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CN103930111A - 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗 - Google Patents

包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗 Download PDF

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CN103930111A
CN103930111A CN201280055708.6A CN201280055708A CN103930111A CN 103930111 A CN103930111 A CN 103930111A CN 201280055708 A CN201280055708 A CN 201280055708A CN 103930111 A CN103930111 A CN 103930111A
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T.R.威尔逊
H.科彭
M.莫钱特
J.塞特尔曼
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

一般地，本发明涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体地，本发明涉及用于治疗病理状况(诸如癌症)的疗法。

Description

包含C-MET拮抗剂和B-RAF拮抗剂的组合治疗
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年9月19日提交的美国专利申请号61/536,436、2011年10月25日提交的美国专利申请号61/551,328、2012年2月14日提交的美国专利申请号61/598,783、和2012年5月1日提交的美国专利申请号61/641,139的优先权，通过述及将其内容完整收入本文。
序列表
本申请含有序列表，已经以ASCII格式经EFS-Web提交且通过述及完整收入本文。2012年8月28日创建的所述ASCII拷贝命名为P47361WO.txt，并且大小为16,669个字节。
发明领域
一般地，本发明涉及分子生物学和生长因子调节领域。更具体地，本发明涉及用于治疗病理状况(诸如癌症)的疗法。
发明背景
癌症仍然是对人类健康的最致命威胁之一。在美国，癌症每年影响近130万新患者，而且是位于心脏病之后的第二位死因，占4例死亡中的大约1例。例如，乳腺癌是癌症的第二位最常见形式，而且是美国女性中的第二位癌症杀手。还预测癌症可能在5年内超越心血管疾病成为第一位死因。实体瘤对大多数上述死亡负有责任。虽然某些癌症的医学治疗中已经取得了重大进步，但是所有癌症的总体5年存活率在最近20年里只改进了约10％。癌症(或称作恶性肿瘤)以不受控制的方式快速生长和转移，使得及时检测和治疗极端困难。
尽管癌症治疗获得了重大进展，但是仍然在寻找改良的疗法。
通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)。
发明概述
提供了c-met拮抗剂用于有效治疗癌症患者的用途。本申请还提供了用于诊断疾病的更好方法，以用于任选用c-met拮抗剂与B-raf拮抗剂组合治疗该疾病。特别地，记载的结果证明了使用B-raf拮抗剂vemurafenib(PLX-4032)和c-met拮抗剂的组合治疗导致与单独用vemurafenib治疗相比肿瘤消退的统计学显著改善，包括部分响应的惊人改善。c-met表达与对vemurafenib治疗的敏感性负相关。另外，相对于用B-raf拮抗剂治疗的具有更低循环HGF水平的患者，具有更高水平的循环肝细胞生长因子(HGF)的具有B-raf突变体黑素瘤的患者在用B-raf拮抗剂治疗时显示出实质性缩短的无进展存活和总体存活。
本发明提供了用于治疗诸如癌症等病理状况的组合疗法，其中c-met拮抗剂与B-raf拮抗剂组合，由此提供显著的抗肿瘤活性。
一方面，提供了用于治疗形成对B-raf拮抗剂的抗性的可能性升高的癌症患者的方法，其包括施用有效量(组合地)的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于提高和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于延长B-raf拮抗剂敏感性时段的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于治疗具有B-raf抗性(B-raf拮抗剂抗性)癌症的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于延长B-raf拮抗剂响应持续时间的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于延迟或阻止形成HGF介导的B-raf抗性癌症的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。如本文中使用的，“升高的”或“高的”c-met指与患者对治疗的响应性有关的c-met量。在一些实施方案中，小量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者不太可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。如本文中使用的，“小”量的c-met指与缺乏对治疗的响应有关的c-met量，或者在一些实施方案中为与对治疗的响应较差(例如与无治疗相比临床受益减少)有关的c-met量。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。
一方面，提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者很可能形成B-raf抗性癌症。在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗该患者。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。
一方面，提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者是用c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗的候选：提高该患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性，恢复该患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性，延长该患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性的时段，和/或阻止该患者的癌症形成HGF介导的B-raf拮抗剂抗性。在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗该患者。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。
一方面，提供了用于为具有已显示表达B-raf生物标志物的癌症的患者选择疗法的方法，其包括在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物的表达，并基于该生物标志物的表达水平选择癌症药物。在一些实施方案中，如果癌症样品表达c-met生物标志物的话，选择该患者用c-met拮抗剂与B-raf拮抗剂组合治疗。在一些实施方案中，使用治疗有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂对该患者治疗癌症。在一些实施方案中，如果癌症样品表达基本上检测不到水平的c-met生物标志物的话，选择该患者用除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。
一方面，提供了用于将患者鉴定为用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗的候选的方法，其包括测定该患者的癌症表达c-met生物标志物。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。
一方面，提供了用于将患者鉴定为有风险形成对B-raf拮抗剂的抗性的方法，其包括测定该患者的癌症表达c-met生物标志物。
一方面，提供了测定B-raf拮抗剂治疗患者中癌症的治疗功效的方法，其包括通过免疫测定法，ELISA，杂交测定法，PCR，5’核酸酶测定法，IHC，和/或RT-PCR测定自所述患者获得的样品中c-met生物标志物和/或B-raf生物标志物的存在情况，其中存在c-met生物标志物指示B-raf拮抗剂在治疗上有效治疗所述受试者中的癌症。在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物。在一些实施方案中，B-raf生物标志物为突变型B-raf。在一些实施方案中，突变型B-raf为组成性活化的B-raf。在一些实施方案中，突变型B-raf为B-raf V600。在一些实施方案中，B-raf V600为B-raf V600E。在一些实施方案中，突变型B-raf为B-raf V600K(GTG>AAG)，V600R(GTG>AGG)，V600E(GTG>GAA)和/或V600D(GTG>GAT)中的一项或多项。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法测定突变型B-raf生物标志物表达：(a)对样品(诸如患者癌症样品)实施基因表达序型分析，PCR(诸如rtPCR或等位基因特异性PCR)，RNA-seq，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，或FISH中的一项或多项；并(b)测定样品中突变型B-raf生物标志物的表达。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法测定突变型B-raf生物标志物表达：(a)对自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸实施PCR；并(b)测定样品中突变型B-raf生物标志物的表达。在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达c-met生物标志物。在一些实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒的c-met染色强度测定c-met表达，而且高c-met表达为低的，中等的和强的测定c-met表达，相对于细胞系HEK-293，A549和细胞系H441而言。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒的c-met染色强度测定c-met表达，而且高c-met表达为中等的和强的测定c-met表达，相对于细胞系A549和细胞系H441而言。在一些实施方案中，c-met表达为低的c-met表达。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒的c-met染色强度测定c-met表达，而且低c-met表达为无或低的测定c-met表达，相对于细胞系H1155和细胞系HEK-293而言。在一些实施方案中，相对于对照细胞团粒的c-met染色强度测定c-met表达，而且低c-met表达为无测定c-met表达，相对于细胞系H1155而言。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为核酸表达，而且使用PCR，RNA-seq，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，或FISH在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，使用磷酸-ELISA测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为磷酸-met表达。在一些实施方案中，通过测定肝细胞生长因子(HGF)的表达(例如使用ELISA)来测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，HGF表达为自分泌。在一些实施方案中，HGF在肿瘤或肿瘤基质中表达(例如使用IHC测定)。在一些实施方案中，在患者的血清中测定表达(例如使用ELISA测定)。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤，结肠直肠癌，乳腺癌，卵巢癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤。在一些实施方案中，该癌症为乳头状甲状腺癌。
一方面，本发明提供了用于确定黑素瘤患者预后的方法，其包括在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物的表达情况，其中c-met生物标志物为HGF且HGF表达预示该受试者中的癌症。在一些实施方案中，HGF表达升高预示例如用B-raf抑制剂(例如vemurafenib)治疗患者时无进展存活缩短和/或总体存活缩短。在一些实施方案中，在患者血清中测定HGF表达，例如使用ELISA。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出中值HGF表达水平(诸如群体中的中值HGF表达水平)。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出例如约330ng/ml。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出约300ng/ml，310ng/ml，320ng/ml，330ng/ml，340ng/ml，350ng/ml，360ng/ml，370ng/ml，380ng/ml，390ng/ml，400ng/ml，420ng/ml，440ng/ml，460ng/ml，480ng/ml，500ng/ml，或更高。在一些实施方案中，选择该患者用有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗。在一些实施方案中，用有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗该患者。在一些实施方案中，黑素瘤表达(已显示表达)B-raf V600。
在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物。B-raf生物标志物可以是突变型B-raf。突变型B-raf为组成性活化的B-raf。在一些实施方案中，突变型B-raf为B-raf V600。B-raf V600可以是B-raf V600E。突变型B-raf的一个非限制性例示性列表为：B-raf V600K(GTG>AAG)，V600R(GTG>AGG)，V600E(GTG>GAA)和/或V600D(GTG>GAT)。在一些实施方案中，检测突变型B-raf多肽。在一些实施方案中，检测突变型B-raf核酸。“V600E”指BRAF第1799位核苷酸处导致谷氨酰胺替代B-raf第600位氨基酸处缬氨酸的突变(T>A)。“V600E”在先前的编号系统(Kumar et al.,Clin.Cancer Res.9:3362-3368,2003)下也称作“V599E”(1796T>A)。
在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法测定突变型B-raf生物标志物表达：(a)对样品(诸如患者癌症样品)实施基因表达序型分析，PCR(诸如rtPCR或等位基因特异性PCR)，RNA-seq，5’核酸酶测定法(例如TaqMan)，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，或FISH中的一项或多项；并(b)在样品中测定突变型B-raf生物标志物的表达。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法测定突变型B-raf生物标志物表达：(a)对自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸实施RT-PCR；并(b)在样品中测定突变型B-raf生物标志物的表达。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法测定突变型B-raf生物标志物表达：(a)对自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸实施PCR；并(b)在样品中测定突变型B-raf生物标志物的表达。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法测定突变型B-raf生物标志物表达：(a)使第一和第二寡核苷酸杂交至B-raf靶序列的至少一种变体；其中所述第一寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且所述第二寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且具有至少一个与靶序列的仅一种变体互补的内部选择性核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中当所述选择性核苷酸与靶形成碱基对时，所述聚合酶能够优先延伸所述第二寡核苷酸，且当所述选择性核苷酸与靶不形成碱基对时，实质性较少；并(c)检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中延伸表示存在寡核苷酸对其具有互补选择性核苷酸的靶序列变体。在一些实施方案中，B-raf靶序列的一种或多种变体为野生型B-raf和V600E B-raf。
在一些实施方案中，该患者的癌症已显示表达c-met生物标志物。c-met生物标志物可以是c-met多肽。在一些实施方案中，使用免疫组织化学(IHC)测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示该患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，IHC得分为2。在一些实施方案中，IHC得分为3。在一些实施方案中，IHC得分为1。在一些实施方案中，IHC得分为0。在一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为50％或更多的肿瘤细胞具有中等c-met染色强度，组合的中等/高c-met染色强度或高c-met染色强度。在一些实施方案中，使用磷酸-ELISA测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为磷酸-met表达，而且在一些实施方案中，使用抗磷酸-c-met抗体检测。
c-met生物标志物表达可以是核酸表达。在一些实施方案中，使用PCR(诸如rtPCR或等位基因特异性PCR)，RNA-seq，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，或FISH在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物。
可以通过测定肝细胞生长因子(HGF)的表达来测定c-met生物标志物。如此，在一些实施方案中，c-met生物标志物为HGF表达，而且例如在血清中(例如使用ELISA)或通过IHC(例如肿瘤或肿瘤基质)检测HGF表达。HGF表达可以是自分泌。HGF可以在肿瘤基质中表达。在一些实施方案中，在患者的血清中测定HGF表达。在一些实施方案中，HGF表达水平超出中值HGF表达水平。在一些实施方案中，中值HGF表达水平为约330pg/mL。在一些实施方案中，血清中的HGF表达大于中值HGF表达水平。在一些实施方案中，血清中的HGF表达大于约330pg/ml。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出约300ng/ml，310ng/ml，320ng/ml，330ng/ml，340ng/ml，350ng/ml，360ng/ml，370ng/ml，380ng/ml，390ng/ml，400ng/ml，420ng/ml，440ng/ml，460ng/ml，480ng/ml，500ng/ml，或更多。
c-met拮抗剂可以是拮抗性抗c-met抗体。在一些实施方案中，抗c-met抗体包含：(a)HVR1-HC，其包含SEQ ID NO:1中所示序列；(b)HVR2-HC，其包含SEQ ID NO:2中所示序列；(c)HVR3-HC，其包含SEQ ID NO:3中所示序列；(d)HVR1-LC，其包含SEQ ID NO:4中所示序列；(e)HVR2-LC，其包含SEQ ID NO:5中所示序列；和(f)HVR3-LC，其包含SEQ ID NO:6中所示序列。在一些实施方案中，抗c-met抗体是单价的且包含：(a)第一多肽，其包含重链，所述多肽包含SEQ ID NO:11中所示序列；(b)第二多肽，其包含轻链，该多肽包含SEQ ID NO:12中所示序列；和第三多肽，其包含Fc序列，该多肽包含SEQ ID NO:13中所示序列，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽存在于复合物中且形成与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比提高所述抗体片段稳定性的Fc区。
在一些实施方案中，c-met拮抗剂为crizotinib，tivantinib，carbozantinib，MGCD-265，ficlatuzumab，人源化TAK-701，rilotumumab，foretinib，h224G11，DN-30，MK-2461，E7050，MK-8033，PF-4217903，AMG208，JNJ-38877605，EMD1204831，INC-280，LY-2801653，SGX-126，RP1040，LY2801653，BAY-853474，GDC-0712，和/或LA480中的一项或多项。在一些实施方案中，c-met拮抗剂为crizotinib。在一些实施方案中，c-met拮抗剂为tivantinib。在一些实施方案中，c-met拮抗剂为GDC-0712。
在一些实施方案中，B-raf拮抗剂为sorafenib，PLX4720，PLX-3603，GSK2118436，GDC-0879，N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺，vemurafenib，GSK2118436，RAF265(Novartis)，XL281，ARQ736，BAY73-4506中的一项或多项。在又一些实施方案中，B-raf拮抗剂为vemurafenib。在又一些实施方案中，B-raf拮抗剂为GSK2118436。B-raf拮抗剂可以是对B-raf V600E选择性的。
B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂可以同时施用。B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂可以序贯施用。在一些实施方案中，在c-met拮抗剂之前施用B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，在B-raf拮抗剂之前施用c-met拮抗剂。
一方面，提供了包括对所述受试者施用至少一种别的治疗(诸如癌症药物)的方法。
癌症可以是黑素瘤，结肠直肠癌，卵巢癌，乳腺癌或乳头状甲状腺癌。本文中描述了其它癌症。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤。在一些实施方案中，癌症对B-raf拮抗剂有抗性。在一些实施方案中，患者先前用B-raf拮抗剂治疗过。在一些实施方案中，患者先前没有用B-raf拮抗剂治疗过。在一些实施方案中，患者对B-raf拮抗剂不应。
此外，本发明涉及为癌症药物(例如c-met拮抗剂)登广告的方法，包括对目标受众宣传该癌症药物用于基于c-met生物标志物的表达(而且，在一些实施方案中，进一步基于B-raf生物标志物(例如突变型B-raf生物标志物)的表达)来治疗癌症患者的用途。宣传可以通过任何可得手段来进行。在一些实施方案中，该宣传是通过伴随c-met拮抗剂(诸如抗c-met抗体)的商业性配制剂的包装插页进行的。该宣传也可以通过伴随第二药物的商业性配制剂的包装插页来进行(在治疗为使用c-met拮抗剂和第二药物(例如B-raf拮抗剂，诸如vemurafenib)的组合疗法时)。宣传可以通过书面或口头告知内科医师或健康护理提供者来进行。在一些实施方案中，宣传通过包装插页来进行，其中包装插页提供说明书来接受c-met拮抗剂，和在一些实施方案中，与第二药物，诸如B-raf拮抗剂(诸如vemurafenib)组合治疗。在一些实施方案中，宣传之后是在有或无第二药物(例如vemurafenib)的情况中用c-met拮抗剂治疗患者。在一些实施方案中，宣传之后是在有或无c-met拮抗剂治疗的情况中用第二药物治疗患者。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达高c-met生物标志物的情况中使用c-met拮抗剂来治疗患者。在一些实施方案中，包装插页指示在患者的癌症样品表达低c-met生物标志物的情况中不使用c-met拮抗剂来治疗患者。
在一些方面，本发明的特征在于指导表达c-met生物标志物的癌症(诸如黑素瘤)患者的方法，其通过提供接受抗c-met抗体(例如抗c-met抗体)治疗，和在一些实施方案中，第二药物(诸如B-raf拮抗剂，例如vemurafenib)治疗以例如延长患者的存活、降低患者的癌症复发风险和/或提高患者的存活可能性的说明书来进行。在一些实施方案中，该治疗包括对黑素瘤患者组合施用抗c-met抗体(例如MetMAb)和B-raf拮抗剂(诸如vemurafenib)。在一些实施方案中，该方法进一步提供说明书来接受至少一种化疗剂治疗。在某些实施方案中，依照该指导方法的指导来治疗患者。
本发明还提供了商业方法，包括销售c-met拮抗剂(例如抗c-met抗体)，用于在人患者中治疗癌症(例如黑素瘤)，例如用于延长存活、降低患者的癌症复发可能性、和/或提高患者的存活可能性，其中患者的癌症表达高(升高的)c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，该治疗包括对癌症患者施用抗c-met抗体(例如onartuzumab(MetMAb))，和在一些实施方案中，施用第二药物(例如B-raf拮抗剂，诸如vemurafenib)。
一方面，本发明提供了诊断试剂盒，其包含一种或多种用于测定来自癌症(例如黑素瘤)患者的样品中c-met生物标志物的表达的试剂。该诊断试剂盒适合与本文中描述的任何方法一起使用。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含使用该试剂盒来选择c-met药物以治疗黑素瘤患者的说明书。在一些实施方案中，该治疗包括对癌症患者施用抗c-met抗体(例如onartuumab(MetMAb))，和在一些实施方案中，第二药物(例如B-raf拮抗剂，诸如vemurafenib)。
本发明还涉及制品，其包含包装在一起的c-met拮抗剂和包装插页，该c-met拮抗剂在药学可接受载体中，该包装插页指示该c-met拮抗剂用于基于c-met生物标志物的表达治疗癌症患者。治疗方法包括本文中公开的任何治疗方法。
附图简述
图1：在癌基因成瘾的癌细胞系(oncogene addicted cancer cell line)中RTK配体减弱激酶抑制。a，描绘来自RTK配体矩阵筛选(matrix screen)的结果的图。在存在或缺失RTK配体(50ng/mL)的情况中用渐增浓度范围的适宜激酶抑制剂处理激酶成瘾的癌细胞系。b，来自用有效激酶抑制剂和六种独特的RTK配体中每一种处理的41种激酶成瘾的癌细胞系的矩阵筛选结果的汇总。NR代表无挽救，P代表部分挽救，而R代表完全挽救。c，细胞存活力测定法，其证明了RTK配体的药物处理的癌细胞系(72h)的影响的多样性。如指示的，用50ng/mL RTK配体共处理细胞，其中观察到三种不同结果–无挽救，部分挽救或完全挽救。误差棒代表均值+/-s.e.m。
图2：促存活途径再活化与RTK配体挽救有关。a，免疫印迹，其显示了激酶抑制(1μM，2h)后急性RTK配体处理(50ng/mL)对sAKT和ERK磷酸化的影响。指示了RTK配体挽救，灰色方形指示完全挽救，而黑色方形指示部分挽救，如通过初始筛选测定的(图1b)。b，细胞存活力测定法，其证明了药物处理(72h)后三种激酶成瘾的癌细胞系中对细胞增殖的阻抑。如指示的，在存在适宜第二激酶抑制剂(0.5μM)的情况中用50ng/mL RTK配体共处理细胞。PD：PD173074，Lap：lapatinib，Criz：crizotinib。误差棒代表均值+/-s.e.m。c，免疫印迹，其显示了在存在和缺失RTK配体(50ng/mL，2h)的情况中急性激酶抑制(1μM)对AKT和ERK磷酸磷酸化的影响。在适宜时用第二激酶抑制剂(0.5μM)共处理细胞细胞。Sun：sunitinib，PD：PD173074，PLX：PLX4032，Lap：lapatinib，Erl：erlotinib，Criz：crizotinib。
图3：在HER2扩增的细胞系中HGF促进lapatinib抗性。a，免疫印迹，其显示了如指示的，用lapatinib(Lap，1μM)，HGF(50ng/mL)和crizotinib(Criz，0.5μM)处理后AU565HER2扩增的乳腺癌细胞中对凋亡(遭到切割的PAPR)的阻抑。b，免疫印迹，其显示了一组HER2扩增的乳腺癌细胞系中的pMET和MET表达。指示了HGF挽救，黑色方形指示部分挽救，如通过初始筛选测定的(图1b)。c，如指示的，用lapatinib(Lap，1μM)，HGF(50ng/mL)或crizotinib(Criz，0.5μM)任一处理的AU565HER2扩增的乳腺癌细胞的Syto60染色。每三天处理细胞，持续指示的数据。突变代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。d，免疫印迹，其显示了两种MET阳性(AU565，HCC1954)和一种MET阴性(BT474)HER2扩增的细胞系中pAKT和pERK的再活化。如指示的，用lapatinib(Lap，1μM)，HGF(50ng/mL)或crizotinib(Criz，0.5μM)任一处理细胞(2h)。e，代表性载玻片，其显示了HER2阳性(3+)乳腺癌组织中的MET表达。f，用lapatinib(1μM)和HGF(50ng/mL)处理3次后对MET表达更高的AU565细胞的选择。g，如指示的，用lapatinib(5μM)和crizotinib(1μM)任一处理的HCC1954HER2扩增的乳腺癌细胞的Syto60染色。每周两次处理细胞，持续指示的时间。图像代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。
图4：在BRAF突变体黑素瘤细胞系中HGF促进PLX4032抗性。a，左边，免疫印迹，其显示了一组BRAF突变体黑素瘤细胞系中的pMET和MET表达。显示了HGF挽救，灰色方形代表完全挽救，黑色方形代表部分挽救，而白色方形代表无挽救。右边，在存在HGF(72h)的情况中PLX4032(1μM)处理的BRAF突变体黑素瘤系中如通过密度测定术测定的MET表达和百分比挽救之间的关联。b，免疫印迹，其显示了三种MET阳性(NAE，624MEL，A375)和两种MET阴性(M14，Hs693T)BRAF突变体细胞系中pERK的再活化。如指示的，用PLX4032(PLX，1μM)，HGF(50ng/mL)或crizotinib(Criz，0.5μM)处理细胞(2h)。c，如指示的，用PLX4032(5μM)和/或crizotinib(1μM)任一处理的624MEL BRAF突变体黑素瘤细胞的Syto60染色。每周两次处理细胞，持续指示的时间。图像代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。d，肿瘤生长测定法，其显示了使用3D6MET激动性抗体活化MET受体对PLX4032处理在928MEL异种移植物中的效果的影响。如指示的，用对照抗体(抗gp120)，3D6(抗MET激动性抗体)，RG7204(PLX4032)或GDC-0712(MET小分子抑制剂)任一处理小鼠，每组10只，持续4周。误差棒代表均值+/-s.e.m。
图5：a，免疫印迹，其显示了用PDGF刺激(50ng/mL，30min)后PDGFR的活化。b，来自用顺铂和六种独特的RTK配体共处理的六种激酶成瘾的癌细胞系的筛选结果的汇总。NR代表无挽救。c，细胞存活力测定法，其证明了药物治疗(72h)后三种激酶成瘾的癌细胞系中对细胞增殖的阻抑。如指示的，在存在适宜第二激酶抑制剂(0.5μM)的情况中用50ng/mL RTK配体共处理细胞。PD：PD173074，Lap：lapatinib，Criz：crizotinib。误差棒代表均值+/-s.e.m。d，免疫印迹，其显示了在存在或缺失RTK配体(50ng/mL，2h)的情况中急性激酶抑制(1μM)对AKT和ERK磷酸化的影响。在适宜时用第二激酶抑制剂(0.5μM)共处理细胞。Criz：crizotinib，PD：PD173074，Lap：lapatinib。
图6：a，免疫印迹，其显示来自矩阵筛选的一组41种激酶成瘾的癌细胞系中MET，PDGFRα，IGF1Rβ，EGFR，HER2，HER3，FGFR1，FGFR2和FGFR3的表达。指示了RTK配体挽救；灰色方形代表完全挽救，黑色方形代表部分挽救，白色方形代表无挽救，而阴影线方形代表配体相关激酶。X代表移除的样品，amp代表扩增的，而mut代表突变的。使用β-微管蛋白测定相等加载。b，关联RTK表达与RTK配体挽救激酶成瘾的细胞免于激酶抑制的能力的表。使用2x2列联表确定统计学显著性。给出了p值。
图7：a，免疫印迹，其证明了在受体表达、非RTK配体挽救的细胞中在不偶联下游存活信号的情况中受体的活化。PLX：PLX4032，Lap：lapatinib。b，免疫印迹，其证明了在受体表达、非RTK配体挽救的细胞中在偶联至少一种下游存活信号的情况中受体的活化。PLX：PLX4032，TAE：TAE684，Erl：erlotinib。c，免疫印迹，其证明了在受体表达、非RTK配体挽救的细胞中RTK配体未能活化适宜受体和相应下游存活信号。PLX：PLX4032，TAE：TAE684，Erl：erlotinib。
图8：a，细胞存活力测定法，其证明了用TAE684或crizotinib处理(72h)处理后在H3122EML4-ALK易位的NSCLC癌细胞系中对细胞增殖的阻抑。用50ng/mL HGF共处理细胞。误差棒代表均值+/-s.e.m。b，免疫印迹，其显示了在存在或缺失HGF(50ng/mL，2h)的情况中急性TAE684或crizotinib(1μM)处理对AKT和ERK磷酸化的影响。c，如指示的，在存在或缺失HGF(50ng/mL)的情况中用TAE684(2μM)处理的H2228EML4-ALK易位的NSCLC细胞的Syto60染色。每3天处理细胞，持续9天。d，如指示的，在存在和缺失HGF(50ng/mL)的情况中用Erlotinib(5μM)处理的H358EGF样配体驱动的NSCLC细胞的Syto60染色。每3天处理细胞，持续9天。图像代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。
图9显示a，细胞存活力测定法，其证明了在用PLX4032(72h)处理后在两种BRAF突变体细胞系中对细胞增殖的阻抑。如指示的，用50ng/mL RTK配体和crizotinib(Criz，0.5μM)共处理细胞。误差棒代表均值+/-s.e.m。b，时间过程，其显示了用lapatinib(1μM)处理的AU565HER2扩增的乳腺癌细胞中HGF(50ng/mL)刺激后持续的存活信号(pAKT和pERK)。
图10：具有BRAF V600F的细胞中各种RTK配体的挽救结果。
图11：如指示的，用lapatinib(5μM)和crizotinib(1μM)任一处理的HCC1954HER2扩增的乳腺癌细胞的Syto60细胞染色。每周两次处理细胞，持续指示的时间。图像代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。
图12：a，免疫印迹，其显示了MET阳性(NAE，624MEL，928MEL，A375)和MET阴性(M14，Hs693T)BRAF突变体细胞系中ERK的再活化。如指示的，用PLX4032(PLX，1μM)，HGF(50ng/mL)或crizotinib(Criz，0.5μM)处理细胞(2h)。b，肿瘤生长测定法，其显示了在928MEL和624MEL异种移植物中使用3D6MET激动性抗体活化MET对PLX4032的生长抑制活性的影响。如指示的，用对照抗体(抗gp120)，3D6(抗MET激动性抗体)，RG7204(PLX4032)或GDC-0712(MET小分子抑制剂)任一处理小鼠(每组10只)，持续4周，并在制定时间测量肿瘤体积。误差棒代表均值+/-s.e.m。使用双向ANOVA确定2组之间的差异(*＝0.0008)。
图13：用PLX4032治疗的患者的转移性黑素瘤中的无进展存活和总体存活。将患者基于他们的血浆HGF水平分层成两组(绿色<中值HGF；红色>中值HGF)。
图14：a，细胞存活力测定法，其通过活化PI3K和MAPK途径二者(72h)，证明了来自激酶抑制的叠加挽救。用lapatinib(1μM)与10ng/mL NRG1或FGF组合共处理AU565细胞。b，细胞存活力测定法，其证明了抑制PI3K途径在逆转配体诱导的挽救方面比MAPK途径更加有力。在存在HGF(50ng/mL)的情况中用适宜的激酶抑制剂处理细胞。然后用100nM PI3K抑制剂(BEZ235)或MAPK抑制剂(AZD6244)任一处理细胞。误差棒代表均值+/-s.e.m。
图15：免疫印迹，其显示了来自矩阵筛选的一组41种激酶成瘾的癌细胞系中MET，PDGFRα，IGF1Rβ，EGFR，HER2，HER3，FGFR1，FGFR2和FGFR3的表达。指示了RTK配体；灰色方形代表完全挽救，深灰色方形代表部分挽救，白色方形代表无挽救，而黑色方形代表配体相关激酶。X代表移除的样品，amp代表扩增的，而mut代表突变的。使用β-微管蛋白测定相等加载。
图16：如指示的，在存在或缺失HGF(50ng/mL)的情况中用TAE684(2μM)处理的H2228EML4-ALK易位的NSCLC细胞的Syto60染色。每3天处理细胞，持续9天。图像代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。
图17：a，描绘在SK-MEL-28细胞中对446种测试分泌因子分析PLX4032敏感性的图。b，来自在存在5μM PLX4032(72h)的情况中在存在50ng/mL配体的情况中在SK-MEL-28细胞上分析446种测试分泌因子的结果的汇总。图呈现了形成初始分析的配体和挽救SK-MEL-28细胞免于PLX4032敏感性的新鉴定的可溶性因子。误差棒代表均值+/-s.e.m。
图18：如指示的，用PLX4032(5μM)和/或crizotinib(1μM)任一处理的A375和928MEL BRAF突变体黑素瘤细胞系的Syto60细胞染色。每周两次处理细胞，持续指示的时间。图像代表3项独立实验，而且数值指示均值+/-s.d。
图19A和19B：汇总来自928MEL和624MEL异种移植物研究的结果的表。
图20显示来自126名转移性黑素瘤患者(服药循环1前)的血浆中的HGF蛋白水平的ELISA结果的汇总。
图21：培养的BRAF突变体黑素瘤癌细胞中MET的IHC染色。
图22：细胞存活力测定法，其证明了用crizotinib处理后对HCC1954和AU565中细胞增殖的阻抑(72h syto60测定法)。在存在crizotinib(0.5μM)(MET TKI)和lapatinib(EGFR/HER2TKI)的情况中用50ng/mL HGF共处理细胞。
图23：显示lapatinib(1μM)在存在NRG1(50ng/mL，2h)的情况中对AKT和ERK磷酸化的影响的免疫印迹。用erlotinib(0.5μM)共处理细胞，如指示的。Lap：lapatinib，Erl：erlotinib。
图24：a，柱状图(带阴影线)，其显示了来自参加BRIM2试验，服药循环1前的126名转移性黑素瘤患者的log(HGF)水平的频率分布，叠加经验密度(黑色)(偏离常态的Kolmogorov-Smirnoff p值为0.18)。b，用PLX4032治疗的转移性黑素瘤患者中的无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。将患者基于他们的血浆HGF水平分层成三组。显示了每个组的事件数目患者和中等的距事件的时间。使用结果在连续结果上的cox-比例模型来计算危害比和相应的p值。
图25：a，GDC-0712的结构。b，cMet和选定激酶的酶IC50。使用活化的cMet激酶域所致poly(Glu,Tyr)磷酸化测定cMet效力，通过ELISA检测。数据为多重测定的几何均值(n＝5)。使用Invitrogen选定筛选服务依照Invitrogen标准方案进行了其它激酶测定法。测定所有IC50，[ATP]在对Km而言的适宜数值。c，在基于细胞的测定法中GDC-0712针对选定RTK的效力和选择性。所有测定法测量在存在10％FBS的情况中与化合物一起温育2小时后，表中限定的细胞系中的RTK自体磷酸化。d，激酶选择性序型分析数据。使用Invitrogen选定筛选服务在0.1μM针对一组210种激酶测定GDC-0712。列出了具有>50％抑制的所有激酶。e，GDC-0712激酶选择性的图示。特定激酶在0.1μM化合物的百分比抑制通过在人kinome上覆盖的圆圈的大小和颜色来表示。
图26：依照国际专利申请WO2007103308A2中概述的规程制备GDC-0712。试剂和条件：(a)(EtO)3CH，Meldrum氏酸，80℃，76％；(b)Dowtherm，220℃，45％；(c)3,4-二氟硝基苯，Cs2CO3，DMF，100℃，88％；(d)TFA，70℃，99％；(e)I2，KOH，DMF，50℃，88％；(f)PMBCl，K2CO3，DMF，rt，61％；(g)SnCl2-2H2O，EtOH，65℃；(h)CuI，吲哚-2-羧酸，DMSO，K2CO3，115℃，56％；(i)EDCI，HOBt，ipr2EtNH，DMF，92％；(j)TFA，CH2Cl2，rt；(k)CH3CHO，NaHB(OAc)3，77％(通过两个步骤)；(l)TFA，70℃，73％。
发明详述
I.定义
在本文中，“患者”为人患者。患者可以是“癌症患者”，即患有或有风险患上一种或多种癌症症状的患者。此外，患者可以是先前治疗过的癌症患者。患者可以是“黑素瘤癌症患者”，即患有或有风险患上一种或多种黑素瘤症状的患者。此外，患者可以是先前治疗过的黑素瘤患者。
如本文中使用的，除非另外指明，术语“c-met”或“Met”指任何天然或变异(无论天然的或合成的)c-met多肽。术语“野生型c-met”一般指包含天然发生c-met蛋白的氨基酸序列的多肽。
如本文中使用的，术语“c-met变体”指在天然c-met序列中包括一处或多处氨基酸突变的c-met多肽。任选地，该一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。
“抗c-met抗体”指以足够亲和力和特异性结合c-met的抗体。所选择的抗体正常情况下会具有足够强的对c-met的结合亲和力，例如抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合人c-met。抗体亲和力可通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。在某些实施方案中，抗c-met抗体能在靶向和干扰涉及c-met活性的疾病或状况中用作治疗剂。还有，所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估它作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且取决于抗体的靶抗原和预定用途。
“c-met拮抗剂”(可互换地称作“c-met抑制剂”)指干扰c-met活化或功能的药剂。在一个具体的实施方案中，c-met抑制剂具有约1,000nM或更低的对c-met的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中，c-met抑制剂具有约100nM或更低的对c-met的结合亲和力。在另一个实施方案中，c-met抑制剂具有约50nM或更低的对c-met的结合亲和力。在另一个实施方案中，c-met抑制剂具有约10nM或更低的对c-met的结合亲和力。在另一个实施方案中，c-met抑制剂具有约1nM或更低的对c-met的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，c-met抑制剂共价结合c-met。在一个具体的实施方案中，c-met抑制剂以1,000nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met抑制剂以500nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met抑制剂以50nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met抑制剂以10nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。在另一个实施方案中，c-met抑制剂以1nM或更低的IC50抑制c-met信号传导。
“c-met活化”指c-met受体的活化或磷酸化。一般而言，c-met活化导致信号转导(例如由c-met受体的细胞内激酶结构域引起的，磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨酸残基)。c-met活化可以由c-met配体(HGF)结合感兴趣c-met受体来介导。HGF对c-met的结合可活化c-met的激酶结构域并由此导致c-met中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它的底物多肽中酪氨酸残基的磷酸化。
“B-raf活化”指B-raf激酶的活化或磷酸化。一般而言，B-raf活化导致信号转导。
如本文中使用的，除非另外指明，术语“B-raf”指任何天然或变异(无论天然的或合成的)B-raf多肽。术语“野生型B-raf”一般指包含天然发生B-raf蛋白的氨基酸序列的多肽。
如本文中使用的，术语“B-raf变体”指在天然B-raf序列中包括一处或多处氨基酸突变的B-raf多肽。任选地，该一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。
“B-raf拮抗剂”(可互换地称作“B-raf抑制剂”)指干扰B-raf活化或功能的药剂。在一个具体的实施方案中，B-raf抑制剂具有约1,000nM或更低的对B-raf的结合亲和力(解离常数)。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂具有约100nM或更低的对B-raf的结合亲和力。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂具有约50nM或更低的对B-raf的结合亲和力。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂具有约10nM或更低的对B-raf的结合亲和力。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂具有约1nM或更低的对B-raf的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，B-raf抑制剂以1,000nM或更低的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以500nM或更低的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以50nM或更低的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以10nM或更低的IC50抑制B-raf信号传导。在另一个实施方案中，B-raf抑制剂以1nM或更低的IC50抑制B-raf信号传导。
“V600E”指BRAF基因中导致谷氨酰胺替代B-Raf氨基酸位置600处缬氨酸的突变。“V600E”在先前的编号系统下也称作“V599E”(Kumar et al.,Clin.Cancer Res.9:3362-3368,2003)。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“选择性”或“更大亲和力”意图指拮抗剂对突变型蛋白质的结合比对野生型蛋白质的结合更加紧密(解离常数更低)。在一些实施方案中，更大亲和力或选择性为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、300、400、500或更多倍数的更大结合。如本文中使用的，术语“B-raf靶向药物”指结合B-raf且抑制B-raf活化的治疗剂。
如本文中所使用的，术语“c-met靶向药物”指结合c-met并抑制c-met活化的治疗剂。
如本文中所使用的，如例如应用于受体激酶活性，术语“组成性”指受体不依赖配体或其它活化性分子的存在的持续信号传导活性。根据受体的性质，所有活性可以是组成性的，或者受体的活性可以通过其它分子(例如配体)的结合而进一步活化。导致受体活化的细胞事件是本领域普通技术人员公知的。例如，活化可包括寡聚化(例如二聚化，三聚化，等)成高级受体复合物。复合物可包含单一种类的蛋白质，即同聚复合物。或者，复合物可包含至少两种不同蛋白质种类，即异聚复合物。可以通过例如受体的正常或突变体形式在细胞表面上的过表达来引起复合物形成。也可以通过受体中的特定突变来引起复合物形成。
短语“基因扩增”指在特定细胞或细胞系中形成多拷贝的基因或基因片段的过程。复制区(扩增的DNA的区段)常常称作“扩增子”。通常，所产生的信使RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也按由所表达特定基因形成的拷贝数的比例增加。
“酪氨酸激酶抑制剂”为一定程度抑制酪氨酸激酶(诸如c-met受体或B-raf)的酪氨酸激酶活性的分子。
“展示出c-met和/或B-raf表达、扩增、或活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中表达(包括过表达)c-met和/或B-raf，扩增了c-met和/或B-raf基因，和/或以其它方式表明c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物学样品。
“不展示c-met和/或B-raf表达、扩增、或活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中没有表达(包括过表达)c-met和/或B-raf，没有扩增c-met和/或B-raf基因，和/或没有以其它方式表明c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物学样品。
“展示出c-met和/或B-raf活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展现出C-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA或IHC来测量C-met和/或B-raf磷酸化)或间接测定。
“不展示c-met和/或B-raf活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不展现出c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA或IHC来测量C-met和/或B-raf磷酸化)或间接测定。
“展示出组成性c-met和/或B-raf活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中展现出组成性c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或B-raf磷酸化)或间接测定。
“不展示c-met扩增”的癌或生物学样品指在诊断测试中不具有扩增的c-met基因的癌或生物学样品。
“展示出c-met”的癌或生物学样品指在诊断测试中具有扩增的c-met基因的癌或生物学样品。
“不展示组成性c-met和/或B-raf活化”的癌或生物学样品指在诊断测试中不展现组成性c-met和/或B-raf活化或磷酸化的癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过ELISA来测量c-met和/或B-raf磷酸化)或间接测定。
“磷酸化”指对蛋白质，诸如B-raf和/或c-met，或其底物添加一个或多个磷酸根基团。
“磷酸-ELISA测定法”(phosho-ELISA assay)在本文中指在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中评估一种或多种c-met和/或B-raf的磷酸化的测定法，其中使用检测磷酸化的c-met和/或B-raf、底物或下游信号分子的试剂(通常是抗体)。优选的是，使用检测磷酸化c-met和/或B-raf的抗体。该测定法可以对细胞溶胞物，优选来自新鲜的或冷冻的生物学样品的细胞溶胞物进行。
“c-met过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细胞相比，具有显著更高水平的c-met蛋白质或基因的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的c-met蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定法；IHC)来测定c-met过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中编码c-met的核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。在上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者身体内的细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估该抗体对患者身体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检。
“不过表达或扩增c-met”的癌细胞指与同一组织类型的非癌性细胞相比，不具有高于正常的c-met蛋白质或基因水平的癌细胞。
术语“突变”在用于本文时指特定蛋白质或核酸(基因，RNA)分别相对于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸可以由基因的一个等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或者在其中找到，而且它可以是体细胞的或种系的。在本发明中，突变一般是体细胞的。突变包括序列重排，诸如插入、删除、和点突变(包括单核苷酸/氨基酸多态性)。
“抑制”指与参照相比减小或降低活性、功能、和/或量。
蛋白质“表达”指基因中编码的信息转换成信使RNA(mRNA)，然后转换成蛋白质。
在本文中，“表达”感兴趣蛋白质(诸如c-met受体)的样品或细胞指其中测定出存在编码该蛋白质的mRNA或蛋白质(包括其片段)的样品或细胞。
“阻断性”抗体或抗体“拮抗剂”指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的阻断性抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。
患者“群体”指一组癌症患者，诸如临床试验中的，或对特定适应证诸如黑素瘤癌症疗法FDA批准之后肿瘤学家看到的。
对于本发明的方法，术语“指导”患者意味着通过任何手段，但是优选书面地，诸如以包装插页或其它书面推广材料的形式提供关于可应用疗法、药疗、处理、处理方案、等等的指导。
对于本发明的方法，术语“宣传(promoting)”意味着通过任何手段，包括书面地，诸如以包装插页的形式提供、登广告、出售、或描述特定药物、药物组合、或治疗模态。宣传在本文中指治疗剂，诸如抗c-met抗体和/或B-raf拮抗剂用于适应证，诸如黑素瘤治疗的宣传，其中此类宣传得到食品和药品管理局(FDA)批准，认为已证明与受试者群体中统计上显著的治疗功效和可接受的安全性有关。
术语“销售”在本文中用于描述产品(例如药物)的宣传、出售或分发。销售具体包括目的在于包装、登广告、和任何使产品商业化的商业活动。
为了本文中的目的，“先前治疗过的”癌症患者已经接受过在先癌症疗法。
即使对癌症患者施用抗肿瘤剂，诸如化疗剂，“顽固性”或“不应性”(refractory)癌症仍然发生进展。
“癌症药物”指有效治疗癌症的药物。癌症药物的例子包括下文所述化疗剂和化疗方案；c-met拮抗剂，包括抗c-met抗体，诸如MetMAb；B-raf拮抗剂。
如本文中所使用的，术语“生物标志物”或“标志物”一般指其在哺乳动物组织或细胞中或上的表达或分泌可以通过已知方法(或本文中所公开的方法)来检测且预示或可用于预测(或帮助预测)细胞、组织或患者对治疗方案的响应性的分子，包括基因、mRNA、蛋白质、碳水化合物结构、或糖脂。
与癌症(例如黑素瘤)患者的临床好处减少有关的生物标志物的“量”或“水平”指生物学样品中没有可检测的生物标志物或有低可检测水平，其中生物标志物的水平与患者临床好处减少有关。这些可以通过本领域技术专家知道及本发明也公开的方法来测量。评估的生物标志物的表达水平或量可用于测定对治疗的响应。在一些实施方案中，生物标志物的量或水平使用IHC(例如患者肿瘤样品的)和/或ELISA和/或5’核酸酶测定法和/或PCR(例如等位基因特异性PCR)来测定。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，而且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA、或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。在一些实施方案中，“表达的水平”指生物学样品中蛋白质的量，如使用IHC测定的。
“患者样品”指从癌症患者得到的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、循环中的肿瘤细胞、血清或血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。在一个实施方案中，所述样品包含黑素瘤肿瘤样品。
患者对药物治疗的“有效响应”或“响应性”及类似用语指在施用癌症药物后对处于癌症(例如黑素瘤)风险或患有癌症(例如黑素瘤)的患者给予的临床或治疗好处。此类好处包括如下任何一项或多项：延长存活(包括总体存活和无进展存活)；导致客观响应(包括完全响应或部分响应)；或改善癌症体征或症状，等。在一个实施方案中，使用生物标志物来鉴定预期在用药物(例如抗c-met抗体)治疗时相对于不以相同水平表达该生物标志物的患者具有更大无进展存活(PFS)的患者。
“存活”(survival)指患者保持存活，而且包括总体存活(overall survival)和无进展存活(progress free survival)。
“总体存活”指保持一定时期诸如1年、5年等存活的患者，自诊断或治疗时起计算。
“无进展存活”指保持存活且癌症没有进展或恶化的患者。
“延长存活”意味着使接受治疗的患者的总体存活或无进展存活相对于未接受治疗的患者(即相对于未用药物治疗的患者)，或相对于不以指定水平表达生物标志物的患者，和/或相对于用已获批准的抗肿瘤剂(诸如厄洛替尼的化疗方案)治疗的患者有延长。
“客观响应”(objective response)指可测量的响应，包括完全响应(CR)或部分响应(PR)。
“完全响应”(complete response)或“CR”指癌症的所有体征响应治疗而消失。这并不总是意味着癌症已经治愈。
“部分响应”(partial response)或“PR”指一处或多处肿瘤或损害的大小或体内癌症的程度响应治疗而减小。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的包括那些早就患有良性、癌前、或非转移性肿瘤的以及要预防癌症发生或复发的。
术语“治疗有效量”指治疗剂在哺乳动物中治疗或预防疾病或病症的量。在癌症的情况中，治疗有效量的治疗剂可减少癌细胞的数目；缩小原发性肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。
术语“癌(症)”和“癌(性)的”指向或描述哺乳动物中典型的以不受调节的细胞生长为特征的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”指非侵入性的或转移性的，或者归为0期、I期、或II期癌症的癌症。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺氏细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括黑素瘤、结肠直肠癌、甲状腺癌(例如乳头状甲状腺癌)、非小细胞肺癌(NSCLC)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer)包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer或hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney或renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤；结肠直肠癌；甲状腺癌，例如乳头状甲状腺癌；或卵巢癌。
术语“多核苷酸”在以单数或复数使用时一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链区和双链区的DNA、单链和双链RNA、及包含单链区和双链区的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，它可以是单链的，或者更典型的是双链的，或者包含单链区和双链区。另外，术语“多核苷酸”在用于本文时指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。此类区中的链可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包含一种或多种分子的整个，但是更典型的是只包含有些分子的一个区。三股螺旋区的分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括包含一种或多种经修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，主链为稳定性或其它原因而修饰的DNA或RNA也是“多核苷酸”该术语在本文中的意图所在。此外，包含罕见碱基诸如肌苷或经修饰碱基诸如氚化碱基的DNA或RNA也包括在本文中所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶学和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞，包括简单和复杂细胞的特征性的DNA和RNA的化学形式。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)()；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)()、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou等人.,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂()、脂质体多柔比星TLC D-99()、PEG化脂质体多柔比星()、和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)()、替加氟(tegafur)()、卡培他滨(capecitabine)()、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS NaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)()、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)()；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)()、长春新碱(vincristine)()、长春地辛(vindesine)(,)、和长春瑞滨(vinorelbine)()；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovovin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)()；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)()、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)()、阿伦膦酸盐(alendronate)()、帕米膦酸盐(pamidronate)()、替鲁膦酸盐(tiludronate)()或利塞膦酸盐(risedronate)()；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmRH(例如)；BAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(例如PS341)；bortezomib()；CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersen sodium()；pixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
在本文中，化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)()、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)()、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)()和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)()，和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole)()、来曲唑(letrozole)()和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)()、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)()、法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)(和)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。
本文中化疗剂或化疗方案的具体例子包括：烷化剂类(例如苯丁酸氮芥、苯达莫司汀(bendamustine)、或环磷酰胺)；核苷类似物或抗代谢物(例如氟达拉滨)、氟达拉滨和环磷酰胺(FC)；泼尼松或泼尼松龙(prednisolone)；含烷化剂的组合疗法，包括环磷酰胺、长春新碱、泼尼松龙(CHOP)，或环磷酰胺、长春新碱、泼尼松龙(CVP)，等。
“目标受众(target audience)”指接受如通过推销或做广告(尤其为了特定用途、治疗、或适应症)进行的特定药物宣传或意图进行的特定药物宣传的人群或机构，诸如患者个体，患者群体，报纸、医学文献、和杂志读者，电视或因特网观众，无线电或因特网听众，内科医生，药品公司，等。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、要与包装的产品组合的其它治疗产品、和/或警告等的信息。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性的CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci。13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。在一个实施方案中，本文中的c-met抗体包含SEQ ID NO：1-6的HVR。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
在用于本文时，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“药物配制剂”指其形式容许药物的生物学活性是有效的，且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的无菌制备物。
“无菌”配制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
“试剂盒”指包含至少一种试剂(例如用于治疗癌症(例如黑素瘤、结肠直肠癌)的药物，或用于特异性检测生物标志物基因或蛋白的试剂(例如抗体))的任何制品(例如包装或容器)。所述制品优选以用于实施本发明方法的单位来宣传、分发、或销售。
“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
II.癌症药物
一方面，本发明特征在于c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂在治疗受试者中病理状况(诸如癌症)的组合疗法中的用途。另一方面，本发明涉及基于一种或多种本文中公开的生物标志物的表达来选择能用癌症药物治疗的患者。癌症药物的例子包括但不限于：
-c-met拮抗剂，包括抗c-met抗体；
-B-raf拮抗剂；
-化疗剂和化疗方案；
-用于治疗癌症(例如黑素瘤)的开发中的或已批准的其它药物或其组合。
c-met拮抗剂的例子包括但不限于可溶性c-met受体、可溶性HGF变体、结合c-met或HGF的适体(apatmer)或肽体(peptibody)、c-met小分子、抗c-met抗体和抗HGF抗体。
在一个实施方案中，c-met拮抗剂是抗体，例如针对或结合c-met的抗体。本文中的抗体包括：单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、单臂抗体、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。在一个实施方案中，抗体是单价的。在另一个实施方案中，抗体是包含Fc区的单臂抗体(即重链可变域和轻链可变域形成单一抗原结合臂)，其中Fc区包含第一和第二Fc多肽，其中第一和第二Fc多肽以复合物存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。单臂抗体可以是单价的。
在另一个实施方案中，抗c-met抗体是MetMAb(onartuzumab)或其生物相似形式。MetMAb公开于例如WO2006/015371；Jin et al,Cancer Res(2008)68:4360。在另一个实施方案中，抗c-met抗体包含重链可变域，其包含下述一项或多项：(a)HVR1-HC，其包含序列GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:1)；(b)HVR2-HC，其包含序列GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:2)；和/或(c)HVR3-HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，抗体包含轻链可变域，其包含下述一项或多项：(a)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:4)；HVR2-LC，其包含序列WASTRES(SEQ ID NO:5)；和/或(c)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，抗c-met抗体包含重链可变域和轻链可变域，该重链可变域包含：(a)HVR1-HC，其包含序列GYTFTSYWLH(SEQID NO:1)；(b)HVR2-HC，其包含序列GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ IDNO:2)；和(c)HVR3-HC，其包含序列ATYRSYVTPLDY(SEQ ID NO:3)，该轻链可变域包含：(a)HVR1-LC，其包含序列KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQID NO:4)；HVR2-LC，其包含序列WASTRES(SEQ ID NO:5)；和(c)HVR3-LC，其包含序列QQYYAYPWT(SEQ ID NO:6)。
在任何上述实施方案中，例如，抗c-met抗体可以是人源化的。在一个实施方案中，抗c-met抗体包含任何上述实施方案中的HVR，且进一步包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。
另一方面，抗c-met抗体包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗c-met抗体保留结合人c-met的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:7中替代、改变插入和/或删除了总共1到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗c-met抗体包含SEQ ID NO:7中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
另一方面，提供抗c-met抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)、插入、或删除，但是包含该序列的抗c-met抗体保留结合c-met的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:8中替代、插入和/或删除了总共1到10个氨基酸。在某些实施方案中，替代、插入、或删除存在于HVR以外的区域(即在FR中)。任选地，抗c-met抗体包含SEQ ID NO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在还有另一个实施方案中，抗c-met抗体包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VL区和与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的VH区。在还有又一个实施方案中，抗c-met抗体包含：HVR-L1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；HVR-L2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；HVR-L3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；HVR-H1，其包含氨基酸序列SEQID NO:4；HVR-H2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；和HVR-H3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。
另一方面，提供抗c-met抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。
又一方面，本发明提供与本文中提供的抗c-met抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供与下述抗c-met抗体结合相同表位或能被下述抗c-met抗体竞争性抑制的抗体，该抗c-met抗体包含VH序列SEQ IDNO:7和VL序列SEQ ID NO:8。
在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的抗c-met抗体可以是单克隆抗体，包括单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗c-met抗体是抗体片段，例如单臂、Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体、或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1或IgG4抗体或其它抗体类或同种型，如本文中定义的。依照另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体包含上文所述HVR或包含上文所述VH和VL区。
在一些实施方案中，抗c-met抗体是单价的，而且包含下述各项(或由下述各项组成或基本上由下述各项组成)：(a)第一多肽，其包含重链可变域(其具有序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:7))、CH1序列、和第一Fc多肽；(b)第二多肽，其包含轻链可变域(其具有序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:8))、和CL1序列；和(c)第三多肽，其包含第二Fc多肽，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂，其中第一和第二Fc多肽在复合物中存在且形成Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，该Fc区提高所述抗体片段的稳定性。在一些实施方案中，第一多肽包含Fc序列CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)，而第二多肽包含Fc序列CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)。
在另一些实施方案中，抗c-met抗体是单价的，而且包含：(a)第一多肽，其包含重链，所述多肽包含序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATYRSYVTPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)；(b)第二多肽，其包含轻链，所述多肽包含序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:12)；和第三多肽，其包含Fc序列，所述多肽包含序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:13)，其中重链可变域和轻链可变域作为复合物存在且形成单一抗原结合臂。
本文中描述了且本领域知道适合用于本发明方法的其它抗c-met抗体。例如，WO05/016382中公开的抗c-met抗体(包括但不限于抗体13.3.2、9.1.2、8.70.2、8.90.3)；由以ICLC编号PD03001保藏于CBA(Genoa)的杂交瘤细胞系生成或识别HGF受体β链胞外域上表位(所述表位与该单克隆抗体识别的表位相同)的抗c-met抗体；WO2007/126799中公开的抗c-met抗体(包括但不限于04536、05087、05088、05091、05092、04687、05097、05098、05100、05101、04541、05093、05094、04537、05102、05105、04696、04682)；WO2009/007427中公开的抗c-met抗体(包括但不限于于2007年3月14日以编号I-3731、于2007年3月14日以编号I-3732、于2007年7月6日以编号I-3786、于2007年3月14日以编号I-3724保藏于CNCM(Institut Pasteur,Paris,France)的抗体)；20110129481中公开的抗c-met抗体；US20110104176中公开的抗c-met抗体；WO2009/134776中公开的抗c-met抗体；WO2010/059654中公开的抗c-met抗体；WO2011020925中公开的抗c-met抗体(包括但不限于自于2008年3月12日以编号I-3949保藏于CNCM(Institut Pasteur,Paris,France)的杂交瘤和于2010年1月14日以编号I-4273保藏的杂交瘤分泌的抗体)。
一方面，抗c-met抗体包含促进抗体片段内Fc序列的异二聚化，同时将同二聚化降至最低的至少一项特征。此类特征改善免疫球蛋白群体的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，抗体包含构成“结”和“穴”的Fc突变，如WO2005/063816中描述的。例如，穴突变可以是Fc多肽中的T366A、L368A和/或Y407V中的一项或多项，而空穴突变可以是T366W。
在一些实施方案中，c-met拮抗剂是抗肝细胞生长因子(HGF)抗体，例如人源化抗HGF抗体TAK701、rilotumumab、Ficlatuzumab、和/或WO2007/143090中描述的人源化抗体2B8。在一些实施方案中，抗HGF抗体是US7718174B2中描述的抗HGF抗体。
在一些实施方案中，c-met拮抗剂是c-met小分子抑制剂。小分子抑制剂优选是除本文中定义的结合多肽或抗体以外的，结合(优选特异性结合c-met的有机分子。在一些实施方案中，c-met小分子抑制剂是选择性c-met小分子抑制剂。在一些实施方案中，c-met拮抗剂是激酶抑制剂。
特异性结合HGF的c-met受体分子或其片段能在本发明的方法中使用，例如用于结合和隔绝HGF蛋白质，由此阻止其信号传导。优选地，c-met受体分子或其HGF结合片段是可溶性形式。在一些实施方案中，所述受体的可溶性形式通过结合HGF，由此阻止它结合其在靶细胞表面上存在的天然受体而对c-met蛋白质的生物学活性发挥抑制效果。还包括c-met受体融合蛋白，下文描述了它的例子。
本发明的可溶性c-met受体蛋白质或嵌合c-met受体蛋白质包括没有经跨膜结构域固定至细胞表面的c-met受体蛋白质。因此，c-met受体的可溶性形式(包括嵌合受体蛋白质)在能够结合和灭活HGF的同时不包含跨膜结构域且如此一般不变成与表达该分子的细胞的细胞膜结合。参见例如Kong-Beltran,M et al Cancer Cell(2004)6(1):75-84。
特异性结合c-met并阻断或降低c-met活化，由此阻止它发信号的HGF分子或其片段能在本发明的方法中使用。
适体是形成特异性结合靶分子(诸如HGF或c-met多肽)的三级结构的核酸分子。适体的生成和治疗用途是本领域已完善建立的。参见例如美国专利No.5,475,096。HGF适体是PEG化的修饰的寡核苷酸，其采取使之能够结合细胞外HGF的三维构象。关于适体的别的信息可见于美国专利申请公开文本No.20060148748。
肽体是与编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列相连接的肽序列。多肽可衍生自随机化序列，通过任何方法来选择特异性结合，包括但不限于噬菌体展示技术。在一个优选的实施方案中，可以将所选择的多肽连接至编码免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列。特异性结合并拮抗HGF或c-met的肽体在本发明的方法中也是有用的。
在一个实施方案中，c-met拮抗剂结合c-met胞外域。在一些实施方案中，c-met拮抗剂结合c-met激酶域。在一些实施方案中，c-met拮抗剂与肝细胞生长因子(HGF)竞争c-met结合。在一些实施方案中，c-met拮抗剂结合HGF。
在某些实施方案中，c-met拮抗剂是下述任一：GDC-0712，SGX-523，Crizotinib(PF-02341066；3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺；CAS no.877399-52-5)；JNJ-38877605(CAS no.943540-75-8)，BMS-698769，PHA-665752(Pfizer)，SU5416，INC-280(Incyte；SU11274(Sugen；[(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基哌嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亚甲基)-N-甲基-2-氧二氢吲哚-5-磺酰胺；CAS no.658084-23-2])，Foretinib(GSK1363089)，XL880(CAS no.849217-64-7；XL880是met和VEGFR2和KDR的抑制剂)；MGCD-265(MethylGene；MGCD-265靶向c-MET、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、Ron和Tie-2受体；CAS no.875337-44-3)，Tivantinib(ARQ197；(-)-(3R,4R)-3-(5,6-二氢-4H-吡咯[3,2,1-ij]喹啉-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)吡咯烷-2,5-二酮；参见Munchi et al,Mol CancerTher June20109；1544；CAS no.905854-02-6)，LY-2801653(Lilly)，LY2875358(Lilly)，MP-470，Rilotumumab(AMG102，抗HGF单克隆抗体)，抗体223C4或人源化抗体223C4(WO2009/007427)，人源化L2G7(人源化TAK701；人源化抗HGF单克隆抗体)；EMD1214063(Merck Sorono)，EMD1204831(Merck Serono)，NK4，Cabozantinib(XL-184，CAS no.849217-68-1；carbozantinib是met和VEGFR2的一种双重抑制剂)，MP-470(SuperGen；是c-KIT、MET、PDGFR、Flt3、和AXL的一种新型抑制剂)，Comp-1，Ficlatuzumab(AV-299；抗HGF单克隆抗体)，E7050(Cas no.1196681-49-8；E7050是一种双重c-met和VEGFR2抑制剂(Esai)；MK-2461(Merck；N-((2R)-1,4-二恶烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-氧-5H-苯并[4,5]环庚[1,2-b]吡啶-7-基]磺酰胺；CAS no.917879-39-1)；MK8066(Merck)，PF4217903(Pfizer)，AMG208(Amgen)，SGX-126，RP1040，LY2801653，AMG458，EMD637830，BAY-853474，DP-3590。在某些实施方案中，c-met拮抗剂是crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、rilotumumab、foretinib、h224G11、DN-30、MK-2461、E7050、MK-8033、PF-4217903、AMG208、JNJ-38877605、EMD1204831、INC-280、LY-2801653、SGX-126、RP1040、LY2801653、BAY-853474,和/或LA480中任一种或多种。在某些实施方案中，c-met拮抗剂是crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、rilotumumab、和/或foretinib中任一种或多种。在一些实施方案中，c-met拮抗剂是GDC-0712。
B-raf拮抗剂是本领域已知的且包括例如sorafenib、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、及WO2007/002325、WO2007/002433、WO2009111278、WO2009111279、WO2009111277、WO2009111280和美国专利No.7,491,829中记载的那些。其它B-raf拮抗剂包括vemurafenib(也称作和PLX-4032)、GSK2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是选择性B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是B-raf V600的选择性拮抗剂。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是B-raf V600E的选择性拮抗剂。在一些实施方案中，B-rafV600是B-raf V600E、B-raf V600K、和/或V600D。在一些实施方案中，B-rafV600是B-raf V600R。
B-raf拮抗剂可以是小分子抑制剂。小分子抑制剂优选是除本文中限定的结合(优选特异性地)B-raf的多肽或抗体以外的有机分子。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是激酶抑制剂。在一些实施方案中，B-raf拮抗剂是抗体、肽、肽模拟物、适体(aptomer)或多核苷酸。
在一个实施方案中，抗体(例如本文方法中使用的抗体)可掺入任何单一或组合特征，如下文1-6节描述的。
1.抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，单臂抗体，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,于ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还可见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；见例如美国专利No.6,248,516B1)。
单臂抗体(即重链可变域和轻链可变域形成单一抗原结合臂)公开于例如WO2005/063816；Martens et al,Clin Cancer Res(2006),12:6144。对于需要拮抗功能且抗体二价性导致不想要的激动效应的病理状况治疗，单臂抗体(即包含单一抗原结合臂的抗体)的单价性状导致和/或确保抗体结合靶分子时的拮抗功能。另外，包含Fc区的单臂抗体的特征在于与具有相似/基本上相同的抗原结合特征的Fab形式相比卓越的药动学属性(诸如体内降低的清除速率和/或延长的半衰期)，如此克服使用常规单价Fab抗体的主要缺点。用于制备单臂抗体的技术包括但不限于“结入穴”工程(参见例如美国专利No.5,731,168)。MetMAb是单臂抗体的一个例子。
可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。
2.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
3.人抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
4.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并且进一步记载于例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；及Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373、和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对c-met，而另一种针对任何其它抗原(例如B-raf)。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合c-met的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达c-met的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)、WO93/08829、和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.,147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合c-met及另一种不同抗原(诸如EGFR)的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US2008/0069820)。
6.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US2003/0157108A1,Presta,L；及WO2004/056312A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)。
在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312，及Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区的位置298、333、和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中，对Fc区做出改变，其导致改变的(即，改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代，例如，Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如，“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，并且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
在一个实施方案中，药物是包含与一种或多种细胞毒剂，诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合的抗体(诸如c-met抗体)的免疫缀合物。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296；Hinman等,Cancer Res.53:3336-3342(1993)；及Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢霉素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗体。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时，它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子，例如tc99m或I123，或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像，mri)用的自旋标记物，诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,Cancer Res52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖，但不限于用交联试剂制备的此类缀合物，所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB，及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是商品化的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
化疗剂
本发明的联合疗法可另外包含用一种或多种化疗剂进行的治疗。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用或同时施用和任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。如果施用的话，由于药物的组合作用或可归于化疗剂施用的消极副作用，通常以关于它们已知的或任选降低的剂量施用化疗剂。可依照制造商的说明书或根据从业人员凭经验确定的那样使用此类化疗剂的制备和剂量给药日程。
上文公开了可组合的多种化疗剂。在一些实施方案中，要组合的化疗剂选自下组：类紫杉醇(taxoid)(包括多西他塞(docetaxel)和帕利他塞(paclitaxel))、长春药(vinca)(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine))、铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin))、芳香酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrazole)、或依西美坦(exemestane))、抗雌激素(例如氟维司群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen))、依托泊苷(etoposide)、塞替哌(thiotepa)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、PEG化脂质体多柔比星(pegylated liposomal doxorubicin)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、或蛋白体抑制剂(例如PS342)。在一些实施方案中，化疗剂为替莫唑胺(temozolomide)和/或达卡巴嗪(dacarbazine)。
III.组合疗法
一方面，提供了用于治疗具有癌症的患者的方法，其包括施用有效(例如治疗有效)量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，c-met拮抗剂为抗c-met抗体(例如MetMAb)。在一些实施方案中，治疗包括与B-raf拮抗剂(诸如vemurafenib)组合施用抗c-met抗体(例如MetMAb)。在一些实施方案中，抗c-met抗体为MetMAb(onartuzumab)。
另一方面，提供了用于治疗形成对B-raf拮抗剂的抗性的可能性升高的癌症患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于提高对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于恢复对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于延长B-raf拮抗剂敏感性时段的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于治疗具有B-raf抗性癌症的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于延长对B-raf拮抗剂的响应的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了延迟或阻止形成HGF介导的B-raf抗性癌症的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于治疗其癌症已显示表达B-raf生物标志物(例如突变型B-raf生物标志物)的患者的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物，并且如果该患者的癌症表达c-met生物标志物的话，施用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于治疗其癌症已显示表达B-raf生物标志物(例如突变型B-raf生物标志物)的患者的方法，其包括：(i)监测正在用b-raf拮抗剂治疗的患者以确定该患者的癌症是否形成c-met生物标志物表达，并(ii)在该患者的癌症显示出表达c-met生物标志物的情况中修改该患者的治疗方案，在B-raf拮抗剂之外还包括c-met拮抗剂。
另一方面，提供了用于治疗其癌症已显示表达B-raf生物标志物(例如突变型B-raf生物标志物)的患者的方法，其包括：(i)监测正在用B-raf拮抗剂治疗的患者以确定该患者的癌症是否形成对该拮抗剂的抗性，(ii)测试该患者以确定该患者的癌症是否表达c-met生物标志物，并(iii)在该患者的癌症显示出表达c-met生物标志物的情况中修改该患者的治疗方案，在B-raf拮抗剂之外还包括c-met拮抗剂。
术语癌症涵盖增殖性病症的集合，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分(转移)(通常经由血流或在淋巴结所处位置经由淋巴系统)的能力。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类；转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝，恶性肿瘤的细胞变得越来越异常，而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade)，而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)(低级)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)(高级)。完全分化的细胞相当正常，表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。
癌症分期系统描述癌症在解剖学上已经传播了多远，而且试图将具有相似预后和处理的患者置于相同分期组中。可实施数项测试来帮助癌症分期，包括活检和某些影像检测诸如胸部x-射线、乳房x射线照片、骨扫描、CT扫描、和MRI扫描。验血和临床评估也用于评估患者的整体健康和检测癌症是否已经传播至某些器官。
为了对癌症分期，美国癌症联合委员会(American Joint Committee onCancer)首先使用TNM分类系统将癌症(特别是实体瘤)置于字母分类中。给癌症指派字母T(肿瘤大小)、N(可触知的结节)、和/或M(转移)。T1、T2、T3、和T4描述渐增的原发性病灶尺寸；N0、N1、N2、N3指示渐进发展中的结节累及；而M0和M1反映远端转移的存在与否。
在第二种分期方法中，也称作整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)，将癌症分成0期至IV期，掺入了原发性病症的尺寸以及结节传播和远端转移的存在。在这种系统中，将癌症分组成四期，以罗马数字I至IV表示，或者归类为“复发”。对于有些癌症，0期称作“原位”或“Tis”，诸如乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级腺瘤也可归类为0期。一般而言，I期癌症是小的局限性癌症，其通常是可治愈的，而IV期通常代表不能手术治疗的或转移性的癌症。II期和III期癌症通常是局部高级的和/或展现出涉及局部淋巴结。一般而言，较高期数指示更严重的(extensive)疾病，包括更大的肿瘤尺寸和/或癌症传播至邻近原发性肿瘤的附近淋巴结和/或器官。这些阶段有精确定义，但是定义对每一种癌症是不同的，而且是熟练技术人员已知的。
许多癌症登记诸如NCI的“监视流行病学和最终结果程序”(Surveillance,Epidemiology,and End Results Program)(SEER)使用概括分期(summarystaging)。这种系统用于所有类型的癌症。它将癌症病历分成五大类：
“原位”指只存在于它开始的细胞层中的早期癌症。
“局限性的”指癌症限于它开始的器官，没有传播的证据。
“区域性的”指癌症已经传播超出起源(原发性)部位至附近的淋巴结或器官和组织。
“远端的”指癌症自原发性部位传播至远端器官或远端淋巴结。
“未知的”用于描述没有足够信息来指明阶段的情况。
另外，癌症在原发性肿瘤被清除后几个月或几年复现是常见的。在所有可见的肿瘤都被根除后复现的癌症称作复发性疾病。在原发性肿瘤的区域中复现的疾病是局部复发的，而作为转移复现的疾病称作远端复发。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenousleukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。上皮细胞实体瘤的例子包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤(例如B-raf突变体黑素瘤)。在一些实施方案中，癌症为结肠直肠癌。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌(例如Her2阳性乳腺癌)。在一些实施方案中，癌症为乳头状甲状腺癌。定义中提供了癌症的其它例子。
在一些实施方案中，患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物。在一些实施方案中，B-raf生物标志物为突变型B-raf。在一些实施方案中，突变型B-raf为B-raf V600。在一些实施方案中，B-raf V600为B-raf V600E。在一些实施方案中，突变型B-raf为组成性有活性的。
在一些实施方案中，患者的癌症已显示表达c-met生物标志物。本文中描述了c-met活性和表达的检测。
在一些实施方案中，B-raf抗性癌症意味着癌症患者在接受B-raf拮抗剂疗法时有进展(即该患者是“B-raf不应性的”)，或者患者在完成基于B-raf拮抗剂的疗法方案之后1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月，或更久内有进展。
在一些实施方案中，vemurafenib抗性癌症意味着癌症患者在接受基于vemurafenib的疗法时有进展(即该患者是“vemurafenib不应性的”)，患者患者在完成基于B-raf拮抗剂的疗法方案1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8个月，9个月，10个月，11个月，12个月，或更久内有进展。
在一些实施方案中，在用B-raf拮抗剂治疗后或者例如在暴露于HGF后(例如HGF介导的抗性)形成(获得)对例如B-raf抑制剂的抗性。在其它实施方案中，患者(例如具有B-raf抗性癌症的患者)先前没有用B-raf拮抗剂治疗过。
在一些实施方案中，患者当前正在用B-raf拮抗剂治疗。在一些实施方案中，患者先前用B-raf拮抗剂治疗过。在一些实施方案中，患者先前没有用B-raf拮抗剂治疗过。
一方面，用别的癌症药物治疗癌症患者。在一些实施方案中，别的癌症药物是化疗剂。在一些实施方案中，别的癌症药物是Yervoy。在一些实施方案中，别的癌症药物是癌症免疫疗法药剂。在一些实施方案中，别的癌症药物是一种不同的(别的)B-raf拮抗剂。在一些实施方案中，别的癌症药物是一种不同的(别的)c-met拮抗剂。
一方面，提供了用于降低癌细胞中B-raf磷酸化的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞中PI3K介导的信号传导的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞中PI3K介导的信号传导的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞中MAPk介导的信号传导的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞中AKT介导的信号传导的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞中ERK介导的信号传导的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞中B-raf介导的信号传导的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于降低癌细胞生长和/或增殖，或提高癌细胞凋亡的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
一方面，提供了用于提高癌细胞凋亡的方法，其包括使细胞接触B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。在一些实施方案中，细胞对B-raf拮抗剂有抗性(在一些实施方案中，已经形成了对B-raf拮抗剂的抗性)。在一些实施方案中，细胞表达c-met生物标志物。
会以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中所使用的治疗剂。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体受试者、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、要组合的药剂的药物-药物相互作用、和医学从业人员知道的其它因素。
使用本领域已知的标准方法通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备治疗用配制剂(Remington’sPharmaceutical Sciences(第20版),A.Gennaro编,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水，或缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
任选但优选的是，配制剂含有药学可接受盐，优选氯化钠，且优选大约为生理浓度。任选的是，本发明的配制剂可含有药学可接受防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的浓度范围为0.1-2.0％，典型的是v/v。合适的防腐剂包括药学领域已知的那些。苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、和对羟基苯甲酸丙酯是优选的防腐剂。任选的是，本发明的配制剂可包括药学可接受表面活性剂，其浓度为0.005-0.02％。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington’s PharmaceuticalSciences,见上文。
依照已知方法给人类患者施用本发明的治疗剂，诸如静脉内施用(像推注或通过一段时间里的连续输注)，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径。回体(ex vivo)策略也可用于治疗性应用。回体策略涉及用编码c-met或B-raf拮抗剂的多核苷酸转染或转导自受试者获得的细胞。然后将经过转染或转导的细胞返回受试者。细胞可以是极其多种类型之任一，包括但不限于造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞、或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、或肌肉细胞。
例如，如果c-met或B-raf拮抗剂是抗体，那么通过任何合适手段施用抗体，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及(如果想要局部免疫抑制治疗的话)病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，合适的是，通过脉冲输注来施用抗体，特别是使用递减剂量的抗体。优选的是，通过注射给予剂量给药，最优选的是，通过静脉内或皮下注射给予剂量给药，这部分取决于施药是短期的还是长期的。
在另一个例子中，在病症或肿瘤位置允许时，局部施用c-met或B-raf拮抗性化合物，例如通过直接注射，而且可以周期性重复注射。也可以在手术切除肿瘤后系统地/全身地将c-met或B-raf拮抗剂投递至受试者或直接投递至肿瘤细胞，例如肿瘤或肿瘤床，用以预防或降低局部复发或转移。
组合中的治疗剂的施用通常在规定的时间段里进行(通常是数分钟、数小时、数天或数周，这取决于所选择的组合)。联合疗法旨在涵盖这些治疗剂以序贯方式的施用(也就是说，其中在不同时间施用每一种治疗剂)，以及这些治疗剂或治疗剂中至少两种以基本上同时的方式的施用。
可以通过相同路径或不同路径来施用治疗剂。例如，可以通过静脉内注射来施用组合中的B-raf和/或c-met拮抗剂，同时可以口服施用所述组合中的蛋白激酶抑制剂。或者，例如，可以口服施用这两种治疗剂，或者可以通过静脉内注射来施用这两种治疗剂，这取决于具体的治疗剂。治疗剂的施用次序也随着具体药剂而变化。
根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至100mg/kg(例如0.1-30mg/kg)每种治疗剂，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至约100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至根据上文所述方法的测量，癌症得到治疗。然而，其它剂量方案也可能是有用的。在一个例子中，如果c-met或B-raf拮抗剂是抗体，那么以范围为大约5mg/kg至大约150mg/kg的剂量每两至三周施用本发明的抗体。如果c-met或B-raf拮抗剂是口服小分子化合物，那么可以以范围为大约25mg/kg至大约50mg/kg的剂量每天施用药物。此外，本发明的口服化合物可以在传统的高剂量间歇方案下施用，或者使用没有安排中断的更低且更频繁的剂量(称作“节拍疗法”(metronomic therapy))来施用。在使用间歇方案时，例如，可以每天给予药物，持续2-3周，接着中断1周；或者，可以每天给予药物，持续4周，接着中断2周，这取决于日剂量和具体适应症。本发明疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
本申请涵盖通过基因疗法来施用c-met和/或B-raf拮抗剂。参见例如1996年3月14日公布的WO96/07321，其关注使用基因疗法来产生胞内抗体。
IV.诊断方法
在一些实施方案中，本文中的患者进行诊断测试，例如在治疗之前和/或期间和/或之后。
一方面，提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物(诸如突变型B-raf)。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗患者。
一方面，提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示患者很可能形成B-raf抗性癌症。在一些实施方案中，患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物(诸如突变型B-raf)。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗患者。
一方面，提供了用于测定c-met生物标志物表达的方法，包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示患者是用c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗的候选者：用于提高患者的癌症对B-raf拮抗剂敏感性，恢复患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性，延长患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性时段，和/或阻止患者的癌症中形成HGF介导的B-raf药物抗性。在一些实施方案中，患者的癌症已显示表达B-raf生物标志物(诸如突变型B-raf)。在一些实施方案中，c-met生物标志物表达为蛋白质表达且使用IHC在来自该患者的样品中测定。在一些实施方案中，用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗患者。
本发明还涉及用于为具有已显示表达B-raf生物标志物(例如突变型B-raf生物标志物)的癌症的患者选择疗法的方法，其包括在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物的表达，并基于该生物标志物的表达水平选择癌症药物。在一个实施方案中，如果癌症样品表达c-met生物标志物的话，选择患者用c-met拮抗剂(例如抗c-met抗体)与B-raf拮抗剂组合治疗。在一些实施方案中，使用治疗有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂对该患者治疗癌症。如此，在一些实施方案中，如果患者的癌症样品表达c-met生物标志物的话，选择患者用c-met拮抗剂(例如抗c-met抗体)治疗，并(在选择后)使用治疗有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂对该患者治疗癌症。在另一个实施方案中，如果癌症样品以基本上检测不到水平表达c-met生物标志物的话，选择患者用除c-met拮抗剂以外的癌症药物治疗。在一些实施方案中，使用治疗有效量的除c-met拮抗剂以外的癌症药物(例如用B-raf拮抗剂治疗)对该患者治疗癌症。如此，在一些实施方案中，如果癌症样品以基本上检测不到水平表达c-met生物标志物的话，选择患者用除c-met拮抗剂以外的癌症药物(例如B-raf拮抗剂，例如vemurafenib)治疗，并(在选择后)使用治疗有效量的c-met拮抗剂对该患者治疗癌症。
另一方面，本发明提供了用于将患者鉴定为用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗的候选者的方法，其包括测定患者的癌症表达c-met生物标志物。在一些实施方案中，患者已经(先前)用B-raf拮抗剂治疗过。在一些实施方案中，患者的癌症对所述B-raf拮抗剂有抗性(例如具有获得性抗性)。
另一方面，本发明提供了用于将患者鉴定为有风险形成对B-raf拮抗剂的抗性的方法，其包括测定患者的癌症表达c-met生物标志物。在一些实施方案中，患者已经(先前)用B-raf拮抗剂治疗过。在一些实施方案中，患者正在用B-raf拮抗剂治疗。
一方面，本发明提供了用于测定黑素瘤患者的预后的方法，其包括在来自该患者的样品中测定c-met生物标志物的表达，其中c-met生物标志物为HGF且HGF的表达是受试者中癌症的预兆。在一些实施方案中，升高的HGF表达是用B-raf抑制剂(例如vemurafenib)治疗患者时例如缩短的无进展存活和/或缩短的总体存活的预兆。在一些实施方案中，测定患者血清中的HGF表达，例如使用ELISA。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出中值HGF表达水平(诸如一种群体中的中值HGF表达水平)。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出例如约330ng/ml。在一些实施方案中，患者血清中的HGF表达超出约300ng/ml，310ng/ml，320ng/ml，330ng/ml，340ng/ml，350ng/ml，360ng/ml，370ng/ml，380ng/ml，390ng/ml，400ng/ml，420ng/ml，440ng/ml，460ng/ml，480ng/ml，500ng/ml，或更大。在一些实施方案中，选择患者用有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗。在一些实施方案中，用有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗患者。检测HGF表达，例如通过IHC(例如对肿瘤或肿瘤基质)。
用于检测c-met表达，活化和扩增的方法是本领域已知的。一方面，使用包括下述步骤的方法测定c-met生物标志物表达：(a)用抗c-met抗体对样品(诸如患者癌症样品)实施IHC分析；和(b)测定样品中的c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，相对于参照值确定c-met IHC染色强度。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，使用本文中公开的c-met染色强度评分方案(例如表A中的)来测定c-met生物标志物表达。在一些实施方案中，该方法进一步包括基于IHC得分将患者分层。在一些实施方案中，IHC得分为1。在一些实施方案中，IHC得分为0且在患者的癌症中观察到c-met表达。
在一些实施方案中，c-met表达为多核苷酸表达。在一些实施方案中，多核苷酸为RNA。在一些实施方案中，多核苷酸为DNA。在一些实施方案中，患者的癌症已显示表达大于2，大于3，大于4，大于5，大于6，大于7，大于8，或更高的c-met拷贝数(例如通过FISH分析)。在一些实施方案中，c-met拷贝数小于8，小于7，小于6，小于5，小于4，小于3。
本发明涵盖可以依照本发明的方法来检测HGF。如此，在一些实施方案中，c-met生物标志物为HGF，和在又一些实施方案中，HGF表达为自分泌表达。在一些实施方案中，在患者的癌症中检测HGF表达。在一些实施方案中，在患者的肿瘤基质中检测HGF表达。在一些实施方案中，在患者血清中检测HGF表达，例如使用ELISA。
一方面，使用如下方法测定c-met生物标志物表达，该方法包括测定样品(诸如患者的癌症样品)中c-met生物标志物表达的步骤，其中患者的样品已经使用抗c-met抗体进行IHC分析。在一些实施方案中，相对于参照值确定c-met IHC染色强度。在一些实施方案中，大量的c-met生物标志物(例如如使用c-met IHC或使用例如ELISA或IHC的HGF检测测定的)指示患者很可能具有B-raf拮抗剂抗性癌症。在一些实施方案中，高c-met为低的，中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，高c-met为中等的或高的测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met为低的或无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，“低”c-met表达为无测定c-met表达，例如相对于如本文中描述的对照细胞团粒A549，H441，H1155，和HEK-293的c-met染色强度而言。在一些实施方案中，使用本文中公开的c-met染色强度评分方案(例如表A中的)来测定c-met生物标志物表达。
在一些实施方案中，IHC分析进一步包括形态学染色，或是在之前或是在之后。在一个实施方案中，使用苏木精对载玻片的细胞核染色。苏木精广泛可得。合适的苏木精的一个例子是苏木精II(Ventana)。当期望浅蓝色核时，可以在苏木精染色之后使用发蓝试剂。本文中公开了使用IHC检测c-met生物标志物，而且本文中公开了c-met染色强度评分方案，例如表A中的。如本文中记录的，可以检测其它生物标志物。本文中公开了例示性的其它生物标志物。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，高c-met生物标志物表达为met诊断阳性临床状态，如依照本文中表A定义的。在本文中公开的任何发明的一些实施方案中，低c-met生物标志物表达为met诊断阴性临床状态，如依照本文中表A定义的。
一方面，使用包括下述步骤的方法来测定c-met生物标志物表达：(a)实施Western印迹，ELISA，磷酸-ELISA，使用磷酸-met抗体的IHC，使用抗HGF抗体的IHC中的一项或多项；并(b)测定样品中c-met生物标志物(包括例如HGF)的表达。
一方面，使用包括下述步骤的方法来测定c-met活化：(a)实施使用磷酸-c-met抗体的IHC或磷酸-ELISA中的一项或多项；并(b)测定样品中磷酸-c-met生物标志物(例如磷酸-c-met)的存在。
一方面，使用如下方法测定c-met生物标志物表达，该方法包括测定c-met下游信号传导途径分子的表达或活性，例如AKT(例如磷酸-AKT)的表达或活性，ERK(例如磷酸-ERK)的表达或活性的步骤。
一方面，使用包括下述步骤的方法来测定c-met生物标志物表达：(a)对样品(诸如患者癌症样品)实施基因表达序型分析，PCR(诸如rtPCR或等位基因特异性PCR)，5’核酸酶测定法(例如Taq-man)，RNA-seq，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，原位杂交(例如针对c-met和/或HGFmRNA)，IHC(例如针对c-met和/或HGF多肽)或FISH；并(b)测定样品中的c-met生物标志物表达。
如本文中记录的，可以检测其它生物标志物。本文中公开了例示性的其它生物标志物。在一些实施方案中，检测ALK生物标志物。在一些实施方案中，检测FGF，FGFR，PDGF，和/或PGFR生物标志物中的一项或多项。
用于检测B-raf和突变型B-raf的方法是本领域已知的且商品化的。参见例如Hailat et al,Diagn Mol Pathol.2012Mar；21(1):1-8。在一些实施方案中，使用如下方法检测V600E突变(也称作V599E(1796T>A))，该方法包括测定外显子15的密码子600中核苷酸第1799位处单碱基突变(T>A)的存在。此突变也可源自核苷酸第1799-1800位处的双碱基突变TG>AA。也可以通过评估第1799位来检查该双碱基突变。在一些实施方案中，还可以对核酸评估第1800位处替代的存在。密码子600处也可存在其它突变。这些包括V600K，V600D，和V600R。在一些实施方案中，检测V600E突变的特征也能检测其它密码子600突变，例如V600D，V600K和/或V600R。在一些实施方案中，探针还能检测密码子601处的突变。
V600E突变的存在可以通过对核酸(例如基因组DNA或mRNA)评估第1799位处碱基替代的存在测定。在一些实施方案中，核酸分析方法为下述一项或多项：使用等位基因特异性寡核苷酸的杂交，引物延伸，等位基因特异性连接，测序，或电泳分离技术，例如单链构象多态性(SSCP)和异源双联体分析。例示性测定法包括5′核酸酶测定法，等位基因特异性PCR，模板指导的染料-终止子掺入，分子信标等位基因特异性寡核苷酸测定法，单碱基延伸测定法，和使用实时焦磷酸测序的突变分析。可以使用各种技术(诸如微芯片，荧光极化测定法，和矩阵辅助激光解吸附离子化(MALDI)质谱术)来实施对扩增序列的分析。可使用的两种别的方法是基于Flap核酸酶的侵入性切割的测定法和采用挂锁探针的方法。
在一些实施方案中，突变型B-raf为B-raf V600E(包含V600E突变(GTG>GAG)的B-raf多肽)。在一些实施方案中，突变型B-raf为B-raf V600K(GTG>AAG)，V600R(GTG>AGG)，V600E(GTG>GAA)和/或V600D(GTG>GAT)中的一种或多种。在一些实施方案中，突变型B-raf为残基V600处的突变体。在一些实施方案中，突变型B-raf多核苷酸包含T1799A突变。在一些实施方案中，突变型B-raf多核苷酸包含外显子11和/或外显子15中的突变。在一些实施方案中，使用包括下述步骤的方法来检测突变型B-raf表达：(a)对样品(诸如患者癌症样品)实施基因表达序型分析，PCR(诸如rtPCR或等位基因特异性PCR)，5’核酸酶测定法，IHC，杂交测定法，RNA-seq，微阵列分析，SAGE，MassARRAY技术，或FISH中的一项或多项；并(b)测定样品中突变型B-raf生物标志物的表达。在一些实施方案中，使用包括下述步骤的方法来检测突变型B-raf生物标志物表达：(a)对自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸实施PCR；并(b)测定样品中突变型B-raf生物标志物的表达。
对来自患者的样品测试本文中一种或多种生物标志物的表达。组织或细胞样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的，冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检或吸出物；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。本文中肿瘤样品的例子包括但不限于肿瘤活检、肿瘤细胞、血清或血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。在一个实施方案中，患者样品为福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤样品(例如黑素瘤肿瘤样品或结肠直肠癌肿瘤样品或肿瘤基质的样品)。可以在用癌症药物(诸如抗c-met拮抗剂)治疗患者之前获得样品。可以自原发性肿瘤或自转移性肿瘤获得样品。可以在第一次诊断癌症时或者例如在肿瘤已经转移之后获得样品。在一些实施方案中，肿瘤样品为肺，皮肤，淋巴结，骨，肝，结肠，甲状腺，和/或卵巢的。
用于测定基因扩增、蛋白质、或mRNA表达的各种方法包括但不限于基因表达序型分析、聚合酶链式反应(PCR)(包括定量实时PCR(qRT-PCR))、等位基因特异性PCR、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达连续分析(SAGE)、MassARRAY、蛋白质组学、免疫组织化学(IHC)、等。在一些实施方案中，对蛋白质表达定量。此类蛋白质分析可以使用IHC来实施，例如对患者肿瘤样品实施。
现在会更加详细地描述用于测定生物标志物表达的各种例示性方法。
1.基因表达序型分析
一般而言，基因表达序型分析的方法可分成两大组：基于多核苷酸杂交分析的方法，和基于多核苷酸测序的方法。本领域中已知用于样品中mRNA表达定量的最常使用的方法包括Northern印迹和原位杂交(Parker&Barnes,Methods in Molecular Biology106:247-283(1999))；RNA酶保护测定法(Hod,Biotechniques13:852-854(1992))；及聚合酶链反应(PCR)(Weis等,Trends inGenetics8:263-264(1992))。或者，可采用能识别特定双链体(包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体)的抗体。基于测序的基因表达分析的代表性方法包括基因表达连续分析(SAGE)和通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析。
2.聚合酶链式反应(PCR)和5’核酸酶测定法
一种灵敏且灵活的定量方法是PCR，其例如可用于比较不同样品群中的，正常和肿瘤组织中的，有或无药物处理下的mRNA水平，表征基因表达样式，区分密切相关的mRNA，及分析RNA结构。然而，应当注意，本文所述核酸分析方法中也可使用其它核酸扩增方案(即除PCR以外的)。例如，合适的扩增方法包括连接酶链式反应(参见例如Wu&Wallace,Genomics4:560-569,1988)；链置换测定法(参见例如Walker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-396,1992；美国专利No.5,455,166)；和数种基于转录的扩增系统，包括美国专利No.5,437,990、5,409,818、和5,399,491中记载的方法；转录扩增系统(TAS)(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177,1989)；和自持续序列复制(3SR)(Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878,1990；WO92/08800)。或者，可使用扩增探针至可检测水平的方法，诸如Qβ-复制酶扩增(Kramer&Lizardi,Nature339:401-402,1989；Lomeli et al.,Clin.Chem.35:1826-1831,1989)。例如Abramson and Myers inCurrent Opinion in Biotechnology4:41-47,1993提供了关于已知扩增方法的综述。
可以从起始组织样品分离mRNA。起始材料典型的是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，可从多种原发性肿瘤中分离RNA，包括乳房、肺、结肠、前列腺、脑、肝、肾、胰、脾、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等肿瘤或肿瘤细胞系，及来自健康供体的合并DNA。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，那么mRNA可从例如冷冻的或归档的石蜡包埋且固定(例如福尔马林固定)的组织样品提取。用于提取mRNA的通用方法是本领域众所周知的，公开于分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等人，《Current Protocols of Molecular Biology》，John Wiley and Sons，1997。用于从石蜡包埋组织提取RNA的方法公开于例如Rupp and Locker,Lab Invest.56:A67(1987)；De Andrés et al.,BioTechniques18:42044(1995)。具体而言，RNA分离可使用来自商业制造商诸如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶依照制造商的说明书进行。例如，来自培养细胞的总RNA可使用QiagenRNeasy微型柱分离。其它商品化RNA分离试剂盒包括完整DNA和RNA纯化试剂盒(,Madison,Wis.)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion,Inc.)。来自组织样品的总RNA可使用RNA Stat-60(Tel-Test)分离。从肿瘤制备的RNA可通过例如氯化铯密度梯度离心来分离。
由于RNA不能充当PCR的模板，在一些实施方案中，通过PCR进行基因表达序型分析的第一步是将RNA模板逆转录成cDNA，接着是它在PCR反应中的指数式扩增。在其它实施方案中，可以使用组合逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)反应，例如如美国专利No.5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864；和5,693,517中记载的。最常用的两种逆转录酶是禽类成髓细胞白血病病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。逆转录步骤典型的使用特异性引物、随机六聚物或oligo-dT引物引发，取决于表达序型分析的境况和目标。例如，提取的RNA可使用GENEAMPTMRNA PCR试剂盒(Perkin Elmer,Calif.,USA)遵循制造商的说明书逆转录。然后可将衍生的cDNA作为模板用于后续PCR反应。
可以使用或5′-核酸酶测定法，如美国专利No.5,210,015；5,487,972；和5,804,375；及Holland et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280中记载的。PCR典型的利用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但是可使用具有等效5'核酸酶活性的任何酶。使用两种寡核苷酸引物来生成扩增子，典型的是PCR反应的。第三种寡核苷酸或探针设计用于检测位于前两种PCR引物之间的核苷酸序列。探针是Taq DNA聚合酶不可延伸的且用报道荧光染料和淬灭荧光染料标记。在两种染料正如它们在探针上的那样位置靠近时，任何激光诱发的来自报道染料的发射受到淬灭染料的淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得探针片段在溶液中解离，来自所释放报道染料的信号不再受到第二荧光团的淬灭效应的作用。每合成一个新的分子就释放一个分子的报道染料，未淬灭报道染料的检测提供了数据定量阐述的基础。该测定法中采用的杂交探针可以是例如在V600E突变位点在突变型和野生型BRAF等位基因之间进行区分的等位基因特异性探针。或者，可以使用等位基因特异性引物和结合扩增产物的经标记探针实施该方法。
任何适合于检测降解产物的方法均可用于5′核酸酶测定法。通常，用两种荧光染料标记检测探针，一种染料能够淬灭另一种染料的荧光。将染料附着于探针，优选一种附着于5′端，另一种附着于内部位点，使得探针处于未杂交状态时发生淬灭且使得在两种染料之间发生DNA聚合酶的5′至3′外切核酸酶活性对探针的切割。扩增导致在染料之间切割探针，伴随着对淬灭的消除及来自最初被淬灭的染料可观察的荧光增加。通过测量反应荧光的增加来监测降解产物的积累。美国专利No.5,491,063和5,571,673(通过述及将二者收入本文)记载了用于检测与扩增伴随发生的探针降解的备选方法。5'-核酸酶测定法数据最初可以表述为Ct，或循环阈值(threshold cycle)。正如上文所讨论的，在每个循环期间记录荧光值并代表至扩增反应中该点时扩增的产物的量。首次记录到有统计学意义的荧光信号的点即循环阈值(Ct)。
为了将错误和样品间变异的影响降至最低，通常使用内部标准物进行PCR。理想的内部标准物在不同组织间以恒定水平表达，不受实验处理的影响。最频繁的用于基因表达样式标准化的RNA是持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和P-肌动蛋白的mRNA。
在一些实施方案中，检测V600E的探针(例如TTS155-BRAF_MU)也检测V600D(1799—1800TG>AT)和V600K(1798—1799GT>AA)。在一些实施方案中，检测V600E突变的探针也检测K601E(1801A>G)和V600R(1798—1799GT>AG)。
在一些实施方案中，可使用与探针序列基本上同一的序列。与探针序列基本上同一的序列包括那些与探针杂交至相同互补序列的。如此，在一些实施方案中，用于本发明的探针序列至少包含15个连续核苷酸，有时是至少16、17、18,19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个连续核苷酸。在一些实施方案中，引物具有TTS155-BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT的至少27、28、29、或30个连续核苷酸。在其它实施方案中，用于本发明的引物与TTS155-BRAF_MU或TTS148-BRAF_WT具有至少80％同一性，在一些实施方案中是至少85％同一性，且在其它实施方案中是至少90％或更高同一性。
多份发表的期刊论文给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源用于基因表达序型分析的代表性方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增(例如Hailat et al,Diagn Mol Pathol.2012Mar；21(1):1-8；Godfreyet al.,J.Molec.Diagnostics2:84-91(2000)；Specht et al.,Am.J.Pathol.158:419-29(2001))。简言之，在一些实施方案中，一种代表性方法由切出石蜡包埋的肿瘤组织样品的约10微米厚切片开始。然后，提取mRNA，并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后，在必要时可包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异启动子逆转录RNA，随后是PCR。
PCR引物和探针是基于待扩增基因中存在的内含子序列设计的。在这个实施方案中，引物/探针设计的第一步是描绘基因内的内含子序列。这可通过公众可得到的软件来进行，诸如由Kent,W.,Genome Res.12(4):656-64(2002)开发的DNA BLAT软件或BLAST软件，包括其变异。后续步骤遵循完全建立的PCR引物和探针设计方法。
为了避免非特异性信号，可能重要的是在设计引物和探针时掩盖(mask)内含子内的重复序列。这可容易的通过使用Repeat Masker程序来实现，该程序可通过贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线获得，它针对重复元件文库筛选DNA序列并返回其中掩盖了重复元件的查询序列。然后可使用任何商品化或通过其它途径公众可获得的引物/探针设计包将掩盖后的内含子序列用于设计引物和探针序列，诸如Primer Express(Applied Biosystems)；MGBassay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3(Rozen and Skaletsky(2000)Primer3在万维网上供一般用户和生物学家编程员使用。在Krawetz S,MisenerS编的《Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology》中，Humana Press，Totowa，N.J.，第365-386页)。
PCR引物设计中考虑的因素包括引物长度、解链温度(meltingtemperature,Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、和3'-末端序列。一般而言，最佳的PCR引物通常长17-30个碱基，包含约20-80％诸如例如约50-60％G+C碱基。典型的优选Tm在50和80℃之间，例如约50-70℃。
关于PCR引物和探针设计的进一步指导参见例如Dieffenbach et al.，“General Concepts for PCR Primer Design”(PCR引物设计的一般概念)，在《PCR Primer,A Laboratory Manual》中，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1995，第133-155页；Innis and Gelfand，“Optimization of PCRs”(PCR的优化)，在《PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications》中，CRC Press，London，1994，第5-11页；及Plasterer,T.N.,Primerselect:Primerand probe design.Methods Mol.Biol.70:520-527(1997)，将其完整公开内容明确收入本文作为参考。
另一方面，可利用靶核酸的等位基因特异性扩增来检测核酸突变的存在或缺失。扩增涉及使用等位基因特异性引物。
在一个实施方案中，本发明是靶序列的变体(其以数种变体序列的形式存在)的等位基因特异性扩增的方法，该方法包括：提供样品，其可能含有靶序列的至少一种变体；提供第一寡核苷酸，其至少与靶序列的一种或多种变体部分互补；提供第二寡核苷酸，其至少与靶序列的一种或多种变体部分互补但具有至少一个与靶序列的仅一种变体互补的内部选择性核苷酸；提供适合于所述第一和第二寡核苷酸杂交至靶序列的至少一种变体的条件；提供适合于核酸聚合酶延伸寡核苷酸的条件；其中在所述第二寡核苷酸对其所杂交的靶序列变体具有所述互补内部选择性核苷酸时，所述聚合酶能够延伸所述第二寡核苷酸，且在所述第二寡核苷酸对其所杂交的靶序列变体具有非互补内部选择性核苷酸时，实质性更少；并将杂交和延伸步骤的程序重复多次。
在本发明的一些实施方案中，扩增涉及聚合酶链式反应，即模板变性、寡核苷酸引物对模板的退火(杂交)、和核酸聚合酶延伸引物的重复循环。在一些实施方案中，退火和延伸发生于同一温度步骤。
在一些实施方案中，扩增反应涉及热启动方案。在等位基因特异性扩增的背景好，可以通过使用热启动方案来增强等位基因特异性引物就错配靶而言的选择性。本领域知道多种热启动方案，例如使用蜡、将关键试剂与反应混合物的其余部分分开(美国专利No.5,411,876)、使用由抗体可逆灭活的核酸聚合酶(美国专利No.5,338,671)、由设计成特异性结合其活性温度的寡核苷酸可逆灭活的核酸聚合酶(美国专利No.5,840,867)或使用具有可逆化学修饰的核酸聚合酶(如记载于例如美国专利No.5,677,152和No.5,773,528)。
在本发明的一些实施方案中，等位基因特异性扩增测定法是实时PCR测定法。在实时PCR测定法中，扩增的测量为“阈循环”或Ct值。在等位基因特异性实时PCR测定法的背景中，匹配和错配模板之间Ct值的差异是等位基因之间的区分或测定法选择性的一种度量。较大差异指示错配模板扩增的较大延迟，并因此指示等位基因之间的较大区分。错配模板常常以比匹配模板大得多的量存在。例如，在组织样品中，只有小部分的细胞可能是恶性的且携带等位基因特异性扩增测定法所靶向的突变(“匹配模板”)。正常细胞中存在的错配模板可以不太有效地扩增，但是正常细胞的压倒性数目会克服任何扩增延迟并消除突变型模板的任何优势。为了在存在野生型模板的情况中检测罕见突变，等位基因特异性扩增测定法的特异性是至关重要的。4800BRAF V600突变测试是商品化的，且利用实时PCR技术。用荧光染料(其充当报道物)和淬灭剂分子(其吸收(淬灭)来自完整探针内的报道物染料的荧光发射)标记反应中的每一种靶特异性寡核苷酸探针。在每个扩增循环期间，与扩增子中的单链DNA序列互补的探针结合并随后受到Z05DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割。一旦通过这种核酸酶活性将报道物染料与淬灭剂分开，在报道物染料受到适宜光谱激发时，可以测量特征性波长的荧光。使用两种不同报道物染料标记靶特异性BRAF野生型(WT)探针和BRAF V600E突变探针。通过在专用光通道中在两种特征性波长测量荧光，可以在一个反应孔中独立检测两种BRAF序列的扩增。
在一些实施方案中，依照美国专利公开文本No.2011/0311968利用在B-raf和V600E B-raf之间区分的引物。
在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸(例如DNA)：(a)对自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸(例如基因组DNA)实施PCR；并(b)测定样品中突变型B-raf多核苷酸的表达。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸表达：(a)将第一和第二寡核苷酸杂交至B-raf靶序列的至少一种变体；其中所述第一寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且所述第二寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且具有至少一个与靶序列的仅一种变体互补的内部选择性核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中在所述选择性核苷酸与靶形成碱基对时，所述聚合酶能够优先延伸所述第二寡核苷酸，且在所述选择性核苷酸与靶不形成碱基对时，实质性较少；并(c)检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中延伸表示存在寡核苷酸对其具有互补选择性核苷酸的靶序列变体。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸(例如DNA)：(a)对自患者癌症样品(例如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸(例如基因组DNA)实施PCR；并(b)测定样品中突变型B-raf多核苷酸的表达。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸(例如DNA)：(a)自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)分离DNA(例如基因组DNA)；(b)对自患者癌症样品提取的DNA实施PCR；并(c)测定样品中突变型B-raf多核苷酸的表达。
在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸表达：(a)自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)分离DNA(例如基因组DNA)；(b)将第一和第二寡核苷酸杂交至DNA中B-raf靶序列的至少一种变体；其中所述第一寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且所述第二寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且具有至少一个与靶序列的仅一种变体互补的内部选择性核苷酸；(c)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中在所述选择性核苷酸与靶形成碱基对时，所述聚合酶能够优先延伸所述第二寡核苷酸，且在所述选择性核苷酸与靶不形成碱基对时，实质性较少；并(d)检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中延伸表示存在寡核苷酸对其具有互补选择性核苷酸的靶序列变体。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸表达：(a)将第一和第二寡核苷酸杂交至B-raf靶序列的至少一种变体；其中所述第一寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且所述第二寡核苷酸至少与靶序列的一种或多种变体部分互补且具有至少一个与靶序列的仅一种变体互补的内部选择性核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸；其中在所述选择性核苷酸与靶形成碱基对时，所述聚合酶能够优先延伸所述第二寡核苷酸，且在所述选择性核苷酸与靶不形成碱基对时，实质性较少；并(c)检测所述寡核苷酸延伸的产物，其中延伸表示存在寡核苷酸对其具有互补选择性核苷酸的靶序列变体。
在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测突变型B-raf多核苷酸(例如DNA)：(a)对自患者癌症样品(诸如FFPE固定的患者癌症样品)提取的核酸(例如基因组DNA)实施PCR；(b)通过对PCR扩增的核酸测序来测定突变型B-raf多核苷酸的表达。在一些实施方案中，使用测序(例如Sanger测序或焦磷酸测序)来检测突变型B-raf多核苷酸(例如DNA)。
3.其它核酸突变检测方法
也可以通过直接测序来检测核酸突变(例如第1799位核苷酸处(GTG>GAA)，其导致谷氨酰胺替代B-raf第600位氨基酸处缬氨酸)的存在(或缺失)。方法包括基于双脱氧测序的方法和诸如PyrosequencingTM寡核苷酸长产物等方法。此类方法常常采用扩增技术，诸如PCR。另一种用于测序的类似方法不要求使用完全PCR，但是通常只使用引物延伸一个荧光标记的双脱氧核糖核酸分子(ddNTP)，其与要调查的核苷酸互补。可以经由检测延伸了一个碱基且荧光标记的引物来鉴定多态性位点处的核苷酸(例如Kobayashi etal,Mol.Cell.Probes,9:175-182,1995)。
也可以通过使用变性梯度凝胶电泳来分析使用扩增反应(例如PCR)生成的扩增产物。可以基于DNA在溶液中的不同序列依赖性解链特性和电泳迁移来鉴定不同等位基因(参见例如Erlich,ed.,PCR Technology,Principles andApplications for DNA Amplification,W.H.Freeman and Co,New York,1992,Chapter7)。
在其它实施方案中，可以使用单链构象多态性分析(其通过单链PCR产物的电泳迁移改变来鉴定碱基差异)来区分靶序列的等位基因，如记载于例如Orita et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.86,2766-2770(1989)。可以如上文所述来生成扩增的PCR产物，并加热或以其它方式变性，以形成单链扩增产物。单链核酸可重折叠或形成二级结构，其部分依赖于碱基序列。可以将单链扩增产物的不同电泳迁移率与靶区的对比文件之间的序列差异关联起来。
可以使用等位基因特异性扩增或引物延伸方法来检测突变(例如核酸突变)的存在或缺失。这些反应通常涉及使用设计为经由引物3’端(例如3’核苷酸或倒数第二个3’核苷酸)的错配特异性靶向突变型(或野生型)位点的引物。当聚合酶缺乏纠错活性时，错配的存在影响聚合酶延伸引物的能力。例如，为了使用基于等位基因特异性扩增或延伸的方法来检测V600E突变型序列，设计在BRAF的第600位密码子中的第1799位核苷酸处与突变型A等位基因互补的引物，使得3’末端核苷酸在突变型位置处杂交。可以通过引物启动延伸的能力来确定突变型等位基因的存在。如果3’末端是错配的，那么延伸受阻。如此，例如，如果引物在3’端与突变型等位基因核苷酸匹配，那么该引物会有效延伸。也可以使用在第1799位特异性来自BRAF野生型序列的等位基因特异性引物来实施扩增。
典型地，所述引物与第二引物在扩增反应中联合使用。第二引物在与突变位置无关的位点处杂交。自两种引物进行扩增，产生可检测产物，其表示存在的特定等位基因形式。基于等位基因特异性扩增或延伸的方法记载于例如WO93/22456；美国专利No.5,137,806；美国专利No.5,595,890；美国专利No.5,639,611；及美国专利No.4,851,331。
使用基于等位基因特异性扩增的基因型测定，等位基因的鉴定只要求检测扩增的靶序列的存在或缺失。用于检测扩增的靶序列的方法是本领域公知的。例如，所记载的凝胶电泳和探针杂交测定法常常用于检测核酸的存在。
在一种备选的无探针方法中，通过监测反应混合物中双链DNA的总量的增加来检测扩增的核酸，如记载于例如美国专利No.5,994,056；及欧洲专利公开文本No.487,218和No.512,334。双链靶DNA的检测依赖于各种DNA结合染料(例如SYBR绿)在结合至双链DNA时展示的荧光的增加。
如本领域技术人员会领会的，可以在采用多种等位基因特异性引物的反应中实施等位基因特异性扩增方法以靶向特定等位基因。用于此类多重应用的引物一般用可区分标记物进行标记，或者选择成使得自等位基因生成的扩增产物通过尺寸可区分。如此，例如，可以使用一个扩增反应通过扩增产物的凝胶分析来鉴定一份样品中的野生型和突变型V600E等位基因二者。
等位基因特异性寡核苷酸引物可以是与杂交区中的等位基因之一准确互补的，或者可以在除寡核苷酸3’末端以外的位置具有一些错配。例如，等位基因特异性寡核苷酸中的倒数第二个3’核苷酸可以是错配的。在其它实施方案中，错配可以发生于两种等位基因序列的(非突变型)位点。
在一些实施方案中，以利用固定化靶或固定化探针的测定法型式实施等位基因特异性杂交。此类型式是本领域公知的，而且包括例如点印迹型式和反向点印迹测定法型式，记载于美国专利No.5,310,893；No.5,451,512；No.5,468,613；及No.5,604,099，通过述及将每一篇收入本文。
4.RNN-Seq
RNA-Seq(也称作全转录组鸟枪测序(WTSS))指使用高通量测序技术来对cDNA测序以获得关于样品的RNA内容物的信息。描述RNA-Seq的出版物包括：Wang et al.“RNA-Seq:a revolutionary tool for transcriptomics”NatureReviews Genetics10(1):57-63(January2009)；Ryan et al.BioTechniques45(1):81-94(2008)；及Maher et al."Transcriptome sequencing to detect gene fusions incancer".Nature458(7234):97-101(January2009)。
5.微阵列
差异基因表达也可使用微阵列技术来鉴定或验证。如此，可使用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的肿瘤组织中测量乳腺癌相关基因的表达序型。在这种方法中，在微芯片基片上涂布(plate)或排列(array)感兴趣多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。然后使排列的序列与来自感兴趣细胞或组织的特异性DNA探针杂交。正如在PCR方法中一样，mRNA的来源典型的是从人肿瘤或肿瘤细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，RNA可以从多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系分离。如果mRNA的来源是原发性肿瘤，那么mRNA可从例如冷冻的或归档的石蜡包埋且固定(例如福尔马林固定)的组织样品提取，所述组织样品是日常临床实践中常规制备和保存的。
在微阵列技术的一个具体实施方案中，将PCR扩增的cDNA克隆的插入物以密集阵列应用至基片。优选的是，将至少10,000种核苷酸序列应用至基片。以每种10,000个成分固定在微芯片上的微阵列基因适于在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可通过从感兴趣组织提取的RNA的逆转录中掺入荧光核苷酸来生成。应用至芯片的经标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点以特异性发生杂交。严格清洗以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜检术或通过其它检测方法诸如CCD照相机扫描芯片。每种阵列成分的杂交的定量容许评估相应mRNA的丰度。凭借双重有色荧光，将从两种RNA来源生成的分开标记的cDNA探针与阵列成对杂交。如此同时测定来自对应于每种指定基因的两种来源的转录物的相对丰度。小型化规模的杂交提供了大量基因表达样式的便利且快速评估。此类方法已经显示出检测以每个细胞少数拷贝表达的罕见转录物所要求的灵敏度及可再现的检测表达水平的至少约2倍差异(Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2):106-149(1996))。微阵列分析可使用商品化设备遵循制造商的方案进行，诸如使用Affymetrix GENCHIPTM技术、或Incyte的微阵列技术。
为大规模分析基因表达而开发的微阵列方法使得有可能系统搜索多种肿瘤类型中的癌症分类和后果预测的分子标志物。
6.基因表达连续分析(SAGE)
基因表达连续分析(SAGE)是容许同时且定量分析大量基因转录物且不需要为每种转录物提供个别杂交探针的一种方法。首先，生成包含足以唯一鉴定一种转录物的信息的一种短序列标签(约10-14bp)，倘若该标签是从每种转录物内的一个唯一位置得到的。然后，将许多转录物连接起来以形成长、连续分子，它们可测序，以同时揭示多种标签的身份(identity)。任何转录物群的表达样式可通过测定个别标签的丰度并鉴定与每种标签对应的基因来定量评估。更多详情参见例如Velculescu et al.,Science270:484-487(1995)；Velculescu et al.,Cell88:243-51(1997)。
7.MassARRAY技术
MassARRAY(Sequenom,San Diego,Calif.)技术是一种使用质谱术(MS)进行检测的自动化、高通量基因表达分析方法。依照此方法，在分离RNA、逆转录并PCR扩增之后，对cDNA进行引物延伸。纯化cDNA衍生的引物延伸产物，并分配到芯片阵列上，该芯片阵列预先加载有MALDI-TOF MS样品制备所需要的成分。通过分析所获得的质谱中的峰面积对反应中存在的各种cDNA定量。
8.免疫组化
免疫组化(“IHC”)方法也适用于检测本发明的生物标志物的表达水平。组织切片的免疫组化染色已经证明是一种评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组化技术利用抗体来探查和显现原位细胞抗原，通常通过显色或者荧光方法。如此，使用对每种标志物特异性的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，最优选单克隆抗体来检测表达。如下文极为详细讨论的，抗体可通过直接标记抗体自身来检测，例如用放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物诸如生物素、或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，未标记一抗与经标记二抗联合使用，包括对一抗特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组化方案和试剂盒是本领域众所周知的，而且可通过商业途径获得。
现有两种常用的IHC方法：直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接测定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的第一抗体(primary antibody)，其不需要进一步的抗体相互作用就能显现。在一种典型的间接测定法中，未偶联的第一抗体结合至抗原，然后经过标记的第二抗体(secondary antibody)结合至第一抗体。若第二抗体偶联有酶标记物，则添加显色底物或荧光底物以提供抗原的显现。因为数个第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应，所以发生信号放大。
用于免疫组化的第一和/或第二抗体通常用可检测模块进行标记。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：
(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可使用CurrentProtocols in Immunology,卷1和2,Coligen等编,Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.1991中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。
(b)胶体金颗粒。
(c)荧光标记物，包括但不限于稀士螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、若丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或商品化荧光团诸如SPECTRUM和SPECTRUM、和/或上述一种或多种的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology,见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。
(d)可利用各种酶-底物标记物且美国专利No.4,275,149中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O'Sullivan等,Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods inEnzym.,J.Langone和H.Van Vunakis编,Academic Press,New York,73:147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，其以过氧化氢为底物，其中过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))。3,3-Diaminobenzidine(DAB)也可以用于观察HRP标记的抗体；
(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和
(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物(例如4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷)。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述四大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。
在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行加热(参见例如Leong等Appl.Immunohistochem.4(3):201(1996))。
在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。
抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选地，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化显色底物诸如3,3'-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是家兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗家兔抗体)。
可以将如此制备的标本放置好并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显微镜。
IHC可以与形态学染色组合，或是在之前或是在之后。脱石蜡后，可以用形态学染料对封固在载玻片上的切片染色以进行评估。使用的形态学染料提供组织切片的精确形态学评估。可以用一种或多种染料对切片染色，每种染料独特染色不同细胞成分。在一个实施方案中，使用苏木精来对载玻片上的细胞核染色。苏木精广泛可得。合适苏木精的一个例子是苏木精II(Ventana)。当期望浅蓝色核时，可以在苏木精染色之后使用发蓝试剂。本领域技术人员会领会，通过延长或缩短载玻片保持在染料中的时间长度可以对给定组织优化染色。
用载玻片制备和IHC加工的自动化系统是商品化的。BenchMark XT系统是此类自动化系统的一个例子。
染色后，可以通过显微术的标准技术来分析组织切片。通常，病理学家或类似人员对组织评估异常或正常细胞或特定细胞类型的存在并提供感兴趣细胞类型的位置。如此，例如，病理学家或类似人员会检查载玻片并鉴定正常细胞(诸如正常肺细胞)和异常细胞(诸如异常或赘生肺细胞)。可以使用定义感兴趣细胞位置的任何手段(例如X-Y轴上的坐标)。
适合用于IHC的抗c-met抗体是本领域公知的，而且包括SP-44(Ventana)、DL-21(Upstate)、MET4、ab27492(Abcam)、PA1-37483(Pierce Antibodies)。本领域技术人员理解，例如使用本文中公开的IHC方案，通过与c-met抗体比较，可以鉴定和表征别的合适的抗c-met抗体。抗磷酸c-met抗体是本领域已知的且包括来自Cell Signalling Technologies的抗磷酸c-met抗体Y1234/5。适合用于IHC的抗HGF抗体是本领域公知的且包括：ab24865(Abcam)，H00003082-A01(Abnova)，MA1-24767(Thermo Fisher)，LS-C123743(LifeSpan)。如本文中使用的，要理解，在患者肿瘤的样品中检测HGF涵盖例如在患者肿瘤的样品中存在的肿瘤基质中检测HGF以及在肿瘤细胞中检测HGF。用于在血清中检测HGF的测定法(诸如ELISA测定法)是商品化的且本领域已知的。参见例如Catenacci et al,Cancer Discovery(2011)1:573。
在一些实施方案中，可以利用具有各种染色强度的对照细胞团粒作为IHC分析的对照以及评分对照。例如，H441(强c-met染色强度)；A549(中等c-met染色强度)；H1703(弱c-met染色强度)，HEK-293(293)(弱c-met染色强度)；和TOV-112D(阴性c-met染色强度)或H1155(阴性c-met染色强度)。在一些实施方案中，例示性c-met IHC评分强度可以参考本文中图1和/或2。在一些实施方案中，图1描绘例示性0、1+、2+和3+c-met IHC评分强度，例如依照下文表A的评分方案。
在一些实施方案中，可以依照表A来评估C-met染色强度标准：
表A
在一些实施方案中，如下定义“临床Met诊断阳性”和“临床Met诊断阴性”分类：
临床c-met诊断阳性：IHC得分2或3(如表A中定义的)，和
临床c-met诊断阴性：IHC得分0或1(如表A中定义的)。
在一些实施方案中，有关的高c-met生物标志物为IHC得分2、IHC得分3、或IHC得分2或3。
在一些实施方案中，低c-met生物标志物为IHC得分0、IHC得分1或IHC得分0或1。
9.蛋白质组学
术语“蛋白质组”定义为某一时间点样品(例如组织、生物体或细胞培养物)中存在的蛋白质的全体。蛋白质组学包括研究样品中蛋白质表达的全局变化(也称为“表达蛋白质组学”)等。蛋白质组学典型的包括下列步骤：(1)通过二维凝胶电泳(2-D PAGE)将样品中的各种蛋白质分开；(2)鉴定从凝胶中回收的各种蛋白质，例如通过质谱术或N-末端测序；及(3)使用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法是其它基因表达序型分析方法的有用补充，可以单独使用或联合其它方法，用于检测本发明的诊断标志物的产物。
10.基因扩增
使用本领域技术人员知道的某些技术来实现对c-met基因扩增的检测。例如，可以使用比较性基因组杂交来生成DNA序列拷贝数作为染色体位置的函数的图。参见例如Kallioniemi et al.(1992)Science258:818-821。也可以例如通过Southern杂交(使用对c-met基因特异性的探针)或通过实时定量PCR来检测c-met基因的扩增。
在某些实施方案中，检测c-met基因的扩增通过直接评估c-met基因的拷贝数来实现，例如通过使用与c-met基因杂交的探针来进行。例如，可实施FISH测定法。在某些实施方案中，检测c-met基因的扩增通过间接评估c-met基因的拷贝数来实现，例如通过评估位于c-met基因以外但与c-met基因共扩增的染色体区的拷贝数来进行。还可使用体内诊断测定法来评估生物标志物表达，例如通过施用结合待检测分子且标记有可检测标记物(例如放射性同位素)的分子(诸如抗体)，然后对患者进行外部扫描以定位所述标记物。
11.其它例示性方法
可以通过多种免疫测定方法(包括本文中描述的IHC，例如见上文)来检测生物标志物。关于免疫学和免疫测定法规程的综述，参见Basic andClinical Immunology(Stites&Terr eds.,7th ed.1991)。此外，可以以数种配置任一来实施本发明的免疫测定法，关于它们的广泛综述参见EnzymeImmunoassay(Maggio,ed.,1980)及Harlow&Lane，见上文。关于一般性免疫测定法的综述还可参见Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology,volume37(Asai,ed.1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites&Ten,eds.,7th ed.1991)。
常用的测定法包括非竞争性测定法(例如三明治式/夹心式测定法)和竞争性测定法。典型地，可使用诸如ELISA测定法等测定法。ELISA测定法是本领域已知的，例如用于测定多种组织和样品，包括血浆或血清。本文中例示了用于在血清中测定HGF的ELISA测定法。适合于在ELISA中使用的抗HGF抗体是本领域已知的。
使用此类测定法型式的广泛免疫测定技术是可得的，参见例如美国专利No.4,016,043，No.4,424,279，及No.4,018,653。这些包括非竞争性类型的单点和两点或“三明治式/夹心式”测定法以及传统的竞争性结合测定法二者。这些测定法还包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。三明治式/夹心式测定法是常用的的测定法。三明治式/夹心式测定技术存在多种变化。例如，在一种典型的正向测定法中，将未标记的抗体固定化于固体基片上，并使待测试的样品与所结合分子接触。温育合适的一段时间后，即足以容许抗体-抗原复合体形成的一段时间，然后添加经能够产生可检测信号的报道分子标记的、对所述抗原特异性的第二抗体，并温育，容许足以形成抗体-抗原-经标记抗体的另一种复合体的时间。洗掉任何未反应的物质，并通过观察由所述报道分子所产生的信号来测定所述抗原的存在。结果可以是定性的(通过对可视信号的简单观察进行)，或者可以是定量的(通过与含有已知量生物标志物的对照样品比较来进行)。
正向测定法上的变化包括同时测定法(simultaneous assay)，其中同时将样品和经标记的抗体两者添加至所结合的抗体。这些技术对本领域技术人员是公知的，包括会容易明白的任何微小变化。在一种典型的正向三明治式测定法中，将具有对所述生物标志物特异性的第一抗体或是共价地或是被动地结合至固体表面。所述固体表面可以是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以采用试管、珠、微量板盘的形式，或者适于进行免疫测定法的任何其它表面。结合规程是本领域公知的，并且一般包括交联、共价结合、或物理吸附，清洗聚合物-抗体复合体，为测试样品做好准备。然后将测试样品的等分试样添加至固相复合体，并在合适的条件(例如从室温至40℃，诸如包括端点在内的25℃和32℃之间)下培养足够的一段时间(例如2-40分钟或者过夜，如果更方便的话)，所述条件和时间适于或足以容许存在于抗体中的任何亚单位的结合。温育期后，清洗抗体亚单位固相，干燥，并与对生物标志物一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物结合的报道分子。
一种备选的方法包括：将样品中的靶生物标志物固定化，然后使固定化的靶物暴露于特异性抗体，该特异性抗体可以是或不是经报道分子标记的。根据靶物的量和报道分子信号的强度，可以通过用所述抗体直接标记，使所结合的靶物变成可检测的。或者，使对第一抗体特异性的经标记第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合体以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合体。通过经标记报道分子所发出的信号检测所述复合体。
在酶免疫测定法的情况中，酶是偶联至第二抗体的，一般藉戊二醛或高碘酸盐进行。然而，会容易认可的是，存在极其多种不同的偶联技术，它们对技术人员是轻易可获得的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶，而且本文中公开了其它酶。一般选择与特定酶一起使用的底物以在相应酶的水解作用后产生可检测的颜色变化。合适酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可能采用产生荧光产物的荧光底物而不是上文所记录的显色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合体，容许结合，然后洗掉过量的试剂。然后将含有合适底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合体。底物会与连接至第二抗体的酶起反应，给出定性的视觉信号，其可以被进一步地定量(通常通过分光光度法)以给出存在于样品中的生物标志物量的指标。或者，荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)可以以化学方法偶联至抗体，而不改变所述抗体的结合能力。通过使用特定波长的光线光照来激发时，荧光染料标记的抗体吸收光能，在分子中诱导激发态，接着发出光线，其特征性颜色是用光学显微镜在视觉上可检测的。如在EIA中那样，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志物复合体。洗掉未结合的试剂后，然后使剩余的三元复合体暴露于适当波长的光线，观察到的荧光表明感兴趣的分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都是非常完善建立的，而且在本文中有讨论。
可使用其它检测技术(例如MALDI)来直接检测样品中生物标志物(例如突变型Braf)的存在。
V.制品
在本发明的另一个实施方案中，提供了用于治疗癌症(诸如黑素瘤或乳头状甲状腺癌)的制品。所述制品包括容器和容器上或伴随容器的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶(bottles)、管形瓶(vials)、注射器(syringes)、等。所述容器可以用多种材料诸如玻璃或塑料制成。所述容器容纳或装有包含癌症药物作为活性剂的组合物，并可以具有无菌出入口(例如该容器可以是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。
所述制品可以进一步包括第二容器，该容器装有药学可接受的稀释缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者观点看有需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
本发明的制品还包括信息，例如以包装插页的形式，指示所述组合物用于基于本文中生物标志物的表达水平，治疗癌症。所述插页或标签可采取任何形式，诸如纸或在电子介质上，诸如磁记录介质(例如软盘)或CD-ROM。所述标签或插页还可包括关于所述试剂盒或制品中药物组合物和剂量形式的其它信息。方法包括本文中的任何治疗和诊断方法。
依照本发明的一个实施方案，提供了制品，其包含包装在一起的c-met拮抗剂(例如抗c-met抗体)和包装插页，该c-met拮抗剂在药学可接受载体中，该包装插页指示该c-met拮抗剂用于基于c-met生物标志物的表达来治疗癌症(诸如黑素瘤)患者。在一些实施方案中，该治疗与B-raf拮抗剂组合。在一些实施方案中，该包装插页指示基于c-met生物标志物和B-raf生物标志物的表达，该c-met拮抗剂与B-raf拮抗剂组合用于治疗具有癌症(诸如黑素瘤)的患者。在一些实施方案中，B-raf生物标志物为B-raf V600E。
本发明还涉及用于制造制品的方法，包括在包装中组合药物组合物和包装插页，该药物组合物包含c-met拮抗剂(例如抗c-met抗体)，该包装插页指示该药物组合物用于基于c-met生物标志物的表达治疗癌症(诸如NSCLC)患者。在一些实施方案中，该治疗与B-raf拮抗剂组合。在一些实施方案中，该包装插页指示基于c-met生物标志物和B-raf生物标志物的表达，该c-met拮抗剂与B-raf拮抗剂组合用于治疗具有癌症(诸如黑素瘤)的患者。在一些实施方案中，B-raf生物标志物为B-raf V600。在一些实施方案中，B-raf生物标志物为B-raf V600E。
所述制品可以进一步包括别的容器，该容器装有药学可接受的稀释缓冲剂，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液、和/或右旋糖溶液。制品还可包括从商业和使用者观点看有需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、和注射器。
VI.诊断试剂盒
本发明还涉及可用于检测任何一种或多种本文中鉴定的生物标志物的诊断试剂盒。因而，提供了诊断试剂盒，其包含用于测定来自癌症患者的样品中c-met和B-raf(诸如B-raf V600)生物标志物中一种或多种的表达的一种或多种试剂。任选地，该试剂盒进一步包含使用该试剂盒来选择癌症药物(例如c-met拮抗剂，诸如抗c-met抗体，与B-raf拮抗剂组合)以治疗癌症患者的说明书，如果该患者表达c-met生物标志物和/或该患者表达B-raf生物标志物的话。在一些实施方案中，B-raf生物标志物为B-raf V600。在一些实施方案中，使用包括下述各项的方法来检测B-raf生物标志物：(a)对自患者黑素瘤样品提取的核酸(例如DNA)实施PCR或测序；并(b)测定该样品中BRAFV600的表达。在一些实施方案中，该黑素瘤样品为福尔马林固定、石蜡包膜的。在一些实施方案中，c-met生物标志物为HGF且使用IHC检测患者黑素瘤(或黑素瘤基质)样品中的表达。在一些实施方案中，c-met生物标志物为HGF且使用ELISA检测患者血清样品中的表达。诊断方法包括本文中的任何诊断方法。
VII.做广告的方法
本文中的发明还关注一种用于为癌症药物做广告的方法，其包括给目标受众宣传所述癌症药物(例如抗c-met抗体)用于基于c-met生物标志物和/或B-raf生物标志物的表达，治疗癌症患者的用途。
做广告为经由非个人媒体进行的、通常付费的通讯，其中发起人受到鉴别且信息受到控制。为本文目的的做广告包括宣传(publicity)、公共关系(public relations)、产品布置(product placement)、赞助(sponsorship)、保险(underwriting)、和促销(sales promotion)。该术语还包括出现在任何印刷传播媒体中的商业信息公告，其设计用于引起大众的兴趣以劝说、通知、宣传、激发、或以其它方式改变行为，向购买、支持、或认可本文中发明的有利方式发展。
本文中诊断方法的广告和宣传可通过任何手段实现。用于传递这些信息的广告媒体的例子包括电视、电台、电影、杂志、报纸、因特网、和告示板，包括商业性的，即出现在广播媒体中的信息。广告还包括那些在食品货车座位上、机场通道墙壁上、和公共汽车侧面上的广告、或电话等候信息或店内PA系统中听到的广告、或可放置视觉或听觉通讯的任何地方的广告。
宣传或做广告手段的更特定的例子包括电视、电台、电影、因特网(诸如网络传播和网络研讨会(webinar))、意图到达同步用户的交互式计算机网络、固定的或电子的告示板和其它公共标牌、海报、传统的或电子的文献(诸如杂志和报纸)、其它媒体渠道、讲座或个体接触，例如通过电子邮件、电话、即时信息、邮寄、快递、大众(mass)、或载体邮件(carrier mail)、亲自访问等进行。
所使用的做广告的类型会取决于许多因素，例如待传达的目标受众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士、和患者，以及成本考虑和管理药物和诊断剂做广告的相关管辖权法律和条例。可根据由服务相互作用和/或其它数据(诸如用户人口统计状况和地理学定位)限定的用户表征使做广告个性化或用户化。
实施例
实施例1：生长因子驱动的对抗癌激酶抑制剂的抗性
方法
RTK配体矩阵筛选。使用核酸染料Syto60(Invitrogen)评估细胞存活力。将细胞(3000-5000个每孔)接种入96孔板，并容许贴壁过夜。次日，用(或不用)50ng/mL RTK配体处理细胞，并相伴暴露于渐增浓度范围的有关激酶抑制剂。72小时药物暴露后，在4％甲醛中固定细胞，用Syto60染色，并使用Odyssey扫描仪(Li-Cor)评估细胞数。通过自药物处理细胞获得的荧光除以自对照(无药物)处理细胞获得的荧光，计算细胞存活力。
细胞系。获得人癌细胞系，并如先前所述(Johannessen,C.M.et al.COTdrives resistance to RAF inhibition through MAP kinase pathway reactivation.Nature468,968-972,doi:10.1038/nature09627(2010))使用自动化平台测试敏感性。在5％CO2的增湿气氛中于37℃维持细胞系，并在RPMI1640或DMEM/F12生长培养基(GIBCO)(补充有10％胎牛血清(GIBCO)，50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素(GIBCO))中培养。
试剂。Lapatinib，sunitinib和erlotinib购自LC Laboratories。Crizotinib，TAE684，AZD6244和BEZ235购自Selleck Chemicals。PD173074购自TocrisBioscience。PLX4032购自Active Biochem。重组人(rh)HGF，EGF，FGF-碱性，IGF-1和PDGF-AB购自Peprotech。rhNRG1-β1购自R and D Systems。对于体内研究，在Genentech生成3D6抗MET激动性抗体，RG7204(PLX4032)和GDC-0712。在异种移植物实验中使用GDC-0712，因为它具有与crizotinib相似的激酶概况(Liederer,B.M.et al.Xenobiotica41,327-339,doi:10.3109/00498254.2010.542500(2011))(图25和26)。
免疫印迹。使用补充有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(ThermoScientific)的Nonidet-P40裂解缓冲液收获细胞裂解物，并使用标准方案进行蛋白质免疫检测。磷酸-HER2(Y1248；#2247)，HER2(#2242)，磷酸-HER3(Y1289；#4791)，磷酸-MET(Y1234/5；#3126)，PDGFRα(#5241)，磷酸-FRS2α(Y196；#3864)，IGF-1Rβ(#3027)，磷酸-ALK(Y1604；#3341)，AKT(#9272)，磷酸-ERK(T202/Y204；#9101)，ERK(#9102)，GAPDH(#2118)和β-微管蛋白(#2146)抗体购自Cell Signaling Technologies。针对HER3(SC-285)，MET(SC-10)，磷酸-PDGFRα(SC-12911)，FRS2α(SC-8318)，FGFR1(SC-7945)，FGFR2(SC-122)，FGFR3(SC-13121)和ALK(SC-25447)的抗体购自Santa Cruz Biotechnologies。磷酸-AKT(S473；#44-621G)抗体购自Invitrogen。磷酸-EGFR(Y1068；ab5644)抗体购自Abcam。EGFR(#610017)抗体购自BD Biosciences。PARP(#14-6666-92)抗体购自eBioscience。使用ImageJ软件进行密度测定术。
组织样品。在适宜IRB批准和患者知情同意书的情况下自下述来源获得原发性(Primary)乳腺肿瘤样品：Cureline(South San Francisco，CA)，ILSbio(Chestertown，MD)和(美国)国家癌症学会人组织合作网络。自BRIM2试验获得转移性黑素瘤肿瘤样品。研究中使用的人组织样品在使用前去标示(de-identify)(双重编码)，因此根据美国健康和人类服务部细则和相关指南不认为使用这些样品的研究是人受试者研究。对以4μm厚度切到带正电荷的玻璃载玻片上的福尔马林固定、石蜡包埋的切片实施MET免疫组织化学。使用MET家兔单克隆抗体SP44(Spring BioScience，Pleasanton，CA；#M3441)和CC1标准抗原修复，在配有Ultraview检测的Discovery XT自动染色仪上(VMSI，Tucson，AZ)实施染色。将切片用苏木精复染色，并在0(无染色)至3+(强染色)的尺度上对c-MET的特异性染色(例如膜染色)评分。
评分方案记载于共同拥有的美国专利公开文本No.US20120089541A1，通过述及将其内容完整收入本文。简言之，对肿瘤细胞进行c-Met染色评分。相对于可用作IHC分析对照以及评分对照、具有各种染色强度的对照细胞团粒，将染色归为强(3+)，中等(2+)，弱(1+)，可疑(+/-)或阴性(-)染色强度。使用H441(强c-met染色强度)；A549(中等c-met染色强度)；H1703(弱c-met染色强度)，HEK-293(293)(弱c-met染色强度)；和TOV-112D(阴性c-met染色强度)或H1155(阴性c-met染色强度)。在评估染色强度之外，还目测评估具有异质信号的样品中各种染色强度/样式的百分比。
肝细胞生长因子(HGF)ELISA。在第一给药周期之前自转移性黑素瘤患者获得血浆，并使用夹心式酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量测量患者衍生血浆中的HGF浓度。用100μL包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)中的0.5μg/mL亲和纯化的山羊抗人肝细胞生长因子多克隆抗体包被(ON，4℃)NUNC MaxiSorp微量滴定板的孔，然后用测定缓冲液(PBS，0.5％BSA，0.05％P20，0.25％CHAPS，0.35M NaCl，5mM EDTA，10ppm Proclin300，pH7.4)中的0.5％牛血清清蛋白(BSA)于室温封闭1小时。一式两份加载测定缓冲液中稀释的人肝细胞生长因子对照和血浆样品(100μL)，并于室温温育2小时，之后添加100μL亲和纯化的山羊抗人肝细胞生长因子生物素(150ng/mL)，于室温再温育1小时。添加PBS，0.5％BSA，0.05％P20，10ppmProclin300，pH7.4中偶联有亲合素的辣根过氧化物酶(40ng/mL)(1小时，室温)，并通过添加100μL显色底物(TMB)15分钟来显现反应。用1M磷酸终止反应，并用ELISA读板仪测量450nm吸光度，减去630nm吸光度。每个步骤之后用清洗缓冲液(0.05％Tween20/PBS)清洗板3次。作为量化参照，通过人肝细胞生长因子的系列稀释(CritRS CR67；2000-15.625pg/mL)建立标准曲线。
异种移植物研究。所有规程遵从Genentech科研动物护理和使用委员会设立的指南和原则，而且在经AAALAC(实验动物护理评估和认证联合会)认证的设施中进行。在CRL C.B-17SCID.bg小鼠(Charles River Laboratories)的右体侧中接种1x107个928MEL或624MEL BRAF突变体黑素瘤细胞(在HBSS/Matrigel(例如1:1混合物)中悬浮)。当肿瘤达到平均体积200mm3时，如所示的，将小鼠(10只每组)用对照抗体(抗gp120；10mg/kg，每周一次；腹膜内)，3D6(抗MET激动性抗体；10mg/kg，每周一次；腹膜内)，RG7204(PLX4032；50mg/kg，每天两次，眼周)，GDC-0712(MET小分子抑制剂，100mg/kg，每天，眼周)任一处理4周。每周两次使用数字测径器(Fred V.Fowler Company，Inc.)测量肿瘤。使用公式(Lx(WxW))/2计算肿瘤体积。这个实施例中的部分响应(PR)定义为肿瘤体积的缩小大于50％但小于100％。这个实施例中的完全响应(CR)定义为肿瘤体积缩小100％。使用双向ANOVA(*＝0.0008)测定用PLX4032处理和用PLX4032和GDC-0712处理的对照抗体组之间的差异。
分泌因子筛选。在适宜时，重组纯化的分泌因子购自Peprotech和R and DSystems，并在PBS/0.1％BSA中重建。以1μg/mL的浓度将分泌因子转移入96孔板，并随后在含有无药物或5μM PLX4032任一的培养基中稀释至100ng/mL。使用Oasis液体操作器等体积的经过稀释的因子(终浓度50ng/mL)排列入预接种SK-MEL-28细胞(在前一天接种500个细胞每孔)的384孔板。72小时温育后，使用Cell Titer Glo(Promega)测定细胞存活力。
统计学。细胞存活力测定法中的误差棒代表均值加或减均值的标准误差(s.e.m.)。为了将受体与配体关联起来，使用具有如下组的2x2列联表进行挽救：受体阳性，挽救RTK配体；受体阳性，不挽救RTK配体；受体阴性，挽救RTK配体；受体阴性，不挽救RTK配体。使用双尾Fisher精确概率检验测定显著性。
BRIM2临床样品的统计学分析。将HGF水平进行对数换算，并使用Kolmogorov-Smirnoff检验对所得分布检验相对于Gaussian分布的偏离。使用cox-比例模型对经过对数换算的HGF水平检验与无进展存活(PFS)和总体存活(OS)的关联。使用Wilcoxon秩和检验来检验响应和HGF水平之间的关联。使用Kaplan-Meier(KM)曲线显示展示HGF水平和距事件的时间结果(PFS和OS)之间的相关性。显示每组事件/患者的数目和距事件的中值时间。使用结果(其作为连续HGF水平的函数)的cox-比例模型来计算危害比和相应的p值。
结果
使用41种具有先前定义的激酶依赖性的不同人肿瘤衍生细胞系7-9，我们采取了“矩阵分析”来检查6种不同RTK配体(HGF，EGF，FGF，PDGF，NRG1，IGF)–已知在癌细胞和肿瘤基质中广泛表达10–对药物响应的影响。具体而言，我们量化了将这些癌细胞系(例如AU565(HER2amp))暴露于每种配体对在其它情况中在72小时内有力阻抑其生长的激酶抑制剂(例如lapatinib)的IC50的影响(图1a)。几乎所有测试的激酶依赖性癌细胞系(包括自多种组织类型衍生且具有不同激酶依赖性(EGFR，HER2，BRAF，MET，ALK，PDGFR，和FGFR)的细胞能由一种或多种RTK配体挽救而免于药物诱导的生长抑制，突显在激酶成瘾的肿瘤细胞中这些配体潜在广泛地有助于对选择性激酶抑制剂的响应(图1b)。
配体暴露对药物响应的后果可分成三类(图1c)；“不挽救”：添加配体对药物响应没有可检测的影响；“部分挽救”：配体部分消除处理响应，或“完全挽救”：配体使IC50曲线“右移”>10倍，或完全阻抑药物响应。在赋予药物抗性方面，HGF，FGF和NRG1是活性最广泛的配体，接着是EGF；而IGF和PDGF具有相对较小的作用，尽管它们有能力活化它们的相应受体(图5a和7a)。值得注意的是，大多数测试的细胞系通过暴露于两者或甚至三种不同配体能被挽救免于处理敏感性，突显此类细胞在暴露于多种RTK配体时牵涉冗余存活途径的表观能力。重要的是，在数种测试的细胞系中测试的RTK配体无一能挽救细胞免于化疗药物顺铂的生长阻抑效应，提示观察到的配体挽救效果并不反映广泛的免于一般性有毒药剂的保护，而是限于途径特异性信号破坏(图5b)。
为了进一步探索与配体介导的免于激酶依赖性的挽救有关的信号传导动力学，我们评估了通常涉及RTK的两种关键的下游存活信号传导途径-PI3K/AKT和MAPK/ERK途径-的状态11。在实现配体介导的挽救的情况中，RTK配体能有效地“再活化”至少一种这些途径，尽管存在激酶抑制剂(图2a)。途径再活化不是由于致癌性激酶的再活化，因为成瘾性激酶的自体磷酸化在RTK配体共处理后保持收到阻抑。在测试的各种模型中，HGF再活化PI3K和MAPK途径二者，IGF和NRG1仅仅再活化PI3K，而FGF和EGF仅仅再活化MAPK途径。
“冗余RTK”的活化和所致下游存活信号传导持续至少48小时，如用lapatinib和HGF共处理的AU565细胞所展现的(图9b)。在存在NRG1，FGF或组合的情况中在用lapatinib处理的AU565细胞中观察到PI3K和MAPK途径二者的再活化的“叠加”作用(图14a)。然而，特异性抑制PI3K途径(而非MAPK)减弱HGF推动的药物抗性，其与两种存活途径的参与有关(图14b)。
正如预期的，观察到的RTK配体诱导的细胞存活挽救和途径信号传导可以通过共靶向第二活化的激酶来逆转，确认有效配体经由它们的关联RTK起作用(图2b，c，图5c，d，图22)。重要的是，在测试的各种模型中介导配体驱动的挽救的“第二”RTK的抑制剂在这些细胞系中作为单一药剂处理时的作用很小或没有，指示在缺乏可得配体的情况中激酶成瘾的细胞最初并非依赖于多种不同RTK。类似地，在缺乏激酶抑制剂的情况中RTK配体刺激对细胞增殖的影响很小或没有(图1c和2b)。
细胞系小组间基线RTK表达的分析确认了所有这些激酶依赖性癌细胞表达多种RTK，提示许多癌细胞被“引发”来接收来自细胞外配体的存活信号。值得注意的是，在一些情况中(例如MET/HGF，EGFR/EGF和HER3/NRG1)，配体诱导的挽救与某些RTK的表达关联较好(p<0.01；图6)，提示肿瘤在治疗前的RTK概况能告知最佳治疗策略，其预期需要共靶向两种或更多种可能有助于癌细胞存活的激酶，取决于肿瘤微环境中相应配体的可得性。
在一些情况中，配体不能挽救细胞免于药物敏感性，尽管配体相关RTK有表达。我们鉴定出与这种背景中配体诱导的挽救失败有关的两种不同生化情节(图7)。在少数情况中，RTK配体能够活化它的受体，如RTK磷酸化所证明的；然而，没有观察到所致的经由PI3K或MAPK的下游信号传导。例如，这在用IGF处理时在COLO-201和BT474细胞系中有看到(图7a)。在其它情况中，RTK配体活化它的受体以及至少一种下游存活效应器；然而，那不足以挽救细胞免于激酶抑制。例如，这用H2228和H358细胞(在暴露于HGF时)或用COLO-201细胞(在暴露于NRG1时)有观察到(图7b)。然而，H2228和H358细胞在较长期的处理后被HGF“挽救”，可能暗示存在能够响应HGF且在存在抑制性激酶的情况中可能随时间得到选择的细胞亚群，如下文详述的(图8c，d)。
细胞系分析产生了数项发现，其具有潜在重要的临床含义。例如，测试的两种包含ALK相关染色体易位(NCI-H3122)且展现ALK激酶成瘾的NSCLC细胞系之一能通过简短暴露于HGF而得到有效挽救而免于ALK抑制(图8)。在这些细胞中，在HGF受体MET表达的情况中，HGF促进ERK和AKT活化，甚至在存在ALK选择性抑制剂TAE684的情况中。然而，重要的是，这些细胞的存活通过用crizotinib(一种双重ALK/MET激酶抑制剂，最近在ALK易位NSCLC中证明印象深刻的临床活性)12处理受到有效阻抑，甚至在存在HGF的情况中。鉴于观察到的这些细胞响应HGF的能力，在许多ALK易位NSCLC患者中观察到的相对持久的临床响应可能部分归于crizotinib的双重抑制本质，它能有效阻抑ALK-和MET介导的存活信号二者。有趣的是，第二种ALK易位NSCLC系(NCI-H2228)也表达可检测的MET，都是在测试的72小时时间点没有受到HGF挽救免于ALK抑制。然而，HGF处理能够在存在TAE684的情况中再活化AKT和ERK活性(图7b)，而且更长期的TAE684处理在存在HGF的情况中在这些细胞中阻止获得性的对TAE684的抗性(图8c)。这项发现让人回忆起先前记载的已有的MET表达肿瘤细胞亚群已显示存在于一些EGFR突变体NSCLC患者中13。
HGF挽救测试的9种HER2扩增的乳腺癌细胞系中3种免于HER2激酶抑制剂lapatinib所致生长抑制的能力也是出乎意料的(图3a)。这3种细胞系都表达MET，而且表达与HGF减弱lapatinib响应的能力关联较好(图3b)。如在NCI-H228细胞系中那样，对部分HGF挽救的AU565MET表达细胞更长期的共处理(12天)揭示了HGF快速促进对lapatinib的抗性，大概是通过驱动对MET表达细胞亚群的选择(图3c，9b)。事实上，对AU565细胞进行9天lapatinib和HGF共处理产生MET表达升高的一群细胞，提示HGF暴露选择MET表达细胞亚群(图3f)。生化分析指示HGF专门在MET阳性细胞中再活化PI3K和MAPK信号传导途径，但是在MET阴性细胞中不然(图3d)。
我们接下来确定HER2阳性原发性乳腺肿瘤是否可检测地表达MET蛋白(图3e)。在分析的10份样品中，1份样品在～30％的肿瘤细胞中展现出中等的和高的MET表达，5份样品在大约10％的肿瘤细胞中展示出MET表达。一种HER2扩增的乳腺癌细胞系(HCC1954)在缺乏外源HGF的情况中展示出升高的磷酸-MET，暗示自分泌机制(图3b)，而且在这些细胞中MET激酶抑制延迟lapatinib抗性的出现(图3g)。总之，这些结果提示MET表达HER2阳性乳腺肿瘤能通过在“引发的”肿瘤细胞的亚群中卷入MET来潜在规避HER2激酶抑制，导致对靶向疗法的抗性，而且这种朝向MET依赖性的转变可以是由HGF的可得性驱动的。与这种可能性一致，SKBR3和AU565细胞衍生自相同患者，突显患者肿瘤内MET表达可能的异质性。我们还发现测试的9种HER2扩增的乳腺细胞系至8种能通过暴露于HER3配体NRG1得到挽救免于lapatinib敏感性，暗示肿瘤微环境中的NRG1表达在对HER2靶向治疗的可变响应中的潜在重要作用(图23)。
另一项立即具有潜在临床含义的观察结果是如下的出乎意料的发现，即在数种测试的BRAF突变体PLX4032敏感性黑素瘤和结肠直肠细胞系中HGF暴露显著减弱对BRAF激酶抑制剂PLX4032的响应。PLX4032最近在BRAF突变体黑素瘤中展现出显著的临床功效，导致它最近批准用于临床使用14。
为了确定除HGF以外的生长因子和其它细胞因子类似地影响PLX4032敏感性的潜在作用，我们比较了在存在446种不同重组纯化的分泌因子每一种的情况中SK-MEL-28细胞对PLX4032的敏感性。这项分析揭示了非常少数的因子(包括HGF)能减弱PLX4032敏感性(图17)。
我们检查了另外12种BRAF突变体黑素瘤细胞系以探索HGF-MET信号传导在对PLX4032的响应中潜在更广泛的作用(图4a)。HGF在12种系的5种中显著减弱PLX4032敏感性。10种HGF挽救的细胞系中8种展示出可检测的MET表达，而MET在不挽救的细胞中检测不到或刚刚能检测到。值得注意的是，在HGF可挽救细胞系中MET表达与PLX4032敏感性负相关，而且在受到HGF挽救的细胞系中HGF能再活化MAPK信号传导，但是在MET阴性HGF不挽救的细胞中不然(图4b)。正如预期的，当MET受到crizotinib抑制时，HGF所致存活挽救遭到逆转(图4b和图9a)。一种BRAF突变体细胞系(624MEL)在缺乏外源HGF的情况中展示出升高的磷酸-MET，与自分泌机制一致(图4a)，而且这些细胞中的MET激酶抑制延迟PLX4032抗性的出现(图4c)。
crizotinib共处理在两种检测不到磷酸-MET的细胞系(A375和928MEL)中也阻止对PLX4032的抗性，进一步支持HGF活化的MET在介导对PLX4032的抗性中的潜在作用(图18)。
为了验证在体内HGF-MET信号传导在对BRAF抑制的抗性中的潜在作用，我们用BRAF突变体928MEL黑素瘤细胞实施了异种移植物研究。重要的是，这些肿瘤中使用激动性抗体3D6实现的MET活化消除PLX4032的生长阻抑效应(图4d)。通过用MET小分子激酶抑制剂共处理证明了3D6所致MET活化在减弱对PLX4032的响应中的相关性。总之，这些结果提示MET激酶(经由HGF活化)在BRAF突变体黑素瘤的一个子集中能有助于对PLX4032的临床响应。
总体发现突显了能在大多数肿瘤细胞中共表达的RTK间的信号交流的广泛本质，以及RTK配体在促成先天性和获得性的对选择性激酶抑制剂如癌症治疗剂的抗性中的潜在广泛作用。此类配体可以由肿瘤细胞自身生成以驱动自分泌存活机制，或者可以由肿瘤基质生成以经由对存活信号传导的旁分泌效应来影响肿瘤细胞中的药物响应15,16。
越来越多地认识到人肿瘤的异质性，它显著地使得阐明药物抗性机制变得复杂17-19。我们的发现突显RTK配体的潜在广泛作用，在此背景中，我们设想了此类异质性能促成获得性抗性的不同机制。如此，可能的情况是治疗之前存在能够响应促进存活的RTK配体的一种肿瘤细胞亚群，而且这种亚群经由药物治疗的选择压力而扩充，如果此类配体在肿瘤微环境内变得可得的话。事实上，BRAF突变体黑素瘤细胞中MET表达的IHC分析揭示了一种异质的细胞群(图21)。在EGFR突变体NSCLC的情况中，在用EGFR激酶抑制剂治疗期间在暴露于HGF时会出现MET驱动的一种肿瘤细胞亚群13。值得注意的是，在成胶质细胞瘤中报告了多种RTK的活化，而且只在共靶向多种活化的受体后观察到对促存活信号的阻抑和细胞死亡(Stommel,J.M.et al.Science318,287-290,doi:10.1126/science.1142946(2007))。也有可能的情况是凭借获得生成RTK配体的能力选择一种肿瘤细胞亚群。在获得性的对激酶抑制剂的抗性的多种临床前模型中，观察到的抗性机制牵涉朝向新RTK依赖性的“转变”20-25，这在一些情况中可归于RTK配体生成的升高。此类升高的配体生成潜在地可通过突变或外遗传机制任一来实现。
虽然基因组生物标志物(诸如BRAF和EGFR突变)在鉴定最很可能受益于疗法的患者中是至关重要的，但是此类患者中有至今还未解释的广泛的对激酶抑制性药物的初始临床响应-在响应的量级和持续时间两方面12,14。由肿瘤细胞分泌的、在肿瘤微环境中表达的、或甚至系统性提供的RTK配体的潜在作用迄今还有很多未探索。因为已经证明肿瘤衍生的细胞系是用于在突变定义的子集中捕捉基因型相关的对选择性激酶抑制剂的敏感性的有力模型7,8，所以来自这项矩阵分析的发现支持RTK配体在来自此类疗法的总体临床受益中的潜在广泛作用，而且为生物标志物基于RTK及其相关配体的表达来告知预先考虑与冗余存活信号传导(其经由许多广泛表达的RTK共同的关键效应器)有关的先天性和获得性抗性机制二者的治疗策略的用途提供基础。
实施例2：具有BRAF V600E的细胞中各种PTK配体的挽救结果
这里使用的方法与实施例1中记载的方法类似。我们在具有BRAF V600E的细胞中检查了6种不同RTK配体(HGF，EGF，FGF，PDGF，NRG1，IGF)对药物响应(PLX4032)的影响。图10显示了用PLX4032处理的细胞中各种PTK配体所致挽救结果。
实施例3：MET激酶抑制在延迟lapatinib抗性中的作用
这里使用的方法与实施例1中记载的方法类似。在HCC1954细胞中检查了MET激酶抑制延迟lapatinib抗性的作用。用lapatinib(5μM)和/或crizotinib(1μM)处理HCC1954HER2扩增的乳腺癌细胞，并用Syto60染色。图11显示了在HCC1954细胞中MET激酶抑制延迟lapatinib抗性的出现。
实施例4：HGF-MET信号传导在对PLX4032的细胞响应中的作用
这里使用的方法与实施例1中记载的方法类似。我们检查了HGF-MET信号传导在对PLX4032的细胞响应中的作用。我们观察到HGF能在通过HGF挽救的细胞系中再激活MAPK信号传导，但在MET阴性、非HGF挽救的细胞中不能(图4a，12a)。为了验证在体内HGF-MET信号传导在对BRAF抑制的抗性中的潜在作用，我们用BRAF突变体928MEL和624MEL黑素瘤细胞实施了异种移植物研究。重要地，使用MET激动性抗体3D6在这些肿瘤中激活MET强烈消除PLX4032的生长阻抑效果(图12b)。通过用MET小分子激酶抑制剂共处理验证了3D6所致MET激活在减弱对PLX4032的响应中的相关性。与体外发现类似，我们观察到在用PLX4032处理的异种移植物中抑制MET激酶活性对肿瘤消退具有更大的效果，观察到更多的部分响应(928MEL：1比8；图12b和图19)。总之，这些结果提示MET激酶(经由HGF激活)在BRAF突变体黑素瘤的一个子集中能有助于对PLX4032的临床响应。
实施例5：HGF-MET信号传导在临床背景中的作用
这里使用的方法与实施例1中记载的方法类似。为了检查HGF-MET信号传导在临床背景中的潜在作用，我们检验了BRAF突变体黑素瘤患者中的循环HGF可有助于临床结果的假说。如此，自参加BRIM2临床试验(用PLX4032治疗的BRAF突变体转移性黑素瘤患者)的132名转移性黑素瘤患者中126人测量治疗前血浆HGF水平。HGF水平的范围为33pg/mL至7200pg/mL，中值水平334pg/mL(图20)。HGF水平超出中值的用PLX4032治疗的患者展现出比HGF水平不及中值的患者实质性缩短的无进展存活(p＝0.005)和总体存活(p<0.001)(图13)。升高的HGF与更差的结果有关，如通过无进展存活(PFS，危害比为1.42且p<0.005)和总体存活(OS，危害比为1.8且p<0.001)测量的。将患者隔离成三组(tertile)揭示了HGF水平和结果之间的连续相关性，而非阈效应(图24B)。这些研究使HGF-MET信号传导与疾病进展和总体存活，和可能对BRAF抑制的临床响应(在BRAF突变体黑素瘤中)联系起来。
实施例6：细胞中配体诱导的挽救
这里使用的方法与实施例1中记载的方法类似。我们分析了细胞中RTK的表达和配体诱导的挽救。结果显示于图15。在一些情况中(例如MET/HGF，EGFR/EGF和HER3/NRG1)，配体诱导的挽救与某些RTK的表达关联较好(p<0.01；图15)，提示肿瘤在治疗前的RTK概况能告知最佳治疗策略，其预期需要共同靶向两种或更多种可能有助于癌细胞存活的激酶，取决于肿瘤微环境中相应配体的可得性。
实施例7：HGF在阻止获得性的对TAE684的抗性中的作用
这里使用的方法与实施例1中记载的方法类似。我们检查了HGF在用TAE684处理的H2228细胞中的作用。图16显示在存在HGF的情况中较长期的TAE684处理在这些细胞中阻止获得性的对TAE684的抗性。
部分文献列表
1Sharma,S.V.&Settleman,J.Oncogene addiction:setting the stage formolecularly targeted cancer therapy.Genes Dev21,3214-3231,doi:10.1101/gad.1609907(2007).
2Sequist,L.V.et al.Genotypic and histological evolution of lungcancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.Sci Transl Med3,75ra26,doi:10.1126/scitranslmed.3002003(2011).
3Garrett,J.T.&Arteaga,C.L.Resistance to HER2-directed antibodiesand tyrosine kinase inhibitors:mechanisms and clinical implications.Cancer BiolTher11,793-800(2011).
4Engelman,J.A.&Settleman,J.Acquired resistance to tyrosine kinaseinhibitors during cancer therapy.Curr Opin Genet Dev18,73-79,doi:10.1016/j.gde.2008.01.004(2008).
5Moritz,A.et al.Akt-RSK-S6kinase signaling networks activated byoncogenic receptor tyrosine kinases.Sci Signal3,ra64,doi:10.1126/scisignal.2000998(2010).
6Zhang,W.&Huang,P.Cancer-stromal interactions:role in cellsurvival,metabolism and drug sensitivity.Cancer Biol Ther11,150-156(2011).
7McDermott,U.et al.Identification of genotype-correlated sensitivity toselective kinase inhibitors by using high-throughput tumor cell line profiling.Proc Natl Acad Sci U S A104,19936-19941,doi:10.1073/pnas.0707498104(2007).
8Wilson,T.R.,Lee,D.Y.,Berry,L.,Shames,D.S.&Settleman,J.Neuregulin-1-Mediated Autocrine Signaling Underlies Sensitivity to HER2Kinase Inhibitors in a Subset of Human Cancers.Cancer Cell20,158-172,doi:10.1016/j.ccr.2011.07.011(2011).
9Yonesaka,K.et al.Autocrine production of amphiregulin predictssensitivity to both gefitinib and cetuximab in EGFR wild-type cancers.ClinCancer Res14,6963-6973,doi:10.1158/1078-0432.CCR-08-0957(2008).
10Mueller,M.M.&Fusenig,N.E.Friends or foes-bipolar effects of thetumor stroma in cancer.Nat Rev Cancer4,839-849,doi:10.1038/nrc1477(2004).
11Grant,S.,Qiao,L.&Dent,P.Roles of ERBB family receptor tyrosinekinases,and downstream signaling pathways,in the control of cell growth andsurvival.Front Biosci7,d376-389(2002).
12Kwak,E.L.et al.Anaplastic lymphoma kinase inhibition innon-small-cell lung cancer.N Engl J Med363,1693-1703,doi:10.1056/NEJMoa1006448(2010).
13Turke,A.B.et al.Preexistence and clonal selection of METamplification in EGFR mutant NSCLC.Cancer Cell17,77-88,doi:10.1016/j.ccr.2009.11.022(2010).
14Chapman,P.B.et al.Improved survival with vemurafenib in melanomawith BRAF V600E mutation.N Engl J Med364,2507-2516,doi:10.1056/NEJMoa1103782(2011).
15Gilbert,L.A.&Hemann,M.T.DNA damage-mediated induction of achemoresistant niche.Cell143,355-366,doi:10.1016/j.cell.2010.09.043(2010).
16Liang,K.et al.Recombinant human erythropoietin antagonizestrastuzumab treatment of breast cancer cells via Jak2-mediated Src activation andPTEN inactivation.Cancer Cell18,423-435,doi:10.1016/j.ccr.2010.10.025(2010).
17Quintana,E.et al.Phenotypic heterogeneity among tumorigenicmelanoma cells from patients that is reversible and not hierarchically organized.Cancer Cell18,510-523,doi:10.1016/j.ccr.2010.10.012(2010).
18Calbo,J.et al.A functional role for tumor cell heterogeneity in a mousemodel of small cell lung cancer.Cancer Cell19,244-256,doi:10.1016/j.ccr.2010.12.021(2011).
19Sharma,S.V.et al.A chromatin-mediated reversible drug-tolerant statein cancer cell subpopulations.Cell141,69-80,doi:10.1016/j.cell.2010.02.027(2010).
20Nazarian,R.et al.Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E)inhibition by RTK or N-RAS upregulation.Nature468,973-977,doi:10.1038/nature09626(2010).
21Guix,M.et al.Acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitorsin cancer cells is mediated by loss of IGF-binding proteins.J Clin Invest118,2609-2619,doi:10.1172/JCI34588(2008).
22McDermott,U.,Pusapati,R.V.,Christensen,J.G.,Gray,N.S.&Settleman,J.Acquired resistance of non-small cell lung cancer cells to METkinase inhibition is mediated by a switch to epidermal growth factor receptordependency.Cancer Res70,1625-1634,doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-3620(2010).
23Johannessen,C.M.et al.COT drives resistance to RAF inhibitionthrough MAP kinase pathway reactivation.Nature468,968-972,doi:10.1038/nature09627(2010).
24Liu,L.et al.Novel mechanism of lapatinib resistance in HER2-positivebreast tumor cells:activation of AXL.Cancer Res69,6871-6878,doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-4490(2009).
25Engelman,J.A.et al.MET amplification leads to gefitinib resistance inlung cancer by activating ERBB3signaling.Science316,1039-1043,doi:10.1126/science.1141478(2007).
26Stommel,J.M.et al.Coactivation of receptor tyrosine kinase affects theresponse of tumor cells to targeted therapies.Science318,287-290,doi:10.1126/science.1142946(2007).
26Liederer,B.M.et al.Preclinical absorption,distribution,metabolism,excretion,and pharmacokinetic-pharmacodynamic modelling ofN-(4-(3-((3S,4R)-1-ethyl-3-fluoropiperidine-4-ylamino)-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-4-yloxy)-3-fluorophenyl)-2-(4-fluorophenyl)-3-oxo-2,3-dihydropyridazine-4-carboxamide,a novel MET kinase inhibitor.Xenobiotica41,327-339,doi:10.3109/00498254.2010.542500(2011).
27Catenacci,D.V.T.et al.Durable Complete Response of MetastaticGastric Cancer with Anti-Met Therapy Followed by Resistance at Recurrence.Cancer Discovery1,573-579,doi:10.1158/2159-8290(2011).
虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过述及明确地完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。

Claims (43)

1.一种用于治疗具有癌症的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
2.一种用于治疗形成对B-raf拮抗剂的抗性的可能性升高的癌症患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
3.一种用于提高和/或恢复对B-raf拮抗剂的敏感性的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
4.一种用于延长B-raf拮抗剂敏感性时段的方法，其包括对癌症患者施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
5.一种用于治疗具有B-raf拮抗剂抗性癌症的患者的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
6.一种用于延长B-raf拮抗剂响应持续时间的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
7.一种用于在患者中延迟或阻止形成HGF介导的B-raf拮抗剂抗性癌症的方法，其包括施用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述患者的癌症显示出表达B-raf生物标志物。
9.权利要求8的方法，其中所述B-raf生物标志物为B-raf V600。
10.权利要求8的方法，其中所述B-raf生物标志物为B-raf V600E。
11.权利要求8-10任一项的方法，其中使用包括下述各项的方法测定所述患者的癌症中的突变型B-raf生物标志物表达：(a)对样品实施基因表达序型分析、PCR杂交测定法、原位杂交、5’核酸酶测定法突变检测测定法、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术、或FISH中一项或多项，和(b)测定样品中突变型B-raf生物标志物的表达。
12.权利要求11的方法，其中使用包括下述各项的方法测定所述患者的癌症中的突变型B-raf生物标志物表达：(a)对自患者癌症样品提取的基因组DNA实施PCR，和(b)测定样品中突变型B-raf生物标志物的表达。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述患者的癌症显示出表达c-met生物标志物。
14.权利要求13的方法，其中c-met生物标志物为多肽。
15.权利要求14的方法，其中使用免疫组织化学(IHC)测定c-met生物标志物表达。
16.权利要求15的方法，其中通过测定肝细胞生长因子(HGF)的表达来测定c-met生物标志物表达。
17.权利要求16的方法，其中HGF在肿瘤或肿瘤基质中表达。
18.权利要求16的方法，其中在所述患者的血清中测定HGF表达。
19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述c-met拮抗剂为拮抗性抗c-met抗体。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述c-met拮抗剂为onartuzumab、crizotinib、tivantinib、carbozantinib、MGCD-265、ficlatuzumab、人源化TAK-701、rilotumumab、foretinib、h224G11、DN-30、MK-2461、E7050、MK-8033、PF-4217903、AMG208、JNJ-38877605、EMD1204831、INC-280、LY-2801653、SGX-126、RP1040、LY2801653、BAY-853474、和/或LA480中一项或多项。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中所述B-raf拮抗剂为sorafenib、PLX4720、PLX-3603、GSK2118436、GDC-0879、N-(3-(5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺、vemurafenib、GSK2118436、RAF265(Novartis)、XL281、ARQ736、BAY73-4506中一项或多项。
22.权利要求21的方法，其中所述B-raf拮抗剂为vemurafenib。
23.权利要求21的方法，其中所述B-raf拮抗剂为GSK2118436。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中同时施用所述B-raf拮抗剂和所述c-met拮抗剂。
25.权利要求1-23任一项的方法，其中序贯施用所述B-raf拮抗剂和所述c-met拮抗剂。
26.权利要求25的方法，其中在所述c-met拮抗剂之前施用所述B-raf拮抗剂。
27.权利要求26的方法，其中在所述B-raf拮抗剂之前施用所述c-met拮抗剂。
28.权利要求1-27任一项的方法，其进一步包括对所述受试者施用至少一种别的治疗。
29.权利要求1-28任一项的方法，其中所述癌症为黑素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌或乳头状甲状腺癌。
30.权利要求29的方法，其中所述癌症为显示出表达B-raf V600的黑素瘤。
31.权利要求1-30任一项的方法，其中所述癌症对B-raf拮抗剂有抗性。
32.权利要求1-30任一项的方法，其中所述患者先前未用B-raf拮抗剂治疗过。
33.一种用于测定c-met生物标志物表达的方法，其包括测定患者的癌症是否表达c-met生物标志物的步骤，其中c-met生物标志物表达指示该患者是用c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗的候选：提高所述患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性，恢复所述患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性，延长所述患者的癌症对B-raf拮抗剂的敏感性的时段，和/或阻止所述患者的癌症中形成HGF介导的B-raf拮抗剂抗性。
34.一种用于将患者鉴定为用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗的候选的方法，其包括：(a)测定所述患者的癌症表达c-met生物标志物；并(b)将所述患者鉴定为用B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗的候选。
35.一种用于将患者鉴定有风险形成对B-raf拮抗剂的抗性的方法，其包括：(a)测定所述患者的癌症表达c-met生物标志物；并(b)将所述患者鉴定为有风险形成对B-raf拮抗剂的抗性。
36.权利要求34或35的方法，其中在步骤(a)和(b)之后，用有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂治疗所述患者。
37.一种测定B-raf拮抗剂治疗患者中癌症的治疗功效的方法，其包括通过免疫测定法、ELISA、杂交测定法、PCR、5’核酸酶测定法、IHC、和/或RT-PCR测定自所述患者获得的样品中c-met生物标志物和/或B-raf生物标志物的存在情况，并选择所述患者用B-raf拮抗剂进行治疗。
38.权利要求37的方法，其进一步包括选择所述患者用c-met拮抗剂进行治疗。
39.权利要求38的方法，其进一步包括用有效量的B-raf拮抗剂和c-met拮抗剂治疗所述患者。
40.一种确定黑素瘤患者预后的方法，其包括测定来自所述患者的样品中c-met生物标志物的表达情况，其中c-met生物标志物为HGF且HGF表达预示所述受试者中的癌症。
41.一种试剂盒，其包含c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂。
42.权利要求41的试剂盒，其进一步包含用于治疗黑素瘤患者的方法的用法说明书，该方法包括将有效量的c-met拮抗剂和B-raf拮抗剂施用于所述患者。
43.一种制品，其包含包装在一起的药学可接受载体中的c-met拮抗剂和包装插页，该包装插页指示该c-met拮抗剂用于基于B-raf生物标志物的表达来治疗具有黑素瘤的患者，其中该治疗与B-raf拮抗剂组合。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109562282A (zh) * 2016-07-29 2019-04-02 伊莱利利公司 用于治疗癌症的使用merestinib和抗-pd-l1或抗-pd-1抑制剂的组合疗法
CN112930215A (zh) * 2018-08-30 2021-06-08 阿雷生物药品公司 作为TAM和MET激酶抑制剂的吡唑并[3，4-b]吡啶化合物

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011057120A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Genentech, Inc. Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
US20140030259A1 (en) * 2012-07-27 2014-01-30 Genentech, Inc. Methods of treating fgfr3 related conditions
US9937161B2 (en) * 2013-03-06 2018-04-10 The General Hospital Corporation Combinatorial compositions and methods for treatment of melanoma
CN105122068A (zh) * 2013-03-15 2015-12-02 因特穆内公司 蛋白质组学ipf标志物
WO2014147573A2 (en) * 2013-03-21 2014-09-25 Novartis Ag Combination therapy
KR101538385B1 (ko) * 2013-09-02 2015-07-29 가톨릭대학교 산학협력단 크리조티닙을 포함하는 톡소포자충 감염증의 예방 및 치료용 조성물
HUE037579T2 (hu) * 2013-12-26 2018-09-28 Ignyta Inc Pirazolo[1,5-a]piridin-származékok és módszerek alkalmazásukra
AU2015229035B2 (en) 2014-03-14 2021-08-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
WO2015148531A1 (en) * 2014-03-24 2015-10-01 Genentech, Inc. Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
US20150283237A1 (en) * 2014-04-02 2015-10-08 Mitchell S. Felder Ctla-4 blockade with metronomic chemotherapy for the treatment of cancer
US10028958B2 (en) 2014-04-19 2018-07-24 Massachusetts Institute Of Technology Methods of treating cancer with a combination of selected MEK1/2 and AXL inhibitors
TW201613919A (en) 2014-07-02 2016-04-16 Pharmacyclics Llc Inhibitors of Bruton's tyrosine kinase
US20170306415A1 (en) * 2014-10-01 2017-10-26 Merrimack Phamaceuticals, Inc. Predicting tumor responses to antibodies against hepatocyte growth factor (hgf) and/or its cognate receptor, c-met
AU2017279555A1 (en) * 2016-06-07 2019-01-03 Expression Pathology, Inc. Detection of exon 14 deletion in the Met protein
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
MX393780B (es) 2017-01-17 2025-03-24 Heparegenix Gmbh Inhibidores de proteina cinasa para promover la regeneracion hepatica o reducir o prevenir la muerte de hepatocitos
JP2021534094A (ja) * 2018-08-07 2021-12-09 イン3バイオ・リミテッドIn3Bio Ltd. 未分化リンパ腫キナーゼ阻害剤と組み合わせてｅｇｆ／ｅｇｆｒ経路を抑制するための方法および組成物
JP7750828B2 (ja) 2019-09-16 2025-10-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 免疫ｐｅｔ撮像のための放射標識されたｍｅｔ結合タンパク質
CN113234090B (zh) * 2021-04-23 2022-07-29 中国药科大学 靶向泛素化降解FoxM1的化合物或其可药用的盐、制备方法及用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009140549A1 (en) * 2008-05-14 2009-11-19 Amgen Inc. Combinations vegf(r) inhibitors and hepatocyte growth factor (c-met) inhibitors for the treatment of cancer
WO2010093789A2 (en) * 2009-02-12 2010-08-19 Arqule, Inc. Combinational compositions and methods for treatment of cancer
WO2011028540A1 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Genentech, Inc. Determining sensitivity of cells to b-raf inhibitor treatment by detecting kras mutation and rtk expression levels

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018653A (en) 1971-10-29 1977-04-19 U.S. Packaging Corporation Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture
US4016043A (en) 1975-09-04 1977-04-05 Akzona Incorporated Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4424279A (en) 1982-08-12 1984-01-03 Quidel Rapid plunger immunoassay method and apparatus
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5604099A (en) 1986-03-13 1997-02-18 Hoffmann-La Roche Inc. Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
CA1284931C (en) 1986-03-13 1991-06-18 Henry A. Erlich Process for detecting specific nucleotide variations and genetic polymorphisms present in nucleic acids
US5310893A (en) 1986-03-31 1994-05-10 Hoffmann-La Roche Inc. Method for HLA DP typing
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4851331A (en) 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
US5322770A (en) 1989-12-22 1994-06-21 Hoffman-Laroche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription
US5310652A (en) 1986-08-22 1994-05-10 Hoffman-La Roche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription
US5693517A (en) 1987-06-17 1997-12-02 Roche Molecular Systems, Inc. Reagents and methods for coupled high temperature reverse transcription and polymerase chain reactions
US5561058A (en) 1986-08-22 1996-10-01 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for coupled high temperatures reverse transcription and polymerase chain reactions
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
JP2774121B2 (ja) 1987-07-31 1998-07-09 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5639611A (en) 1988-12-12 1997-06-17 City Of Hope Allele specific polymerase chain reaction
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5137806A (en) 1989-12-11 1992-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of sequences in selected DNA molecules
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2141088T3 (es) 1990-02-16 2000-03-16 Hoffmann La Roche Mejoras en la especificidad y conveniencia de la reaccion en cadena de la polimerasa.
CA2084987C (en) 1990-06-11 2007-02-13 Larry Gold Nucleic acid ligands
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH04234422A (ja) 1990-10-31 1992-08-24 Internatl Business Mach Corp <Ibm> 二重硬化エポキシバックシール処方物
EP0487218B1 (en) 1990-10-31 1997-12-29 Tosoh Corporation Method for detecting or quantifying target nucleic acid
IE913930A1 (en) 1990-11-13 1992-06-17 Siska Diagnostics Nucleic acid amplification by two-enzyme, self-sustained¹sequence replication
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5455166A (en) 1991-01-31 1995-10-03 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0540997A1 (en) 1991-11-05 1993-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and reagents for HLA class I DNA typing
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
EP0655090B1 (en) 1992-04-27 2000-12-27 The Trustees Of Dartmouth College Detection of gene sequences in biological fluids
US5338671A (en) 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5491063A (en) 1994-09-01 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes
US5910486A (en) 1994-09-06 1999-06-08 Uab Research Foundation Methods for modulating protein function in cells using, intracellular antibody homologues
US5571673A (en) 1994-11-23 1996-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5773258A (en) 1995-08-25 1998-06-30 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2601882T5 (es) 1999-04-09 2021-06-07 Kyowa Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
DE60042021D1 (de) 1999-07-29 2009-05-28 Gilead Sciences Inc Nukleinsäureliganden für den hepatozytischen wachstumsfaktor/dispersionsfaktor (hgf/sf) und seines c-met rezeptors
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
DK1242438T3 (da) 1999-12-29 2007-02-12 Immunogen Inc Cytotoksiske midler omfattende modificerede doxorubiciner og daunorubiciner og deres terapeutiske anvendelse
DK2857516T3 (en) 2000-04-11 2017-08-07 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses thereof
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
WO2003085119A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcϜ RECEPTOR IIIa
CA2481656A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells in which activity of the protein involved in transportation of gdp-fucose is reduced or lost
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DK2289936T3 (en) 2002-12-16 2017-07-31 Genentech Inc IMMUNGLOBULIN VARIATIONS AND APPLICATIONS THEREOF
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
WO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α1,6-フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するRNAを用いた抗体組成物の製造法
DK2380910T3 (en) 2003-11-05 2015-10-19 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
PT2489364E (pt) 2003-11-06 2015-04-16 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina conjugados com anticorpos
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1718677B1 (en) 2003-12-19 2012-04-18 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
ES2344793T3 (es) 2004-08-05 2010-09-07 Genentech, Inc. Antagonistas anti-cmet humanizados.
NZ553500A (en) 2004-09-23 2009-11-27 Genentech Inc Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates withCysteine engineered antibodies and conjugates with a free cysteine amino acid in the heavy chain a free cysteine amino acid in the heavy chain
TW200639163A (en) 2005-02-04 2006-11-16 Genentech Inc RAF inhibitor compounds and methods
US20060211073A1 (en) * 2005-03-21 2006-09-21 May Earl W Assay for B-Raf activity based on intrinsic MEK ATPase activity
MX2007016463A (es) 2005-06-22 2008-03-04 Plexxikon Inc Derivados de pirrolo [2,3-b] piridina como inhibidores de proteina cinasa.
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
EP2001880A2 (en) 2006-03-07 2008-12-17 Array Biopharma, Inc. Heterobicyclic pyrazole compounds and methods of use
WO2007126799A2 (en) 2006-03-30 2007-11-08 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies of c-met
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
PT2027156E (pt) 2006-06-02 2011-04-18 Aveo Pharmaceuticals Inc Proteínas de ligação ao factor de crescimento de hepatócito (hgf)
EP2043675A2 (en) * 2006-07-07 2009-04-08 Washington State University Research Foundation C-met receptor regulation by angiotensin iv (at4) receptor ligands
KR100829972B1 (ko) 2006-07-14 2008-05-16 재단법인서울대학교산학협력재단 항-ｈｇｆ/ｓｆ 인간화 항체 및 이의 제조방법
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
TW200940539A (en) 2008-02-29 2009-10-01 Array Biopharma Inc RAF inhibitor compounds and methods of use thereof
WO2009111277A1 (en) 2008-02-29 2009-09-11 Array Biopharma Inc. Imdizo [4. 5-b] pyridine derivatives used as raf inhibitors
JP2011513332A (ja) 2008-02-29 2011-04-28 アレイ バイオファーマ、インコーポレイテッド 癌の治療のためのｒａｆ阻害剤としてのｎ−（６−アミノピリジン−３−イル）−３−（スルホンアミド）ベンズアミド誘導体
CL2009000447A1 (es) 2008-02-29 2010-01-04 Array Biopharma Inc Y Genentech Inc Compuestos derivados de (1h-pirrolo{2,3-b}piridin-5-il)-sulfonamido-benzamida sustituida; procedimiento de preparacion; composicion farmaceutica; y su uso en el tratamiento del cancer, a travez de la inhibicion de raf.
CN102076355B (zh) 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US8637554B2 (en) * 2008-05-07 2014-01-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for treating thyroid cancer
WO2010045344A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Genentech, Inc. Combination therapy comprising a c-met antagonist and a vegf antagonist
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
EP2287197A1 (en) 2009-08-21 2011-02-23 Pierre Fabre Medicament Anti-cMET antibody and its use for the detection and the diagnosis of cancer
KR101671378B1 (ko) 2009-10-30 2016-11-01 삼성전자 주식회사 ｃ-Ｍｅｔ에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
RU2013114360A (ru) 2010-08-31 2014-10-10 Дженентек, Инк. Биомаркеры и способы лечения

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009140549A1 (en) * 2008-05-14 2009-11-19 Amgen Inc. Combinations vegf(r) inhibitors and hepatocyte growth factor (c-met) inhibitors for the treatment of cancer
WO2010093789A2 (en) * 2009-02-12 2010-08-19 Arqule, Inc. Combinational compositions and methods for treatment of cancer
WO2011028540A1 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Genentech, Inc. Determining sensitivity of cells to b-raf inhibitor treatment by detecting kras mutation and rtk expression levels

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109562282A (zh) * 2016-07-29 2019-04-02 伊莱利利公司 用于治疗癌症的使用merestinib和抗-pd-l1或抗-pd-1抑制剂的组合疗法
CN112930215A (zh) * 2018-08-30 2021-06-08 阿雷生物药品公司 作为TAM和MET激酶抑制剂的吡唑并[3，4-b]吡啶化合物

Also Published As

Publication number Publication date
RU2014114617A (ru) 2015-10-27
US20130078252A1 (en) 2013-03-28
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KR20140064971A (ko) 2014-05-28
WO2013043715A1 (en) 2013-03-28
IL231056A0 (en) 2014-03-31

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