CN103080303A

CN103080303A - 产生IL-13的Tr1-样细胞及其用途

Info

Publication number: CN103080303A
Application number: CN201180042091XA
Authority: CN
Inventors: 阿尔诺·福萨特; 埃尔韦·巴斯蒂安; 瓦莱丽·布鲁恩; 布里吉特·夸坦尼恩斯
Original assignee: TxCell SA
Current assignee: Sangamo Therapeutics SA
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-05-01
Also published as: RU2013103765A; CA2803779A1; US20130101568A1; MX2013000115A; BR112012033727A2; EP2588595A2; CN107189983A; AU2011273103B2; EP2412802A1; NZ605088A; CL2012003705A1; KR20130093083A; JP2013539356A; ZA201209758B; WO2012001533A3; MX347533B; JP2017148042A; AU2011273103A1; WO2012001533A2

Abstract

本发明涉及能够产生IL-13的分离的Tr1-样细胞群体，所述群体具有免疫抑制活性；和用于鉴定/分离/富集所述群体的方法及其用途。

Description

产生IL-13的Tr1-样细胞及其用途

技术领域

本发明涉及分离的产生IL-13的Tr1细胞，用于鉴定/分离/富集它们的方法以及使用分离的产生IL-13的Tr1细胞用于诊断或者治疗炎症性疾病、自身免疫病、过敏疾病和器官移植病的方法和试剂盒。

背景技术

免疫系统的稳态依赖于对侵入病原体的免疫反应与对自身抗原的免疫耐受之间的平衡。中心和外周耐受是诱导和维持T细胞耐受的重要机制。在近十年内，许多注意力集中于在维持外周免疫耐受中起重要作用的调节性T细胞(Treg)。现在已经坚定地确定Treg可以分成两个不同的亚型：天然Treg(nTreg)和可诱导Treg群体，例如TGF-β诱导的Treg细胞、Tr1细胞或者Th3细胞。

nTreg主要作为FoxP3+T细胞描述而Tr1细胞描述为产生IL-10的调节性T细胞(Allan等，2008，Immunological reviews，223：391-421)。FoxP3+nTregs抑制/调节广泛多种的不同免疫细胞，包括初始CD4+和CD8+T效应细胞和记忆CD4+和CD8+T效应细胞、B细胞、单核细胞和树突细胞。Tr1细胞通过分泌IL-10和转化生长因子β(TGF-β)调节免疫反应并具有抑制初始T细胞反应和记忆T细胞反应两者的能力。

已经证明Tr1细胞在细胞治疗中是有用的，因为向具有克隆病的患者注射Tr1细胞改善了他们的病症。然而，持续需要改善使用Tr1细胞的这种细胞治疗的有效性。

令人惊奇地是，发明人发现了能够产生IL-13的Tr1细胞亚群。发明人证明，这些细胞除了具有Tr1细胞标志性的IL-10抑制性作用之外，还具有通过IL-13诱导的抑制性效应。

发明内容

本发明的一个目标是能够产生IL-13的分离的Tr1-样细胞群体，优选地，分离的人Tr1-样细胞群体。在一个实施方案中，本发明的分离的Tr1-样细胞群体能够在本发明所述测试A的条件下产生IL-13。在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体产生低数量的IL-4。在本发明的另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体表达：

-CD4和

-低水平CD127和

-低水平CD62L。

在本发明的另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞是静息细胞并表达低水平CD25和低水平FoxP3。在本发明的另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体是活化的并表达CD25和中等水平的FoxP3。

在本发明的另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞是抗原特异性的，优选地抗原是II型胶原、卵清蛋白、髓磷脂碱蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白或HSP。

在本发明的一个实施方案中，分离的Tr1-样细胞群体是能够产生IL-13的Tr1-细胞群体，优选地人Tr1细胞群体，优选在测试A条件下能够产生IL-13的Tr1-细胞群体，优选地人Tr1细胞群体。在本发明的一个实施方案中，本发明的Tr1-样细胞群体，优选本发明的Tr1细胞群体，产生IL-10，优选在测试A的条件下产生IL-10。

本发明的另一目标是能够产生IL-13的分离的Tr1-样克隆，优选人分离的Tr1-样克隆。在一个实施方案中，本发明的分离的Tr1-样克隆能够在本发明所述的测试A的条件下产生IL-13。在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样克隆产生少量的IL-4。在另一个实施方案中，所述Tr1-样克隆表达：

-CD4和

-低水平CD127和

-低水平CD62L。

在本发明的另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样克隆是抗原特异性的，优选地抗原是II型胶原、卵清蛋白、髓磷脂碱蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白或HSP。

在本发明的一个实施方案中，分离的Tr1-样克隆是在测试A的条件下能够产生IL-13的Tr1克隆，优选人Tr1克隆。在本发明的一个实施方案中，本发明的Tr1-样克隆，优选本发明的Tr1克隆在测试A的条件下产生IL-10。

本发明的另一个目标是鉴定产生IL-13的Tr1-样细胞群体的方法，包括：

-检测CD127和CD62L标志物中的至少一个和CD4在细胞群体上的细胞表面表达，

-检测IL-13的产生，

其中表达CD4和低水平CD127和/或低水平CD62L并产生IL-13的细胞是产生IL-13的Tr1-样细胞群体。

在一个实施方案中，本发明的方法用于鉴定分离的产生IL-13的人Tr1细胞群体，其中方法还包括检测IL-10的产生。

本发明的另一个目标是用于使细胞群体中富集产生IL-13的Tr1-样细胞的方法，包括：

-鉴定表达CD4和低水平CD127和/或低水平CD62L并产生IL-13的细胞，

-选择所述细胞，

由此得到富集产生IL-13的Tr1-样细胞的细胞群体，其中产生IL-13的Tr1-样细胞百分数是富集前产生IL-13的Tr1-样细胞百分数的至少两倍。

在一个实施方案中，本发明的方法用于使细胞群体富集产生IL-13的人Tr1细胞群体，其中方法还包括检测IL-10的产生。

本发明的另一个目标是根据本文上述方法得到的富集的产生IL-13的Tr1-样细胞群体。在本发明的一个实施方案中，群体富含产生IL-13的人Tr1细胞。

本发明的另一个目标是用于鉴定或者分离产生IL-13的Tr1-样细胞群体，优选产生IL-13的人Tr1细胞群体的试剂盒，包括用于检测CD4、CD25、CD127和CD62L细胞表面表达的工具和用于检测IL-13的产生或IL-10和IL-13的产生的工具。

本发明的另一个目标是分离的和/或富集的产生IL-13的Tr1-样细胞群体，优选分离的和/或富集的产生IL-13的人Tr1细胞群体，或者产生IL-13的Tr1-样克隆，优选产生IL-13的人Tr1克隆，用于预防或者治疗免疫反应、移植物抗宿主疾病和器官排斥、过敏疾病、炎症性疾病或者自身免疫病。

本发明的另一目标是去除细胞群体中产生IL-13的Tr1-样细胞的方法，包括：

-如上所述鉴定产生IL-13的Tr1-样细胞，

-去除所述细胞，

由此得到产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的细胞群体，其中产生IL-13的Tr1-样细胞的百分数是去除前产生IL-13的Tr1-样细胞百分数的0.5倍。

在本发明的一个实施方案中，本发明的方法用于去除细胞群体中的产生IL-13的人Tr1细胞。

本发明的另一个目标是根据上述方法得到的去除产生IL-13的Tr1-样细胞的细胞群体。在本发明的一个实施方案中，被去除处理的细胞群体是产生IL-13的人Tr1细胞被去除了。

本发明的另一个目标是去除产生IL-13的Tr1-样细胞的细胞群体用于增强需要其的受试者中的免疫反应。在本发明的一个实施方案中，用于增强需要其的受试者中免疫反应的被去除处理的细胞群体是产生IL-13的人Tr1细胞被去除了。

具体实施方式

本发明提供具有免疫抑制能力的，新的分离的产生IL-13的Tr1-样细胞群体，以及用途。发明人发现，这些细胞是Tr1-样细胞，因为它们表达与Tr1细胞相同的表面标志物并且这些细胞能够产生IL-13和低水平的IL-4。发明人发现，它们的免疫抑制能力部分地通过IL-13介导。此外，这些Tr1-样细胞中的一些细胞还能够产生IL-10。因此，发明人认为能够产生IL-10和IL-13的这些细胞是Tr1细胞的亚群。

发明人惊奇地发现，该Tr1细胞亚群具有增强的免疫抑制效应，这在细胞治疗中具有极大的兴趣。

不希望被理论所束缚，发明人提出所述增强的免疫抑制效应可能是因为IL-10和IL-13对靶细胞具有不同且互补的效应。例如，Minty等(Eur CytokineNetw.1997；8(2)：189-201)证明，IL-13和IL-10诱导活化单核细胞中不同的细胞因子分泌谱。

本发明的一个目标是能够产生IL-13的分离的Tr1-样细胞群体，优选在测试A的条件下能够产生IL-13的分离的Tr1-样细胞群体。优选地，分离的Tr1-样细胞群体是人细胞群体。

如本文所使用，术语“IL-13”指白细胞介素13。

如本文所使用，术语“产生IL-13”指在培养基中IL-13的分泌量大于50pg/ml，优选大于100pg/ml，更优选大于200pg/ml，甚至更优选大于500pg/ml，甚至更优选大于大约1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000，16000，18000，或20000pg/ml或更高。以另一种方式表述，该术语指IL-13的分泌量大于250pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，优选大于500pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞和更优选大于1000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞。如本文所使用，数值之前的术语“大约”指加或减所述数值的10％。

在本发明的一个实施方案中，本发明的Tr1-样细胞是Tr1细胞，因为它们产生IL-10，优选在测试A的条件下产生IL-10。

如本文所使用，术语“IL-10”指白细胞介素10。

在本发明的一个实施方案中，本发明的人Tr1细胞产生高水平IL-10。

如本文所使用，术语“产生IL-10”指在培养基中IL-10的分泌量为至少50pg/ml，优选至少100pg/ml，更优选至少200pg/ml，至少大约500pg/ml，有代表性地大于大约1000，2000，4000，6000，8000，10000，12000，14000，16000，18000，或20000pg/ml或更高。以另一种方式表述，该术语指IL-10的分泌量大于250pg/10⁶个产生IL-13的Tr1细胞，优选大于500pg/10⁶个产生IL-13的Tr1细胞和更优选大于1000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体产生少量的IL-4，优选在测试A的条件下产生少量的IL-4。

如本文所使用，术语“IL-4”指白细胞介素4。

如本文所使用，术语“少量的IL-4”指小于500pg/ml，优选小于250pg/ml，更优选小于100pg/ml的量。以另一种方式，该术语指IL-4的量小于2000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，优选小于1000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，更优选小于500pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，甚至更优选小于250pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，甚至更优选小于100pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞。

在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体产生中等水平的TGF-β，优选在测试A的条件下产生中等水平的TGF-β。

如本文所使用，术语“TGF-β”指转化生长因子β。

如本文所使用，术语“中等水平TGF-β”指TGF-β的量至少大约100pg/ml，有代表性地大于大约200，300，400，600，800，或1000pg/ml或更高。

以另一种方式，该术语指TGF-β的量至少大约400pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，有代表性地大于大约800，1200，1600，2400，3200，或4000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞或更高。

在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体产生中等水平的IFN-γ，优选在测试A的条件下产生中等水平的IFN-γ。

如本文所使用，术语“IFN-γ”指干扰素γ。

如本文所使用，术语“中等水平IFN-γ”指IFN-γ的量介于0.1pg/ml和至少400pg/ml之间，有代表性地大于大约600，800，1000，1200，1400，1600，1800，或2000pg/ml或更高。

以另一种方式，该术语指IFN-γ的量介于0.4pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞和至少1600pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞之间，有代表性地大于大约2400，3200，4000，4800，5600，6400，7200，或8000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞或更高。

在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体产生少量的IL-2，优选在测试A的条件下产生少量的IL-2。

如本文所使用，术语“IL-2”指白细胞介素2。

如本文所使用，术语“少量的IL-2”指量小于大约500pg/ml，优选小于大约250，100，75，或50pg/ml，或更少。

以另一种方式，该术语指IL-2的量小于大约2000pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，优选小于大约1000，400，300，或200pg/10⁶个产生IL-13的Tr1-样细胞，或更少。

在本发明的一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞群体是分离的产生IL-13的人Tr1群体，并且产生IL-13，IL-10，中等水平IFNγ和TGFβ和少量的IL-4和/或IL-2。根据该实施方案，分离的Tr1-样细胞群体是人Tr1细胞亚群，因为发明人证明Tr1细胞在测试A的条件下会产生或者不产生IL-13(见实施例)。

用于评估细胞是否能够产生IL-13，IL-10，产生中等水平IFNγ和TGFβ和产生少量的IL-4和/或IL-2的方法是本领域众所周知的。

如本发明中所定义的测试A在下文被描述并且使得确定在测试A的条件下培养的细胞所产生的细胞因子。测试A相当于以一种或者多种TCR活化剂活化细胞。

在一个实施方案中，TCR活化剂是T淋巴细胞的多克隆活化剂，例如抗CD3+抗CD28抗体或白细胞介素-2，PMA+离子霉素。

在另一个实施方案中，TCR活化剂是由抗原呈递细胞呈递的抗原。

例如，在添加有10％胎牛血清的RPMI或DMEM培养基中的1×10⁶个细胞在一种或更多种TCR活化剂存在下，在48h期间被活化。然后收集培养基并通过本领域众所周知的方法测量细胞因子产生。

这些方法中的一个实例如下：细胞在抗CD3(10μg/ml)和抗CD28(1μg/ml)存在下在48h期间被活化并且在该点通过ELISA或者通过FACS测量细胞因子分泌。

在本发明的另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞在它们的表面上表达CD4和低水平CD127和低水平CD62L。

在一个实施方案中，所述分离的Tr1细胞亚群在它们的表面上表达CD4和低水平CD127和低水平CD62L。

在一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞是静息的并且在它们的表面上不表达CD25。在一个实施方案中，所述分离的Tr1细胞亚群是静息的并且在它们的表面上不表达CD25。

在另一个实施方案中，所述分离的Tr1-样细胞是活化的并且在它们的表面上表达CD25。在另一个实施方案中，所述分离的Tr1细胞亚群是活化的并且在它们的表面上表达CD25。

如本文所使用，“分离的”指细胞或者细胞群体从其自然环境(例如外周血)被移除并且是分离的、纯化的或者分开的，并且至少大约75％，80％，85％和优选大约90％，95％，96％，97％，98％，99％不含与其天然存在的但是缺乏分离细胞所依赖的细胞表面标志物的其它细胞。

如本文所使用，术语“细胞表面标志物”指可以用于鉴别细胞群体的细胞表面上的蛋白质、糖或者脂。

如本文所使用，术语“表达”可互换性地指基因表达或者基因产物，包括编码的多肽或者蛋白质。基因产物的表达可以通过例如免疫测定法使用与多肽结合的一种或多种抗体测定。备选地，基因的表达可以通过测量mRNA水平，例如通过RT-PCR、RT-qPCR测量mRNA水平测定。

术语“初始的”是本领域众所周知的，指还没有接触任何特异抗原的免疫细胞或细胞群体。

术语“静息的”是本领域众所周知的并且指没有增殖，没有产生细胞因子和没有在表面上表达常规免疫细胞活化分子例如CD25的免疫细胞或者细胞群体。

术语“活化的”是本领域众所周知的并且指增殖和/或产生细胞因子并且在其表面上表达常规免疫细胞活化分子例如CD25的免疫细胞或者细胞群体。

尤其对于T淋巴细胞，从静息状态到活化状态的过渡由T细胞与其特异抗原相遇或者由活化细胞因子或促分裂原的活化介导。

与CD127^lo/-，CD62L^lo/-或CD25L^lo/-相关使用的术语“低”或“lo”或“lo/-”是本领域众所周知的并且指目的细胞标志物的表达水平，其中细胞标志物的表达水平与作为整体分析的细胞群体中该细胞标志物的表达水平相比较低。更加具体而言，术语“lo”指以比一种或者更多种其他不同细胞群体更低的水平表达细胞标志物的不同细胞群体。

术语“高”或“hi”或“亮”是本领域众所周知的并且指目的细胞标志物的表达水平，其中细胞标志物的表达水平与作为整体分析的细胞群体中该细胞标志物的表达水平相比较高。

术语“+”和“-”是本领域众所周知的并且指目的细胞标志物的表达水平，其中对应于“+”的细胞标志物的表达水平高或中等并且对应于“-”的细胞标志物的表达水平低或者无。通常，染色强度前2％、3％、4％或5％的细胞被称为“hi”，落入群体前50％的那些细胞归类为“+”。荧光强度处于后50％的那些细胞被称为“lo”细胞并且荧光强度处于后5％的细胞被称为“-”细胞。

如本文所使用，术语“CD127”指细胞表面上存在的“白细胞介素-7受体”(IL-7R)。IL-7受体α链在文献中有描述(例如Goodwin等.(1990)Cell60：941-951)。IL-7R在文献中也称作CD127。CD127⁺指当用针对CD127的标记抗体处理时染色中等或者亮的细胞。CD127^lo/-指当接触标记的CD127抗体时染色弱/不清楚或者根本不染色的细胞类型。通常，基于染色强度上容易辨别的差别，根据它们的CD127表达水平区分细胞，这是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，基于对所有细胞观察到的荧光强度分布，可以设定将细胞称为CD127^lo/-细胞的截断值，其中荧光强度处于后50％、40％、30％或20％的那些细胞被称为CD127^lo/-细胞。CD127^-细胞可以被指定为荧光强度处于后10％的细胞。在一些实施方案中，得到所有细胞的CD127染色的频率分布并将群体曲线拟合至较高染色和较低染色群体，并且根据对各种群分布的统计学分析，将细胞归为统计学最有可能属于的群体中。在一些实施方案中，CD127^lo/-细胞的染色强度比CD127⁺细胞弱2至3倍。

如本文所使用，术语“CD62L”指L-选择蛋白，它是淋巴细胞迁移的关键粘附分子。CD62L⁺指当用针对CD62L的标记抗体处理时染色中等或者亮的细胞。CD62L^lo/-指当接触标记的CD62L抗体时染色弱/不清楚或者根本不染色的细胞类型。通常，基于染色强度上容易辨别的差别，根据它们的CD62L表达水平区分细胞，这是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，基于对所有细胞观察到的荧光强度分布，可以设定将细胞称为CD62L^lo/-细胞的截断值，其中荧光强度处于后50％、40％、30％或20％的那些细胞被称为CD62L^lo/-细胞。CD62L^-细胞可以被指定为荧光强度处于后10％的细胞。在一些实施方案中，获得所有的细胞的CD62L染色的频率分布并将群体曲线拟合至较高染色和较低染色群体，并且根据对各种群分布的统计学分析，将细胞归为统计学最有可能属于的群体中。在一些实施方案中，CD62L^lo/-细胞的染色强度比CD62L⁺细胞弱2至3倍。

如本文所使用，术语“CD4”指有代表性地存在于成熟辅助T细胞和未成熟的胸腺细胞上以及单核细胞和巨噬细胞上的细胞表面糖蛋白。在T细胞上，CD4是T细胞受体(TCR)的共受体并且召募酪氨酸激酶lck。CD4使用其D1-部分附着至MHC II类分子的β2结构域。CD4⁺指当接触标记的抗CD4抗体时染色亮的细胞，并且CD4^-指当接触荧光标记的CD4抗体时染色亮度最小，不清楚或者根本不染色的细胞类型。通常，基于染色强度上容易辨别的差别，根据它们的CD4表达水平区分细胞，因为CD4染色明显双峰。在一些实施方案中，获得所有细胞的CD4染色的频率分布并将群体曲线拟合至较高染色和较低染色群体，并且根据对各种群分布的统计学分析，将细胞归为统计学最有可能属于的群体中。在一些实施方案中，CD4^-细胞的染色强度比CD4+细胞弱2至3倍。

如本文所使用，术语“CD25”指白细胞介素-2受体α亚基，它是分子量55kD的单链糖蛋白。当T细胞在单核因子白细胞介素-1存在下被抗原或者促分裂原活化之后，快速合成并分泌白细胞介素2(IL-2)。作为对此的反应，亚群T细胞表达IL-2的高亲和性受体。这些细胞增殖，扩增了能够介导辅助、阻抑制因子和细胞毒性功能的T细胞群体。IL-2受体并非唯一存在于T细胞上。CD25^hi指当与标记的抗CD25抗体接触时染色亮的细胞，CD25⁺指当与标记的抗CD25抗体接触时染色亮度稍差的细胞，并且CD25^lo/-指当接触标记的CD25抗体时染色亮度最小、不清楚或者无染色的细胞类型。通常，基于染色强度差别，根据它们的CD25表达水平区分细胞，这是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，基于观察到的所有细胞的荧光强度分布设置将细胞归为CD25表达类别hi、+、lo、或-细胞的截断值。通常，染色强度前2％、3％、4％或5％的细胞被归为“hi”，落入群体前50％的那些细胞归类于“+”。荧光强度处于后50％的那些细胞被称为CD25^lo细胞并且荧光强度处于后5％的细胞被称为CD25^-细胞。

因此所述的Tr1-样细胞可以通过它们的细胞表面标志物和它们产生IL-13的能力有效表征。因此所述Tr1细胞亚群可以通过它们的细胞表面标志物和它们产生IL-13和IL-10的能力有效表征。这些细胞表面标志物可以由特异性结合细胞表面标志物的试剂识别。例如，Tr1细胞表面上的蛋白质、糖或脂可以通过特定蛋白质或糖特异性的抗体进行免疫识别(对于抗体对标志物的用途参见Harlow，Using Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Pres s，ColdSpring Harbor，N.Y.，1999；还参见实施例)。Tr1-样细胞表面上存在的和这些细胞表面上缺乏的标志物组是Tr1-样细胞特征性的。因此，可以通过使用细胞表面标志物的正选择和负选择来选择Tr1-样细胞。结合由Tr1-样细胞所表达细胞表面标志物，即“阳性标志物”的试剂可以用于Tr1-样细胞的正选择(即，保留表达细胞表面标志物的细胞)。相反，负选择依赖于这样的事实，即Tr1-样细胞不表达某些细胞表面标志物。因此，“阴性标志物”(即，Tr1-样细胞表面上不存在的标志物)可用于通过去除与阴性标志物特异性试剂结合的细胞而将群体中非Tr1-样细胞的那些细胞去除。

在一个实施方案中，基于所检测到的细胞表面标志物表达辨别细胞，通过比较细胞表面标志物的表达与对照细胞群体的平均表达进行。例如，Tr1-样细胞上标志物的表达可以与来自与Tr1-样细胞相同的样品的其他细胞上相同标志物的平均表达相比较。通过标志物表达鉴别细胞的其他方法包括通过流式细胞术使用试剂组合选通细胞(参见Givan A，Flow Cytometry：First Principles，(Wiley-Liss，New York，1992)；Owens M A & Loken M R.，Flow Cytometry：Principles for Clinical Laboratory Practice，(Wiley-Liss，New York，1995))。

“试剂组合”意思是指至少两种与Tr1-样细胞表面上存在(阳性标志物)或不存在(阴性标志物)的细胞表面标志物结合的试剂，或者结合阳性标志物与阴性标志物组合的至少两种试剂。例如，使用Tr1-样细胞表面标志物特异性抗体组合可从许多种样品/组织中分离和/或富集Tr1-样细胞。

根据本发明，“抗X抗体”或者“X抗体”是能特异性结合X的抗体。例如，抗CD127抗体或CD127抗体能够结合CD127。根据本发明使用的抗体包括，但不限于，重组抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人单克隆抗体、人源化或灵长源化单克隆抗体和抗体片段。许多淋巴细胞生物标志物特异性的抗体可以商业上获得。这些抗体包括抗CD127抗体、抗CD4抗体、抗CD62L抗体、抗CD25抗体、抗IL-4抗体、抗IL-10抗体和抗IL-13抗体(R&D、BDBiosciences等)。“抗体”指包含来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽或其特异性结合并识别抗原的片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε，和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ，μ，α，δ，或ε，反过来这定义了免疫球蛋白类别分别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。有代表性地，抗体的抗原结合区对于结合特异性和亲和性而言是最关键的。示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体。每一四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一多肽链对具有一个“轻链”(大约25kD)和一个“重链”(大约50-70kD)。每一链的N-末端定义了主要负责抗原识别的大约100至110或者更多个氨基酸的可变区。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。抗体作为例如完整的免疫球蛋白存在或者作为通过用不同肽酶消化产生的许多良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区内二硫键以下的抗体产生F(ab)′2，它是Fab的二聚体，Fab自身为通过二硫键与VH-CH1结合的轻链。F(ab)′2可以在温和条件下被还原以破坏铰链区内的二硫键，由此将F(ab)′2二聚体转变成Fab′单体。Fab′单体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见Fundamental Immunology(Paul编，第3版，1993))。虽然以消化完整抗体的方式定义了不同抗体片段，但是技术人员会意识到，此类片段可以通过化学方法或者通过使用重组DNA方法从头合成。因此，术语抗体，如本文所使用，还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法学从头合成的那些(例如单链Fv)或者使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见例如McCafferty等，Nature 348：552-554(1990))。在一些实施方案中，可以使用靶标的高亲和性配体代替抗体。短语“特异性(或者选择性)结合”抗体或者与之“特异性(或者选择性)免疫反应”当涉及到蛋白质或肽时是指常常在蛋白质和其它生物产品的异质群体中决定着蛋白质存在的结合反应。在此类条件下与抗体的特异性结合需要选择其对特定蛋白质具有特异性的抗体。例如，可以对多克隆抗体进行选择以得到仅与所选择的抗原特异性免疫反应而不与其他蛋白质特异性免疫反应的那些多克隆抗体。这种选择可以通过削减掉与其他分子交叉反应的抗体实现。

优选地，“标签”或者“可检测部分”与抗体共价或非共价连接。标签可以通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测到。特别有用的标签是荧光染料。将标签与抗体相连的方法是本领域普通技术人员众所周知。特别优选的标签是通过连接体连接至抗体的那些，所述的连接体可以容易地切割或分离或者在生理条件下与预定酶接触而经受水解。抗体还可以与磁性微粒，例如顺磁微珠缀合(Miltenyi Biotec，德国)。被磁性标记抗体结合的活化T细胞可以使用技术包括，但不限于，磁性细胞分选分离。适宜标记的CD127抗体、CD62L抗体、CD4抗体和CD25抗体，以及许多其它分化簇的适宜标记抗体可以商业性获得并且是本领域普通技术人员已知的。抗体可以在与样品接触之前或之后或者在与CD接触之前或之后被标记。CD抗体可以通过与结合CD抗体的标记抗体接触而被标记。如本文所使用，术语“CD”或者“分化簇”或“共同决定簇”指被抗体识别的细胞表面分子。

在本发明的一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样细胞群体是静息的并且细胞表达低水平FoxP3。在一个实施方案中，产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群是静息的并且细胞表达低水平FoxP3。

在本发明的另一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样细胞群体是活化的并且细胞表达中等水平的FoxP3。在一个实施方案中，产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群是活化的并且细胞表达中等水平的FoxP3。

如本文所使用，术语“Foxp3”指据认为担任转录因子的核蛋白Foxp3(Hori等，2003；Yasayko，J.E.等，Nat.Genet.27：68-73(2001)；Fontenot，J.D.等，Nat.Immunol.4：330-336(2003)；Khattri，R.等，Nat.Immunol.4：337-342(2003))。由于Foxp3定位在细胞内，Foxp3的表达可以通过使用标记抗Foxp3抗体(eBioscience inc或BD biosciences)的细胞内流式细胞术评价。

本发明的另一个目标是组合物，所述组合物包含分离的产生IL-13的Tr1-样细胞，基本上由分离的产生IL-13的Tr1-样细胞组成，或者由分离的产生IL-13的Tr1-样细胞组成。

本发明的另一个目标是组合物，所述组合物包含分离的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群，基本上由分离的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群组成，或者由分离的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群组成。

在本发明的一个实施方案中，Tr1细胞亚群或者Tr1-样细胞是抗原特异性的或者是多重抗原特异性的。

Tr1细胞亚群或者Tr1-样细胞特异性抗原实例包括，但不限于，自身抗原；来自普通人饮食的食物抗原；炎症性抗原例如多发性硬化相关抗原或者关节相关抗原；和变应原。

术语“来自普通人饮食的食物抗原”指来自人普通粮食的免疫原性肽，例如下列非限制性列表中的食物抗原：牛抗原例如载脂蛋白、Ca-结合S100、α-乳清蛋白、乳球蛋白例如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鲑鱼抗原例如细小清蛋白、鸡抗原例如类卵粘蛋白、卵清蛋白、Ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清白蛋白、花生、虾抗原例如原肌球蛋白、小麦抗原例如凝集素或麦醇溶蛋白、芹菜抗原例如芹菜肌动蛋白抑制蛋白、胡萝卜抗原例如胡萝卜肌动蛋白抑制蛋白、苹果抗原例如索马甜、苹果脂转移蛋白、苹果肌动蛋白抑制蛋白、梨抗原例如梨肌动蛋白抑制蛋白、异黄酮还原酶、鳄梨抗原例如内切壳多糖酶、杏抗原例如杏脂转移蛋白、桃抗原例如桃脂转移蛋白或桃肌动蛋白抑制蛋白、大豆抗原例如HPS、大豆肌动蛋白抑制蛋白或(SAM22)PR-I0prot。

术语“自身抗原”指来源于所述个体蛋白质的免疫原性肽。它可以是例如下列非限制性列表中的自身抗原：乙酰胆碱受体、肌动蛋白、腺嘌呤核苷酸易位蛋白、肾上腺素能受体、芳香族L-氨基酸脱羧酶、去唾液酸糖蛋白受体、杀菌/通透性增加蛋白(B Pi)、钙敏感受体、胆固醇侧链剪切酶，胶原IV型-链、细胞色素P450 2D6、结蛋白、桥粒芯糖蛋白-1、桥粒芯糖蛋白-3、F-肌动蛋白、GM-神经节苷脂、谷氨酸脱羧酶、谷氨酸受体、H/K ATP酶、17--羟化酶、21-羟化酶、IA-2(ICAS12)、胰岛素、胰岛素受体、内因子类型1、白细胞功能抗原1、髓鞘相关糖蛋白、髓磷脂碱蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白、肌球蛋白、P80-环形体蛋白、丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)、钠碘转运体、SOX-10、甲状腺和眼肌肉共享蛋白质、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、促甲状腺素受体、组织转谷氨酰胺酶、转录辅激活因子p75、色氨酸羟化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羟化酶、ACTH、氨酰基-tRNA-组氨酰合成酶、心磷脂、碳酸酐酶II、着丝粒相关蛋白质、DNA依赖的核小体刺激的ATP酶、纤维蛋白、纤连蛋白、葡萄糖6磷酸异构酶、β2-糖蛋白I、高尔基体蛋白(95，97，160，180)、热休克蛋白、半桥粒蛋白180、组蛋白H2A，H2B、角蛋白、IgE受体、Ku-DNA蛋白激酶、Ku-核蛋白、La磷蛋白、髓过氧化物酶、蛋白酶3、RNA聚合酶I-III、信号识别蛋白、拓扑异构酶I、微管蛋白、vimenscin、髓鞘相关少突胶质细胞碱蛋白(MOBP)、蛋白脂质蛋白质、少突胶质细胞特异性蛋白质(OSP/Claudinl 1)、环核苷酸3′磷酸二酯酶(CNP酶)、BP抗原1(BPAG1-e)、转醛醇酶(TAL)、人线粒体自身抗原PDC-E2(Novo1和2)、OGDC-E2(Novo3)和BCOADC-E2(Novo4)、大疱性类天疱疮(BP)180、层粘连蛋白5(LN5)、DEAD-盒蛋白质48(DDX48)或者胰岛瘤相关抗原-2。

术语“多发性硬化相关抗原”指髓磷脂碱蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓磷脂少突胶质细胞蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白质(PLP)、少突胶质细胞髓磷脂寡聚蛋白(OMGP)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudinl 1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、周围髓磷脂蛋白22(PMP22)、2’3′-环核苷酸3″-磷酸二酯酶(CNP酶)、其片段、变异体和混合物。

术语“关节相关抗原”指瓜氨酸取代的环状和线性聚丝蛋白肽、胶原II型肽、人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、异质性胞核核糖核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP B1、hnRNP D、Ro60/52、HSP60，65，70和90、BiP、角蛋白、波形蛋白、血纤蛋白原、胶原类型I，II，III，IV和V肽、膜联蛋白V、葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)、乙酰基-钙蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脱氢酶(PDH)、醛缩酶、拓扑异构酶I、snRNP、PARP、Scl-70、Scl-100、磷脂抗原包括阴离子的心磷脂和磷脂酰丝氨酸、电中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱、基质金属蛋白酶、肌原纤蛋白、聚集蛋白聚糖。

术语“变应原”指吸入变应原、摄入变应原或接触变应原。变应原的实例包括，但不限于，来源于花粉(Cup，Jun)、房屋尘螨(Der，Gly，Tyr，Lep)、狗、猫和啮齿动物(Can，Fel，Mus，Rat)的吸入变应原。接触变应原的实例包括，但不限于，重金属(例如镍、铬、金)、乳胶、半抗原例如氟烷、肼苯哒嗪。

在本发明的一个实施方案中，Tr1细胞亚群或者Tr1-样细胞群体特异性的抗原是HSP，优选HSP60。

本发明的另一个目标是用于鉴定/分离/定量产生IL-13的Tr1-样细胞群体的方法，包括：

-检测细胞群体上CD127和CD62L之一和CD4在细胞表面上的表达，

-检测IL-13的产生，例如在测试A的条件下检测IL-13的产生，

其中表达CD4(即为CD4⁺)和低水平CD127和/或低水平CD62L(即为CD127^lo/-和CD62L^lo/-)并且产生IL-13的细胞是产生IL-13的Tr1-样细胞，和

-鉴定/分离/定量所述细胞。

本发明的另一个目标是用于鉴定/分离/定量产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群的方法，包括：

-检测细胞群体上CD127和CD62L之一和CD4在细胞表面上的表达，

-检测IL-13和IL-10的产生，例如在测试A的条件下检测IL-13和IL-10的产生，

其中表达CD4(即为CD4⁺)和低水平CD127和/或低水平CD62L(即为CD127^lo/-和CD62L^lo/-)并且产生IL-13和IL-10的细胞是所述Tr1细胞亚群，和

-鉴定/分离/定量所述细胞。

如上面所述，CD4、CD127和CD62L的细胞表面表达可以通过使用抗CD4、抗CD62L和抗CD127抗体检测。

IL-13和IL-10产生的检测可以通过本领域众所周知的不同手段开展。

例如，用于检测IL-13或IL-10产生的第一种方法依赖于使用标记的抗IL-13或抗IL-10抗体，用于对先前透化的T细胞进行细胞内染色，通过FACS读取染色。

用于检测IL-13或IL-10产生的方法的另一个实例依赖于用标记的抗IL13或抗IL-10抗体开展的ELISA测定。

最后，用于检测IL-13产生的方法的另一个实例依赖于使用Miltenyi Biotech商业化的IL-13分泌测定试剂盒(130-093-480)或其等效物。该方法是特别受关注的，因为它允许检测并富集产生IL-13的细胞，而无需对它们进行透化。用于检测IL-10产生的方法的另一个实例依赖于使用Miltenyi Biotech商品化的IL-10分泌测定试剂盒(130-090-434)或其等效物。该方法是特别受关注的，因为它允许检测并富集产生IL-10的细胞，而无需对它们进行透化。

包含T细胞的任何细胞来源可以用于分离产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群。有用的来源包括，但不限于，外周血、滑液、脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、派尔斑和扁桃体。

用于分开、分离或者选择细胞的方法包括，但不限于使用抗体包被的磁珠的磁选(Schwartz，等，美国专利号5,759,793)和亲和性层析或者使用连接至固体基质(例如板)的抗体的“淘选”。提供精确分离的更多的技术包括荧光激活细胞分选仪(FACS)，它可以具有不同的复杂程度，例如具有多颜色通道，低角和圆头光散射检测通道，或者阻抗通道。死细胞可以通过用与死细胞有关的染料(碘化丙啶，LDS)选择而去除。红细胞可以通过例如冲洗、溶血或者Ficoll-Paque梯度去除。可以采用对所选择细胞的活性没有过分有害的任何技术。

抗体可以方便地与用于许多不同目的的标签缀合：例如与磁珠缀合以方便分离Tr1细胞；与以高亲和性结合抗生物素蛋白或链亲和素的生物素缀合；与可以与荧光激活细胞分选仪一起使用的荧光染料缀合；与半抗原缀合；等等。可以使用FACS或者免疫磁性分选与流式细胞术的组合进行多颜色分析。多颜色分析对于基于例如以下的多种表面抗原的细胞分离而言是感兴趣的：例如非-CD4⁺免疫细胞标志物(CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ和血型糖蛋白A)、CD4、CD25、CD127和CD62L。发现可在多颜色分析中使用的荧光染料包括，但不限于，藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白；荧光素，和得克萨斯红。

磁性分选是用于在磁场梯度中选择性将磁性材料保留在容器例如离心管或柱内的过程。Tr1细胞可以通过特异性相互作用，包括免疫亲和性相互作用而将磁性颗粒结合至细胞表面而被磁性标记。然后将适宜容器内的包含Tr1细胞的悬液暴露于足够强的磁场梯度下以将Tr1细胞与悬液中的其它细胞分离。然后用适宜的流体洗涤容器以去除未标记的细胞，产生纯化的Tr1细胞悬液。

大多数的磁标记系统使用超顺磁颗粒和与其表面共价结合的单克隆抗体或链亲和素。在细胞分离应用中，这些颗粒可以用于正选择，其中目的细胞被磁性标记并保留，或者负选择，其中大多数不希望的细胞被磁性标记和保留。所使用的颗粒的直径广泛变化，从MACS颗粒(Miltenyi Biotec)和StemSep(TM)胶体(StemCell Technologies)的大约50-100nm，至EasySep(R)(StemCellTechnologies)和Imag颗粒(BD Biosciences)的150-450nm，最高为Dynabeads(Dynal Biotech)的4.2μm。用来分离所标记细胞的磁体技术影响所使用的颗粒类型。

存在两个重要种类的磁性分选技术，为了方便和实用的原因它们均使用永久磁体而不是电磁体。第一类是基于柱的高梯度磁场分离技术，它使用小的弱的磁性颗粒标记目的靶标，并且在填充有可磁化基质的柱内分离这些靶标。当向柱应用磁场时，在接近于基质元件的表面产生非常高的梯度。对于分离用这些相对弱的磁性颗粒标记的靶标而言使用高梯度是必需的。第二类是基于管的技术，它使用更强的磁性颗粒标记目的靶标。然后将这些目的靶标通过管外磁体产生的磁场梯度在离心类型的管内分离。该方法的优势在于它不依赖于可磁化基质产生梯度；并且因此不需要昂贵的一次性柱或者以不便的清洗和净化过程处理的可重复使用的柱。

一旦放置在磁体内，靶细胞向最高磁场强度的区域或多个区域迁移并且保留在磁场内，而未标记的细胞被排出掉。然后在从磁场中移出后收集靶细胞并使用。在需要负选择的情况下，未标记的细胞被保留并且用于多种用途。

FACS允许基于当它们经过激光柱时的光散射特性分离细胞亚群。向前光散射(FALS)与细胞大小有关，并且右角光散射，也称作侧散射特性(SSC)与细胞密度、细胞内容物和核质比，即细胞复杂性有关。由于细胞可以用荧光缀合的抗体标记，所以它们可以通过抗体(荧光)强度进一步表征。

在特别的实施方案中，本发明的产生IL-13的Tr1-样细胞使用免疫磁性层析分离。例如，抗CD4抗体连接至磁性珠。这些抗体标记的磁性珠用作亲和纯化的基础。T细胞的抗体标记部分应用至磁性亲和柱上。非粘附的细胞被排出并且通过除去磁场将粘附的细胞从磁性柱洗脱。在另一个实施方案中，首先将细胞用抗体(例如抗CD4)标记，然后用携带磁性珠或球的次级抗体标记。

在另一个实施方案中，与Tr1细胞具有免疫反应性的次级抗体可以用于富集产生IL-13的Tr1-样细胞的群体。次级抗体的使用是本领域普遍已知的。有代表性地，次级抗体是与第一个抗体的恒定区具有免疫反应的抗体。优选的次级抗体包括抗兔、抗小鼠、抗大鼠、抗山羊、抗马免疫球蛋白并且可以商业性获得。商业上可得到的试剂盒提供与标记试剂，例如但不限于磁性颗粒和荧光染料缀合的次级抗体。

本发明的另一个目标是用于使细胞群体富集产生IL-13的Tr1-样细胞的方法，包括：

-鉴定表达CD4和低水平CD127和/或CD62L并产生IL-13的细胞，

-选择所述细胞，

由此得到富集产生IL-13的Tr1-样细胞的细胞群体。

本发明的另一个目标是用于使细胞群体富集产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群的方法，包括：

-鉴定表达CD4和低水平CD127和/或CD62L并产生IL-13和IL-10的细胞，

-选择所述细胞，

由此得到富集产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群的细胞群体。

在本发明的另一个实施方案中，使群体富集产生IL-13的Tr1-样细胞的方法可以包括：

-将细胞群体与结合非-CD4⁺细胞的标志物的至少一种试剂接触，由此去除非-CD4⁺细胞，

-如上所述鉴定产生IL-13的Tr1-样细胞并选择它们。

在本发明的另一个实施方案中，用于使群体富集产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群的方法可以包括：

-如上所述鉴定产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群并选择它们。

结合非-CD4⁺细胞的标志物的实例包括，但不限于，CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123和血型糖蛋白A。

结合所述标志物的优选试剂是抗体。在再一实施方案中，抗体与荧光染料或磁性颗粒缀合。在另一实施方案中，通过流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性选择、亲和层析或者淘选或其组合开展细胞选择。

本发明的另一个目标是根据所述方法得到的产生IL-13的Tr1-样细胞的富集群体。本发明的另一个目标是根据所述方法得到的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群的富集群体。

本发明的另一个目标是组合物，所述组合物包含富集的产生IL-13的Tr1-样细胞群体，基本上由富集的产生IL-13的Tr1-样细胞群体组成，或者由富集的产生IL-13的Tr1-样细胞群体组成。

本发明的另一个目标是组合物，所述组合物包含富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群，基本上由富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群组成，或者由富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群组成。

如本文所使用，产生IL-13的Tr1-样细胞富集的组合物/群体是这样的组合物/群体，即其中产生IL-13的Tr1-样细胞的百分数高于在最初得到细胞的群体中产生IL-13的Tr1-样细胞的百分数。尽管有可能，但是富集的产生IL-13的Tr1-样细胞的群体不需要包含同质的产生IL-13的Tr1-样细胞的群体。在特别的实施方案中，所述组合物细胞的至少大约50％，大约55％，大约60％，大约65％，大约70％，大约75％，大约80％，大约85％，大约90％，大约95％，大约98％，或大约99％是产生IL-13的Tr1-样细胞。在另一个实施方案中，富集的组合物/群体中产生IL-13的Tr1-样细胞的百分数是富集前产生IL-13的Tr1-样细胞百分数的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。

如本文所使用，产生IL-13和IL-10的Tr1细胞富集的组合物/群体是这样的组合物/群体，即其中产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的百分数高于在最初得到细胞的群体中产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的百分数。尽管有可能，但是富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的群体不需要包含同质的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的群体。在特别的实施方案中，所述组合物细胞的至少大约50％，大约55％，大约60％，大约65％，大约70％，大约75％，大约80％，大约85％，大约90％，大约95％，大约98％，或大约99％是产生IL-13和IL-10的Tr1细胞。在另一个实施方案中，富集的组合物/群体中产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的百分数是富集前产生IL-13和IL-10的Tr1细胞百分数的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。

包含T细胞的任何细胞来源可以用于分离/富集产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞。有用的来源包括，但不限于，外周血、滑液、脾脏、胸腺、淋巴结、骨髓、派尔斑和扁桃体。

基于与富集过程每一步骤有关的富集水平，富集方法是不同的。产生IL-13的Tr1-样细胞或产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的富集水平和纯度百分数会依赖于许多因素，包括，但不限于，供体、细胞/组织来源和供体的疾病状态。

本发明的另一个目标是产生IL-13的Tr1-样克隆。

本发明的另一个目标是产生IL-13和IL-10的Tr1克隆。

根据本发明，产生IL-13的Tr1-样细胞根据上述方法分离，然后通过本领域众所周知的方法将产生IL-13的Tr1-样细胞进行克隆。

根据本发明，产生IL-13和IL-10的Tr1细胞根据上述方法分离，然后通过本领域众所周知的方法将产生IL-13和IL-10的Tr1细胞进行克隆。

在另一个实施方案中，本领域的技术人员可以分离表达CD4和低水平CD127和/或CD62L的细胞，克隆所述细胞，然后当活化时分离产生IL-13或者IL-10和IL-13的克隆。

本发明的另一个目标是组合物，所述组合物包含产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆，基本上由产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆组成，或者由产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆组成。

在本发明的一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆产生低水平的IL-4。

在本发明的一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆产生低水平的IL-2。

在本发明的一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆产生中等水平的IFNγ。

在本发明的一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样克隆或产生IL-13和IL-10的Tr1克隆产生中等水平的TGFβ。

通过本发明方法分离的产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群可以通过WO2006/108882中所述的体外方法进一步扩增。所述方法包括：

a)在低于35℃的温度T1下，在培养基Mf中培养饲养细胞例如昆虫饲养细胞，所述温度T1允许饲养细胞增殖并且所述饲养细胞表达与下列细胞表面蛋白相互作用的因子：

-CD3/TCR复合体，

-CD28蛋白，

-IL-2受体，

-CD2蛋白，

-IL-4受体，

b)将在步骤a)中得到的清除或者未清除它们的培养基Mf的饲养细胞与培养基Mp中包含的产生IL-13的Tr1-样细胞群体或产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群接触，其中所述培养基Mp最初不包含步骤a)中所述的因子，以得到包含Tr1细胞群体，饲养细胞和培养基Mp的混合物，

c)在温度T2下培养在步骤b)中得到的混合物，温度T2至少为35℃，选择所述的温度使得Tr1细胞群体增殖而饲养细胞不增殖，

d)将如此扩增的Tr1细胞群体回收。

与上面提到的细胞表面蛋白相互作用的因子实例包括：

-抗CD3抗体，优选修饰的抗CD3抗体，其中CD3重链的抗CD3胞质内结构域被替换成跨膜结构域，

-CD80或CD86蛋白，

-由饲养细胞分泌的IL-2，

-CD58蛋白，

-选自IL-4和IL-13的白细胞介素。

Mp培养基用来培养T细胞并且可以是无血清培养基。Mp培养基的非限定性实例是商业上可以得到的无血清培养基例如来自BioWhittaker的XVIVO15、来自Invitrogen的AIM V培养基、DMEM、RPMI等。

Mf培养基用来培养饲养细胞并且可以是无血清培养基。Mf培养基的非限定性实例是商业上可以得到的无血清培养基例如来自BioWhittaker的Schneider无血清培养基、来自Invitrogen的作为SFM的MD Gibco无血清昆虫细胞培养基或者来自Krackeler S cientific Inc的Insectagro。

在本发明的实施方案中，如此得到的Tr1细胞可以使用常规用于克隆T细胞的方法进行克隆。

在本发明的实施方案中，如此得到的Tr1细胞或者Tr1细胞克隆可以冷冻以储存。

本发明的另一个目标是组合物，所述的组合物包含富集并扩增的产生IL-13的Tr1-样细胞群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群，基本上由富集并扩增的产生IL-13的Tr1-样细胞群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群组成，或者由富集并扩增的产生IL-13的Tr1-样细胞群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群组成。

本发明的另一个目标是用于去除细胞群体中产生IL-13的Tr1-样细胞或产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的方法，包括：

-鉴定表达CD4和低水平CD127和/或CD62L并产生IL-13或IL-10和IL-13的细胞，

-去除所述细胞，

-由此得到产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的细胞群体。

本发明的另一个目标是组合物，所述组合物包含产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的群体，基本上由产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的群体组成，或者由产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的群体组成。

产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的组合物/群体或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的组合物/群体是这样的组合物/群体，即其中产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的百分数低于在最初得到细胞的群体中产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的百分数。

本发明的另一个目标是根据上述方法得到的产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的细胞群体。本发明的另一个目标是根据上述方法得到的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的细胞群体。

如上面所解释，用于分离细胞的方法包括，但不限于，使用抗体包被磁珠的磁性分选、亲和层析或者使用与固体基质(例如板)相连的抗体的“淘选”和荧光激活细胞分选仪(FACS)。Tr1细胞被去除，而不是被选择。

在一个实施方案中，产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞在经去除的组合物/群体中的百分数是去除前产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞百分数的至少0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍、0.1倍。

本发明的另一个目标是用于鉴定或分离产生IL-13的Tr1-样细胞群体，或者用于使细胞群体富集或去除产生IL-13的Tr1-样细胞的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测CD4、CD25、CD127和CD62L细胞表面表达的试剂和用于检测IL-13产生的工具。

本发明的另一个目标是用于鉴定或分离产生IL-13和IL-10的Tr1细胞群体，或者用于使细胞群体富集或者去除产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测CD4、CD25、CD127和CD62L细胞表面表达的试剂和用于检测IL-13和IL-10产生的工具。

优选地，所述试剂是抗体。更优选地，这些抗体与荧光染料或者磁性颗粒缀合。

在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于检测Foxp3表达的试剂。优选地，所述试剂是抗体。更优选地，所述抗体与荧光染料缀合。

本发明的另一目标是抑制需要其的受试者中免疫反应的方法，包括向受试者施用有效量的根据本发明分离的或者富集的产生IL-13的Tr1-样细胞。

本发明的另一目标是抑制需要其的受试者中免疫反应的方法，包括向受试者施用有效量的根据本发明分离的或者富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞。

在一个实施方案中，受试者已经经历或者正在经历移植，例如骨髓移植或者器官移植。

在另一个实施方案中，受试者具有过敏症。

本发明的另一个目标是用于预防或者治疗需要其的受试者中炎症性疾病的方法，包括向受试者施用有效量的根据本发明分离或者富集的产生IL-13的Tr1-样细胞或者分离或富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞。

本发明的另一个目标是用于预防或者治疗需要其的受试者中自身免疫病的方法，包括向受试者施用有效量的根据本发明分离或者富集的产生IL-13的Tr1-样细胞或者分离或富集的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞。

在本发明的一个实施方案中，细胞群体可以从随后向其引入产生IL-13的Tr1-样细胞富集的组合物或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞富集的组合物的受试者得到。

在本发明的一个实施方案中，受试者可以是希望抑制其免疫反应的受试者。

在一个实施方案中，受试者是患有炎症性病或疾病/病症的人，例如任何疾病/病症，包括但不限于，非自身免疫炎症性肠病、术后粘连、冠状动脉疾病、肝脏纤维化、急性呼吸窘迫综合征、急性炎症性胰腺炎、内镜逆行胰胆管造影术引起的胰腺炎、烧伤、冠状动脉、脑动脉和外周动脉粥样化形成、阑尾炎、胆囊炎、憩室炎、内脏纤维变性病症、创伤愈合、皮肤瘢痕病症(疤痕疙瘩、化脓性汗腺炎)、肉芽肿病症(结节病、原发性胆汁性肝硬变)、哮喘、坏疽性脓皮病、斯威特综合征、贝赫切特病、原发性硬化性胆管炎、和脓肿。

在另一个实施方案中，受试者是患有自身免疫病或者疾病/病症的人，包括但不限于，红斑狼疮、寻常天疱疮、甲状腺炎、血小板减少性紫癜、格雷夫斯病、糖尿病、青少年糖尿病、自发的自身免疫性糖尿病、重症肌无力、艾迪生病、关节炎病症例如风湿性关节炎、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎；多发性硬化、银屑病、葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、硬皮病、肠炎症性病症例如自身免疫炎症性肠病、克隆病、大肠炎、食物过敏有关的肠炎症；斯耶格伦病、桥本病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌腺病综合征、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多肌炎、和甲状腺炎、以及以人狼疮为代表的全身性自身免疫病。“自身抗原”如本文所使用指哺乳动物天然的并且在所述哺乳动物疾病中为免疫原性的抗原或表位。

本发明的细胞还可以用于预防或者治疗移植反应，例如移植物抗宿主疾病(GVHD)和移植排斥。

使用本领域众所周知的方法例如继承性细胞转移开展产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞向患者内的引入。简言之，从靶供体提取混合的细胞群体。取决于应用，在疾病缓解阶段或者在活动性疾病过程中提取细胞。有代表性地，这通过收集外周血和通过白细胞去除术收获白血细胞实现。例如，已经显示大体积白细胞去除术(LVL)使血液白细胞得率最大。收集的淋巴细胞可以使用基于Tr1特异性细胞标志物，例如本文所述的那些细胞标志物的细胞分离技术分离，然后输入到患者，有代表性地是细胞供体中(GVHD除外，在GVHD中供体和受体是不同的)，用于过继性免疫抑制。大约10³至10¹¹，优选10⁴至10¹⁰，优选10⁵至10⁹，优选10⁶至10⁹，更优选10⁶至10⁸个Tr1细胞注射入到患者内。

如本文所使用，术语“有效量”意思是指治疗物质或者组合物的量足以减轻(以任何程度)或者改善病症或者其一个或更多个症状的严重性/持续时间，防止病症进展，引起病症退化，预防一个或多个病症相关症状复发、发生、发作或进展，检测病症，或者增强或改善另一治疗(例如预防剂或治疗剂)的一种或多种预防性或治疗性效果。有效量将随着受试者的年龄、性别、种族、种类、一般情况等、所治疗病症严重性、所使用的特定试剂、治疗持续时间、任何并行治疗的性质、所使用的可药用载体、和本领域技术人员知识和经验范围内的类似因素而变。根据情况，任何个体案例中的“有效量”可以由本领域普通技术人员参考有关教科书和文献和/或通过使用常规实验确定，(例如参见Gennaro等，编者，Remington′s The Science and Practice of Pharmacy，第20版，(2000)，LippincottWilliams and Wilkins，Baltimore MD；Braunwald等，编者，Harrison′s Principlesof Internal Medicine，第15版，(2001)，McGraw Hill，NY；Berkow等，编者，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，(1992)，Merck Research Laboratories，Rahway NJ)。

术语“预防”、“预防着”和“预防的”在本文中指抑制病症的发生或发作或者防止受试者中因施用治疗(例如预防剂或治疗剂)或者施用治疗组合(例如预防剂或治疗剂的组合)导致的病症的一个或更多个症状复发、发作或进展。“治疗”或“治疗着”意思是指达到至少改善宿主病症的有关症状，其中改善以广义使用，是指至少减少参数例如与正在治疗病症相关的症状的强度。照此，治疗还包括这样的情况，即其中病理病症或者与其有关的至少一些症状完全被抑制，例如被阻止发生，或者被停止，例如被终止，以致于受试者不再遭受病症，或者至少病症特征性的症状。

如本文所使用，术语“受试者”指动物，优选哺乳动物并且最优选人。

本发明的另一个目标是用于增加所移植细胞群体在需要其的受试者内的免疫反应的方法，包括向所述受试者施用有效量的如上所述产生IL-13的Tr1-样细胞被去除的细胞群体。

本发明的另一个目标是用于增加所移植细胞群体在需要其的受试者内的免疫反应的方法，包括向所述受试者施用有效量的如上所述产生IL-13和IL-10的Tr1细胞被去除的细胞群体。

在一个实施方案中，所述方法用于治疗经历癌症治疗的受试者。

在一个实施方案中，所移植的细胞群体是抗原特异性效应T细胞群体。优选地，所述T细胞群体是肿瘤抗原特异性的，抗原为例如黑素瘤的MART-1(Melan A)或者黑素瘤的MAGE1，2，3、甲状腺髓样癌、小细胞肺癌、结肠和/或支气管鳞状细胞癌等等。

在另一个实施方案，所述方法是用于治疗传染性疾病例如EBV、HIV、HCV、CMV感染。

已经证明去除调节T细胞会增强癌症患者内的疫苗介导的免疫(Dannull等，2005，115(12)：3623-3633)。因此，在本发明的另一个实施方案中，建议将产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞的去除用于治疗癌症或者传染性疾病的细胞治疗中，其中所述的产生IL-13的Tr1-样细胞或者所述的产生IL-13和IL-10的Tr1细胞对于治疗是有害的。例如，在癌症治疗中，在疫苗接种/免疫疗法方案之前，暂时去除产生IL-13的Tr1-样细胞或者产生IL-13和IL-10的Tr1细胞是感兴趣的，通过根据本发明的去除方法的装置而在活体外方式对患者血液进行去除处理，并且立即将其回注到患者内，获得所述的短暂去除。

附图说明

图1：T细胞增殖活性被IL-13的体外抑制。重组人IL-13(12.5ng/ml)加入到用抗CD3和抗CD28单克隆抗体活化的人PBMC培养物中。在培养3天后使用WST-1标记的活细胞评价细胞的增殖。

图2：T细胞增殖活性被产生IL-13的Tr1-样细胞的体外抑制。图A显示用抗CD3+抗CD28单克隆抗体处理后48小时过程中的产生IL-13的调节细胞的体外细胞因子分泌模式。图B显示IL-13活化细胞上清对用抗CD3+抗CD28单克隆抗体在培养中刺激3天的人PBMC增殖的抑制性潜能。组C显示加入抗IL13封闭抗体能够逆转产生IL-13的调节细胞上清的抑制作用。

图3：产生IL-13的人调节细胞的表型。人IL-13调节细胞用荧光标记的CD25、CD127、CD62L或FoxP3特异性单克隆抗体染色进行流式细胞术分析。细胞在静息状态下分析或者在使用IL-2和CD3+CD28刺激剂活化7天后分析。

图4：不同Tr1克隆的IL-13和IL-10的产生。来自2个不同供体的人Tr1克隆使用抗CD3+抗CD28单克隆抗体体外活化。48h后，通过ELISA测量上清液中IL-10、IFN-γ和IL-13的产生。结果显示，在所测试的两个不同供体中，数个克隆能够产生IL-10和IFN-γ，但不产生IL-13，而其它克隆能够产生三种细胞因子。对于每一供体显示两个亚群中的一个克隆。

实施例

实验过程

产生IL-13的Tr1样细胞分离和上清液产生

对于产生IL-13的Tr1-样细胞的分离，外周血细胞通过Ficoll密度离心分离并在特异性抗原存在情况下以2×10⁶个细胞每ml培养，以使得抗原特异性Tr1-样细胞增殖。在培养7天后，在3周内通过有限稀释方法克隆细胞。然后使用CD3/CD28刺激剂和细胞因子(IL-2和IL-4)扩增生长的克隆。通过流式细胞术评价表型来评价克隆的Tr1-样细胞身份，显示组成型地伴有CD62L和CD127缺乏，以及仅在活化状态下表达CD25和Foxp3。通过用抗CD3+抗CD28包被磁珠(Dynal)在2天过程中在X-vivo培养基中于37℃+5％CO2情况下刺激细胞得到Tr1-样细胞上清液的产生。

流式细胞术研究

对于对人细胞的流式细胞术研究，使用下列抗体：PE-缀合的抗CD127(来自Beckman Coulter的克隆R34.34)，来自Becton Dickinson的FITC-标记的抗CD4Ab(克隆号RP4-T4)，PeCy5-标记的抗CD62L(来自Becton Dickinson的克隆Dreg56)和别藻蓝蛋白-缀合的抗CD25(来自Becton Dickinson的克隆M-A251)。使用PE-缀合的抗Foxp3 Ab(来自BD的克隆259D/C7)和胞质内染色试剂盒(BD)，根据厂商的说明书开展人Foxp3的胞质内染色。

细胞因子测定

为了测定细胞因子产生谱(测试A的实例)，Tr1-样细胞克隆用抗CD3+抗CD28包被珠以2珠/细胞的浓度刺激，并且48小时后收集上清液。使用来自Diaclone(IFN-γ，IL-10和IL-4)和来自e-Bioscience(IL-13)的商业可得的试剂盒开展ELISA。实验按照厂商的说明书开展。

抑制研究

对于抑制研究，外周血单核细胞在2天过程中用可溶性的抗CD3单克隆抗体(1μg/ml)在产生IL-13的Tr1-样细胞上清液存在或缺乏下，抗IL13(克隆31606，R&D systems)或者重组人IL-13(6ng/ml，R&D systems)活化。使用来自Roche的可以评价每个培养孔内的活细胞数量的WST1试剂盒测量所培养细胞的增殖。

结果

T细胞增殖活性被IL-13体外抑制

首先，我们想证明重组人IL-13能够体外下调T细胞增殖活性。为此目的，将IL-13加入到用抗CD3和抗CD28单克隆抗体活化的PBMC培养物中，并在培养3天后测量细胞增殖(图1)。结果证明，IL-13能够体外抑制T细胞增殖，显示该细胞因子具有免疫抑制性潜能。

T细胞增殖活性被产生IL-13的Tr1-样细胞体外抑制

因此，我们想知道在使用IL-13作为抑制细胞因子的相同类型的实验设置中产生IL-13的Tr1-样细胞是否能够抑制旁观T淋巴细胞活性。图2A显示被抗CD3和抗CD28单克隆抗体活化的IL-13调节细胞的细胞因子分泌模式，其中IL-13分泌高但没有IL-4分泌。图2B显示活化的产生IL-13的调节细胞的上清液能够抑制培养的旁观T细胞的活化。重要的是，使用IL-13封闭抗体可以抑制这种上清液介导的T细胞增殖抑制(图2C)，显示这些细胞因子代表由这些细胞分泌的主要的可溶性抑制因子。

产生IL-13的人调节细胞的表型

最后，我们测试了IL-13调节细胞的数种调节细胞标志物的表达，显示所述细胞不表达CD127、CD62L和FoxP3分子。此外，在3种标志物当中，活化后FoxP3和CD25上调(图3)。

能够产生IL-13和IL-10的Tr1细胞亚群

图4显示Tr1细胞在测试A的条件下能够分离成两个群体：一个Tr1细胞亚群能够产生IL-10但不产生IL-13，而另一个Tr1细胞亚群能够产生IL-10和IL-13。

Claims

1.分离的人Tr1细胞群体，其能够产生IL-13。

2.根据权利要求1的分离的人Tr1细胞群体，其中所述细胞产生IL-10。

3.权利要求1或2的分离的人Tr1细胞群体，其中所述细胞表达：

-CD4和

-低水平CD127，和

-低水平CD62L。

4.根据权利要求1至3任一项的分离的人Tr1细胞群体，其中所述细胞是抗原特异性的，优选地，所述抗原是II型胶原、卵清蛋白、髓磷脂碱蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白或HSP。

5.分离的人Tr1克隆，其能够产生IL-13和IL-10。

6.根据权利要求5的分离的人Tr1克隆，其中所述克隆表达：

-CD4和

-低水平CD127，和

-低水平CD62L。

7.根据权利要求5或6的分离的人Tr1克隆，其中所述克隆是抗原特异性的，优选地，所述抗原是II型胶原、卵清蛋白、髓磷脂碱蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白或HSP。

8.鉴定根据权利要求1至4任一项的人Tr1细胞群体的方法，包括：

-检测CD127和CD62L标志物中的至少一个和CD4标志物在细胞群体上的细胞表面表达，

-检测IL-13和IL-10的产生，

其中表达CD4和低水平CD127和/或低水平CD62L并产生IL-13和IL-10的细胞是产生IL-13的Tr1细胞群体。

9.使细胞群体富集根据权利要求1至4任一项的产生IL-13的人Tr1细胞的方法，包括：

-鉴定表达CD4和低水平CD127和/或低水平CD62L并产生IL-13和IL-10的细胞，

-选择所述细胞，

由此得到富集了产生IL-13的人Tr1细胞的细胞群体，其中产生IL-13的人Tr1细胞百分数是富集前产生IL-13的人Tr1细胞百分数的至少两倍。

10.根据权利要求9得到的富集的产生IL-13的人Tr1细胞群体。

11.用于鉴定或分离产生IL-13的人Tr1细胞群体的试剂盒，包含用于检测CD4、CD25、CD127和CD62L的细胞表面表达的工具和用于检测IL-13和IL-10产生的工具。

12.根据权利要求1至4任一项的或者权利要求10的分离的和/或富集的产生IL-13的人Tr1细胞群体，或者根据权利要求5至7任一项的产生IL-13的人Tr1克隆，用于预防或者治疗免疫反应、移植物抗宿主疾病和器官排斥、过敏疾病、炎症性疾病或自身免疫病。

13.使细胞群体去除根据权利要求1至4任一项的产生IL-13的人Tr1细胞的方法，包括：

-根据权利要求8鉴定产生IL-13的人Tr1细胞，

-去除所述细胞，

由此得到产生IL-13的人Tr1细胞被去除的细胞群体，其中产生IL-13的人Tr1细胞的百分数是去除前产生IL-13的人Tr1细胞百分数的至少0.5倍。

14.根据权利要求13得到的产生IL-13的人Tr1细胞被去除的细胞群体。

15.根据权利要求14的产生IL-13的人Tr1细胞被去除的细胞群体，用于增强需要其的受试者中的免疫反应。