CN102206673A

CN102206673A - 植物耐逆性相关蛋白MtMYB5在培育耐逆植物中的应用

Info

Publication number: CN102206673A
Application number: CN 201110090797
Authority: CN
Inventors: 董江丽; 王涛; 胡晓娜; 张运芹
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-04-12
Filing date: 2011-04-12
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2031-04-12
Also published as: CN102206673B

Abstract

本发明公开了植物耐逆性相关蛋白MtMYB5在培育耐逆植物中的应用。本发明提供的MtMYB5蛋白在培育耐逆植物中的应用，所述MtMYB5蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述应用为将MtMYB5蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。本发明的实验证明，本发明筛选到的一个盐诱导后表达量显著上调的转录因子MtMYB5，将该基因导入经济作物苜蓿等豆科作物将对培育耐盐耐干旱的转基因豆科作物有重要价值。

Description

植物耐逆性相关蛋白MtMYB5在培育耐逆植物中的应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域，尤其涉及植物耐逆性相关蛋白MtMYB5在培育耐逆植物中的应用。

背景技术

干旱、低温、土壤盐渍化和病、虫害是影响农业生产的严重问题。在有关植物抗逆境的众多研究中，科学家已经克隆了许多不同来源的与逆境相关的功能基因并把它们转化到植物体中，但取得的效果并不理想。植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对高盐、干旱及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。

转录因子又称反式作用因子，通过结合特异的DNA元件来调控下游基因的转录。一些转录因子起转录激活作用，一些起转录抑制作用，而另一些既有转录激活活性也有转录抑制活性。一个转录因子可以调控多个与性状相关的基因的表达，通过增强一些关键的调节因子的作用来促进这些抗逆基因资源发挥作用，使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。在提高作物对环境胁迫的分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，从改良或增强一个关键的转录因子调控能力着手，提高物的抗逆性将是一种更为有效的方法和途径。因此应用转录因子提高植物的抗逆性研究已经成为当今的研究热点。

截型苜蓿具有基因组小、染色体数为2×8(2n＝16)、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高、与豆科主要作物亲缘关系较近等特点，因此被选作豆科模式植物。研究表明，非生物胁比如盐胁迫，会影响植物的结瘤，从而影响固氮，因此截型苜蓿的一些转录因子可能同时参与非生物胁迫和结瘤。因此，研究截型苜蓿的耐盐抗旱相关基因(尤其是转录因子)，将为培育优良豆科植物品种提供有价值的分子操作依据。

发明内容

本发明的目的是提供MtMYB5蛋白在培育耐逆植物中的应用。

本发明提供的MtMYB5蛋白在培育耐逆植物中的应用，所述MtMYB5蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

所述应用为将MtMYB5蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

所述MtMYB5蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

所述MtMYB5蛋白的编码基因通过表达载体导入所述目的植物中。

所述表达载体为将所述MtMYB5蛋白的编码基因插入载体pCAMBIA1302的BglII和Spe I酶切位点之间得到的载体。

所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

所述目的植物单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥，如columbia生态型拟南芥。

上述序列表中的序列2由278个氨基酸残基组成。

上述序列表中的序列1由837个核苷酸组成，编码区为序列1的自5’末端的第1-837位核苷酸。

本发明的实验证明，本发明筛选到的一个盐诱导后表达量显著上调的转录因子MtMYB5，将该基因导入拟南芥，经过潮霉素初筛、分子检测、盐胁迫和干旱胁迫等手段，筛选到抗盐和抗干旱能力提高的转基因拟南芥株系，将该基因导入经济作物苜蓿等豆科作物将对培育耐盐耐干旱的转基因豆科作物有重要价值。

附图说明

图1为MtMYB5在酵母中的转录活性分析

图2为MtMYB5在洋葱表皮中的亚细胞定位分析

图3为载体pCAMBIA1302-MtMYB5构建流程图

图4为T₁代转基因拟南芥的分子水平检测

图5为T₃代转基因拟南芥的分子水平检测

图6为T₃代转基因拟南芥NaCl胁迫下的萌发率统计图

图7为T₃代转基因拟南芥干旱胁迫下的根长统计图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

截型苜蓿(Medicago truncatula)A17：购自法国INRA BRC-MTR：BiologicalResource Centre for the model species Medicago truncatula L.。

拟南芥(Arabidopsis thaliana，columbia-o生态型，以下称为野生型拟南芥)：购自salk公司。

农杆菌EHA105记载在抗生素抑制农杆菌的效果及对条斑紫菜生长发育的影响，王萍等，水产科学，200928(7)，中，公众可从中国农业大学获得。

实施例1、MtMYB5基因的克隆

1、MtMYB5基因的获得

在盐胁迫截型苜蓿A17后的芯片筛选中发现这一表达量显著上调的基因，为了研究这一基因在非生物胁迫中的功能，截型苜蓿A17的4周龄苗浇250mMNaCL水溶液一小时，提取RNA，反转录得到cDNA，以截型苜蓿A17的cDNA为模板，以MtMYB5___5’和MtMYB5___3’为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物，将PCR产物插入pMD18 T-simple载体(购自TaKaRa生物工程公司)，得到重组载体，测序，结果为，该PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸，该PCR产物的基因命名为MtMYB5，该基因的编码区为序列表中序列1自5’端第1-837位所示的核苷酸，该基因编码的蛋白命名为MtMYB5，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，将该重组载体命名为pMD18 T-simple-MtMYB5。

由Invitrogen公司合成特异性引物对：

MtMYB5___5’：5’-ATGGATACTAATTACAAAACCAATA-3’(序列3)；

MtMYB5___3’：5’-TCATAAATCATCAGCCAATTGTTGC-3’(序列4)。

也可人工合成序列1，采用相同的方法构建得到pMD18 T-simple-MtMYB5。

2、酵母系统中MtMYB5的转录活性分析

以pMD18 T-simple-MtMYB5为模板，用分别含有EcoR I和Sal I酶切位点的引物5’-GAATTCATGGATACTAATTACAAAAC和3’-GTCGACTCATAAATCATCAGCCAATT进行PCR扩增，得到PCR产物。将该PCR产物经EcoR I和Sal I酶切，回收片段，与经过同样酶切的载体pBDGAL4(Liao Y，Zou HF，Wang HW，Zhang WK，Ma B，Zhang JS，Chen SY(2008)Soybean GmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.Cell Res 18：1047-1060，公众可从中国农业大学获得。)连接，将连接产物转化酵母菌株YRG2(Liao Y，Zou HF，Wang HW，Zhang WK，Ma B，Zhang JS，Chen SY(2008)Soybean GmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.Cell Res 18：1047-1060，公众可从中国农业大学获得。)中，将转化产物涂布在缺色氨酸的SD培养基中，生长的即为阳性克隆。同时转化pGAL4(作为CK+，载体来源与pBDGAL4相同，记载在Liao Y，Zou HF，Wang HW，Zhang WK，Ma B，Zhang JS，Chen SY(2008)Soybean GmMYB76，GmMYB92，and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.Cell Res 18：1047-1060，公众可从中国农业大学获得)、pBDGAL4空载体(作为CK-)到酵母菌株YRG2。

将阳性克隆涂在同时缺色氨酸、组氨酸的培养基平板上生长。同时利用X-Gal对β-半乳糖苷酶酶活性检测。结果如图1所示，其中SD/-Trp-His为同时缺色氨酸、组氨酸的SD培养基、SD/-Trp培养基为缺色氨酸的SD培养基，CK+为转有pGAL4的酵母，CK-为转有pBDGAL4的酵母，阳性克隆能在SD/-Trp-His培养基平板上生长，X-Gal对β-半乳糖苷酶酶活性检测呈阳性。说明，MtMYB5具有转录激活活性。

2、在洋葱表皮中MtMYB5的亚细胞定位分析

扩增MtMYB5基因全长开放阅读框(ORF)，引物分别含有Xho I和Kpn I酶切位点，5’-CTCGAGGATGGATACTAATTACAAAAC和3’-GGTACCCTAAATCATCAGCCAATTGTT，克隆到载体E3025(靳静晨，烟草中依赖于NAD<’+>的山梨醇脱氢酶基因的克隆及功能的初步，河南农业大学2008届硕士学位论文，2008，28-32，公众可从中国农业大学获得。)上，得到融合质粒。

利用基因枪的方法将融合质粒轰击洋葱表皮，以空载体E3025作为对照，在共聚焦显微镜下观察，结果如图2所示，E3025含有GFP基因，说明MtMYB5定位于细胞核。

实施例2、转MtMYB5拟南芥的获得及其功能研究

1、pCAMBIA1302-MtMYB5组成型高效表达载体的构建

Invitrogen公司合成分别含有BglII和Spe I酶切位点的特异性引物对：

5’-AGATCTTATGGATACTAATTACAAAACCAATA-3’(序列5)

5’-ACTAGTTCATAAATCATCAGCCAATTGTTGC-3’(序列6)

以pMD18 T-simple-MtMYB5为模板，以序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子为引物，扩增得到含有BglII和Spe I酶切位点的片段，该片段与经同样酶切过的载体pCAMBIA1302(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture，www.cambia.org)连接，连接产物转化大肠杆菌，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果表明，该质粒为将序列表中的序列1插入pCAMBIA1302的BglII和SpeI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pCAMBIA1302-MtMYB5，该质粒的详细构建见图4。

2、农杆菌EHA105/pCAMBIA1302-MtMYB5的获得

1)EHA105农杆菌感受态细胞的制备

挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃，5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油的0.15M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮；农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl于液氮中速冻1min，冻存于-70℃。

2)表达载体转化农杆菌EHA105

取1μg上述获得的表达载体pCAMBIA1302-MtMYB5加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀，静止5min；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃150rpm振荡培养4h；5000rpm离心3min，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml Kan和50μg/ml利福平的YEB固体平板上，28℃培养约48h，得到转化子。

将转化子进行菌液PCR鉴定，引物为序列5所示的DNA分子和序列6所示的DNA分子，得到850bp的片段为阳性克隆。将阳性克隆提取质粒，测序结果进一步证明载体pCAMBIA1302-MtMYB5已经成功转入农杆菌中，将阳性克隆命名为EHA105/pCAMBIA1302-MtMYB5。

3、转MtMYB5拟南芥的获得

将EHA105/pCAMBIA1302-MtMYB5接种于10ml含50μg/mlKan和50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养过夜；转化前一天以1∶50比例浓度接种于200ml含相同抗生素的YEP培养基中扩大培养至OD₆₀₀为1.6，5000rpm，10min离心集菌，重悬于渗入缓冲液(新制的5％蔗糖溶液)，使OD₆₀₀为0.8；可采用Foral dip法将农杆菌转化花蕾期的野生型拟南芥。可以在拟南芥抽苔5cm时剪去顶端花序，促使腋生花序生长，以得到更多的花序，剪时伤口应位于最高的茎生叶上方，约5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透且将已经开放的花朵去掉，只保留未开放的小花蕾；转化时将拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有菌液及0.05％Silwet L-77的容器中浸泡1.5-2min，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，黑暗培养16小时，再直立花盆恢复正常的光照培养，得到T₀代转MtMYB5拟南芥，从T₀代转MtMYB5拟南芥收获种子，即为T₁代转MtMYB5拟南芥的种子。

4、转MtMYB5拟南芥的筛选

1)潮霉素筛选

收获T₁代转MtMYB5拟南芥的种子后，播种于含80mg/L Hyg+的MS固体平板上，4℃春化72小时，置22℃全日照光照培养箱中正置培养5天，观察表型，转化体表现为真叶呈深绿色，且明显高于非转化体，获得了15个T₁代转基因株系。将筛选到的转化体移至不含抗生素的MS培养基中复壮，4天后将绿色的幼苗转到土壤中繁种，收获T₂代转MtMYB5拟南芥种子。同样的方法筛选T₂代，得到T₃代转MtMYB5拟南芥种子，播种，得到15个株系T₃代转MtMYB5拟南芥。

2)分子检测

提取T₁代转拟南芥的基因组DNA，并以其作为模板，用5’-TGATCTTCATTCCCGTTGG-3’和5’-TCACACGTGGTGGTGGTG-3’(正向引物选用基因内部的片段，反向引物选用载体上的片段)为引物，得到1293bp的目的片段，说明MtMYB5的转基因拟南芥。

采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转入野生型拟南芥中，得到T₁代转空载体拟南芥种子，播种T₁代转空载体拟南芥，提取基因组DNA，用5’-TGATCTTCATTCCCGTTGG-3’和5’-TCACACGTGGTGGTGGTG-3’为引物，没有目的片段，说明得到的为T₁代转空载体拟南芥，从T₁代收获T₂代种子，从T₂代植株收获T₃代种子，从T₃代种子播种，得到T₃代转空载体拟南芥。

反应体系：

PCR反应程序为：第一轮：94℃变性5min；第二轮：94℃变性45sec，43℃复性50sec，72℃延伸1min，30个循环；第三轮：72℃延伸10min。反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果如图4所示，为MtMYB5基因PCR扩增产物电泳图。WT为未转化的拟南芥PCR产物(阴性对照)，1-15为转基因拟南芥PCR产物。从图中看出，与野生型拟南芥(WT)相比，编号为1-15的T₁代转MtMYB5拟南芥得到1293bp的PCR产物，证明其含有MtMYB5基因。野生型拟南芥和T₁代转空载体拟南芥结果无显著差异。

RT-PCR检测：为了检测PCR阳性植株中MtMYB5基因是否得到转录，进一步进行RT-PCR检测。用Trizol法提取PCR鉴定阳性的编号为5-1、5-2、5-10、5-12的T₃代转MtMYB5的总RNA，以完整性好、无污染的RNA为模板，用M-MLV酶(购自Promage公司)反转录RNA为cDNA，以野生型拟南芥(WT)和T₃代转空载体拟南芥。内参基因Actin2的引物为5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG和3’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC。

反转录反应体系：

RNA 2μg

Oligd T(18) 2.0μl

RNase Free H₂O 加至15.0μl

将上述混合物混匀后，短暂离心将之收集于管底，72℃温育5min，再立即置于冰上5min，再加入以下成分：

将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，在42℃温育60min，70℃反应15min，取出置于冰上，离心后储存于-20℃。

以0.5μl反转录产物为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系及反应条件如前。

结果如图5所示，WT为未转化的拟南芥RT-PCR产物(阴性对照，野生型拟南芥)，5-1、5-2、5-10、5-12为T₃代转MtMYB5拟南芥RT-PCR产物，Actin2为参比。与野生型拟南芥(WT)相比，编号为5-1、5-2、5-10、5-12的T₃代转MtMYB5拟南芥中MtMYB51基因得到表达。野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥结果无显著差异。

5、转MtMYB5拟南芥的耐逆性研究

将经上述编号为5-1、5-2、5-12的T₃代转MtMYB5拟南芥进行功能检测，检测方法如下：

1)萌发期盐胁迫实验：

编号为5-1、5-2、5-12的T₃代转MtMYB5拟南芥和对照(野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥)种子分别种于含有150mM NaCl的MS培养基上，4℃春化72小时，光照(16h光/8h暗)培养，温度22℃，从第2天开始每天统计萌发率，直至第7天，进行萌发率计算。每个株系各40株。

萌发率的计算公式为萌发率＝萌发数/总数。

萌发率计算结果如图6所示，第7天5-1、5-2、5-12的T₃代转MtMYB5拟南芥和野生型拟南芥的萌发率分别为91.11％、82.07％、93.92％、36.15％；

野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥结果无显著差异。

2)干旱实验：

编号为5-1、5-2、5-12的T₃代转MtMYB5拟南芥和对照(野生型拟南芥和T₃代转空载体拟南芥)种子分别种于MS培养基上，4℃春化72小时，光照培养(16h光/8h暗)6天，温度22℃，转移到PEG溶液(含45％(质量百分含量)PEG8000的MS液体培养基)平衡过的MS培养基(具体方法参照Paul E.Verslues et al.，(2006)Methods and concepts in quantifying resistance to drought，salt and freezing，abiotic stresses that affect plant water status.The Plant Journal，Protocol S1 in the Supplementary Material)上，10天后统计根长。每个株系各15株。统计结果如图7所示，

5-1、5-2、5-12的T₃代转MtMYB5拟南芥和野生型拟南芥的根长分别为1.6567、1.4567、1.6900、0.9300。

Claims

1.MtMYB5蛋白在培育耐逆植物中的应用；所述MtMYB5蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为将MtMYB5蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述MtMYB5蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

4.如权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述MtMYB5蛋白的编码基因通过表达载体导入所述目的植物中。

5.如权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述表达载体是将所述MtMYB5蛋白的编码基因插入pCAMBIA1302的多克隆位点得到的载体。

6.如权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。

7.如权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述目的植物单子叶植物或双子叶植物。