系，在检测之前都需要进行一步低温融合的步骤，4℃放置约2h，荧光蛋白的两个部分能更好的融合在一起形成完整的荧光蛋白。在该体系中，发现经低温融合后荧光强度确实有显著提升(结果未展出)。

除了上述因素之外，融合蛋白重组质粒组的转染量以及两个质粒的转染比例，还有转染之后的表达时间等都对最终荧光强度有显著影响。质粒转染后的表达时间主要受限于后续的实验操作，可变性很小，故在此不做优化。后续工作主要针对融合蛋白重组质粒组的转染量以及两个质粒的转染比例做进一步优化。

细胞在细胞板中培养24h，融合度达到约60-70％，使用Lipofectamine 3000 脂质体转染试剂进行瞬时转染，其中lipo3000∶DNA＝2∶1，于无血清、双抗培养基中进行，6h后将培养基更换成含10％FBS的培养基，约30h后检测荧光信号。结果显示，两个融合蛋白重组质粒YNF∶YCS＝1∶1时，二者形成融合蛋白能产生最强荧光，如图4A所示，这与预期结果相符。

以6孔细胞培养板为例，两个融合蛋白重组质粒比例为1∶1，按每孔总转染质粒量计算。结果显示，当质粒总量为3μg时荧光信号最强，如图4B所示。

2、融合蛋白组合物YNF+YCS在FXR蛋白SUMO化抑制剂筛选中的应用

下列示例中，通过一些小分子化合物处理已经转染过BiFC体系质粒的细胞，由此检测该小分子对FXR蛋白SUMO化的影响。

首先，使用了已报道的SUMO化抑制剂Ginkgolic Acid对细胞进行处理。将HEK293T细胞接种于24孔板中，待细胞生长到融合度约60-70％时，使用 Lipofectamine3000脂质体转染试剂进行瞬时转染，向细胞中以1∶1的比例转入 pcDNA3.1(+)-YNF和转染pcDNA3.1(+)-YCS重组质粒，于无血清、双抗培养基中进行，6h后将培养基更换成含10％FBS的培养基。在转染后继续培养约24h，然后给予不同浓度化合物进行刺激，于无血清培养基中进行，其中对照组加入等量的 DMSO(0μM浓度组)，化合物作用约12h后经荧光显微镜(红光激发)和酶标仪(512nm 激发，538nm发射)检测黄色荧光信号，如图5所示。结果显示从1μM到40μM的 4个浓度梯度上Ginkgolic Acid对FXR蛋白SUMO化的抑制作用具有较好的剂量依赖性的。

接着，对于化合物GinkgolicAcid在5-30μM设置了5、10、15、20、25、30μM 共六个浓度，细胞培养及化合物处理方法同上所述，使用酶标仪检测荧光强度。如图6A所示，结果显示该化合物的抑制作用具有良好的剂量依赖性，根据此组数据，计算了该化合物在此BiFC体系中抑制FXR蛋白SUMO化的IC₅₀值，如图6B所示， IC₅₀＝22.72μM与其它方法测得的IC₅₀值基本相同。

为了进一步验证该BiFC体系的有效性，还使用了一个实验室通过其他方法验证能显著有效抑制FXR蛋白SUMO化的化合物WSU008来处理转染过BiFC体系质粒的细胞，细胞操作及化合物处理如上所述。本实验室通过其它方法验证化合物WSU008能显著有效抑制FXR蛋白SUMO化，简单来说是向HEK293T细胞中转染重组了SUMO1 cDNA的质粒过表达SUMO1蛋白，然后通过Epigentek公司的In Vivo Protein SUMOylating Assay Ultra Kit检测细胞中FXR蛋白的SUMO化水平。结果显示在该BiFC 体系中，化合物WSU008也能显著的抑制FXR蛋白SUMO化，进一步说明了本文所述的BiFC体系在FXR蛋白SUMO化抑制剂筛选中的真实有效性。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组、重组载体组、及检测方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggatcaa aaatgaatct cattgaacat tcccatttac ctaccacaga tgaattttct 60

ttttctgaaa atttatttgg tgttttaaca gaacaagtgg caggtcctct gggacagaac 120

ctggaagtgg aaccatactc gcaatacagc aatgttcagt ttccccaagt tcaaccacag 180

atttcctcgt catcctatta ttccaacctg ggtttctacc cccagcagcc tgaagagtgg 240

tactctcctg gaatatatga actcaggcgt atgccagctg agactctcta ccagggagaa 300

actgaggtag cagagatgcc tgtaacaaag aagccccgca tgggcgcgtc agcagggagg 360

atcaaagggg atgagctgtg tgttgtttgt ggagacagag cctctggata ccactataat 420

gcactgacct gtgaggggtg taaaggtttc ttcaggagaa gcattaccaa aaacgctgtg 480

tacaagtgta aaaacggggg caactgtgtg atggatatgt acatgcgaag aaagtgtcaa 540

gagtgtcgac taaggaaatg caaagagatg ggaatgttgg ctgaatgtat gtatacaggc 600

ttgttaactg aaattcagtg taaatctaag cgactgagaa aaaatgtgaa gcagcatgca 660

gatcagaccg tgaatgaaga cagtgaaggt cgtgacttgc gacaagtgac ctcgacaaca 720

aagtcatgca gggagaaaac tgaactcacc ccagatcaac agactcttct acattttatt 780

atggattcat ataacaaaca gaggatgcct caggaaataa caaataaaat tttaaaagaa 840

gaattcagtg cagaagaaaa ttttctcatt ttgacggaaa tggcaaccaa tcatgtacag 900

gttcttgtag aattcacaaa aaagctacca ggatttcaga ctttggacca tgaagaccag 960

attgctttgc tgaaagggtc tgcggttgaa gctatgttcc ttcgttcagc tgagattttc 1020

aataagaaac ttccgtctgg gcattctgac ctattggaag aaagaattcg aaatagtggt 1080

atctctgatg aatatataac acctatgttt agtttttata aaagtattgg ggaactgaaa 1140

atgactcaag aggagtatgc tctgcttaca gcaattgtta tcctgtctcc agatagacaa 1200

tacataaagg atagagaggc agtagagaag cttcaggagc cacttcttga tgtgctacaa 1260

aagttgtgta agattcacca gcctgaaaat cctcaacact ttgcctgtct cctgggtcgc 1320

ctgactgaat tacggacatt caatcatcac cacgctgaga tgctgatgtc atggagagta 1380

aacgaccaca agtttacccc acttctctgt gaaatctggg acgtgcagtg a 1431

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Ser Lys Met Asn Leu Ile Glu His Ser His Leu Pro Thr Thr

1 5 10 15

Asp Glu Phe Ser Phe Ser Glu Asn Leu Phe Gly Val Leu Thr Glu Gln

20 25 30

Val Ala Gly Pro Leu Gly Gln Asn Leu Glu Val Glu Pro Tyr Ser Gln

35 40 45

Tyr Ser Asn Val Gln Phe Pro Gln Val Gln Pro Gln Ile Ser Ser Ser

50 55 60

Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Gly Phe Tyr Pro Gln Gln Pro Glu Glu Trp

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Gly Ile Tyr Glu Leu Arg Arg Met Pro Ala Glu Thr Leu

85 90 95

Tyr Gln Gly Glu Thr Glu Val Ala Glu Met Pro Val Thr Lys Lys Pro

100 105 110

Arg Met Gly Ala Ser Ala Gly Arg Ile Lys Gly Asp Glu Leu Cys Val

115 120 125

Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys

130 135 140

Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Ile Thr Lys Asn Ala Val

145 150 155 160

Tyr Lys Cys Lys Asn Gly Gly Asn Cys Val Met Asp Met Tyr Met Arg

165 170 175

Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Arg Lys Cys Lys Glu Met Gly Met

180 185 190

Leu Ala Glu Cys Met Tyr Thr Gly Leu Leu Thr Glu Ile Gln Cys Lys

195 200 205

Ser Lys Arg Leu Arg Lys Asn Val Lys Gln His Ala Asp Gln Thr Val

210 215 220

Asn Glu Asp Ser Glu Gly Arg Asp Leu Arg Gln Val Thr Ser Thr Thr

225 230 235 240

Lys Ser Cys Arg Glu Lys Thr Glu Leu Thr Pro Asp Gln Gln Thr Leu

245 250 255

Leu His Phe Ile Met Asp Ser Tyr Asn Lys Gln Arg Met Pro Gln Glu

260 265 270

Ile Thr Asn Lys Ile Leu Lys Glu Glu Phe Ser Ala Glu Glu Asn Phe

275 280 285

Leu Ile Leu Thr Glu Met Ala Thr Asn His Val Gln Val Leu Val Glu

290 295 300

Phe Thr Lys Lys Leu Pro Gly Phe Gln Thr Leu Asp His Glu Asp Gln

305 310 315 320

Ile Ala Leu Leu Lys Gly Ser Ala Val Glu Ala Met Phe Leu Arg Ser

325 330 335

Ala Glu Ile Phe Asn Lys Lys Leu Pro Ser Gly His Ser Asp Leu Leu

340 345 350

Glu Glu Arg Ile Arg Asn Ser Gly Ile Ser Asp Glu Tyr Ile Thr Pro

355 360 365

Met Phe Ser Phe Tyr Lys Ser Ile Gly Glu Leu Lys Met Thr Gln Glu

370 375 380

Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Leu Ser Pro Asp Arg Gln

385 390 395 400

Tyr Ile Lys Asp Arg Glu Ala Val Glu Lys Leu Gln Glu Pro Leu Leu

405 410 415

Asp Val Leu Gln Lys Leu Cys Lys Ile His Gln Pro Glu Asn Pro Gln

420 425 430

His Phe Ala Cys Leu Leu Gly Arg Leu Thr Glu Leu Arg Thr Phe Asn

435 440 445

His His His Ala Glu Met Leu Met Ser Trp Arg Val Asn Asp His Lys

450 455 460

Phe Thr Pro Leu Leu Cys Glu Ile Trp Asp Val Gln

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Asp Gln Glu Ala Lys Pro Ser Thr Glu Asp Leu Gly Asp Lys

1 5 10 15

Lys Glu Gly Glu Tyr Ile Lys Leu Lys Val Ile Gly Gln Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Ile His Phe Lys Val Lys Met Thr Thr His Leu Lys Lys Leu Lys

35 40 45

Glu Ser Tyr Cys Gln Arg Gln Gly Val Pro Met Asn Ser Leu Arg Phe

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Leu Phe Glu Gly Gln Arg Ile Ala Asp Asn His Thr Pro Lys Glu Leu

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Gly Met Glu Glu Glu Asp Val Ile Glu Val Tyr Gln Glu Gln Thr Gly

85 90 95

Gly

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

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ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

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gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

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50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

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Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

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Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

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Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

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Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

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Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu

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Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

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<212> DNA

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<400> 7

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccggcgg tggaggctca 480

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tcccatttac ctaccacaga tgaattttct ttttctgaaa atttatttgg tgttttaaca 600

gaacaagtgg caggtcctct gggacagaac ctggaagtgg aaccatactc gcaatacagc 660

aatgttcagt ttccccaagt tcaaccacag atttcctcgt catcctatta ttccaacctg 720

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

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Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

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50 55 60

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65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

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Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gly Ser Lys Met Asn

165 170 175

Leu Ile Glu His Ser His Leu Pro Thr Thr Asp Glu Phe Ser Phe Ser

180 185 190

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Gly Asn Cys Val Met Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys

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Arg Leu Arg Lys Cys Lys Glu Met Gly Met Leu Ala Glu Cys Met Tyr

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Thr Gly Leu Leu Thr Glu Ile Gln Cys Lys Ser Lys Arg Leu Arg Lys

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Asn Val Lys Gln His Ala Asp Gln Thr Val Asn Glu Asp Ser Glu Gly

385 390 395 400

Arg Asp Leu Arg Gln Val Thr Ser Thr Thr Lys Ser Cys Arg Glu Lys

405 410 415

Thr Glu Leu Thr Pro Asp Gln Gln Thr Leu Leu His Phe Ile Met Asp

420 425 430

Ser Tyr Asn Lys Gln Arg Met Pro Gln Glu Ile Thr Asn Lys Ile Leu

435 440 445

Lys Glu Glu Phe Ser Ala Glu Glu Asn Phe Leu Ile Leu Thr Glu Met

450 455 460

Ala Thr Asn His Val Gln Val Leu Val Glu Phe Thr Lys Lys Leu Pro

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Gly Phe Gln Thr Leu Asp His Glu Asp Gln Ile Ala Leu Leu Lys Gly

485 490 495

Ser Ala Val Glu Ala Met Phe Leu Arg Ser Ala Glu Ile Phe Asn Lys

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Ser Ile Gly Glu Leu Lys Met Thr Gln Glu Glu Tyr Ala Leu Leu Thr

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Ala Ile Val Ile Leu Ser Pro Asp Arg Gln Tyr Ile Lys Asp Arg Glu

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240

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ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccggcgg tggaggctca 480

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<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

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Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asp Gln Glu Ala

165 170 175

Lys Pro Ser Thr Glu Asp Leu Gly Asp Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Ile

180 185 190

Lys Leu Lys Val Ile Gly Gln Asp Ser Ser Glu Ile His Phe Lys Val

195 200 205

Lys Met Thr Thr His Leu Lys Lys Leu Lys Glu Ser Tyr Cys Gln Arg

210 215 220

Gln Gly Val Pro Met Asn Ser Leu Arg Phe Leu Phe Glu Gly Gln Arg

225 230 235 240

Ile Ala Asp Asn His Thr Pro Lys Glu Leu Gly Met Glu Glu Glu Asp

245 250 255

Val Ile Glu Val Tyr Gln Glu Gln Thr Gly Gly

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<210> 13

<211> 1728

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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tcctcgtcat cctattattc caacctgggt ttctaccccc agcagcctga agagtggtac 540

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ctgacctgtg aggggtgtaa aggtttcttc aggagaagca ttaccaaaaa cgctgtgtac 780

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tcatgcaggg agaaaactga actcacccca gatcaacaga ctcttctaca ttttattatg 1080

gattcatata acaaacagag gatgcctcag gaaataacaa ataaaatttt aaaagaagaa 1140

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aagaaacttc cgtctgggca ttctgaccta ttggaagaaa gaattcgaaa tagtggtatc 1380

tctgatgaat atataacacc tatgtttagt ttttataaaa gtattgggga actgaaaatg 1440

actcaagagg agtatgctct gcttacagca attgttatcc tgtctccaga tagacaatac 1500

ataaaggata gagaggcagt agagaagctt caggagccac ttcttgatgt gctacaaaag 1560

ttgtgtaaga ttcaccagcc tgaaaatcct caacactttg cctgtctcct gggtcgcctg 1620

actgaattac ggacattcaa tcatcaccac gctgagatgc tgatgtcatg gagagtaaac 1680

gaccacaagt ttaccccact tctctgtgaa atctgggacg tgcagtga 1728

<210> 14

<211> 575

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn

1 5 10 15

Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr

20 25 30

Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser

35 40 45

Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met

50 55 60

Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp

65 70 75 80

Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Ser Met Gly Ser Lys Met Asn Leu Ile Glu His Ser His Leu

100 105 110

Pro Thr Thr Asp Glu Phe Ser Phe Ser Glu Asn Leu Phe Gly Val Leu

115 120 125

Thr Glu Gln Val Ala Gly Pro Leu Gly Gln Asn Leu Glu Val Glu Pro

130 135 140

Tyr Ser Gln Tyr Ser Asn Val Gln Phe Pro Gln Val Gln Pro Gln Ile

145 150 155 160

Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Gly Phe Tyr Pro Gln Gln Pro

165 170 175

Glu Glu Trp Tyr Ser Pro Gly Ile Tyr Glu Leu Arg Arg Met Pro Ala

180 185 190

Glu Thr Leu Tyr Gln Gly Glu Thr Glu Val Ala Glu Met Pro Val Thr

195 200 205

Lys Lys Pro Arg Met Gly Ala Ser Ala Gly Arg Ile Lys Gly Asp Glu

210 215 220

Leu Cys Val Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn Ala

225 230 235 240

Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Ile Thr Lys

245 250 255

Asn Ala Val Tyr Lys Cys Lys Asn Gly Gly Asn Cys Val Met Asp Met

260 265 270

Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Arg Lys Cys Lys Glu

275 280 285

Met Gly Met Leu Ala Glu Cys Met Tyr Thr Gly Leu Leu Thr Glu Ile

290 295 300

Gln Cys Lys Ser Lys Arg Leu Arg Lys Asn Val Lys Gln His Ala Asp

305 310 315 320

Gln Thr Val Asn Glu Asp Ser Glu Gly Arg Asp Leu Arg Gln Val Thr

325 330 335

Ser Thr Thr Lys Ser Cys Arg Glu Lys Thr Glu Leu Thr Pro Asp Gln

340 345 350

Gln Thr Leu Leu His Phe Ile Met Asp Ser Tyr Asn Lys Gln Arg Met

355 360 365

Pro Gln Glu Ile Thr Asn Lys Ile Leu Lys Glu Glu Phe Ser Ala Glu

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Glu Asn Phe Leu Ile Leu Thr Glu Met Ala Thr Asn His Val Gln Val

385 390 395 400

Leu Val Glu Phe Thr Lys Lys Leu Pro Gly Phe Gln Thr Leu Asp His

405 410 415

Glu Asp Gln Ile Ala Leu Leu Lys Gly Ser Ala Val Glu Ala Met Phe

420 425 430

Leu Arg Ser Ala Glu Ile Phe Asn Lys Lys Leu Pro Ser Gly His Ser

435 440 445

Asp Leu Leu Glu Glu Arg Ile Arg Asn Ser Gly Ile Ser Asp Glu Tyr

450 455 460

Ile Thr Pro Met Phe Ser Phe Tyr Lys Ser Ile Gly Glu Leu Lys Met

465 470 475 480

Thr Gln Glu Glu Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Leu Ser Pro

485 490 495

Asp Arg Gln Tyr Ile Lys Asp Arg Glu Ala Val Glu Lys Leu Gln Glu

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Asp His Lys Phe Thr Pro Leu Leu Cys Glu Ile Trp Asp Val Gln

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<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 60

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 120

ctgcccgaca accactacct gagctaccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 180

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 240

gagctgtaca agggcggtgg aggctcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggtagtatg 300

tctgaccagg aggcaaaacc ttcaactgag gacttggggg ataagaagga aggtgaatat 360

attaaactca aagtcattgg acaggatagc agtgagattc acttcaaagt gaaaatgaca 420

acacatctca agaaactcaa agaatcatac tgtcaaagac agggtgttcc aatgaattca 480

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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1 5 10 15

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20 25 30

Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser

35 40 45

Tyr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met

50 55 60

Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp

65 70 75 80

Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

85 90 95

Gly Gly Ser Met Ser Asp Gln Glu Ala Lys Pro Ser Thr Glu Asp Leu

100 105 110

Gly Asp Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Ile Lys Leu Lys Val Ile Gly Gln

115 120 125

Asp Ser Ser Glu Ile His Phe Lys Val Lys Met Thr Thr His Leu Lys

130 135 140

Lys Leu Lys Glu Ser Tyr Cys Gln Arg Gln Gly Val Pro Met Asn Ser

145 150 155 160

Leu Arg Phe Leu Phe Glu Gly Gln Arg Ile Ala Asp Asn His Thr Pro

165 170 175

Lys Glu Leu Gly Met Glu Glu Glu Asp Val Ile Glu Val Tyr Gln Glu

180 185 190

Gln Thr Gly Gly

195

Claims

1.一种用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组，其特征在于：由融合蛋白YNF和融合蛋白YCS组成，所述融合蛋白YNF对应的氨基酸序列具体为序列表中序列10；所述融合蛋白YCS对应的氨基酸序列具体为序列表中序列16；所述融合蛋白YNF由FXR和位于其N末端的荧光蛋白片段YN组成；所述融合蛋白YCS由SUMO1Δ和位于其N末端的荧光蛋白片段YC组成；所述SUMOlΔ是1-97位氨基酸的活化蛋白分子。

2.根据权利要求1所述的用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组，其特征在于：所述SUMO1Δ是在完整的SUMO1蛋白的C末端截去4个氨基酸得到1-97位氨基酸的活化蛋白分子SUMO1Δ。

3.根据权利要求1所述的用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组，其特征在于：所述融合蛋白YNF从N末端起依次为荧光蛋白片段YN、连接肽、FXR氨基酸序列；所述融合蛋白YCS从N末端起依次为荧光蛋白片段YC、连接肽、SUMO1Δ氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的用于检测细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的融合蛋白组，其特征在于：所述荧光蛋白为黄色荧光蛋白EYFP，氨基酸序列为序列表中序列6；所述荧光蛋白片段YN由黄色荧光蛋白EYFP从N末端起1-155位氨基酸所组成；所述荧光蛋白片段YC由黄色荧光蛋白EYFP从N末端起156-239位氨基酸所组成；所述连接肽的氨基酸序列为序列表中序列8。

5.一种DNA分子组，其特征在于：由融合蛋白YNF和融合蛋白YCS对应的核酸编码序列组成，融合蛋白YNF对应的DNA分子核苷酸序列为序列9，融合蛋白YCS对应的DNA分子核苷酸序列为序列15。

6.一种重组载体组，其特征在于：由表达融合蛋白YNF和融合蛋白YCS的重组质粒组成；所述表达融合蛋白YNF的重组质粒为将融合蛋白YNF对应的DNA分子核苷酸序列插入载体质粒所组成；所述表达融合蛋白YCS的重组质粒为将融合蛋白YCS对应的DNA分子核苷酸序列插入载体质粒所组成；

7.权利要求1-4所述的融合蛋白组、权利要求5所述的DNA分子组、权利要求6所述的重组载体组在利用BiFC体系检测影响细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的物质方法中的应用。

8.一种用BiFC体系检测影响细胞内FXR蛋白SUMO化修饰程度的物质的方法，其特征在于：包括如下步骤：将待测物作用于瞬时转染权利要求6所述的重组载体组的细胞，检测处理后的细胞中的黄色荧光信号；若处理后的细胞相比于对照组细胞荧光信号强度下降，则表示该待测物质能下调FXR蛋白的SUMO化修饰；若处理后的细胞相比于对照组细胞荧光信号强度上升，则表示该待测物质能上调FXR蛋白的SUMO化修饰。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测物为小分子化合物或生物大分子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：若为小分子化合物，则将化合物加入到细胞培养基中进行培养；若为蛋白或核酸，则将含有该蛋白对应编码基因的载体质粒或核酸通过转染导入细胞中。