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CN107236813A - 一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统 - Google Patents

一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统 Download PDF

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CN107236813A CN201710554366.7A CN201710554366A CN107236813A CN 107236813 A CN107236813 A CN 107236813A CN 201710554366 A CN201710554366 A CN 201710554366A CN 107236813 A CN107236813 A CN 107236813A
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Abstract

本发明公开了一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统，提供了与eGFP N端158位氨基酸融合的Nrf2蛋白和与eGFP C端159位氨基酸融合的Keap1蛋白编码基因重组的表达载体，同时转染细胞后，表达的Nrf2与Keap1相互作用，融合的荧光蛋白eGFP的N端和C端重构成完整荧光蛋白。本发明将BIFC系统瞬时转染细胞或构建成稳定表达细胞系，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中Nrf2‑Keap1信号通路活性状态及其变化，为通过检测BiFC荧光变化筛选影响Nrf2‑Keap1相互作用的小分子化合物及抗肿瘤药物奠定基础。

Description

一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统。
背景技术
化学药物治疗是肿瘤治疗技术的常规疗法，但化疗耐药性仍是目前肿瘤临床治疗的难点，会导致肿瘤复发、转移，严重影响患者生存质量。Nuclear factor erythroid 2-related factor(Nrf2)可调控抗氧化反应，抵抗由活性氧和亲电试剂造成的细胞损伤。Kelch-like ECH associated protein 1(Keap1)，是依赖于(Cullin-3)的E3连接酶复合物的特异性底物衔接蛋白，负调控Nrf2的活性。肿瘤细胞Keap1-Nrf2通路常处于过度激活状态，Nrf2表达上调，以抵抗胞内高水平的ROS和化疗药物的攻击，但是肿瘤细胞产生耐药性的机理十分复杂，Keap1与Nrf2的调控作用模型还存在争议，肿瘤细胞耐药性与Keap1/Nrf2通路的分子调控机理还有待于进一步研究。
人体细胞电子失衡与多种疾病发生相关，如果体内活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平升高，就会使得氧化还原状态失衡。Nrf2与Keap1及其下游靶基因的抗氧化反应元件ARE共同构成的Nrf2-Keap1-ARE信号通路是细胞氧化应激反应中的关键通路。
在正常生理状态下，Keap1通过将Nrf2锚定在细胞质中并介导Nrf2的泛素化降解抑制Nrf2活性。Keap1利用C端的DGR结构域与Nrf2 N端的Neh2结构域(包括DLG和ETGE序列)相互作用结合成二聚体，并与胞浆肌动蛋白结合将Nrf2锚定在胞浆中，其N端的BTB结构域是滞蛋白(cullin)依赖性泛素连接酶E3的作用底物，促进Nrf2泛素结合和随后的26S蛋白酶体降解，使Nrf2的含量维持在基础水平介导相关基因的基本转录。当细胞内氧化物或自由基增多时，或细胞暴露于亲电物质时，Keap1同二聚体的Kelch结构域可与Nrf2的Neh2结构域N端的DLG模体和ETGE模体结合。Keap1与DLG的结合是弱结合(门闩)，与ETGE的结合是强结合(铰链)，铰链的强度是门闩的100倍。当发生氧化应激时，Keap1的半胱氨酸残基被修饰，Keap1构象发生改变，破坏了Kelch与DLG的弱结合(门闩破坏)，但是Kelch与ETGE的强结合不受影响(铰链保留)。此时，Nrf2依然与Keap1结合，但是门闩连接的破坏足够阻止Nrf2的泛素化，结果导致Keap1被Nrf2饱和，新生成的Nrf2发生磷酸化，不断地自胞质进入胞核，与小分子蛋白Maf(如MafG、MafT、MafF、Mafk(运晨霞等，2008))、Jun、ATF(activatingtranscription factor)(Yu et al.，2011)、Bach1(王梅芳等，2009)等结合形成异二聚体，识别ARE上的DNA序列并与之结合，激活ARE调节的靶基因启动II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因(醌氧化还原酶(nicotinamide quinone oxidoreductase 1，NQO1)、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase，GSTs))的转录，编码抗氧化蛋白，提高细胞抗氧化应激能力。
因此，通过构建Nrf2-Keap1相互作用的胞内可视化检测系统，可以通过对荧光的检测分析影响Nrf2-Keap1相互作用的药物，实现对细胞中的Nrf2-Keap1的实时监控。当正常细胞受到外界刺激时，胞内Nrf2水平升高，活化的Nrf2通过调控下游靶基因发挥防御保护细胞的作用。但对于肿瘤细胞，Nrf2水平升高却导致其对化疗药物的敏感性降低，即出现肿瘤耐药(Kansanen et al.，2013)。
蛋白质相互作用研究是蛋白质功能和信号调控研究的重要内容，荧光蛋白作为可视化的蛋白标记在细胞研究中应用越来越广泛。近年来发展的双分子荧光互补技术(BiFC)被广泛应用于体内蛋白质的研究。蛋白Nrf2和其胞质接头蛋白Keap1是肿瘤细胞耐药性分子机制中的重要调节者。因此，灵敏的Keap1和Nrf2相互作用检测系统一直是筛选药物的需要。BiFC技术操作简单，结果直观，可在活细胞的生理状态下直接观察到细胞内蛋白互作。荧光蛋白经过改造，发展了多个适合BiFC的荧光蛋白。
对于Nrf2和Keap1相互作用的研究已有很多报道，但大部分是建立在体外的蛋白质相互用检测，或者是利用荧光能量转移(FRET)对Kelch和ETGE功能域的相互作用进行分析，或者是利用多光子荧光寿命成像显微镜技术(multiphoton fluorescence lifetimeimaging microscopy technique)对细胞内的Nrf2和Keap1相互作用进行检测。这些分析要么不能对细胞内Nrf2和Keap1的相互作用进行实时监控，要么不能反应完整的Nrf2和Keap1功能蛋白的相互作用，要么需要昂贵的复杂的检测仪器。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统，以绿色荧光蛋白EGFP为材料，构建单分子荧光检测体系，瞬时转化细胞，可以在细胞内实时通过普通的荧光显微镜检测eGFP荧光的变化分析Nrf2和Keap1完整蛋白的相互作用，该检测系统方便、直观、经济、实用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP-C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、BD其中的一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，这4种组合条件下均可检测到Nrf2-Keap1在细胞中的相互作用；所述的Nrf2和Keap1为完整的氨基酸序列，所述eGFP的N158为对应氨基酸残基自N末端第1-159位氨基酸；所述eGFP的C159为对应氨基酸残基自N末端第159-265位氨基酸，所述的linker的长度为5个氨基酸；
所述Nrf2蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；
所述Keap1蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；
所述Keap1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
所述Linker蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
所述的重组而成的载体由表达载体pEGFP-C1删掉编码eGFP的编码片段pC1和编码A、B、C、D的基因片断重组而成。
所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达融合蛋白C的重组载体为将所述编码融合蛋白C的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达融合蛋白D的重组载体为将所述编码融合蛋白D的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达载体pC1为pEGFP-C1删掉编码eGFP的DNA片段，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明还提供了一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内方法，将所述的融合蛋白组AC、AD、BC、BD的重组载体任意一种组合共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明Nrf2-Keap1存在相互作用，若外界刺激或药物处理，荧光信号强度发生变化，表明Nrf2-Keap1和相互作用受到抑制或增强，实现了可视化观察细胞中的Nrf2-Keap1信号通路状态或变化的目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明的检测系统更为直观、方便，且可直观显示活细胞中Nrf2-Keap1信号转导的相互作用，同时也建立了一个可用于筛选影响二者互作关系的研究体系。本发明提供的BIFC构建策略包括EGFP荧光蛋白片段的采用，与Nrf2、Keap1的C端和N端的融合位置以及linker序列的使用，帮助特异、有效的BIFC荧光形成，并对于要检测的其他物种中同源蛋白或互作蛋白均可适用。
附图说明
图1为重叠延伸法获得的A、B、C、D片段的凝胶电泳图。M：DNA分子量标准1kb DNALadder，A为Nrf2+linker+eN158；B为eN158+linker+Nrf2；C为Keap1+linker+eC159；D为eC159+linker+Keap1。
图2为pEGFP-C1去除EGFP片段的载体PCR产物凝胶电泳图。M：DNA分子量标准，D2000DNA Marker，pC1-1至4为平行的4组PCR产物。
图3为本发明实施例重组反应示意图。
图4为通过In-fusion克隆获得的重组质粒DNA凝胶电泳图。M：DNA分子量标准1kbDNA Ladder，pC1-A为A：Nrf2+linker+eN158与pC1的重组质粒DNA；pC1-B为B：eN158+linker+Nrf2与pC1的重组质粒DNA；pC1-C为C：Keap1+linker+eC159与pC1的重组质粒DNA；pC1-D为D：eC159+linker+Keap1与pC1的重组质粒DNA。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP-C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、BD其中的一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，这4种组合条件下均可检测到Nrf2-Keap1在细胞中的相互作用；所述的Nrf2和Keap1为完整的氨基酸序列，所述eGFP的N158为对应氨基酸残基自N末端第1-159位氨基酸；所述eGFP的C159为对应氨基酸残基自N末端第159-265位氨基酸，所述的linker的长度为5个氨基酸；
所述Nrf2蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；
所述Keap1蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；
所述Keap1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
所述Linker多肽的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。
所述的重组而成的载体由表达载体pEGFP-C1删掉编码eGFP的编码片段pC1和编码A、B、C、D的基因片断重组而成。
所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达融合蛋白C的重组载体为将所述编码融合蛋白C的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达融合蛋白D的重组载体为将所述编码融合蛋白D的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
所述表达载体pC1为pEGFP-C1删掉编码eGFP的DNA片段，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示。
本具体实施将BIFC系统瞬时转染细胞或构建成稳定表达细胞系，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中Nrf2-Keap1信号通路活性状态及其变化，为通过检测BiFC荧光变化筛选影响Nrf2-Keap1相互作用的小分子化合物及抗肿瘤药物奠定基础；使用时将所述的融合蛋白组AC、AD、BC、BD的重组载体任意一种组合共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明Nrf2-Keap1存在相互作用，若外界刺激或药物处理，荧光信号强度发生变化，表明Nrf2-Keap1和相互作用受到抑制或增强，实现了可视化观察细胞中的Nrf2-Keap1信号通路状态或变化的目的。
本具体实施利用in-fusion重组克隆技术构建Nrf2，keap1相互作用检测的BiFC系统。将荧光蛋白EGFP的N158，C159片段分别与Keap1和Nrf2融合构建融合蛋白，将重组基因片段插入到删除EGFP基因的表达载体peGFP-C1中，重组表达载体测序后转染MCF-7细胞。经倒置荧光显微镜检测，结果表明：对于Keap1和Nrf2的eGFP的BiFC检测系统在细胞中检测到了绿色荧光，成功检测Keap1和Nrf2在细胞内的相互作用。
实施例
融合片段：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1
设计下列引物(表1)，分别以含有eGFP的载体pEGFP-C1、含有Nrf2的载体pET28a-Nrf2、含有Keap1的载体pET28a-Keap1为模板，加入引物(1)、(2)PCR合成eN158加有linker序列的片段；加入引物(3)、(4)PCR合成Linker和Nrf2的片段；加入引物(5)、(6)PCR合成eC159加有linker序列的片段；加入引物(7)、(8)PCR合成Linker和Keap1的片段；加入引物(9)、(10)PCR合成Nrf2加有linker序列的片段；加入引物(11)、(12)PCR合成Linker和eN158的片段；加入引物(13)、(14)PCR合成Keap1加有linker序列的片段；加入引物(15)、(16)PCR合成Linker和eC159的片段。
体系50μl 用量
模板(30-50ng) 1-2μl
引物F(10μM) 1μl
引物R(10μM) 1μl
2×PCR Premix 25μl
ddH2O 21-22μl
PCR反应条件：98℃ 10sec；56℃ 5sec；72℃ 20sec；30个循环。然后根据重叠延伸PCR法(CN 105907749A)获得A、Nrf2+linker+eN158；B、eN158+linker+Nrf2；C、Keap1+linker+eC159；D、eC159+linker+Keap1的融合片段(图1)。
表1 引物序列表
重组表达载体的构建
根据引物(17)、(18)以载体pEGFP-C1为模板，PCR获得不含eGFP片段的载体pC1(图2)，反应体系如下：
体系50μl 用量
模板(30-50ng) 1-2μl
引物F(10μM) 1μl
引物R(10μM) 1μl
2×PCR Premix 25μl
ddH2O 21-22μl
PCR反应条件：
以含有KOZAK序列的引物(19)、(20)对A进行PCR扩增并进行产物凝胶电泳回收，与pC1片段进行in-fusion反应，转化大肠杆菌并进行重组质粒DNA提取。
In-fusion反应体系
将反应体系混合均匀后置于50℃孵育15min，放在冰上备用。
取2.5μL反应液转化感受态细胞，吸取适量菌液涂在LB+kan固体平板。挑取阳性单克隆进行摇菌。收集菌体提取质粒DNA。
重组反应如图3所示，同样，B以引物(21)、(24)，C以引物(22)、(24)，D以引物(23)、(24)进行PCR扩增并进行产物凝胶电泳回收后in-fusion反应，转化大肠杆菌并进行重组质粒DNA提取(图4)。
重组载体测序验证后进行细胞转染
在转染前一天，对MCF-7细胞再进行一次传代，将细胞转到12孔细胞板，加入DMEM不完全培养基。待细胞长到70～80％时，按照lipofectamineTM 2000的说明书对细胞进行转染，将AC、AD、BC、BD其中的任一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，同时设置单独转染A、B、C、D以及含有eGFP的对照。将转染后的细胞放到37℃，5％CO2的培养箱中培养。6-8小时后，将孔内的培养基更换为DMEM完全培养液，于37℃，5％CO2的培养箱中过夜培养。用Leica荧光倒置显微镜观察转染后的细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP-C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、BD其中的一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，这4种组合条件下均可检测到Nrf2-Keap1在细胞中的相互作用；所述的Nrf2和Keap1为完整的氨基酸序列，所述eGFP的N158为对应氨基酸残基自N末端第1-159位氨基酸；所述eGFP的C159为对应氨基酸残基自N末端第159-265位氨基酸，所述的linker的长度为5个氨基酸RSIAT；
所述Nrf2蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；
所述Keap1蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；
所述Keap1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示
所述eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
所述RSIAT Linker蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述的重组而成的载体由表达载体pEGFP-C1删掉编码eGFP的编码片段pC1和编码A、B、C、D的基因片断重组而成。
3.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白A的重组载体为将所述编码融合蛋白A的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
4.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白B的重组载体为将所述编码融合蛋白B的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
5.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白C的重组载体为将所述编码融合蛋白C的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
6.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达融合蛋白D的重组载体为将所述编码融合蛋白D的DNA分子插入表达载体pC1得到的载体。
7.如权利要求1所述的一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，所述表达载体pC1为pEGFP-C1删掉编码eGFP的DNA片段，其DNA序列如SEQ ID NO：7所示。
8.一种指示Nrf2-Keap1相互作用的BiFC细胞内方法，其特征在于，将权利要求1所述的融合蛋白组AC、AD、BC、BD的重组载体任意一种组合共同导入宿主细胞，得到转基因细胞，观察转基因细胞，若有荧光产生，表明Nrf2-Keap1存在相互作用，若外界刺激或药物处理，荧光信号强度发生变化，表明Nrf2-Keap1和相互作用受到抑制或增强。
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