CN114005538B - Nectin家族和类nectin分子在低级别胶质瘤预后模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物信息和生物医学技术领域，具体涉及NECTIN家族和类NECTIN分子在低级别胶质瘤预后模型中的应用。通过评估三个独立数据库中的表达谱，本发明确定了nectin和necls之间的四个预后相关基因CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR，这些基因具有作为LGG治疗靶点和预后生物标志物的巨大潜力。此外，我们还讨论了参与新四基因风险评分的潜在通路，发现风险评分模型在LGG的免疫过程中发挥了重要作用。本发明提供了广泛的nectin和Necls分析，并为LGG的预后预测提供了一个四基因模型，为进一步研究CADM2、NECTIN1/2和PVR作为LGG的潜在临床和免疫靶点提供了思路，具有广阔的临床应用全景。

Description

NECTIN家族和类NECTIN分子在低级别胶质瘤预后模型中的 应用

技术领域

本发明属于生物信息和生物医学技术领域，具体涉及NECTIN家族和类NECTIN分子在低级别胶质瘤预后模型中的应用。

背景技术

Nectin和类Nectin分子(Necls)是细胞粘附分子，参与细胞间粘附和重要的细胞活动。多项研究结果表明，Nectin和Necls在肿瘤发生和肿瘤免疫监测中发挥重要作用。然而，Nectin和Necls在低级别胶质瘤中的具体作用尚未明确。

低级别胶质瘤(LGG)是一种常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，在生物学行为上具有高度异质性。尽管治疗涉及最大限度的手术切除和术后放疗和化疗，但大多数LGG病例最终进展为耐治疗的高侵袭性胶质瘤，预后并没有明显改善。因此，确定LGG的新预后因素非常重要。一些生物标志物，如异柠檬酸脱氢酶(IDH)突变和染色体臂1p和19q共缺失(1p/19q共缺失)已被纳入2016年世卫组织脑肿瘤分类中，以进一步细分患者类型。然而，LGG是一种具有复杂变异遗传背景的疾病，这些生物标志物不能充分区分患者的预后。因此，利用多个先进的分子平台识别新的预后生物标志物，以改善LGG的预后分类是迫切和非常重要的。

发明内容

针对上述问题，本发明通过提供一种新型的低级别胶质瘤患者总体生存率预后模型。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）获取单元：获取待测样本中与低级别胶质瘤患者预后相关的生物标志物的数据；

（2）处理单元：将（1）中获取的数据导入至预先建立的预后模型中，计算出的风险评分；

（3）预测单元：通过单因素与多因素Cox回归分析和生存分析对风险评分进行预后分析，获得待测样本低级别胶质瘤预后参数。

进一步地，步骤（1）中所述的与低级别胶质瘤患者预后相关的生物标志物的数据为NECTIN家族和类NECTIN的表达水平。

优选地，所述NECTIN家族和类NECTIN包括CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR。

进一步地，步骤（2）中所述风险评分公式为：风险评分=−0.386*CADM2+−0.659*NECTIN1+0.538*NECTIN2+0.746*PVR。

进一步地，步骤（3）中所述预后参数预后生存风险分组，和/或指定年限的生存概率值。

优选地，所述指定年限的生存概率值包括：预后生存期为半年、一年和三年的概率值。

本发明还提供一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预后模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）从癌症基因组图谱TCGA，中国胶质瘤基因组图谱CGGA以及Rembrandt图谱中寻找NECTIN基因家族和类Nectin分子中与胶质瘤临床特征的关系；

（2）使用R包survival，在（1）所述的三个数据库中分别将患者按照基因的表达水平分为高、低两组，P < 0 .05作为筛选预后相关基因的截止值，筛选出CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR作为预后相关基因，用于构建预后模型；

（3）使用L1-penalized Coxproportional hazards regression方法建立（2）中筛选出的四个预后相关的基因模型，并在（1）所述的三个数据库中根据基因模型计算出的风险评分，将LGG患者分为高风险组与低风险组；

（4）使用单因素对风险评分进行预后分析，可以作为低级别胶质瘤的独立预后因素；使用R包ROC计算在多个时间点曲线下面积AUC，以评估预后模型辨别能力。

本发明还提供一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预测装置，其特征在于，所述装置包括：

存储器；

通信接口；

处理器，配置为执行以下步骤：

S1获取待测样本中与低级别胶质瘤患者预后相关的生物标志物的数据；

S2将S1中获取的数据导入至预先建立的预后模型中，计算出的风险评分；

S3通过单因素与多因素Cox回归分析和生存分析对风险评分进行预后分析，获得待测样本低级别胶质瘤预后参数。

进一步地，所述处理器进一步配置为执行本发明所述的任一项或所有的方法步骤。

与现有技术相比本发明的有益效果。

（1）本发明建立了具有4个NECTIN基因家族和类NECTIN分子的预后模型，并将低级别胶质瘤患者分为高、低风险组。在三个不同的数据库中LGG患者的风险评分与OS显著相关（P <0 .001）。ROC曲线分析显示，在1年，3年和5年随访中，AUC均>0.7。我们的基因模型预测性能在多个数据库中得到验证。

（2）对与风险评分最相关的1000个基因进行富集分析，我们发现NECTIN与类NECTIN分子的基因模型与多个免疫通路密切相关。利用TIMER网站，发现高、低风险组的LGG患者间的巨噬细胞以及髓系树突状细胞的数量存在差异。

附图说明

图1 NECTIN和necls基因在各类型癌症和相应匹配的正常组织中的表达情况。

图2分析TCGA、CGGA和REMBRANDT数据库中NECTIN家族和necl基因的表达情况。

图3分析TCGA、CGGA和REMBRANDT数据库中NECTIN家族和necl基因与LGG样本组织学分级的关系。

图4NECTIN家族和necl基因的差异表达与IDH突变状态和1p19q共缺失状态相关性。其中A、B是NECTIN家族和necl基因的差异表达与IDH状态相关性； C、D是NECTIN家族和necl基因的差异表达与1p19q共缺失状态相关性。

图5 基于UALCAN网站的分析显示了NECTIN家族和necls中基于不同组织学LGG亚型的表达差异。

图6 分析TCGA LGG患者的NECTIN家族和necl基因变化。

图7 NECTIN家族成员和necls在TCGA数据库中的Kaplan-Meier生存曲线结果。

图8 NECTIN家族成员和necls在CGGA数据库中的Kaplan-Meier生存曲线结果。

图9 NECTIN家族成员和necls在REMBRANDT数据库中的Kaplan-Meier生存曲线结果。

图10 基于TCGA、CGGA、REMBRANDT三个数据库的单因素Cox回归分析结果。

图11 构建基于TCGA的LGG基于NECTIN族和necl的特征评分。

图12 LGG患者中风险评分的分布与不同的临床特征的关系。

图13与使用与风险评分最相关的1000个基因进行富集分析，寻找NECTIN家族和necl基因相关的通路。其中A是TCGA数据库中的富集情况；B是CGGA数据库中的富集情况。

图14 NECTIN家族和necls的风险评分与一些重要的免疫相关途径和免疫分子分子相关性。其中A是最具代表性的四个免疫相关通路；B是所有具有统计学意义的通路展示。

图15利用GeneMANIA构建了风险评分相关基因的蛋白-蛋白相互作用网络。

图16 基于TCGA队列观察风险评分与免疫、基质和肿瘤纯度的相关性。

图17 基于CGGA队列观察风险评分与免疫、基质和肿瘤纯度的相关性。

图18 TCGA队列的高危组样本估计免疫细胞浸润结果。

图19 TCGA队列的低风险组样本估计免疫细胞浸润结果。

图20 Pearson相关检验分析风险评分与重要免疫分子的相关性。

图21风险评分与IL2、IL8、IFNγ的相关性。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1模型构建方法和效果验证。

1.材料和方法。

1.1Oncomine数据库：

基于Oncomine数据库（AnnArbon, MI, USA）（http://www.oncomine.org/）分析不同类型癌症中各个NECTIN家族成员和necls的表达水平。Oncomine提供715个数据集、微阵列信息和一些在线功能。通过t检验得到癌症标本与正常对照之间NECTIN家族基因差异的p值。fold change阈值设置为2，p-value设置为0.05。

1.2LGG患者的表达数据：

本发明中的LGG患者的数据来自肿瘤基因组图谱(TCGA) LGG队列（下载自http://xena.ucsc.edu/）、中国胶质瘤基因组图谱(CGGA；http://www.cgga.org.cn)数据库和REMBRANDT (https://caintegrator.nci.nih.gov/rembrandt/)数据库。TCGA LGG队列包含463个肿瘤样本，CGGA队列包含172个肿瘤样本，REMBRANDT队列包含107个肿瘤样本。本发明相关LGG患者基本特征见表1。

表1纳入研究的LGG患者的临床特征

。

1.3LGG中NECTIN和necls的mRNA表达及相关性研究：

通过免费在线数据分析平台Sanger box工具(http://www.sangerbox.com/tool)，比较NECTIN和necls基因在不同级别LGG组织中的表达情况，分析NECTIN家族基于IDH状态或1p19q共缺失状态的表达差异。利用corrplot软件包进一步探索NECTIN和necls在LGG中的表达之间的相关性，并使用Sanger box工具将结果可视化。

1.4UALCAN 数据库：

UALCAN网站提供癌症转录组数据的综合评估(https://ualcan.path.uab.edu/)。利用UALCAN数据库分析不同组织学亚型LGG组织中NECTIN和necl基因的表达水平。

1.5cBioportal数据提取：

cBioportal数据库提供全面分析复杂的转录和临床癌症基因组图谱的数据(TCGA) (https: / / www.cbioportal.org/)。TCGALGG患者的NECTIN家族的基因改变和necls的基因改变（扩增、缺失和错义突变）被cBioportal进行评估。

1.6 LGG患者中NECTIN家族和necls的生存分析：

采用以下两步评估TCGA LGG队列、CGGA LGG队列和REMBRANDT队列中NECTIN成员和necls的预后价值：(1)用R包“survival”，根据基因表达的中值将患者分为两组。应用kaplan - meier方法和log-rank检验来评估三个独立的队列中各个nectin成员和necls的表达情况对LGG患者的总生存期(OS)的影响。(2)单变量Cox比例风险回归分析被用来评估三个数据库中NECTIN家族与和necls与总生存期的显著关联。在3个数据库中步骤(1)和步骤(2)中p值均小于0.05的基因为预后相关基因，用于进一步分析。所有分析均使用R3.6.3软件中的R包“survival”进行。

1.7 特征评分的建立与统计分析：

根据由上述方法确定的预后相关基因的表达水平的线性组合构成特征评分的风险公式，并采用单因素Cox比例风险回归分析的相应回归系数进行加权。TCGA队列作为训练集，CGGA和REMBRANDT队列作为验证集。根据风险评分将患者分为高危组和低危组。高危评分组与低危评分组LGG患者之间的组织学分级、IDH状态、1p19q共缺失状态的差异采用t检验。采用Kaplan-Meier生存曲线评估高、低危组的生存时间的差异，并用log-rank检验检测两组OS的差异，并采用R包“survivalROC”评估风险评分模型在0.5年、1年、3年的预后意义。各统计方法差异均设为0.05，结果图由Sanger box在线工具制作。

1.8NECTIN家族与necls的功能及相互作用的富集分析、GSEA和PPI分析：

采用Pearson相关分析获取基因以功能注释。然后将风险评分和p-value<0.05相关的前1000个基因上传metascape网站，用于基因本体(GO)富集分析注释和可视化(http://metascape.org)。此外，我们进行了基因集富集分析(GSEA，版本4.0.1；http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)，寻找TCGA LGG患者中与风险评分表达的相关通路。基因集的注释文件c5.go.bp.v7.4.entrez.gmt(来自Msig数据库)被用作参考。随机重复1000次，p值<0.05作为筛选靶途径。风险评分中的相关基因，通过基因多关联网络整合算法(GeneMANIA;HTTPS://www.genem ania.org)来进行蛋白-蛋白作用网络分析。

1.9免疫浸润分析：

TCGA与CGGA队列高、低风险评分组免疫细胞丰度（包括B细胞、CD4+ T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞）的差异通过肿瘤免疫估计资源(TIMER；https://cistrome. shinyapps.io/timer/)计算或获得。根据表达数据，采用“estimate”软件包分析每个LGG患者的免疫评分、间质评分和肿瘤纯度，评估免疫细胞浸润水平和肿瘤组织间质细胞水平。计算Pearson相关系数，评估风险评分值与上述三个评分或IL2、IL8、IFNγ表达水平的相关性。

2.结果

2.1 LGG患者中NECTIN家族与necls基因的表达模式。

首先，本发明确定了NECTIN家族和necls基因的染色体定位。具体情况见表2。接下来，检查了ONCOMINE数据库，以比较多种癌症中癌症组织和正常组织中NECTIN家族的mRNA表达情况。如图1所示，NECTIN和necls基因在各类型癌症和相应匹配的正常组织中的表达均不同。CADM3和CADM4在大多数癌症中表达上调，而NECTIN2在大多数癌症中表达下调。在脑和中枢神经系统肿瘤样本中，CADM1、CADM2、NECTIN1和NECTIN3下调，而NECTIN2过表达。

表2 NECTIN基因家族与类NECTIN分子的特征

。

随后，分别分析了TCGA、CGGA和REMBRANDT数据库中NECTIN家族和necl基因的表达与LGG样本组织学分级的关系。在TCGA样本中，CRTAM、NECTIN2、NECTIN4和PVR的表达水平随级别升高而上调，而CADM2、CADM3、NECTIN1和NECTIN3的表达水平下调(图2A)。在CGGA样本中，CRTAM、NECTIN2和PVR的表达随着级别的增加而上调，而CADM2和NECTIN1的表达则下调(图2B)。在REMBRANDT样本中，CADM4、NECTIN2和PVR的水平在更高级的级别上上调，而CADM2和NECTIN1的水平下调(图2C)。因此，在所有三个数据库中，NECTIN2和PVR上调，而CADM2和NECTIN1下调。进一步分析表明NECTIN家族成员间存在相关性。如图3A所示，在TCGA LGG样本中，CADM2与NECTIN1/3之间存在较强的正相关，NECTIN2与CADM2或NECTIN1/3之间存在较强的负相关，而在CGGA和REMBRANDT数据库中，nectin家族成员之间的相关性不显著(图3B，图3C)。

2.2NECTIN家族和necls基因改变与LGG亚型、IDH1状态和1P19q状态的关系。

独立分析来自TCGA和CGGA数据库的635个LGG样本，发现NECTIN家族和necl基因的差异表达与IDH突变状态、1p19q共缺失状态和组织学亚型显著相关。从这两个数据库的结果来看，CADM1、CRTAM、NECTIN2和PVR在idh野生型样本中高表达，而CADM2、NECTIN1和NECTIN3在idh突变型样本中高表达(图4A，4B)。此外，CADM2和NECTIN1在1p19q共缺失样本中高表达，而CADM4、CRTAM、NECTIN2和PVR在1p19q非共缺失样本中高表达(图4C，4D)。基于UALCAN网站的分析显示了NECTIN家族和necls中基于不同组织学LGG亚型的表达差异(图5)。其次，分析TCGA LGG患者的基因变化，深入了解NECTIN家族和necl基因差异表达的分子机制。如图6所示，NECTIN1发生改变的概率最高(10%)，其次是PVR(8%)，而NECTIN4发生改变的概率最低(2.8%)。这些结果表明NECTIN家族基因表达与一系列重要的临床参数密切相关。

2.3LGG样本中4个预后相关NECTIN家族和necls基因的鉴定

随后分析NECTIN家族成员和necls的预后价值。所有NECTIN家族成员和necls在TCGA、CGGA、REMBRANDT数据库中的Kaplan-Meier生存曲线结果见图7、8和9。独立分析三个数据库发现，NECTIN2、PVR高表达、CADM2、NECTIN1低表达的患者预后较差(P<0.05；图7A、8A、9)。基于三个数据库的单因素Cox回归分析结果显示，CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR与总生存期(OS, p . lt;0.05；图10A、B、C)。因此，本发明在LGG样本中鉴定出上述4个基因为NECTIN家族和necl的预后相关基因。

2.4构建基于TCGA的LGG基于NECTIN族和necl的特征评分

在独立筛选3个数据库中的4个预后相关基因后，根据4个基因的表达水平构建风险评分公式；回归系数为：风险评分=−0.386*CADM2+−0.659*NECTIN1+0.538*NECTIN2+0.746*PVR。所有LGG患者根据中位风险评分分为高危组和低危组，Kaplan-Meier生存分析显示，基于TCGA训练集(log-rank<0.0001)和两个验证队列(CGGA和REMBRANDT，均为log-rank p<0.0001；图11A, 11E, 11I)。此外，风险评分模型有更好的预测0.5年、1年和3年生存时间的能力，对应ROC曲线下的面积值在TCGA训练队列为0.733，0.801，和0.801(图11B~11D)，在CGGA验证队列0.752，0.793和0.765(图11F，11H)，在REMBRANDT验证队列为0.69，0.729和0.757，分别表明NECTIN家族标记在预测LGG患者的总生存期方面具有很强的作用(图11J~11L)。接下来，根据TCGA和CGGA队列中所有患者的临床特点，采用单变量和多变量COX分析，验证风险评分模型能否作为独立的预后因素。我们发现，风险评分模型与总生存时间显著相关，在TCGA训练集中HR=1.22(95%置信区间[CI] = 1.02-1.46；p=0.03)，CGGA验证集中HR=1.50(95% CI = 1.28-1.84；p&lt；0.001)(表3)。

表3TCGA训练集以及CGGA验证集中COX分析的结果

。

2.5LGG患者中与风险评分的相关临床特征及通路

首先，本发明探讨了LGG患者中风险评分的分布与不同的临床特征的关系。风险评分较高的患者胶质瘤恶性程度也较高，例如，这类患者有着更高的LGG级别，IDH状态为野生型，同时1p19q未缺失(图12A-C)，这些结果在里也得到了验证(图12D-F)。

随后，为了探索与风险评分相关的生物学通路，我们首先试图确定TCGA和CGGA中与我们的风险评分最相关的前1000个基因，结果如表4和5所示。这些差异基因随后在Metascape (http://metascape.org)中进行富集分析。有趣的是，除了许多研究中提到的定位和生物粘附等功能外，免疫系统通路如免疫效应通路、T细胞激活和免疫系统中细胞因子信号转导也与NECTIN家族和necl基因相关(图13A、B)。同时，基因集富集分析(GSEA)显示，NECTIN家族和necls的风险评分与一些重要的免疫相关途径和免疫分子分子相关，如先天性免疫应答、淋巴细胞的激活、IL2、IL8和干扰素(图14A、B)。此外，本发明还利用GeneMANIA构建了风险评分相关基因的蛋白-蛋白相互作用网络(图15)，以探索它们之间潜在的相互作用。SRC是一种主要参与免疫调节的重要酪氨酸激酶，它是预测与四个特征基因相互作用的邻近基因之一，这进一步揭示了NECTIN家族和necl特征与免疫过程之间的深层联系。

表4. TCGA数据库中与风险评分最相关的998个基因

。

表5 CGGA数据库中与风险评分最相关的999个基因

。

2.6Nectin家族风险评分与免疫浸润的关系。

根据ESTIMATE方法，我们基于TCGA和CGGA队列分别观察了风险评分与免疫、基质和肿瘤纯度的相关性。风险评分与免疫评分和基质评分呈强正相关，与肿瘤纯度呈负相关，说明高危评分患者存在更为复杂的免疫微环境(图16，图17)。接下来，肿瘤免疫估计资源网站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)用于TCGA队列的每个样本，以估计免疫细胞浸润。如图18所示，高危组中巨噬细胞和髓样树突状细胞的数量较多。相比之下，低风险组的B细胞和中性粒细胞数量较多（图19）。Pearson相关检验分析风险评分与重要免疫分子的相关性(图20)，结果显示风险评分与IL2、IL8、IFNγ呈正相关(图21A-C)。这些数据表明NECTIN家族和necl标记相关基因在LGG的免疫调节中发挥重要作用。

综上所示，通过评估三个独立数据库中的表达谱，本发明确定了nectin和necls之间的四个预后相关基因(CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR)，这些基因具有作为LGG治疗靶点和预后生物标志物的巨大潜力。此外，我们还讨论了参与新四基因风险评分的潜在通路，发现风险评分模型在LGG的免疫过程中发挥了重要作用。

Claims (5)

1.一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）获取单元：获取待测样本中与低级别胶质瘤患者预后相关的生物标志物的数据；生物标志物的数据为NECTIN家族和类NECTIN的表达水平；所述NECTIN家族和类NECTIN包括CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR；

（2）处理单元：将（1）中获取的数据导入至预先建立的预后模型中，计算出的风险评分；所述风险评分=−0.386*CADM2+−0.659*NECTIN1+0.538*NECTIN2+0.746*PVR；

（3）预测单元：通过单因素与多因素Cox回归分析和生存分析对风险评分进行预后分析，获得待测样本低级别胶质瘤预后参数。

2.根据权利要求1所述的一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预测方法，其特征在于，步骤（3）中所述预后参数预后生存风险分组，和/或指定年限的生存概率值。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述指定年限的生存概率值包括：预后生存期为半年、一年和三年的概率值。

4.一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预后模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）从癌症基因组图谱TCGA，中国胶质瘤基因组图谱CGGA以及Rembrandt图谱中寻找NECTIN基因家族和类Nectin分子中与胶质瘤临床特征的关系；

（2）使用R包survival，在（1）中的三个数据库中分别将患者按照基因的表达水平分为高、低两组，P<0.05作为筛选预后相关基因的截止值，筛选出CADM2、NECTIN1、NECTIN2和PVR作为预后相关基因，用于构建预后模型；

（3）使用L1-penalized Coxproportional hazards regression方法建立（2）中筛选出的四个预后相关的基因模型，并在（1）所述的三个数据库中根据基因模型计算出的风险评分，将LGG患者分为高风险组与低风险组；

（4）使用单因素对风险评分进行预后分析，作为低级别胶质瘤的独立预后因素；使用R包ROC计算在多个时间点曲线下面积AUC，以评估预后模型辨别能力。

5.一种低级别胶质瘤预后总体生存期的预测装置，其特征在于，所述装置包括：存储器；通信接口；所述处理器配置为执行如权利要求1-3任一项所述的方法。