CN103966236B - 小麦耐盐基因TaCYP81及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦耐盐基因TaCYP81，其cDNA的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示；本发明公开了含有所述基因的植物表达载体pROK2-TaCYP81和pGA3626-TaCYP81。同时本发明还提供所述基因TaCYP81在培育抗盐植物中的应用；实验证明，获得的转基因植株耐盐能力明显提高，预示其可广泛用于培育耐盐农作物尤其是耐盐小麦品种。

Description

小麦耐盐基因TaCYP81及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种耐盐基因——小麦耐盐基因TaCYP81及其应用。

背景技术

土壤盐渍化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐渍化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐渍化以外，培育耐盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

目前，利用基因工程技术开展植物耐盐方面研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐盐机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗盐能力得到提高。

然而，虽已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的基因，但有关CP450类基因特别是小麦耐盐基因TaCYP81及其在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐盐基因——小麦耐盐基因TaCYP81及其应用。

本发明的技术方案是：从小麦中分离得到一种耐盐基因——小麦耐盐基因TaCYP81，然后将该基因转化到拟南芥中以实现研究CP450类基因的功能以及植物的耐盐机理，从而为其在培育抗盐植物中的应用提供基础,并正在尝试在小麦上应用此基因实现小麦耐盐性的提高。

本发明所述的耐盐基因名称为小麦耐盐基因TaCYP81，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

本发明还提供了含上述的小麦耐盐基因TaCYP81的植物表达载体pROK2-TaCYP81(拟南芥)或pGA3626-TaCYP81(小麦)。

本发明所述小麦耐盐基因TaCYP81在培育耐盐植物中的应用，以及本发明所述植物表达载体pROK2-TaCYP81或pGA3626-TaCYP81在培育抗盐植物中的应用。

其中，所述植物优选是拟南芥或普通小麦。

将本发明所述小麦耐盐基因TaCYP81导入植物细胞，植物就可以获得盐胁迫的耐受能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaCYP81的植物表达载体(pROK2-TaCYP81或pGA3626-TaCYP81)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pROK2或pGA3626。

本发明提供的小麦耐盐基因TaCYP81可广泛用于培育耐盐农作物品种，特别是小麦。

本发明的有益效果：利用植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦耐盐基因TaCYP81，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐能力明显提高，预示其可广泛用于培育耐盐农作物品种，尤其是在培育耐盐小麦品种中将有重要作用。已经得到小麦转基因T2代，将会深入研究该基因对于改善小麦耐盐性的重要作用。

附图说明

图1TaCYP81基因全长cDNA序列的扩增结果

其中：SR3为山融3号小麦，JN177为济南177小麦，M为λDNA/(BamHⅠ+Sac)Marker；下同；

结果显示：分别在山融3号和济南177中获得开放阅读框长约1500bp的PCR产物。

图2山融3号和济南177盐胁迫0h、1h、6h和24h下TaCYP81在根(R)和叶(L)的RT-PCR分析。

其中：Actin为内参。

图3pBI221-TaCYP81在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。

图4BamHI和SacI双酶切中间载体pEASY-T1-TaCYP81和pROK2质粒。

图5pROK2-TaCYP81表达载体的验证

其中：1、2分别为pROK2-TaCYP81两个阳性克隆。

图6盐胁迫对转基因拟南芥株系与对照株系的生长的影响

其中：OE1为pROK2-TaCYP81转基因拟南芥株系1，OE2为pROK2-TaCYP81转基因拟南芥株系2。

图7pGA3626-TaCYP81小麦转基因过表达系T2代检测结果。

其中：C为阳性对照，箭头所示为小麦过表达阳性株系。

具体实施方式

实施例1、TaCYP81的克隆

1.1提取小麦TotalRNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4.4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μlRNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kbDNAMarker作为对照。

1.2cDNA反转录

反转录酶：M-MLVReverseTranscriptase(Invitrogen)。

2.65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-StrandBuffer4μl

0.1MDTT2μl

RNaseOUT(Invitrogen)1μl

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μlM-MLVRT，混匀，37℃反应50min；

5.70℃温育15min使M-MLVRT失活；

6.加入1μlRNaseH(Invitrogen)，37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3开放阅读框的克隆和序列测定

1.引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物，扩增基因的开放阅读框。

其中引物如下：

TaCYP81-F:ATGGATAAGGCATACATTGC

TaCYP81-R:TCAGAGGCTCTCAAGCACGTC

2.PCR反应体系(50μl)：

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段，琼脂糖凝胶电泳，结果如图1.

5.切胶回收后与pEASY-T1载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由华大基因(山东)公司完成。

1.4基因表达分析(RT-PCR和real-timePCR)

a.胁迫下RNA的提取

山融3号和济南177小麦种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)

开始施加盐胁迫(200mMNaCl)，分别在处理后的0、1、6、24小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。

b.反转录(RT)产生cDNA

反转录产生cDNA，方法同上。

c.PCR反应及电泳

1.以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下

TaAct-S：5’-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’

TaAct-A:5’-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3’

2.PCR体系：

3.PCR程序：

95℃5min,25～30cycles95℃20s,57℃60s,72℃60s；72℃7min.

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

4.1％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2，在小麦SR3和JN177中的该基因的表达受到盐胁迫的强烈诱导，说明该基因是一个盐胁迫响应基因。

实施例2、植物表达载体的构建(35S启动子)

2.135S启动子植物表达载体的构建

利用植物表达载体pROK2，选用SacI和BamHⅠ分别对pROK2和含有目的基因的pEASY-T1载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T₄DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

(1)质粒pROK2空载体和pEASY-T1的SacI和BamHⅠ双酶切

碱裂解法提取pROK2空载体和pEASY-T1质粒，各取10μg酶切，酶切体系如下：

于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pROK2中14kb的载体大片段和pEASY-T1中大约1.5kb的目的基因条带，回收该条带。

(2)pROK2质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

(3)经酶切和脱磷的pROK2载体片段(约14kb)和pEASY-T1双酶切回收片段(约1.5kb)以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含Kan50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

(5)重组子的鉴定

①质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增，体系如下：

PCR反应条件如下：预变性94℃3min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

②质粒酶切鉴定

提质粒进行SacI和BamHI双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

结果见图4、图5，成功构建pROK2-TaCYP81载体。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

3.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

(1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

(3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)将菌体重悬于冰浴的10ml0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

(5)再悬浮于1ml20mmol/L冰预冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

3.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

(1)在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

(2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

(3)加入无抗生素的YEP800μl，28℃震荡培养3小时。

(4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/mlKan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

3.3菌体PCR鉴定

实施例4、转基因功能验证－拟南芥转化及筛选、表型鉴定

4.1拟南芥种植

将种子放入EP管中，70％乙醇中浸泡5min，然后清洁剂(20％漂水(白猫，上海)，0.1％Triton)洗涤10-15min，无菌水冲洗4次，4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5％agarose(冷却至40度以免把种子烫死，加agarose是为了有利于种子散开)，铺于1/2MS固体培养基上，超净台上吹干，(可多吹一会，以免种子萌发过程中培养皿盖子上有水汽)。转入人工气候室中培养一周左右，可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot，70℃烘干2小时以上(杀死虫卵等，否则会长虫)，然后将pot放在营养液中，使其充分吸水，将在1/2MS固体培养基上生长7-10天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中，盖上保鲜膜，转入人工气候室中培养。1-2天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水(浇在pot底下的铁盘子里)。

4.2拟南芥转化

(1)当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导测花序的生成。转化前将材料浇透营养液。

(2)转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL1加到含相应抗生素的200mlYEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

(3)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％SilwetL-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

(4)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

(5)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，至于19-22℃培养室培养。

(6)隔5-7天再同法浸染一次。

(7)大约一个月后收获种子。

4.3拟南芥转化阳性株系筛选

(1)收获的T₀代种子消毒后(75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3－5次)，铺于含50μg/mlKan或50μg/mlHygo的MS筛选培养基上(方法同上)。

(2)4℃春化48h，移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。

(3)等植物绝大多数花苞已经结果荚，用小绳将植物单株绑起，以便单株收种子T₁代种子。

(4)PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物

TaCYP81-F:ATGGATAAGGCATACATTGC

TaCYP81-R:TCAGAGGCTCTCAAGCACGTC

(5)T₁种子处理同前，在T₂代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。

(6)得到纯合系后，选出两个表达量合适的株系OE1、OE2进行拟南芥过表达系表型鉴定，结果见图6，pROK2-TaCYP81过表达拟南芥系在对照情况与pROK2系生长无差异，但在盐胁迫处理下，pROK2-TaCYP81过表达系生长状况明显好于pROK2对照系，说明该基因的过表达提高了拟南芥的耐盐性。

实施例5、小麦耐盐基因TaCYP81在培育耐盐小麦品种中的应用

TaCYP81在小麦中受到盐处理的强烈诱导，说明它是一个小麦盐胁迫响应基因；而且该基因在拟南芥中过表达后，可以明显改善拟南芥的耐盐性，充分说明该基因对于改善小麦的耐盐性也有重要意义，可以应用于培育耐盐小麦品种。

为了更直接地研究该基因对提高小麦耐盐性的重要性，我们选取HindIII+BamHI构建了小麦过表达载体pGA3626-TaCYP81，借助我实验室小麦转化平台，成功转化小麦，如图7所示，获得50多株小麦转基因阳性植株，接下来将会对该基因过表达系的表型进行鉴定和分析。

Claims (6)

1.一种小麦耐盐基因TaCYP81，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因TaCYP81的植物表达载体pROK2-TaCYP81。

3.一种含有权利要求1所述基因TaCYP81的植物表达载体pGA3626-TaCYP81。

4.权利要求1所述基因TaCYP81在培育抗盐拟南芥或普通小麦中的应用。

5.权利要求2所述植物表达载体pROK2-TaCYP81在培育抗盐拟南芥或普通小麦中的应用。

6.权利要求3所述植物表达载体pGA3626-TaCYP81在培育抗盐拟南芥或普通小麦中的应用。