MX2013000115A

MX2013000115A - Celulas similares a tr1 que producen il-13, y su uso.

Info

Publication number: MX2013000115A
Application number: MX2013000115A
Authority: MX
Inventors: Arnaud Foussat; Valerie Brun; Herve Bastian; Brigitte Quattannens
Original assignee: Txcell
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-09-13
Also published as: CA2803779A1; US20130101568A1; NZ605088A; CN103080303A; WO2012001533A3; RU2013103765A; EP2412802A1; JP2017148042A; WO2012001533A2; CL2012003705A1; BR112012033727A2; ZA201209758B; AU2011273103B2; KR20130093083A; EP2588595A2; CN107189983A; JP2013539356A; MX347533B; AU2011273103A1

Abstract

La presente invención se refiere a una población aislada de células similares a Tr1, capaz de producir IL-13; teniendo dicha población actividades inmunosupresoras; a métodos para identificar / aislar / enriquecer dicha población, y a sus usos.

Description

CÉLULAS SIMILARES A TRl QUE PRODUCEN IL-13, Y SU USO Campo de la Invención La presente invención se refiere a células Trl que producen IL-13, aislada; a métodos para su identificación / aislamiento / enriquecimiento, y a métodos y equipos para diagnosticar o tratar enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas y condiciones de trasplante de órganos, usando células Trl que producen IL-13, aislada.

Antecedentes de la Invención La homeostasis del sistema inmunológico depende del equilibrio entre la respuesta inmune a un patógeno invasor y la tolerancia inmune a auto-antigenos. Tanto la tolerancia central como la periférica son mecanismos importantes para la inducción y el mantenimiento de la tolerancia de células T. En la pasada década se había dado mucha atención a las células T reguladoras (Treg) que juegan un papel importante en el mantenimiento de la tolerancia inmune periférica. Se ha establecido ahora firmemente que las Treg pueden dividirse en dos subtipos diferentes: las Treg naturales (nTreg) y las poblaciones de Treg inducibles, tales como las células Treg inducidas por TGF-beta, las células Trl o las células Th3.

Están descritas las nTreg principalmente como células T FoxP3+; mientras que se describen las células Trl como células T reguladoras que producen IL-10 (Alian y coautores, 2008, Immunological reviews, 223: 391-421). Las nTregs Fox P3+ suprimen / modulan una gran variedad de células inmunes diferentes, incluyendo las células efectoras T CD4+ y CD8+ , naturales y de memoria, las células B, las células monociticas y dendriticas. Las células Trl regulan las respuestas inmunologicas secretando IL-10 y transformando el factor beta de crecimiento (TGF-ß) y tienen la capacidad de suprimir las respuestas tanto de células T naturales como las de memoria.

Se ha comprobado que las células Trl son útiles en la terapia celular, ya que la inyección de células Trl en pacientes que tienen mal de Crohn mejoró su condición. Sin embargo, sigue habiendo necesidad de mejorar la eficiencia de esta terapia celular, usando células Trl.

Sorprendentemente, los inventores encontraron una población escasa de células Trl que sean capaces de producir IL-13. Los inventores demostraron que estas células tienen, además de una acción supresora de IL-10, que es una característica de las células Trl, un efecto supresor inducido por IL-13.

Sumario de la Invención Es un objetivo de la invención una población de células similares a Trl, aislada, de preferencia una población de células similares a Trl humanas, ^aislada, capaces de producir IL-13. En una modalidad, la población de células similares a Trl aislada, de la invención, es capaz de producir IL-13 en las condiciones de la prueba A que están descritas en la presente invención. En una modalidad de la invención, dicha población de células similares a Trl aislada, produce bajas cantidades de IL-4. En otra modalidad de la invención, dicha población de células similares a Trl aislada expresa: - CD4 y - un nivel bajo de CD127 y - un nivel bajo de CD62L.

En otra modalidad de la invención, las células similares a Trl aislada son células en reposo y expresan un nivel bajo de CD25 y un nivel bajo de FoxP3. En otra modalidad de la invención, dicha población de células similares a Trl aislada es activada y expresa CD25 y un nivel intermedio de FoxP3.

En otra modalidad de la invención, las células similares a Trl aislada son especificas de un antigeno, de preferencia, el antigeno es colágeno del tipo II, ovoalbúmina, proteina básica mielina, proteína oligodendrocítica de mielina o HSP.

En una modalidad de la invención, la población de células similares a Trl, aislada, es una población de células Trl, de preferencia una población de células Trl humanas, capaces de producir IL-13, de preferencia en las condiciones de la prueba A. En una modalidad de la invención, la población de células similares a Trl de la invención, de preferencia la población de células Trl de la invención, produce IL-10, de preferencia en las condiciones de la prueba A.

Es otro objetivo de la invención un clon similar a Trl aislado, de preferencia un clon similar a Trl aislado, humano, capaz de producir IL-13. En una modalidad, el clon similar a Trl aislado, de la invención, es capaz de producir IL-13 en las condiciones de la prueba A que se describen en la presente invención. En una modalidad de la invención, el clon similar a Trl aislado produce cantidades bajas de IL-4. En otra modalidad, el clon similar a Trl expresa: - CD4 y - un nivel bajo de CD127 y - un nivel bajo de CD62L.

En otra modalidad de la invención, el clon similar a Trl aislado es especifico de un antigeno, de preferencia el antigeno es colágeno del tipo II, ovoalbúmina, proteina básica de mielina, proteina oligodendrocitica de mielina o HSP.

En una modalidad de la invención, el clon similar a Trl aislado es un clon de Trl, de preferencia un clon de Trl humano, capaz de producir IL-13 en las condiciones de la prueba A. En una modalidad de la invención, el clon similar a Trl de la invención, de preferencia el clon de Trl de la invención, produce IL-10 en las condiciones de la prueba A.

Es otro objetivo de la invención un método para identificar una población de células similares a Trl, que producen IL-13, que comprende: - detectar la expresión de CD4 en la superficie de las células, y por lo menos uno de los marcadores CD127 y CD62L en una población de células; - detectar la producción de IL13; donde las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o un nivel bajo de CD62L y que producen IL-13, son la población de células similares a Trl, que producen IL-13.

En una modalidad, el método de la invención es para identificar una población de células Trl que producen IL-13 humanas, aislada, donde el método comprende además la detección de la producción de IL-10.

Es otro objetivo de la invención un método para enriquecer una población de células en células similares a Trl, que producen IL-13, que comprende: - identificar las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o un nivel bajo de CD62L y que producen IL-13; - seleccionar dichas células; con lo que se obtiene una población de células enriquecida en células similares a Trl, que producen IL-13; donde el porcentaje de las células similares a Trl, que producen IL-13, es por lo menos el doble que el porcentaje de células similares a Trl, que producen IL-13, antes del enriquecimiento .

En una modalidad, el método de la invención es para enriquecer una población de células en una población de células Trl que producen IL-13, humanas, donde el método comprende además la detección de la producción de IL-10.

Es otro objetivo de la invención una población de células similares a Trl, que producen IL-13, enriquecida, obtenida de acuerdo con el método descrito más arriba. En una modalidad de la invención, la población es enriquecida en células Trl que producen IL-13, humanas.

Otro objetivo de la invención es un equipo para identificar o aislar una población de células similares a Trl, que producen IL-13, de preferencia una población de células Trl que producen IL-13 humanas, que comprende medios para detectar la expresión de D4, CD25, CD127 y CD62L en la superficie de las células, y medios para detectar la producción de IL-13 o IL-10 e IL-13.

Es otro objetivo de la invención una población de células similares a Trl, que producen IL-13, aislada y/o enriquecida, de preferencia, la población de células Trl que producen IL-13 humanas, aislada y/o enriquecida, o el clon similar a Trl productor de IL-13, de preferencia el clon de Trl productor de IL-13, humano, para prevenir o tratar una respuesta inmunológica, la enfermedad de injerto contra huésped y el rechazo de órganos, enfermedades alérgicas y una condición inflamatoria o una condición autoinmune.

Es otro objetivo de la invención un método para agotar una población de células en células similares a Trl que producen IL-13, que comprende: - identificar las células similares a Trl que producen IL-13, como se describió más arriba; - agotar dichas células; con lo que se obtiene una población de células empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, donde el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13 es por lo menos 0.5 veces el porcentaje de las células similares a Trl que producen IL-13, antes del agotamiento.

En una modalidad de la invención, el método de la invención es para agotar una población de células en células Trl que producen IL-13 humanas.

Es otro objetivo de la invención una población de células, empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, obtenida de acuerdo con el método que se describe más atrás. En una modalidad de la invención, la población empobrecida de células es empobrecida en células Trl que producen IL-13, humanas.

Es otro objetivo de la invención una población de células empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, para incrementar una respuesta inmune en un sujeto que tenga necesidad de ello. En una modalidad de la invención, la población de células empobrecida para incrementar una respuesta inmune en un sujeto que tiene necesidad de ello, es empobrecida en células Trl que producen IL-13, humanas.

Breve Descripción de las Figuras de la Invención Figura 1: Inhibición in vitro de la actividad proliferante de células T mediante IL-13. Se añadió 12.5 ng/mL de IL-13 humano recombinante a un cultivo de PBMC humanos activados con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28. Se evaluó la proliferación de las células después de 3 días de cultivo, usando etiquetado de células viables con WST-1.

Las Figuras 2A a 2C: Inhibición in vitro de la actividad proliferante de células T mediante células similares a Trl que producen IL-13. La figura 2A muestra el patrón de la secreción de citoquina in vitro de células reguladoras que producen IL-13, después del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 + anti-CD28, durante 48 horas. La figura 2B muestra el potencial supresor del sobrenadante de células activadas con IL-13, sobre la proliferación de PBMC humanas, estimuladas 3 dias en cultivo con anticuerpos monoclonales anti-CD3 + anti-CD28. La figura 2C muestra que la adición de anticuerpos bloqueadores anti-ILl3 es capaz de invertir la acción supresora del sobrenadante de células reguladoras que producen IL-13.

Figura 3: Fenotipo de células reguladoras humanas que producen IL-13. Se tiñeron células reguladoras de IL-13 humanas con CD25, CD127, CD621 o anticuerpos monoclonales específicos para FoxP3, marcados con fluorescente, para análisis citométrico de flujo. Se analizaron las células en un estado de reposo o después de 7 días de activación, usando IL-2 agentes estimuladores de CD3 + CD28.

Figura 4: Producción de IL-13 e IL-10 por diferentes clones de Trl. Se activaron in vitro clones de Trl humano de 2 diferentes donadores, usando anticuerpos monoclonales anti-CD3 + anti-CD28. Después de 48 horas se midió la producción de IL-10, IFN-? e IL-13 en los sobrenadantes, mediante ELISA. Los resultados muestran que en los dos diferentes donadores probados, varios clones son capaces de producir IL-10 e IFN-?, pero no IL-13; mientras que otros clones son capaces de producir las tres citoquinas. Se muestra un clon de ambas subpoblaciones para cada donador.

Descripción Detallada de la Invención La invención provee una nueva población de células similares a Trl, aislada, que producen IL-13, que tiene capacidades inmunosupresoras , y a su uso. Los inventores descubrieron que esas células son células similares a Trl, ya que expresan los mismos marcadores superficiales que las células Trl, y que estas células son capaces de producir IL-13 y un nivel bajo de IL-4. Los inventores descubrieron que sus capacidades inmunosupresoras son mediadas parcialmente por IL-13. Además, algunas de estas células similares a Trl también son capaces de producir IL-10. Por lo tanto, los inventores proponen que estas células capaces de producir IL-10 e IL-13 son una subpoblacion de células Trl.

Los inventores descubrieron sorprendentemente que esta subpoblacion de células Trl tiene un efecto inmunosupresor incrementado, que es de gran interés en la terapia celular.

Sin intención de apegarse a la teoría, los inventores sugieren que el efecto inmunosupresor incrementado puede deberse a los efectos diferentes y complementarios de IL-10 e IL-13 sobre las células de destino. Por ejemplo, Minty y coautores {Eur. Cytokine Netw., 1997; 8(2): 189-201) mostraron que IL-13 e IL-10 inducen diferentes perfiles de secreción de citoquina en monocitos activados.

Es un objetivo de la invención una población aislada de células similares a Trl, capaz de producir IL-13, de preferencia en las condiciones de la prueba A. De preferencia, la población aislada de células similares a Trl es una población de células humanas.

Cuando se usa aquí, el término "IL-13" se refiere a interleuquina 13.

Cuando se usa aquí, el término "producción de IL-13" se refiere a la secreción de una cantidad de IL-13 de más - lu ¬ de 50 pg/mL, de preferencia más de 100 pg/mL en el medio de cultivo, más preferible, más de 200 pg/mL, todavía más preferible, más de 500 pg/mL, más preferible aún, más de alrededor de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 mil pg/mL o más. De otra manera, se refiere a la secreción de una cantidad de IL-13 de más de 250 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, de preferencia, más de 500 pg/105 células similares a Trl que producen IL-13 y, más preferible, más de 1000 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13. Cuando se usa aquí, el término "alrededor de" que precede una cifra significa más o menos 10 por ciento del valor de dicha cifra.

En una modalidad de la invención, las células similares a Trl de la invención son células Trl, ya que producen IL-10, de preferencia en las condiciones de la prueba A.

Cuando se usa aquí, el término "IL-10" se refiere a la interleuquina 10.

En una modalidad de la invención, las células Trl humanas de la invención producen niveles elevados de IL-10.

Cuando se usa aquí, el término "producción de IL-10" se refiere a la secreción de cantidades de IL-10 de por lo menos 50 pg/mL, de preferencia por lo menos 100 pg/mL en el medio de cultivo; más preferible, por lo menos 200 pg/mL, por lo menos alrededor de 500 pg/mL en el medio de cultivo, típicamente, más de alrededor de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 mil pg/mL o más. De otra manera, se refiere a la secreción de una cantidad de IL-10 de más de 250 pg/106 células Trl que producen IL-13, de preferencia, más de 500 pg/106 células Trl que producen IL-13 y, más preferible, más de 1000 pg/106 células Trl que producen IL-13.

En una modalidad de la invención, dicha población aislada de células similares a Trl produce bajas cantidades de IL-4, de preferencia en las condiciones de la prueba A.

Cuando se usa aquí, el término "IL-4" se refiere a la interleuquina 4.

Cuando se usa aquí, el término bajas cantidades de IL-4" se refiere a cantidades de menos de 500 pg/mL, de preferencia, menos de 250 pg/mL, más preferible, menos de 100 pg/mL .

Dicho de otra maneara, se refiere a cantidades de IL-4 de menos de 2000 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, de preferencia, menos de 1000 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13; más preferible, menos de 500 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13; todavía más preferible, menos de 250 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, más preferible aún, menos de 100 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13.

En una modalidad de la invención, la población aislada de células similares a Trl produce niveles intermedios de TGF-ß, de preferencia en las condiciones de la prueba A.

Cuando se usa aquí, el término TGF-ß se refiere al factor de desarrollo de transformación beta.

Cuando se usa aquí, el término "niveles intermedios de TGF-ß se refiere a una cantidad de TGF-ß de por lo menos alrededor de 100 pg/mL, típicamente, más de alrededor de 200, 300, 400, 600, 800 o 1000 pg/mL o más.

Dicho de otra manera, se refiere a cantidades de TGF-ß de por lo menos alrededor de 400 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, típicamente, más de alrededor de 800, 1200, 1600, 2400, 3200 o 4000 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, o más.

En una modalidad de la invención, la población aislada de células similares a Trl produce niveles intermedios de IFN-?, de preferencia en las condiciones de la prueba A.

Cuando se usa aquí, el término "IFN-?" se refiere al interferón gamma.

Cuando se usa aquí, el término "niveles intermedios de IFN-? se refiere a una cantidad de IFN-? comprendida entre 0.1 pg/mL y por lo menos 400 pg/mL, típicamente, más de alrededor de 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 o 2000 pg/mL o más.

Dicho de otra manera, se refiere a cantidades de IFN-? comprendidas entre 0.4 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13 y por lo menos 1600 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, típicamente, más de alrededor de 2400, 3200, 4000, 4800, 5600, 6400, 7200 u 8000 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, o más.

En una modalidad de la invención, la población aislada de células similares a Trl produce bajas cantidades de IL-2, de preferencia en las condiciones de la prueba A.

Cuando se usa aquí, el término "IL-2" se refiere a la interleuquina 2.

Cuando se usa aquí, el término "bajas cantidades de IL-2" se refiere a las cantidades de menos de alrededor de 500 pg/mL, de preferencia, menos de alrededor de 250, 100, 75 o 50 pg/mL, o menos.

Dicho de otra manera, se refiere a cantidades de IL-2 de menos de alrededor de 2000 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, de preferencia, menos de alrededor de 1000, 400, 300 o 200 pg/106 células similares a Trl que producen IL-13, o menos.

En una modalidad de la invención la población aislada de células similares a Trl es una población aislada de Trl productora de IL-13, humana, y produce IL-13, IL-10, niveles intermedios de IFN-? y de TGF-ß y cantidades bajas de IL-4 y/o IL-2. De acuerdo con esta modalidad, la población aislada de células similares a Trl es una subpoblación de células Trl humanas, ya que los inventores demostraron que una célula Trl puede producir o no IL-13 en las condiciones de la prueba A (ver los ejemplos) .

Los métodos para evaluar si una célula es capaz de producir IL-13, IL-10, producir niveles intermedios de IFN-? y de TGF-ß y producir cantidades bajas de IL-4 y/o IL-2, son bien conocidos en la técnica.

La prueba A, como se define en la presente invención, está descrita aquí más adelante, y permite la determinación de la producción de citoquina, cultivando las células en las condiciones de la prueba A. La prueba A corresponde a la activación de las células con uno o más agentes activadores de TCR.

En una modalidad, los agentes activadores de TCR son activadores policlonales de linfocitos T, tales como los anticuerpos anti-CD3 + anti-CD28 o interleuquina-2 , PMA + ionomicina .

En otra modalidad, el agente activador de TCR es un antígeno presentado por una célula que presenta antigeno.

Por ejemplo, se activan 1 x 106 células en un medio RPMI o DMEM, suplementado con 10% de suero fetal de ternera, en presencia de uno o más agentes activadores de TCR durante 48 horas. Luego se cosecha el medio y se mide la producción de citoquinas mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Un ejemplo de estos métodos es el siguiente: Se activan las células en presencia de anti-CD3 (10 ug/mL) y anti-CD28 (1 g/mL) durante 48 horas y se mide la secreción de citoquinas en este punto mediante ELISA o mediante FACS.

En otra modalidad de la invención, dichas células similares a Trl aisladas expresan CD4 en su superficie y un nivel bajo de CD127 y un nivel bajo de CD62L.

En una modalidad, la subpoblacion aislada de células Trl expresa CD4 en su superficie y un nivel bajo de CD127 y un nivel bajo de CD62L.

En una modalidad, las células aisladas similares a Trl están en reposo y no expresan CD25 en su superficie. En una modalidad, la subpoblacion aislada de células Trl está en reposo y no expresa CD25 en su superficie.

En otra modalidad, se activan las células aisladas, similares a Trl, y expresan CD25 en su superficie. En otra modalidad, la subpoblacion aislada de células Trl es activada y expresa CD25 en su superficie.

Cuando se usa aquí, "aislado" se refiere a una célula o a una población de células que es sacada de su ambiente natural (tal como la sangre periférica) y que está aislada, purificada o separada, y está libre por lo menos en alrededor de 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento y, de preferencia, alrededor de 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento libre de otras células con las que está presente naturalmente, pero que carecen de marcadores en la superficie de la célula, con base en los cuales se aislaron las células.

Cuando se usa aquí, el término "marcador superficial de la célula" se refiere a proteínas, carbohidratos o lípidos en la superficie de las células que pueden ser usados para discriminar una población de células.

Cuando se usa aquí, el término "expresión" se refiere, intercambiablemente, a la expresión de un gen o un producto de gen, que incluye el polipéptido o la proteína codificados. La expresión de un producto de gen se puede determinar, por ejemplo, mediante inmunoanálisis, usando uno o más anticuerpos que se une (n) con el polipéptido. Alternativamente, se puede determinar la expresión de un gen, mediante la medición de los niveles de mARN, por ejemplo, mediante RT-PCR, RT-qPCR.

El término "natural" es bien conocido en la técnica y se refiere a una célula inmune o a una población de células que todavía no ha encontrado ningún antígeno específico.

El término "en reposo" es bien conocido en la técnica y se refiere a una célula inmune o a una población de células que no prolifera, no produce citoquinas y que no expresa moléculas de activación de célula inmune convencionales, en la superficie, tal como CD25.

El término "activado" es bien conocido en la técnica y se refiere a una célula inmune o a una población de células que proliferan y/o producen citoquinas y expresan moléculas de activación de célula inmune convencionales, en su superficie, tal como CD25.

Especialmente para los linfocitos T, el paso de un estado de reposo a un estado activado es mediado por el encuentro de la célula T con su antigeno especifico o por activación con las citoquinas o los mitógenos activadores.

El término "bajo", "lo" o "lo/-" cuando se usa en relación con CD127lo/", CD62Llo/" o CD252Llo " es bien conocido en la técnica y se refiere al nivel de expresión del marcador de célula que interesa, ya que el nivel de expresión del marcador de célula es bajo, por comparación con el nivel de expresión de ese marcador de célula en la población de células que se está analizando, en su totalidad. Más en particular, el término "lo", se refiere a una población de células distinta, que expresa el marcador de célula a un nivel menor que una o más poblaciones distintas de células.

El término "alto" o "hi" o "brillante" es bien conocido en la técnica y se refiere al nivel de expresión del marcador de célula que interesa, ya que el nivel de expresión del marcador de célula es elevado en comparación con el nivel de expresión de ese marcador de célula en la población de células que se está analizando en su totalidad. Los términos "+" y "-" son bien conocidos en la técnica y se refieren al nivel de expresión del marcador de célula que interesa, ya que el nivel de expresión del marcador de célula que corresponde a "+" es alto o intermedio, y el nivel de expresión del marcador de célula que corresponde a "-" es bajo o nulo. En general, las células en el 2, 3, 4 o 5 por ciento superior de intensidad de teñido están designadas "hi", y aquellas que quedan en la mitad superior de la población se categorizan como "+". Las células que quedan debajo del 50 por ciento de intensidad de fluorescencia están designadas como células "lo" y por debajo del 5 por ciento están designadas como células Cuando se usa aqui, el término "CD127" se refiere al "receptor de interleuquina-7" (IL-7R) presente en la superficie de una célula. La cadena alfa del receptor de IL-7 está descrita en la literatura (por ejemplo, Good in y coautores (1990), Cell 60: 941-951). También se denomina a IL-7R en la literatura como CD127. CD127+ se refiere a células que se tiñen de forma intermedia o brillantemente cuando se tratan con un anticuerpo marcado, dirigido hacia CD127. CD127lo " se refiere a células de un tipo que se tiñe ligeramente / débilmente o que no se tiñe en absoluto, cuando se pone en contacto con un anticuerpo CD127 marcado. En general, se distinguen las células de acuerdo con sus niveles de expresión de CD127 basados en una diferencia fácilmente discernióle en la intensidad de tinción, como lo saben quienes son expertos ordinarios en la materia. En algunas modalidades el punto de corte para designar a una célula como célula CD127lo " se puede fijar en términos de la distribución de la intensidad de fluorescencia observada para todas las células, designándose aquellas células que quedan por debajo del 50 por ciento, el 40 por ciento, el 30 por ciento o el 20 por ciento de intensidad de fluorescencia, células CD127l0,~. Se puede designar una célula CD127 como una que cae por debajo del 0.1 por ciento inferior, con respecto a la intensidad de fluorescencia. En algunas modalidades, la distribución de frecuencia de la tinción de CD127 se obtiene para todas las células y la curva de población se ajusta a una población de tinción superior y una población de tinción inferior; y las células asignadas a la población a la que es muy probable estadísticamente que pertenezcan en vista de un análisis estadístico de las respectivas distribuciones de población. En algunas modalidades, las células CD127lo " se tiñen de dos a tres veces menos intensamente que las células CD127+ .

Cuando se usa aquí, el término "CD62L" se refiere a L-selectina, que es una molécula de adherencia crítica para la migración de los linfocitos. CD62L+ se refiere a células que se tiñen de manera intermedia o brillante, cuando se tratan con un anticuerpo marcado, dirigido a CD62L. CD62LW" se refiere a células de un tipo que se tiñe ligeramente / débilmente o no se tiñe en absoluto cuando se pone en contacto con un anticuerpo CD62L marcado. Por lo general, se distinguen las células de acuerdo con sus niveles de expresión de CD62L, con base en una diferencia fácilmente discernible, en la intensidad de tinción, como lo saben quienes son expertos ordinarios en la materia. En algunas modalidades, el punto de corte para designar a una célula CD62Llo/" puede fijarse en términos de la distribución de la intensidad de fluorescencia para todas las células, designándose las células que quedan por debajo del 50 por ciento, 40 por ciento, 30 por ciento o 20 por ciento de intensidad de fluorescencia, células CD62Llo/". Se puede designar una célula CD62L"" si queda por debajo del 0.1 por ciento inferior, con respecto a la intensidad de fluorescencia. En algunas modalidades, la distribución de frecuencia de la tinción de CD62L se obtiene para todas las células y la curva de población se ajuste a una población de tinción mayor y de tinción menor, y las células asignadas a la población a la que muy probablemente pertenecen estadísticamente, en vista del análisis estadístico de las respectivas distribuciones de población. En algunas modalidades, las células CD62Llo/~ se tiñen de dos a tres veces menos intensamente que las células CD62L+.

Cuando se usa aquí, el término "CD4" se refiere a una glicoproteína de la superficie de célula, que se encuentra típicamente en las células T auxiliares maduras y en los timocitos inmaduros, así como en monocitos y macrófagos. En las células T, CD4 es el correceptor para el receptor de célula T (TCR) y recluta la tirosina quinasa Ick. Con su porción DI, CD4 puede atacar al dominio beta2 de las moléculas de MHC de clase II. CD4+ se refiere a células que se tiñen brillantemente cuando se ponen en contacto con el anticuerpo anti-CD4 marcado, y CD4" se refiere a las células de un tipo que se tiñen menos brillantemente, pálidamente o no se tiñe en absoluto cuando se pone en contacto con un anticuerpo CD4 marcado fluorescentemente. Por lo general, las células se distinguen de acuerdo con sus niveles de expresión de CD4, con base en una diferencia fácilmente discernible en la intensidad de tinción, ya que la tinción de CD4 es claramente bimodal. En algunas modalidades, la distribución de frecuencia de la tinción de CD4 se obtiene para todas las células, y la curva de población se ajusta a una población de mayor tinción y una población de menor tinción; y las células asignadas a la población a la que muy probablemente pertenecen estadísticamente, en vista de un análisis estadístico de las distribuciones de población respectiva. En algunas modalidades, las células CD4" se tiñen de dos a tres veces menos intensamente que las células CD4+.

Cuando se usa aquí, el término "CD25" se refiere a la subunidad alfa del receptor de interleuquina-2 , una glicoproteína de una sola cadena, con un peso molecular de 55 kD. Después de la activación de las células T con antígeno o mitógeno en presencia de la monoquina interleuquina-1, se sintetiza y secreta rápidamente la interleuquina 2 (IL-2) . En respuesta a esto, una subpoblación de células T expresa receptores de gran afinidad para IL-2. Estas células proliferan, expanden la población de células T que es capaz de mediar las funciones auxiliar, supresora y citotóxica. El receptor de IL-2 no únicamente se encuentra en las células T. CD25hl se refiere a células que se tiñen brillantemente cuando se ponen en contacto con el anticuerpo anti-CD-25 marcado, CD25+ se refiere a células que se tiñen menos brillantemente cuando se ponen en contacto con el anticuerpo anti-CD25 marcado, y CD25lo/" se refiere a células que son de un tipo que se tiñe menos brillantemente, pálidamente o nulamente cuando se pone en contacto con un anticuerpo de CD25 marcado. Por lo general, se distinguen las células de acuerdo con sus niveles de expresión de CD25, con base en niveles de expresión por diferencias en la intensidad de tinción, como lo sabe quien sea experto ordinario en la materia. En algunas modalidades, el punto de corte para designar una célula como una célula con una expresión de CD25 en la categoría hi, +, lo ó - se puede fijar en términos de la distribución de la intensidad de fluorescencia observada para todas las células. Por lo general, las células en el 2, 3, 4 o 5 por ciento superior de la intensidad de tinción se designan "hi", y aquellas que quedan en la mitad superior de la población se categorizan como "+". Las células que quedan por debajo del 50 por ciento de intensidad de fluorescencia se designan células CD2510 y las que quedan debajo del 5 por ciento, como células CD25".

Así, dichas células similares a Trl pueden ser caracterizadas operativamente por sus marcadores de la superficie de la célula y su capacidad para producir IL-13. Dicha subpoblación de células Trl puede caracterizarse operativamente por sus marcadores de la superficie de la célula y por su capacidad para producir IL-13 e IL-10. Estos marcadores de la superficie de la célula se pueden reconocer mediante reactivos que se unen específicamente a los marcadores de la superficie de la célula. Por ejemplo, se pueden reconocer inmunológicamente proteínas, carbohidratos o lípidos en la superficie de las células Trl mediante anticuerpos específicos para la proteína o el carbohidrato particular (para uso de los anticuerpos para marcadores, ver Harlow, Using Antibodies : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. U., 1999; ver también los ejemplos). La serie de marcadores presentes en la superficie de las células similares a Trl y ausentes de la superficie de estas células es característica de las células similares a Trl. Por lo tanto, se pueden seleccionar las células similares a Trl mediante selección positiva y negativa, usando os marcadores de la superficie de la célula. Se puede usar un reactivo que se una a un marcador de la superficie de la célula, expresado por una célula similar a Trl, un "marcador positivo" para la selección positiva de las células similares a Trl (es decir, células de retención que expresen el marcador de la superficie de la célula) . Inversamente, la selección negativa se basa en el hecho de que ciertos marcadores de la superficie de la célula no son expresados por las células similares a Trl. Por lo tanto, se puede usar un "marcador negativo" (es decir, un marcador que no esté presente en la superficie de la célula de las células similares a Trl) para la eliminación de esas células en la población que no consiste de células similares a Trl, mediante la eliminación de las células que se unen al reactivo específico para el marcador negativo.

En una modalidad, la discriminación entre las células basada en la expresión detectada de marcadores de la superficie de la célula, ocurre comparando la expresión de un marcador de la superficie de la célula con la expresión media mediante una población de células de control. Por ejemplo, la expresión de un marcador en una célula similar a Trl, puede ser comparada con la expresión media del mismo marcador en otras células derivadas de la misma muestra que la célula similar a Trl. Otros métodos para discriminar entre células mediante la expresión de marcador incluyen impedir el paso de células mediante citometría de flujo, usando una combinación de reactivos (ver Givan A., Flow Cytometry: First Principies (Wiley-Liss, Nueva York, 1992); Owens, M. A. y Loken M. R. , Flow Cytometry: Principies for Clinical Laboratory Practice, (Wiley-Liss, Nueva York, 1995) ) . Por una "combinación de reactivos" se quiere decir por lo menos dos reactivos que se unan a los marcadores de la superficie de la célula, ya sea que estén presentes (marcador positivo) o que no estén presentes (marcador negativo) en la superficie de las células similares a Trl, o que se unan a una combinación de marcadores positivos y negativos. Por ejemplo, el uso de una combinación de anticuerpos específicos para marcadores de la superficie de células similares a Trl, da por resultado el aislamiento y/o el enriquecimiento de células similares a Trl, a partir de una variedad de muestras / tejidos.

Un "anticuerpo anti-X" o un "anticuerpo X", de acuerdo con la invención, es un anticuerpo que se une específicamente a X. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD127 o anticuerpo CD127 es capaz de unirse a CD127. Los anticuerpos para uso de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación a ellos: anticuerpos recombinantes, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados o primatizados, y fragmentos de anticuerpo. Están disponibles en el comercio una gran cantidad de anticuerpos específicos para biomarcador de linfocito. Estos incluyen anticuerpos anti-CD127, anti-CD4, anti-CD62L, anti-CD25, anti-IL-4, anti-IL-10 y anti-IL-13 (R&D, BD Biosciences ... ) . "Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de maraco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos de él, que se une específicamente con y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras están clasificadas kappa o lambda. Las cadenas pesadas están clasificadas como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que, a su vez, definen las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Típicamente, la región de unión al antígeno de un anticuerpo será sumamente crítica en su especificidad y afinidad de unión. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) de ejemplo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está constituido por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido; teniendo cada par una cadena "ligera" (alrededor de 25 kD) y una cadena "pesada" (alrededor de 60 a 70 kD) . El extremo N de cada cadena define una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos, responsables primariamente del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) , se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente. Existen anticuerpos, por ejemplo, como las inmunoglobulinas intactas, o como numerosos fragmentos bien caracterizados, producidos por digestión con diversas peptidasas- Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región de gozne para producir F(ab)'2, un dímero de Fab, que a su vez es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante una unión disulfuro. Se puede reducir el F(ab)'2 bajo condiciones moderadas para romper el enlace disulfuro en la región de gozne, convirtiendo de esa manera el dimero F(ab)'2 a un monómero Fab' . El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de gozne (ver Fundamental Immunology (Paul ed., 3a. ed. 1993)). Si bien varios fragmentos de anticuerpo están definidos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, quien sea experto en la materia apreciará que dichos fragmentos pueden ser sintetizados de novo ya sea químicamente o mediante el uso de metodología de ADN recombinante . Así pues, el término anticuerpo, cuando se usa aquí, incluye también los fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de los anticuerpos enteros, o los sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de una sola cadena) o los identificados usando bancos de exhibición de fagos (ver, por ejemplo, McCafferty y coautores, Nature 348: 552-554 (1990)). En algunas modalidades, se puede usar un ligando de gran afinidad de un blanco en lugar del anticuerpo. La frase "se une específicamente (o selectivamente" a un anticuerpo o #específicamente (o selectivamente" inmunorreactivo con", cuando se refiere a una proteína o un péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, frecuentemente en una población heterogénea de proteínas y otros elementos biológicos. La unión específica a un anticuerpo, bajo tales condiciones, requiere de un anticuerpo que esté seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, se pueden seleccionar los anticuerpos policlonales para obtener sólo los anticuerpos policlonales que son específicamente inmunorreactivos con el antígeno seleccionado y no con otras proteínas. Esta selección se puede obtener sustrayendo los anticuerpos que reaccionan cruzadamente con otras moléculas.

De preferencia, una "etiqueta" o una "porción detectable" es fijada covalentemente o no covalentemente al anticuerpo. Una etiqueta puede ser detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos inmunoquímicos , químicos u otros medios físicos. Las etiquetas particularmente útiles son tintes fluorescentes. Los métodos para fijar etiquetas a los anticuerpos son bien conocidos por quienes tengan experiencia ordinaria en la materia. Las etiquetas particularmente preferidas son aquellas que se fijan al anticuerpo mediante un enlazador que puede ser desprendido o separado fácilmente o sometido a hidrólisis mediante contacto con una enzima predeterminada, bajo condiciones fisiológicas. El anticuerpo también puede estar conjugado con una partícula magnética, tal como una microperla paramagnética (Miltenyi B otec, Alemania) . Una célula T activada, unida mediante un anticuerpo etiquetado (marcado) magnéticamente, puede ser aislada usando técnicas que incluyen, pero sin restricción a ella, la clasificación magnética de células. Los anticuerpos etiquetados adecuadamente para CD127, CD62L, CD4 y CD25, así como otras muchas agrupaciones de diferenciación, pueden ser obtenidos comercialmente y son conocidos por quienes son expertos ordinarios en la materia. El anticuerpo puede ser marcado antes o después del contacto con la muestra, o antes o después del contacto con el CD. Se puede etiquetas el anticuerpo CD poniéndolo en contacto con un anticuerpo etiquetado, que se una al anticuerpo CD. Cuando se usa aquí, el término "CD" o "agrupación de diferenciación" o "determinante común", se refiere a moléculas de la superficie de la célula, reconocidas por los anticuerpos.

En una modalidad de la invención, la población de células similares a Trl, que producen IL-13, está en reposo y las células expresan un nivel bajo de FoxP3. En una modalidad, la subpoblacion de células Trl que producen IL-13 e IL-10, está en reposo y las células expresan un nivel bajo de FoxP3.

En otra modalidad de la invención, la población de células similares a Trl que producen IL-13 está activada y las células expresan un nivel intermedio de FoxP3. En una modalidad, la subpoblacion de células Trl que producen IL-13 e IL-10 está activada y las células expresan un nivel intermedio de FoxP3.

Cuando se usa aqui, el término "FoxP3" se refiere a la proteina nuclear Foxp3, que se cree que actúa como un factor de transcripción (Hori y coautores, 2003; Yasayko, J. E. y coautores, Nat. Genet . , 27: 68-73 (2001); Fontenot, J. D. y coautores, Nat. Immunol., 4: 330-336 (2003); Khattri, R. y coautores, Nat. Immunol., 4: 337-342 (2003)). Como está localizado dentro de la célula, la expresión de Foxp3 puede ser determinada mediante citometria de flujo intracelular , usando un anticuerpo anti-Foxp3 etiquetado (EBioscience Inc. o BD Biosciences) .

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende o que consiste esencialmente de, o que consiste de, las células aisladas similares a Trl que producen IL-13.

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la subpoblación aislada de células Trl que producen IL-13 e IL-10.

En una modalidad de la invención, la subpoblación de células Trl o de células similares de Trl es especifica de un antigeno o es especifica de antigenos múltiples. Los ejemplos de antigeno a los que puede ser especifica la subpoblación de células Trl o de células similares a Trl incluyen, pero sin limitación a ellos: auto-antigenos, antigeno de alimento procedente de dieta humana común, antigenos inflamatorios, tales como antigenos asociados con esclerosis múltiple o antigenos asociados con articulaciones, y alérgenos.

El término "antigeno de alimento procedente de dieta humana común" se refiere a un péptido inmunógeno que procede de materiales alimenticios comunes para los humanos, tales como los antigenos de alimento de la siguiente lista no restrictiva: antigenos bovinos, tales como lipocalina, S100 que se une a Ca, alfa-lactoalbúmina, lactoglobulinas, tales como beta-lactoglobulina, albúmina de suero bovino, caseínas. Los antígenos de alimento también pueden ser antígenos de salmón del Atlántico, tales como parvalbúmina, antígenos de pollo, tales como ovomucoide, ovoalbúmina, Ag22, conalbúmina, lisozima o albúmina de suero de pollo; cacahuates, antígenos de camarón, tales como tropomiosina, antígenos de trigo, tales como aglutinina o gliadina; antígenos de apio, tales como profilina de apio, antígenos de zanahoria, tales como profilina de zanahoria, antígenos de manzana, tales como taumatina, proteína de transferencia de lipido de manzana, profilina de manzana, antígenos de pera, tales como profilina de pera, isoflavona reductasa, antígenos de aguacate, tales como endoquitinasa, antígenos de albaricoque, tales como proteína de transferencia de lipido de albaricoque, antígenos de durazno, tales como proteína de transferencia de lipido de durazno o profilina de durazno; antígenos de soya, tales como HPS, profilina de soya o (SAM22) PR-10 prot .

El término "auto-antígeno" se refiere a un péptido inmunógeno derivado de una proteína del individuo. Puede ser, a manera de ejemplo, un auto-antígeno de la siguiente lista no restrictiva: receptor de acetilcolina, actina, translocador de nucleótido de adenina, adrenorreceptor, descarboxilasa de L-aminoácido aromática, receptor de asialoglicoproteína, proteína incrementadora de bactericida / permeabilidad (BPi) , receptor sensor de calcio, enzima de división de cadena lateral de colesterol, cadena de colágeno de tipo IV, citocromo P450 2D6, desmina, desmogleína-1 , desmogleína-3, F-actina, GM-gangliosidas , glutamato descarboxilasa, receptor de glutamato, H/K ATPasa, 17-hidroxilasa, 21-hidroxilasa, IA-2 (ICAS12), insulina, receptor de insulina, factor intrínseco tipo 1, antígeno 1 de función leucocito, glicoproteína asociada con mielina, proteína básica de mielina, proteína oligodendrocítica de mielina, miosina, P80-colina, complejo E2 de deshidrogenasa piruvato (PDC-32) , simportador de yoduro de sodio, SOX-10, proteína compartida por tiroides y músculo del ojo, tiroglobulina, peroxidasa de tiroides, receptor de tirotropina, transglutaminasa de tejido, coactivador p75 de transcripción, triptofano hidroxilasa, tirosinasa, tirosina hidroxilasa, ACTH, aminoacil-tARN-histidil sintetasa, cardiolipina, anhidrasa II carbónica, proteínas asociadas con centromero, ATPasa estimulada por nucleosoma dependiente de ADN, fibrilarina, fibronectina, isomerasa de 6-fosfato de glucosa, beta-2-glicoproteína I, golgin (95, 97, 160, 180), proteínas de choque térmico, proteína 180 semidesmosómica, histona H2A, H2B, queratina, receptor de IgE, Ku-ADN proteína quinasa, Ku-nucleoproteína, La fosfoproteína, mieloperoxidasa, proteinasa 3, ARN polimerasa I-III, proteína de reconocimiento de señal, topoisomerasa I, tubulina, vimenscina, proteína básica oligodendrocítica asociada con mielina (MOBP) , proteína proteolípida, proteína oligodendrocítica específica, (OSP/Claudin 11), 3'-fosfodiesterasa de nucleótido cíclico (CNPasa) , antígeno 1 de BP (BPAGl-e), transaldolasa (TAL) , autoantígenos mitocondrianos humanos PDC-3S (Novo 1 y 2), OGDC-E2 (Novo 3) y BCOADC-E2 (Novo 4), Penfigoide bulloso (BP)180, laminina 5 (ln5), proteína 48 DEAD-box (DDX48), o antígeno-2 asociado con insulinoma. El término "antígeno asociado con esclerosis múltiple" se refiere a proteína básica de mielina (MBP) , glicoproteína asociada con mielina (MAG) , proteína oligodendrocítica específica (OSP/Claudin 11) , proteínas de choque térmico, proteínas oligodendrocíticas específicas (OSP) , NOGO A, glicoproteína Po, proteína 22 de mielina periférica (PMP22) , 2 ', 3 ' -nucleótido cíclico-3"-fosfodiesterasa (CNPasa) , fragmentos, variantes y mezclas de ellos .

El término "antígeno asociado con articulaciones" se refiere a péptidos cíclicos y filagrínicos lineales, sustituidos con citrulina, péptidos de colágeno tipo II, péptidos de glicoproteína 39 de cartílago humano (HCgp39) , HSP, péptidos de ribonucleoproteína A2 nuclear heterogénea (hnRNP) , hnRNP Bl, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, 65, 70 y 90, BiP, queratina, vimentina, fibrinógeno, péptidos de colágeno tipo I, II, III, IV y V, anexina V, isomerasa de fosfato de glucosa 6 (GPI), acetil-calpastatin, piruvato deshidrogenasa (PDH), aldolasa, topoisomerasa I, snRNP, PARP, Scl-70 Scl-100, antígeno de fosfolípido, incluyendo cardiolipina aniónica y fosfatidilserina , fosfatidil etanolamina fosfatidilcolina cargadas neutralmente, metaloproteinasa de matriz, fibrilina, agrecán..

El término "alérgeno" se refiere a un alérgeno inhalado, un alérgeno ingerido o un alérgeno de contacto. Los ejemplos de los alérgenos incluyen, pero sin limitación a ellos: los alérgenos inhalados, derivados de polen (Cup, Jun) , los ácaros de polvo doméstico (Der, Gly, Tyr, Lep) , perro, gato y roedores (Can, Fel, Mus, Rat) . Los ejemplos de alérgenos de contacto incluyen, pero sin limitación a ellos: metales pesados (tales como níquel, cromo, oro) , látex, haptenos tales como halotano, hidralacina..

En una modalidad de la invención, el antígeno al que es específica la subpoblación de células Trl o la población de células similares a Trl es HSP, de preferencia HSP60.

Otro objetivo de la invención es un método para identificar / aislar / cuantificar una población de células similares a Trl, que producen IL-13, que comprende: - detectar la expresión de CD4 en la superficie de la célula, y uno de CD127 y CD62L en una población de células; - detectar la producción de IL-13, por ejemplo, en las condiciones de la prueba A; donde las células que expresan CD4 (es decir, que son CD4+) y un nivel bajo de CD127 y/o un nivel bajo de CD62L (es decir, que son CD127lo/" y CD62Llo ") y que producen IL-13, son las células similares a TR1 que producen IL-13; y - identificar / aislar / cuantificar dichas células.

Es otro objetivo de la invención un método para identificar / aislar / cuantificar una subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, que comprende: -detectar la» expresión de CD4 en la superficie de la célula, y uno de CD127 y CD62L en una población de células; -detectar la producción de IL-13 e IL-10, por ejemplo, en las condiciones de la prueba A; donde las células que expresan CD4 (es decir, que son CD4+) y un nivel bajo de CD127 y/o un nivel bajo de CD62L (es decir, que son CD127lo/" y CD62Llo ") y que producen IL-13 e IL-10, son la subpoblación de células Trl; y - identificar / aislar / cuantificar dichas células.

Como se mencionó anteriormente aqui, la expresión de CD4, CD127 y CD62L en la superficie de la célula puede ser detectada usando anticuerpos anti-CD4, -CD62L y -CD127.

La detección de la producción de IL-13 e IL-10 se puede llevar a cabo mediante diferentes medios bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, un primer método para detecta la producción de IL-13 o IL-10 se basa en el uso de un anticuerpo etiquetado anti-IL-13 o anti-IL-10, para una tinción intracelular de células T, previamente permeabilizadas, leyéndose la tinción mediante FACS.

Otro ejemplo de un método para detectar la producción de IL-13 o IL-10 se basa en un análisis ELISA llevado a cabo con un anticuerpo anti-IL13 o anti-IL-10 etiquetado .

Finalmente, otro ejemplo de un método para detectar la producción de IL-13 se basa en el uso del equipo de análisis de secreción de IL, comercializado por iltenyi Biotech (130-093-480) o su equivalente. Este método es de interés particular, ya que permite la detección y el enriquecimiento de las células que producen IL-13 sin tener que permeabilizarlas . Otro ejemplo de un método para detectar la producción de IL-10 se basa en el uso del equipo de análisis de secreción de IL-10, comercializado por Miltenyi Biotech (130-090-434) o su equivalente. Este método es de interés particular, ya que permite la detección y el enriquecimiento de células que producen IL-10, sin tener que permeabilizarlas .

Se puede usar cualquier fuente celular que contenga células T para aislar las células similares de Rtl que producen IL-13, o la subpoblacion de células Trl que producen IL-13 e IL-10. Las fuentes útiles incluyen, pero sin restricción a ellas: sangre periférica, fluido sinovial, bazo, timo, nodos linfáticos, médula ósea, parches de Peyer y amígdalas .

Los métodos para separar, aislar o seleccionar células incluyen, pero sin limitación a ellos: la separación magnética usando perlas magnéticas revestidas con anticuerpo (Schwartz y coautores, patente estadounidense No. 5,759,793) y cromatografía por afinidad o "lavado en batea" usando el anticuerpo fijado a una matriz sólida (por ejemplo, una placa) . Otras técnicas que proveen separación precisa incluyen los clasificadores de células activados por fluorescencia (FACS) que pueden tener grados variables de sofisticación, tales como tener múltiples canales de color, canales detectores con barrido de luz a ángulo bajo y obtuso, o canales de impedancia. Se pueden eliminar las células muertas mediante selección con tintes asociados con células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio, LDS) . Se pueden eliminar los glóbulos rojos de la sangre, por ejemplo, mediante elutriación, hemolisis o gradientes de Ficoll-Paque . Se puede emplear cualquier técnica que no sea indebidamente dañina para la viabilidad de las células seleccionadas.

Contenientemente se pueden conjugar los anticuerpos con etiquetas para varios propósitos diferentes, por ejemplo, gránulos magnéticos para permitir la fácil separación de las células Trl; biotina, que se une con gran afinidad a la avidina o a la estreptavidina ; fluorocromos , que pueden ser usados con clasificadores de células activados por fluorescencia; haptenos, y otros similares. Se pueden emplear análisis de varios colores con FACS o en combinación de separación inmunomagnética y citometría de flujo. El análisis de colores múltiples es de interés para la separación de células con base en antígenos de superficie múltiples, por ejemplo, marcadores de células inmunes que no sean CD4+ (CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123.

TCRgamma/delta y glicoforina A), CD , CD25, CD127 y CD62L. Los fluorocromos que tienen uso en un análisis de colores múltiples incluyen, pero sin limitación a ellos: ficobiliproteinas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas , fluoresceina y rojo de Texas.

La separación magnética es un proceso usado para retener selectivamente materiales magnéticos dentro de un recipiente, tal como un tubo de centrifuga o una columna, en un gradiente de campo magnético. Se pueden etiquetar magnéticamente las células Trl uniendo las partículas magnéticas a la superficie de las células, por medio de interacciones específicas, incluyendo interacciones de inmuno-afinidad. La suspensión que contiene las células Trl dentro de un recipiente adecuado, se expone luego a gradientes de campo magnético de resistencia suficiente para separar las células Trl de otras células de la suspensión. Luego se puede lavar el recipiente con un fluido adecuado para eliminar las células no etiquetadas, lo que da por resultado una suspensión purificada de células Trl.

La mayoría de los sistemas de etiquetado magnético usan partículas superparamagnéticas , con anticuerpos monoclonales o estreptavidina, unidos covalentemente a su superficie. En aplicaciones de separación de células, se pueden usar esas partículas para selección positiva, donde las células que interesan son etiquetadas magnéticamente y retenidas, o bien selección negativa, donde la mayoría de las células indeseadas son etiquetadas magnéticamente y retenidas. El diámetro de la partícula usada varía ampliamente, desde alrededor de 50-100 nm para las partículas de MACS ( iltenyi Biotec) y coloide StemSep™ (StemCell Technologies) , hasta 150-450 nm para EasySep® (StemCell Technologies) y partículas de Imag (BD Biosciences) hasta 4.2 pm para Dynabeads (Dynal Biotech) . El tipo de partícula usado está influenciado por la tecnología magnética empleada para separar las células etiquetadas.

Hay dos clases importantes de tecnologías de separación magnética, y ambas, por conveniencia y por razones-prácticas, usan imanes permanentes, en oposición a electroimanes. La primera clase es una tecnología de separación por campo magnético de alto gradiente, basada en columna, que usa partículas débilmente magnéticas pequeñas para etiquetar los blancos de interés, y separar esos blancos en una columna llena con una matriz magnetizable. Se generan gradientes muy elevados cerca de la superficie de los elementos de matriz cuando se aplica un campo magnético a la columna. Los gradientes elevados son necesarios para separar blancos etiquetados con esas partículas relativamente débilmente magnéticas. La segunda clase es una tecnología basada en tubo, que usa partículas más fuertemente magnéticas para etiquetar los blancos de interés. Estos blancos de interés son separados luego dentro de un tubo del tipo de centrífuga, por medio de gradientes de campo magnético generados por un imán situado fuera del tubo. Este método tiene la ventaja de que no se basa en una matriz magnetizable para generar los gradientes; y por lo tanto, no requiere de una columna desechable costosa ni de una columna reutilizable, con un procedimiento inconveniente de limpieza y descontaminación.

Una vez colocadas dentro del imán, las células etiquetadas migran hacia la región o las regiones de la máxima fuerza de campo magnético y son retenidas dentro del campo magnético, mientras que las células no etiquetadas son expulsadas. Luego se pueden recoger las células de blanco y se las puede usar después de sacarlas del campo magnético. En el caso de que se requiera la selección negativa, las células no etiquetadas son retenidas y pueden ser utilizadas para una variedad de aplicaciones.

FACS permite la separación de subpoblaciones de células sobre la base de sus propiedades dispersadoras de la luz, cuando pasan a través de un rayo láser. El dispersador de luz positivo (FALS) está relacionado con el tamaño de las células, y el dispersador de luz a ángulo recto, también conocido como característica de dispersador lateral (SSC) está relacionado con la densidad de las células, con el contenido de las células y con la proporción nucleo-citoplásmica, es decir, la complejidad de la célula. Puesto que se pueden etiquetar las células con anticuerpos conjugados por fluorescencia, pueden caracterizarse adicionalmente por la intensidad del anticuerpo (fluorescencia) .

En modalidades particulares, las células similares a Trl que producen IL-13 de la presente invención, son aisladas usando cromatografía inmunomagnética . Por ejemplo, se fija un anticuerpo anti-CD4 a gránulos magnéticos. Estos gránulos magnéticos con etiqueta de anticuerpo son usados como la base para la purificación por afinidad. La fracción de células T etiquetada con anticuerpo es aplicada a la columna de afinidad magnética. Se descartan las células no adherentes y las células adherentes son eluidas de la columna magnética mediante eliminación del campo magnético. En otra modalidad, las células son marcadas primero con un anticuerpo (por ejemplo, anti-CD4) y' luego etiquetadas con un anticuerpo secundario que lleva un gránulo magnético o una esfera magnética .

En otra modalidad, se puede usar un inmunorreactivo de anticuerpo secundario con una célula Trl para enriquecer la población de células similares a Trl que producen IL-13. El uso de un anticuerpo secundario es conocido generalmente en la técnica. Típicamente, los anticuerpos secundarios son anticuerpos inmunorreactivos con las regiones constantes del primer anticuerpo Los anticuerpos secundarios preferidos incluyen inmunoglobulinas anti-conejo, anti-ratón, anti-rata, anti-cabra y anti-caballo, y pueden ser obtenidas comercialmente . Los equipos obtenibles en el comercio proveen anticuerpos secundarios conjugados a agentes etiquetadores , tales como, pero sin limitación a ellos, partículas magnéticas y fluorocromos.

Otro objetivo de la invención es un método para enriquecer una población de células en células similares a Trl que producen IL13, que comprende: - identificar las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o CD62L, y que producen IL-13; - seleccionar dichas células; obteniéndose de esa manera una población de células enriquecida en células similares a Trl que producen IL-13.

Otro objetivo de la invención es un método para enriquecer una población de células en una subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, que comprende: - identificar las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o CD62L y que producen IL-13 e IL-10; - seleccionar dichas células con lo que se obtiene una población de células enriquecida en la subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10.

En otra modalidad de la invención, un método para enriquecer una población en células similares a Trl que producen IL-13 puede comprender: - poner en contacto la población de células con al menos un reactivo que se una a un marcador de células que no sean CD4+, agotando de esa manera las células que no son CD4+; - identificar las células similares a Trl que producen IL-13, como se describió aqui más atrás, y seleccionarlas.

En otra modalidad de la invención, un método para enriquecer una población en la subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, puede comprender: - poner en contacto la población de células con al menos un reactivo que se una a un marcador de las células que no son CD4+, agotando de esa manera las células que no son CD4+; identificar la subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, como se describió aqui con anterioridad, y seleccionarlas.

Los ejemplos de marcadores que se unen a células que no son CD4+ incluyen, pero sin limitación a ellos: CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123 y glicoforina A.

Los reactivos preferidos que se unen a dichos marcadores son anticuerpos. En otra modalidad, los anticuerpos son conjugados a un fluorocromo o a una partícula magnética. En otra modalidad, se lleva a cabo la selección de las células mediante citometría de flujo, clasificación de células activada por fluorescencia, selección magnética, cromatografía por afinidad o lavado en bandeja, o combinaciones de ellas.

Otro objetivo de la invención es una población enriquecida de células similares a Trl que producen IL-13, obtenida de acuerdo con dichos métodos. Es otro objetivo de la invención una población enriquecida de subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, obtenida de acuerdo con dichos métodos.

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la población enriquecida de células similares a Trl que producen IL-13.

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende, que consiste esencialmente de o que consiste de la subpoblación enriquecida de células Trl que producen IL-13 e IL-10.

Cuando se usa aquí, la composición / población enriquecida de células similares a Trl que producen IL-13 es una en la que el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13 es mayor que el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13, presentes en la población de células obtenida originalmente. Si bien es posible, una población enriquecida de células similares a Trl que producen IL-13 no necesita contener una población homogénea de células similares a Trl que produzcan IL-13. En modalidades particulares, por lo menos alrededor del 50 por ciento, alrededor del 55 por ciento, alrededor del 60 por ciento, alrededor del 65 por ciento, alrededor del 70 por ciento, alrededor del 75 por ciento, alrededor del 80 por ciento, alrededor del 85 por ciento, alrededor del 90 por ciento, alrededor del 95 por ciento, alrededor del 98 por ciento o alrededor del 99 por ciento de las células de la composición, son células similares a Trl que producen IL-13. En otras modalidades, el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13, en la composición / población enriquecida es por lo menos el doble, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60, veces, 70, veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13, antes del enriquecimiento.

Cuando se usa aquí, una composición / población enriquecida en células Trl que producen IL-13 e IL10 es una en la que el porcentaje de células Trl que producen IL-13 e IL-10 es mayor que el porcentaje de las células Trl que producen IL-13 e IL-10 de la población de células obtenida originalmente. Si bien es posible, una población enriquecida de células Trl que producen IL-13 e IL-10 no necesariamente contiene una población homogénea de células Trl que producen IL-13 e IL-10. En modalidades particulares, por lo menos alrededor del 50 por ciento, alrededor del 55 por ciento, alrededor del 60 por ciento, alrededor del 65 por ciento, alrededor del 70 por ciento, alrededor del 75 por ciento, alrededor del 80 por ciento, alrededor del 85 por ciento, alrededor del 90 por ciento, alrededor del 95 por ciento, alrededor del 98 por ciento o alrededor del 99 por ciento de las células de la composición son células Trl que producen IL-13 e IL-10. En otras modalidades, el porcentaje de células Trl que producen IL-13 e IL-10 en la composición / población enriquecida, es por lo menos el doble, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, el porcentaje de células Trl que producen IL-13 e IL-10, antes del enriquecimiento.

Se puede usar cualquier fuente de células que contenga células T para aislar / enriquecer las células similares a Trl que producen IL-13, o las células Trl que producen IL-13 e IL-10. Las fuentes útiles incluyen, pero sin limitación a ellas: sangre periférica, fluido sinovial, bazo, timo, nodos linfáticos, médula ósea, parches de Peyer y amígdalas .

Los métodos de enriquecimiento son variables, con base en el nivel de enriquecimiento asociado con cada paso del proceso de enriquecimiento. El nivel de enriquecimiento y el porcentaje de pureza de las células similares a Trl que producen IL-13 o de las células Trl que producen IL-13 e IL-10, dependerá de muchos factores, incluyendo, pero sin limitación a ellos: el donador, la fuente de células / tejido y el estado de enfermedad del donador.

Es otro objetivo de la invención un clon similar a Trl que produce IL-13.

Es otro objetivo de la invención un clon de Trl que produce IL-13 e IL-10.

De acuerdo con la invención, se aislan las células similares a Trl que producen IL-13 de acuerdo con el método descrito más atrás, y luego se clonan las células similares a Trl que producen IL-13 mediante métodos bien conocidos en la técnica .

De acuerdo con la invención, se aislan las células Trl que producen IL-13 e IL-10 de acuerdo con el método descrito más arriba, y a continuación se clonan las células Trl que producen IL-13 e IL10, mediante métodos bien conocidos en la técnica.

En otra modalidad, las personas expertas en la materia pueden aislar las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o CD62L, clonan dichas células y luego aislan los clones que producen IL-13 o IL-10 e IL-13, cuando se activan .

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende, que consiste esencialmente de o que consiste del clon similar a Trl que produce IL-13 o el clon de Trl que produce IL-13 e IL-10.

En una modalidad de la invención el clon similar a Trl que produce IL-13 o el clon de Trl que produce IL-13 e IL-10, produce niveles bajos de IL-4.

En una modalidad de la invención, el clon similar a Trl que produce IL-13 o el clon de Trl que produce IL-13 e IL-10, produce niveles bajos de IL-2.

En una modalidad de la invención, el clon similar a Trl que produce IL-13 o el clon de Trl que produce IL-13 e IL-10 produce niveles intermedios de IFN-?.

En una modalidad de la invención, el clon similar a Trl que produce IL-13 o el clon de Trl que produce IL-13 e IL-10 produce niveles intermedios de TGF-ß.

Las células similares a Trl que producen IL-13 o la subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, aisladas mediante el método de la invención, pueden ser expandidas adicionalmente mediante el método in vitro descrito en WO2006/108882. Dicho método comprende: a) cultivar, a una temperatura TI inferior a 35 °C, en un medio de cultivo Mf, células alimentadoras, tales como células alimentadoras de insecto, permitiendo dicha temperatura TI la proliferación de las células alimentadoras y expresando las células alimentadoras factores que interactúan con las siguientes proteínas de la superficie de las células: - el complejo CD3 / TCR; - la proteína CD28; - el receptor de IL-2; - la proteína CD2; - el receptor de IL-4; b) poner en contacto las células alimentadoras obtenidas en el paso a) , liberadas o no de su medio de cultivo Mf, con la población de células similares a Trl que producen IL-13, o con la subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10, contenidas en el medio de cultivo Mp; donde el medio de cultivo Mp no contiene inicialmente los factores citados en el paso a) , a fin de obtener una mezcla que contenga la población de células Trl, las células alimentadoras y el medio de cultivo Mp; c) cultivar la mezcla obtenida en el paso b) a una temperatura T2 que sea por lo menos 35 °C; seleccionándose dicha temperatura de manera que la población de células Trl prolifere y que las células alimentadoras no proliferen; d) recuperar la población de células Trl asi expandida.

Los ejemplos de factores que interactúan con las proteínas de la superficie de las células, mencionadas arriba, incluyen: - un anticuerpo anti-CD3, de preferencia un anticuerpo anti-CD3 modificado, donde el dominio intracitoplásmico anti-CD3 de la cadena pesada de CD3 es reemplazado con un dominio de transmembrana; - la proteína CD80 o CD86; - la IL-2 secretada por las células alimentadoras; - la proteína CD58; - una interleuquina seleccionada del grupo que comprende IL-4 e IL-13.

El medio Mp está adaptado al cultivo de las células T y puede ser un medio de cultivo libre de suero. Los ejemplos no restrictivos de medio Mp son un medio libre de suero obtenible en el comercio, tal como XVIVO 15 de BioWhittaker, el medio AI V de Invitrogen, DMEM, RPMI ...

El medio Mf está adaptado al cultivo de las células alimentadoras y puede ser un medio de cultivo libre de suero. Los ejemplos no restrictivos de medio Mf son: un medio libre de suero obtenible en el comercio, tal como el medio de Schneider sin suero, de BioWhittaker, el medio de cultivo de células de insecto, libre de suero, MD de Gibco, SFM de Invitrogen o Insectagro de Krackeler Scientific Inc.

En una modalidad de la invención, las células Trl así obtenidas pueden ser clonadas usando métodos convencionales para clonar células T.

En una modalidad de la presente invención las células Trl asi obtenidas, o los clones de las células Trl, pueden ser congelados para ser almacenados.

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende, que consiste esencialmente de o que consiste de la población enriquecida y expandida de células similares a Trl que producen IL-13, o la subpoblación de células Trl que producen IL-13 e IL-10.

Es otro objetivo de la invención un método para agotar una población de células en células similares a Trl que producen IL-13 o en células Trl que producen IL-13 e IL-10, que comprende: - identificar las células que expresen CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o CD62L y que producen IL-13 o IL-10 e IL-13; - agotar dichas células; con lo que se obtiene una población de células empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13 o en células Trl que producen IL-13 e IL-10.

Es otro objetivo de la invención una composición que comprende, que consiste esencialmente de, o que consiste de la población empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, o la población empobrecida en células Trl que producen IL-13 e IL-10.

Una composición / población empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, o una composición / población empobrecida en células Trl que producen IL-13 e IL-10, es una en la que el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13 o de células Trl que producen IL-13 e IL-10, es menor que el porcentaje de las células similares a Trl que producen IL-13 y de las células Trl que producen IL-13 e IL-10, en la población de células obtenida originalmente.

Es otro objetivo de la invención una población de células empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, obtenida de acuerdo con el método que se describió aqui con anterioridad. Es otro objetivo de la invención una población de células empobrecida en células Trl que producen IL-13 e IL-10, obtenida de acuerdo con el método que se describió aqui con anterioridad.

Como se explicó aqui antes, los métodos para aislar células incluyen, pero sin limitación a ellos: separación magnética usando gránulos magnéticos revestidos con anticuerpo; cromatografía por afinidad o "lavado en bandeja", usando anticuerpo fijado a una matriz sólida (por ejemplo, una placa, y clasificadores de células activados por fluorescencia (FACS) . En lugar de seleccionarlas, se empobrecen las células Trl.

En una modalidad, el porcentaje de células similares a Trl que producen IL-13 o de células Trl que producen IL-13 e IL-10, en la composición / población empobrecida, es por lo menos 0.5 veces, 0.4 veces, 0.3 veces, 0.25 veces, 0.2 veces, 0.15 veces, 0.1 veces el porcentaje de células parecidas a Trl que producen IL-13 y de las células Trl que producen IL-13 e IL-10, antes del empobrecimiento.

Es otro objetivo de la invención un equipo para identificar o aislar una población de células similares a Trl que producen IL-13, o para enriquecer o empobrecer una población de células en células similares a Trl que producen IL-13; comprendiendo el equipo reactivos para detectar la expresión de CD4, CD25, CD127 y CD621 en la superficie de las células y medios para detectar la producción de IL-13.

Es otro objetivo de la invención un equipo para identificar o aislar una población de células Trl que producen IL-13 e IL-10, o para enriquecer o empobrecer una población de células en células Trl que producen IL-13 e IL-10; comprendiendo el equipo reactivos para detectar la expresión de CD4, CD25, CD127 y CD62L en la superficie de las células, y medios para detectar la producción de IL-13 e IL-10.

De preferencia, esos reactivos son anticuerpos. Se prefiere más que los anticuerpos sean conjugados a un fluorocromo o a una partícula magnética.

En otra modalidad, el equipo comprende además un reactivo para detectar la expresión de Foxp3. De preferencia, ese reactivo es un anticuerpo. Se prefiere más que el anticuerpo esté conjugado a un fluorocromo.

Es otro objetivo de la presente invención un método para inhibir una respuesta inmune en un sujeto que tiene necesidad de ello, que comprende la administración de una cantidad efectiva de las células similares a Trl que producen IL-13, aisladas o enriquecidas, de acuerdo con la invención, al sujeto.

Es otro objetivo de la presente invención un método para inhibir una respuesta inmune en un sujeto que tenga necesidad de ello, que comprende la administración de una cantidad efectiva de las células Trl que producen IL-13 e IL-10, aisladas o enriquecidas, de acuerdo con la invención, al sujeto .

En una modalidad, el sujeto ha sido sometido o lo está siendo, a trasplante, por ejemplo, trasplante de médula ósea o trasplante de órgano.

En otra modalidad, el sujeto tiene una alergia.

Es otro objetivo de la presente invención un método para prevenir o tratar una condición inflamatoria en un sujeto que tiene necesidad de ello; que comprende la administración de una cantidad efectiva de las células similares a Trl que producen IL-13, aisladas o enriquecidas, o de células Trl que producen IL-13 e IL-10, aisladas o enriquecidas, de acuerdo con la invención, al sujeto.

Es otro objetivo de la presente invención un método para prevenir o tratar una condición autoinmune en un sujeto que tiene necesidad de ello, que comprende la administración de una cantidad efectiva de las células similares a Trl que producen IL-13, aisladas o enriquecidas, o de células Trl que producen IL-13 e IL-10, aisladas o enriquecidas, de acuerdo con la invención, al sujeto.

En una modalidad de la invención se puede obtener la población de células del sujeto al que se introducirá subsecuentemente la composición enriquecida en células similares a Trl que producen IL-13 o la composición enriquecida en células Trl que producen IL-13 e IL-10.

En una modalidad de la invención el sujeto puede ser uno en quien se desea la supresión de una respuesta inmune .

En una modalidad, el sujeto es un humano afectado por una condición inflamatoria o una enfermedad / trastorno, tal como cualquiera de las enfermedades / trastornos, incluyendo, pero sin limitación a ellos: mal de intestino inflamable no autoinmunológico, adherencias post-quirúrgicas , enfermedad de la arteria coronaria, fibrosis hepática, síndrome de dificultad respiratoria aguda, pancreatitis inflamatoria aguda, pancreatitis endoscópica retrógrada , inducida por colangiopancreatografía, quemaduras, aterogénesis de la coronaria, arterias cerebral y periféricas, apendicitis, colecistitis, diverticulitis, trastornos fibróticos viscerales, cicatrización de heridas, trastornos de formación de cicatrices en la piel (queloide, hidradenitis supurante) , trastornos granulomatosos (sarcoidosis, cirrosis biliar primaria) , asma, pyoderma grandrenosum, síndrome de Sweet, mal de Behcet, colangitis esclerosante primaria, y un absceso.

En otra modalidad, el sujeto es un humano afectado por una condición autoinmume o una enfermedad / un trastorno, incluyendo, pero sin limitación a ellos: lupus eritematoso, pénfigo vulgar, tiroiditis, púrpura trombocitopénica, mal de Graves, diabetes melitus, diabetes juvenil, diabetes autoinmune espontánea, miastenia grave, mal de Addison, una condición artrítica, tal como artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil artritis psoriásica, esclerosis múltiple, psoriasis, uveítis, anemia hemolítica autoinmune, escleroderma, una condición inflamatoria intestinal, tal como una enfermedad de intestino inflamable autoinmune, mal de Crohn, colitis, inflamación intestinal ligada a alergia a alimentos, mal de Sjorgen, enfermedad de Hashimoto, miastenia grave, síndromes de poliendocrinopatía autoinmune, diabetes melitus tipo I (TIDM) , gastritis autoinmune, uveoretinitis autoinmune, polimiositis y tiroiditis, asi como en enfermedades autoinmunes generalizadas, tipificadas por lupus humano. "Cuando se usa aquí, "autoantígeno" se refiere a un antigeno o un epítopo que es nativo del mamífero y que es inmunógeno en la enfermedad del mamífero.

También se pueden usar las células de la invención para prevenir o tratar reacciones de trasplante, tales como el mal de injerto que ataque al huésped (GVHD) y los rechazos de injerto.

La introducción de las células similares a Trl que producen IL-13 o de las células Trl que producen IL-13 e IL-10 en pacientes se efectúa usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como la transferencia de células adoptivas. Brevemente, se extrae la población mixta de células de un donador de destino. Dependiendo de la aplicación, se pueden extraer las células durante un periodo de remisión, o durante la enfermedad activa. Típicamente se hace esto recogiendo sangre periférica y cosechando los glóbulos blancos mediante leucoaféresis ( leucoforesis ) . Por ejemplo, se ha demostrado que la leucoaféresis en gran volumen (LVL) eleva al máximo la producción de leucocitos de la sangre. Se pueden separar los linfocitos cosechados usando técnicas de separación de células basadas en marcadores de célula específicos para Trl, tales como los descritos aquí, y luego se os puede transfundir a un paciente, típicamente al donador de las células (excepto en GVHD, donde el donador y el receptor son diferentes) para supresión inmune adoptiva. Se inyectan al paciente aproximadamente 103 o 10u, de preferencia de 104 a 1010, de preferencia de 105 a 109, de preferencia de 106 a 109, más preferible, de 106 a 108 células Trl.

Cuando se usa aquí, el término "cantidad efectiva" significa la cantidad de una sustancia o composición terapéutica que es suficiente para reducir (en cualquier medida) o mejorar la severidad y/o la duración de un trastorno o uno o más de sus síntomas; prevenir el avance de un trastorno, provocar la regresión de un trastorno, prevenir la recurrencia, el desarrollo, el inicio o el avance de uno o más síntomas asociados con el trastorno, detectar un trastorno o incrementar o mejorar el efecto o los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) . La cantidad efectiva variará con la edad, el sexo, la raza, la especie, la condición general, etc., del sujeto; la severidad de la condición que se está tratando, el agente particular administrado, la duración del tratamiento, la naturaleza de cualquier tratamiento concurrente, el portador aceptable para uso farmacéutico usado, y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia de quienes son expertos en la materia. Cuando es apropiado, se puede determinar la "cantidad efectiva" en cualquier caso individual por quien tenga experiencia ordinaria en la materia, mediante referencia a los textos pertinentes y/o usando experimentación rutinaria (por ejemplo, ver Gennaro y coautories, Eds. Remington' s The Science and Practice of Pharmacy, 20a. edición (2000), Lippincott Wiliams y Wilkins, Baltimore MD; Braunwald y coautores, Eds. Harrison' s Principles of Intermal Medicine, 15a. edición (2001), McGraw Hill, NY, E. U. A., Berkow y coautores, Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (1992), Merck Research Laboratories, Rahway, NJ, E. U. A) .

Los términos "prevenir" "previene" y "prevención" se refieren aquí a la inhibición del desarrollo o inicio de un trastorno o a la prevención de la recurrencia, el inicio o el desarrollo de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto, que resultan de la administración de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) , o la administración de una combinación de terapias (por ejemplo, una combinación de agentes profilácticos o terapéuticos) . Mediante "tratamiento" o "tratar" se quiere decir que se obtiene por lo menos una mejora de los síntomas asociados con el trastorno en el huésped; donde se usa mejoría en un sentido amplio para referirse a por lo menos una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, un síntoma, asociado con la condición que se está tratando. 'De esa manera, el tratamiento incluye también situaciones en las que la condición patológica, o por lo menos los síntomas asociados con ella, son inhibidos por completo, por ejemplo, se previene que sucedan o se detienen, por ejemplo, se terminan, de manera que el sujeto ya no sufra de la condición, o por lo menos de los síntomas que caracterizan la condición .

Cuando se usa aquí, el término "sujeto" se refiere a un animal, de preferencia un mamífero y, muy preferible, un humano .

Es otro objetivo de la invención un método para incrementar la respuesta inmunológica de una población de células trasplantada en un sujeto que tiene necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una población de células empobrecida en células similares a Trl que producen IL-13, como se describió aquí más atrás.

Es otro objetivo de la invención un método para incrementar la respuesta inmune de una población de células trasplantadas en un sujeto que tiene necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una población de células empobrecida en células Trl que producen IL-13 e IL-10, como se describió aquí más arriba.

En una modalidad, el método es para tratar un sujeto que está siendo sometido a un tratamiento contra el cáncer .

En una modalidad, la población de células trasplantada es una población de células T efectoras, especifica al antigeno. De preferencia, la población de células T es especifica para un antigeno de tumor, tal como MART-1 (Melan A) de melanoma, o AGE 1, 2, 3 de melanoma, tiroides medular, cáncer de células pequeñas del pulmón, cáncer de colon y/o de célula escamosa bronquial, etc.

En otra modalidad, dicho método es para tratar enfermedades infecciosas, tales como infecciones por VEB, VIH, VHC, VCM.

Se ha demostrado que el empobrecimiento de células T reguladoras acrecienta la inmunidad mediada por vacuna en pacientes con cáncer (Dannull y coautores, 2005, 115(12): 3623-3633) . Asi, en otra modalidad de la invención se sugiere que el empobrecimiento de células similares a Trl que producen IL-13 o de células Trl que producen IL-13 e IL-10, se puede usar en terapia de células para tratar el cáncer o una enfermedad infecciosa, en las que dichas células similares a Trl que producen IL-13 o dichas células Trl que producen IL-13 e IL-10 pueden ser dañinas o perjudiciales para el tratamiento. Por ejemplo, en el tratamiento de cáncer, podría ser interesante un empobrecimiento transitorio de células similares a TI que producen IL-13 o de células Trl que producen IL-13 e IL-10, antes del protocolo de vacunación / inmunoterapia; obteniéndose dicho empobrecimiento transitorio empobreciendo la sangre de un paciente ex vivo a través de un dispositivo de acuerdo con el método de empobrecimiento de la invención y reinyectándola inmediatamente al paciente.

EJEMPLOS PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Aislamiento y producción de sobrenadante de células similares a Trl que producen IL-13.

Para el aislamiento de las células similares a Trl que producen IL-13 se separaron las células de la sangre periférica mediante centrifugación por densidad de Ficoll y se cultivaron a 2 x 106 células por mL, en presencia de un antígeno específico a fin de permitir la proliferación de células similares a Trl específicas para el antígeno. Después de 7 días de cultivo, se clonaron las células mediante el método de dilución limitante durante 3 semanas.

Luego se expandieron los clones en crecimiento usando agentes estimuladores de CD3 ( CD29 y citoquinas (11-2 e IL-4). Se determinó la identidad de los clones de células similares a Trl evaluando el fenotipo mediante citometria de flujo que muestra la ausencia concomitante constitutiva de CD62L y CD127, con expresión de CD25 y Foxp3, sólo en estado activado. La producción del sobrenadante de células similares a Trl se obtuvo estimulando las células con gránulos magnéticos revestidos con anti-CD3 + anti-CD28 (Dynal) durante 2 días en un medio X-vivo a 37 °C + 5 por ciento de C02.

Estudios de citometria de flujo Se usaron los siguientes anticuerpos para los estudios de citometria de flujo en células humanas: anti-CD127 conjugado con PE (clon R34.34 de Beckman Coulter) , anti-CD4 Ab etiquetado con FITC de Becton Dickinson (clon #RP4-T4), anti-CD62L etiquetado con PeCy5 (clon Dreg56 de Becton Dickinson) y anti-CD25 conjugado con aloficocianina (clon M-A251 de Becton Dickinson) . Se llevó a cabo el teñido intracitoplásmico para Foxp3 humano usando anti-Foxp3 Ab conjugado con PE (clon 259 D/C7 de BD) y el equipo de tinción intracitoplásmica (BD) , de acuerdo con el instructivo del fabricante .

Análisis de citoquina Para la determinación del perfil de producción de citoquina (ejemplo de prueba A), se estimularon los clones de células similares a Trl con gránulos revestidos con anti-CD3 + anti-CD28, a concentración de 2 gránulos por célula y se cosecharon los sobrenadantes después de 48 horas. Se llevaron a cabo los ELISA usando equipos obtenibles en el comercio de Diaclone IFN-gamma, IL-10 e IL-4) y de e-Bioscience (IL-13). Se llevaron a cabo los experimentos siguiendo el instructivo del fabricante.

Estudios de supresión Para los estudios de supresión se activaron células mononucleares de sangre periférica durante dos días con anticuerpo monoclonal anti-CD3 soluble (1 microg/mL) en presencia o ausencia de IL-13, lo que produjo un sobrenadante de células similares a Trl, anti-IL13 (clon 31606, sistemas R&D) , o IL-13 humana (6 ng/mL, sistemas R&D). Se midió la proliferación de las células incubadas usando el equipo WST1 de Roche que permite evaluar el número de células viables por concavidad de cultivo.

RESULTADOS Inhibición in vitro de la actividad proliferante de células T por IL-13.

Primeramente, se deseaba demostrar que la IL-13 recombinante era capaz de regular de manera descendente la actividad proliferante de las células T, in vitro. Para este propósito, se añadió IL-13 a un cultivo de PBMC, activadas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 y se midió la proliferación de las células después de 3 días de cultivo (figura 1) . Los resultados demuestran que IL-13 es capaz de inhibir la proliferación de células T in vitro, lo que muestra el potencial inmunosupresor de esta citoquina.

Inhibición in vitro de la actividad proliferante de células T por células similares a Trl que producen IL-13.

Asi, se deseaba saber si las células similares a Trl que producen IL-13 eran capaces de inhibir la actividad de linfocitos T espectadores en la misma clase de regulaciones experimentales que utilizaron IL-13 como citoquina supresora. La figura 2A muestra el patrón de secreción de citoquina de las células reguladoras de IL-13 activadas por anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28, con elevada secreción de IL-13 pero sin secreción de IL-4. La figura 2B muestra que el sobrenadante de células reguladoras activadas, que producen IL-13, es capaz de inhibir la activación de células T espectadoras, en cultivo. Muy importante, esta supresión de la proliferación de células T, mediada por el sobrenadante, fue inhibida usando anticuerpos bloqueadores de IL-13 (figura 2C) , lo que muestra que esta citoquina representa un factor supresor principal soluble, secretado por estas células.

Fenotipo de células reguladoras humanas , productoras de IL-13 Finalmente, se probó la expresión de varios marcadores de células reguladoras mediante células reguladoras de IL-13, y se mostró que las células no expresan CD127, CD62L ni la molécula FoxP3. Además, de los tres marcadores, se regulan de manera ascendente FoxP3 y CD25, después de la activación (figura 3) .

Subpoblacion de células Trl capaces de producir il- 13 e 11-10 La figura 4 muestra quec las células Trl, en las condiciones de la prueba A, se pueden separar en dos poblaciones: una subpoblacion de células Trl capaz de producir IL-10 y no IL-13, mientras que la otra subpoblacion de células Trl es capaz de producir IL-10 e IL-13.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Una población aislada de células Trl humanas, capaz de producir IL-13.

2. - La población aislada de células Trl humanas de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las células producen IL-10.

3. - La población aislada de células Trl humanas de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que las células expresan: - CD4 y - un nivel bajo de CD127, y - un nivel bajo de CD62L.

4. - La población aislada de células Trl humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichas células son especificas de un antigeno; de preferencia ese antigeno es colágeno tipo II, ovoalbúmina, proteina básica de mielina, proteina oligodendrocitica de mielina o HSP.

5. - Un clon de Trl humana aislado, capaz de producir IL-13 e IL-10.

6. - El clon aislado de Trl humana de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el clon expresa: - CD4 y - un nivel bajo de CD127, y - un nivel bajo de CD62L.

7. - El clon aislado de Trl humana de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que el clon es especifico de un antigeno, de preferencia el antigeno es colágeno tipo II, ovoalbúmina, proteina básica de mielina, proteina oligodendrocitica de mielina o HSP.

8. - Un método para identificar una población de células Trl humanas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: - detectar la expresión de CD4 en la superficie de las células, y por lo menos uno de los marcadores CD127 y CD62L en una población de células; - detectar la producción de IL-113 e IL-10; donde las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o un nivel bajo de CD62L y que producen IL-13 e IL-10 son la población de células Trl que producen IL-13.

9. - Un método para enriquecer una población de células en células humana Trl que producen IL-13 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: - identificar las células que expresan CD4 y un nivel bajo de CD127 y/o un nivel bajo de CD62L y que producen IL-13 e IL-10; - seleccionar dichas células; con lo que se obtiene una población de células enriquecida en células Trl humanas que producen IL-13, donde el porcentaje de células Trl humanas que producen IL-13 es por lo menos el doble que el porcentaje de células Trl humanas que producen IL-13, antes del enriquecimiento.

10. - Una población enriquecida de células Trl humanas que producen IL-13, obtenida de acuerdo con la reivindicación 9.

11. - Un equipo para identificar o aislar una población de células Trl humanas que producen IL-13, que comprende medios para detectar la expresión de CD4, CD25, CD127 y CD62L en la superficie de las células, y medios para detectar la producción de IL-13 e IL-10.

12. - La población aislada y/o enriquecida de células Trl humanas que producen IL-13, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 10, o el clon de Trl humano que produce IL-13, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, para prevenir o tratar una respuesta inmune, enfermedad de injerto contra huésped y rechazo de órgano, enfermedad alérgica, una condición inflamatoria o una condición autoinmune.

13. - Un método para empobrecer una población de células en células Trl humanas que producen IL-13 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: - identificar las células Trl humanas que producen IL-13 de acuerdo con la reivindicación 8; - empobrecer dichas células; con lo que se obtiene una población de células empobrecida en células Trl humanas que producen IL-13; donde el porcentaje de células Trl humanas que producen IL-13 es por lo menos 0.5 veces el porcentaje de células Trl humanas que producen IL-13 antes del empobrecimiento.

14. - Una población de células empobrecida en células Trl humanas que producen IL-13, obtenida de acuerdo con la reivindicación 13.

15. - La población de células empobrecida en células Trl humanas que producen IL-13, de acuerdo con la reivindicación 14, para incrementar una respuesta inmune en un sujeto que tiene necesidad de ello. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una población aislada de células similares a Trl, capaz de producir IL-13; teniendo dicha población actividades inmunosupresoras; a métodos para identificar / aislar / enriquecer dicha población, y a sus usos.