CN103054870A - 色胺酮类化合物作为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种8-硝基色胺酮作为吲哚胺2,3－双加氧酶抑制剂的用途。本发明所述的8-硝基色胺酮为IDO的可逆抑制剂，抑制常数Ki为0.054μM，体外和细胞水平半数有效抑制浓度IC₅₀分别为0.103μM和1.80×10^-5μM，抑制效力明显优于现有抑制剂1-甲基色氨酸（Ki34μM，IC₅₀340μM）。本发明公开的8-硝基色胺酮作为IDO抑制剂，可以有效地下调肿瘤动物模型中异常升高的IDO活性；起到治疗肿瘤的作用，包括延缓肿瘤生长、缩小肿瘤体积，以及体外对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明公开的8-硝基色胺酮作为IDO抑制剂，有广阔的应用前景，可以用于具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括癌症、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等重大疾病的治疗。

Description

色胺酮类化合物作为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种色胺酮类化合物作为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的用途。

背景技术

吲哚胺2，3-双加氧酶(Indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)是一种细胞内含有亚铁血红素的酶，是肝脏以外唯一可催化色氨酸代谢使其沿犬尿氨酸途径分解生成包括喹啉酸在内的一系列代谢产物的限速酶(MacKenzie, C. R. et. al. Current Drug Metabolism, 2007, 8: 237-244)。

IDO与很多生理病理过程有关。有关对怀孕小鼠模型的研究发现母胎界面的合胞体滋养层细胞和抗原提呈细胞可以合成IDO，并且IDO表达的动态变化与胚胎形成一致，如果特异性阻断IDO的作用，则可导致小鼠流产，表明IDO可以使胎儿免于母体的排斥，维持母胎界面免疫偏离的形成(David, H. M.; et al. Science, 1998, 281:5380)。该研究结果说明IDO与机体免疫系统的免疫耐受有关，是一种免疫调节酶。IDO与肿瘤细胞逃避机体免疫系统对其监视和杀伤的免疫逃逸现象有关。Uyttenhove等发现多种人实体肿瘤细胞（宫颈癌、胃癌、结肠癌、黑素瘤和胰腺癌等）高表达的IDO使局部T 细胞增殖受抑, 从而介导肿瘤细胞逃避免疫系统的攻击(Uyttenhov, C, et al. Nat Med,  2003, 9: 1269-1274)。IDO参与调节T细胞的反应。T细胞对色氨酸耗竭特别敏感，当色氨酸浓度较低时，T细胞增殖就会静止在G1期，IDO通过降解色氨酸，可切断T细胞的活化。基于这种机制，IDO保护胎儿免受母体排斥，也介导了肿瘤免疫逃逸。

色氨酸代谢的犬尿氨酸途径异常, 通常伴随着IDO活性的提高和喹啉酸水平的上调，与神经系统炎症和神经退行性紊乱密切相关(Heyes, M. P., et al., Brain, 1992, 115: 1249-1273)。直接和间接地证据都表明IDO和犬尿氨酸途径在阿尔茨海默病(AD)的发病机制中发挥重要作用(Guillemin, G.J. et al.. Redox Rep 2002, 7, 199–20 ; Stone, T.W., et al., J. Alzheimers Dis. 2001, 3: 355–66)。AD患者血液中的色氨酸浓度与其认知缺陷的程度成负相关(Widner B, et al., Adv Exp Med Biol 1999, 467: 133–8)，血清中犬尿氨酸浓度高于正常人，而且升高的程度与认知缺陷的水平密切相关(Baran H, et al., J. Neural Transm 1999, 106:165–81; Widner B, et al., J Neural Transm  2000, 107: 343–53)。AD患者大脑中IDO含量比正常人丰富：IDO和喹啉酸在AD患者海马体皮质层的小胶质细胞、星形细胞及神经元细胞中均有表达，在老年斑周围的小胶质细胞、星形细胞中含量最高(Guillemin, G. J. Et al., Neuropathology and Applied Neurobiology 2005, 31: 395–404)。β淀粉样多肽Aβ(1-42)能够激活原代培养的人小胶质细胞，诱导IDO的表达(Guillemin G. J., et al., Neuro Report 2003, 14: 2311-2315; Walker D. G.,et al., J. Leukoc. Biol. 2006, 79: 596-610)。

干扰素γ可诱导IDO的表达，在高水平干扰素γ刺激的持续活化期间，IDO降低了游离血清色氨酸的利用度。因而，也降低了5-羟色胺的产生。与诸如喹啉酸的具有神经活性的犬尿氨酸代谢物的蓄积相结合的这些变化有助于神经病学、精神病学病症的发生，而且是多种心境障碍的因素，也是具有IDO活化和色氨酸降解特征的一些慢性病相关症状的因素，所述慢性病例如AD、多种类型抑郁症、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、和癌症(Schroecksnadel K., et al., Clin Exp Immunol. 2005, 140(1): 41–45)。

IDO活性还涉及与年龄相关的核性白内障的发生。IDO是晶状体中紫外线滤器生物合成中的第一个酶，并且是限速酶。来自色氨酸降解的紫外线滤器化合物（犬尿氨酸和3-羟基犬尿氨酸葡萄苷）修饰存在于人晶状体中的蛋白质。这些紫外线滤器化合物的量随年龄而增加，并且这些紫外线滤器化合物会导致与年龄相关的核性白内障的晶状体逐渐浑浊(Takikawa O, et al., Exp Eye Res. 2001, 72(3): 271-7)。

IDO抑制剂可以治疗肿瘤。已有研究表明目前公认的IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)在体外能增强肿瘤细胞对T细胞的免疫刺激的敏感性，在体内的动物模型中能延缓肿瘤细胞的生长并增强化疗药物的抗肿瘤效果，而且几乎对所有的自发性肿瘤都起作用(Friberg M, et al. Int J Cancer, 2002, 101: 151-155)。IDO抑制剂可以治疗心境障碍以及其他具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括：AIDS、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病)、抑郁症、白内障、与年龄相关的黄化以及自身免疫性疾病。

IDO与多种疾病发病机制密切相关, 已被证实是癌症、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等重大疾病的靶标，IDO抑制剂作为药物具有广阔的应用前景，但是迄今未有合适的IDO抑制剂可作为药物上市，因此寻找新型高效的IDO抑制剂具有重要的理论意义和应用价值。IDO抑制剂药物研究从2000年左右进入高速发展阶段，目前已经有D-1-MT和INCB023843两个化合物进入临床二期试验。

色胺酮为吲哚喹唑啉类生物碱, 其化学名称为吲哚[2,1-b] 喹唑啉-6, l2-二酮。色胺酮是一种黄色的针状结晶, 主要存在于马蓝、蓼蓝、菘蓝等产蓝植物中(Honda G, et al. Planta Medica, 1980, 38(3): 275-276)，另外，也可以从微生物的发酵液中提取(Hosoe T, et a1. Mycopathologia, 1999, 144(1): 9-12)。近年来，国内、外学者对色胺酮的药理进行了部分研究，其作用主要表现在抗菌、抗炎、抗肿瘤及抗寄生虫 (Oberthur C, et al. Fitoterapia, 2005, 76(3-4): 324-332; Motoki T, et a1. Biol Pharm Bull, 2005, 28(2): 260-266)等方面。色胺酮是一种非常难得的药用资源，具有很好的研究与开发新药的潜力。虽然从蓼蓝、马蓝、菘蓝等产蓝植物及微生物的代谢产物中可以提取色胺酮，但分离过程长、提取率低，难以满足研究和临床用药的需求。只有通过探索耗时短、收率高、简便易得的人工合成途径才能提供更多的色胺酮资源，使其进一步的开发和应用成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种8-硝基色胺酮作为吲哚胺2, 3－双加氧酶(IDO)抑制剂的用途。

本发明提出的8-硝基色胺酮作为吲哚胺2, 3－双加氧酶(IDO)抑制剂的用途，所述8-硝基色胺酮具体结构为：

本发明提出的8-硝基色胺酮的合成可以色胺酮为原料，经硝化而得到，其反应路线如下：

本发明所述8-硝基色胺酮作为IDO抑制剂能够使肿瘤动物模型中异常升高的IDO活性有效下调。

本发明所述8-硝基色胺酮作为IDO抑制剂在治疗肿瘤中的应用，包括对肿瘤细胞的杀伤作用，对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的延缓作用。

本发明中，8-硝基色胺酮在制备预防和/或治疗具有吲哚胺2,3－双加氧酶介导的色氨酸代谢紊乱的病理学特征的疾病的药物中的应用。

本发明中，所述具有吲哚胺2,3－双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括但不限于癌症、阿尔茨海默病、抑郁症。

本发明所述的8-硝基色胺酮为IDO的可逆抑制剂，抑制常数Ki为0.054 μM，体外和细胞水平半数有效抑制浓度IC₅₀分别为0.103 μM和1.80×10^-5 μM，抑制效力明显优于现有抑制剂1-甲基色氨酸（Ki为34 μM，体外半数有效抑制浓度IC₅₀为380 μM）。本发明所述8-硝基色胺酮可以作为高活性的新型IDO抑制剂，用于具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括癌症、阿尔茨海默病和抑郁症等重大疾病的治疗，其作为难得的药用资源，具有很好的研究与开发新药的潜力。

具体实施方式

下述通过实施例进一步说明本发明，但并不限制本发明要求保护的范围。

实施例1：8-硝基色胺酮的制备

在反应瓶中先加入1ml浓硫酸，冰浴冷却下，分批加入色胺酮（248mg，1mmol），然后滴加（0.15ml）浓硝酸，反应1h。反应结束后，倒入冰水中，抽干得黄绿色8-硝基色胺酮固体。产率90%。表征数据如下：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ= 8.86(d, 1H), 8.75(d, 1H), 8.69(m, 1H), 8.49(m, 1H), 8.09(d, 1H), 7.95(m, 1H), 7.76(d, 1H)。

实施例2：IDO抑制活性初步检测

含人IDO基因的质粒的构建、在大肠杆菌中的表达、提取及纯化等均按Littlejohn等报道方法进行(Protein Exp Purif, 2000. 19(1): 22-9)。化合物对IDO的抑制活性按照介绍的方法检测。将50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，底物L-色氨酸和待测样品混合，混合液37 ℃保温5分钟，再向上述混合液内加入IDO 酶，反应在37 ℃下进行30 分钟，加入30%（w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65 ℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm离心10分钟，取上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在490 nm观测。

测试结果表明：8-硝基色胺酮对IDO的抑制效力优于目前国际上体内外实验通用的IDO抑制剂1-MT (1-甲基色氨酸，市售)。

实施例3：是否为可逆抑制的判定

在固定抑制剂浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂反应并测定反应速度。以反应速度对酶浓度(ν～[E])作图，根据曲线的特征可以判定是否是可逆抑制剂。

反应条件：在500 μl的反应体系中，先加入50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，300 mM底物L-色氨酸或同时加入100 mM抑制剂（8-硝基色胺酮），混合液37 ℃保温5分钟，再向上述混合液内分别加入不同体积的IDO酶（对于8-硝基色胺酮，加入酶的体积分别为0.5、1、2、3、4、5、6、7 μl），反应在37 ℃下进行30分钟，加入30%（w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65 ℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm离心10分钟，取上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪检测490 nm波长读数。

测试结果表明：8-硝基色胺酮是IDO的可逆抑制剂。

实施例4：8-硝基色胺酮抑制剂类型判断及Ki值测定

在500 μl的反应体系中，先加入50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，分别加入150、200、300 mM底物L-色氨酸，在一个底物浓度下，加入不同浓度的8-硝基色胺酮（2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM）混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入10 μl IDO (约20 nM)，反应在37 ℃下进行30分钟，加入30% （w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65 ℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm离心10分钟，取上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪检测490 nm波长读数。以Dixon作图法（1/v~[I]）判定8-硝基色胺酮的抑制剂类型，以S/v~[I]作图，可以得到抑制剂的Ki值。

测试结果表明：8-硝基色胺酮为IDO的反竞争性抑制剂，Ki 值为0.054 μM。1-MT的Ki 值为34 μM。

实施例5：体外半数有效抑制浓度IC₅₀测定

将50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5），40 mM维生素C，400 μg/ml 过氧化氢酶，20 μM亚甲基蓝，底物L-色氨酸150 mM和抑制剂混合。抑制剂浓度选用2 μM，4 μM，8 μM，10 μM，12 μM，14 μM，16 μM混合液37 ℃保温5分钟，再向上述混合液内加入IDO酶。反应在37 ℃下进行30分钟，加入30%（w/v）三氯乙酸200 μl使反应终止，反应体系在65 ℃加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm旋转10分钟，取200 μl上清与等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在490 nm观测，所得结果利用IC₅₀计算器计算。

测试结果表明：8-硝基色胺酮体外IC₅₀为0.103 μM。1-MT的IC₅₀值为380 μM。

实施例6：细胞水平半数有效抑制浓度IC₅₀测定

利用脂质体Lipofectamin2000介导质粒pcDNA3.1-hIDO瞬转HEK 293细胞。细胞水平抑制剂活性测定采用的HEK 293细胞培养基为高糖DMEM，含50 U/mL青霉素，50 U/mL 链霉素，10% FBS，37 ℃，5% CO₂培养。细胞转染质粒24 h后，加入待测化合物，孵育一段时间后，取上清到另一96孔板中，加入10 μL 30%（w/v）三氯乙酸，在65 ℃加热15 min使之完成甲酰犬尿氨酸向犬尿氨酸的转化，然后12000 rpm离心10 min，取等体积2%（w/v）对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合显色，最后采用酶标仪在490 nm下检测吸光值。

测试结果表明：8-硝基色胺酮细胞水平IC₅₀为1.80×10^-5μM。

实施例7：抗小鼠肺癌作用研究

7.1. 方法

7.1.1. 细胞系

小鼠路易斯肺癌细胞Lewis lung carcinoma (LLC) cells购自American Type Culture Collection。

7.1.2. 实验动物

八周龄C57BL/6 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2007-0005。

7.1.3. 荷瘤小鼠模型建立、分组及给药

LLC 细胞被注射于小鼠前肢腋下，每只注射2×10⁶。肿瘤直径达到5mm时开始给药，本实验细胞共分4组，每组10只，均为雌性。分别口服给予羧甲基纤维素钠(0.5% CMC)、200 mg/Kg IDO抑制剂（1-MT，8-硝基色胺酮），100 mg/Kg静脉注射环磷酰胺（CTX）每周一次。给药持续14天。

7.1.4 给药试验对于肿瘤小鼠体内IDO活性的影响

IDO的活性可以用犬尿氨酸/色氨酸（KYN/TRP）来反映，我们用高效液相色谱法检测实验小鼠血清中的KYN与TRP含量，得到各组小鼠血清中IDO活性数据，并进行比较。

给药结束后，取各组小鼠的血清，4℃过夜，3000 rpm离心15 min后取上清，与5%的高氯酸等体积混合后静置10 min，12000 rpm离心10 min，将上清用0.45 μm滤头过滤，4 ℃保存。流动相为15 mM乙酸-乙酸钠和8%的乙腈，检测波长为225 nm，色谱柱为C18柱。

7.2. 结果

7.2.1肿瘤体积计算公式：（宽度²×长度）/2

组别	n	肿瘤体积 mm3	肿瘤重量 g
				空白对照组	10	3377.05	4.54
1-MT组	10	2163.73	2.96
				8-硝基色胺酮组	10	1288.42	1.40
CTX组	10	261.08	0.27

IDO抑制剂可以有效缩小肿瘤体积，减少肿瘤重量，8-硝基色胺酮的抗肿瘤效果优于1-MT。

7.2.2高效液相色谱检测结果：

空白对照小鼠血液内IDO活性高于其余三组小鼠（CTX组、8-硝基色胺酮组与1-MT组），而IDO抑制剂能够显著降低血清中IDO的活性，8-硝基色胺酮的作用效果强于1-MT。

实施例8：肿瘤杀伤作用研究

8.1. 方法：

8.1.1 细胞系及试剂

人肺癌细胞株A549购自American Type Culture Collection。

3-[4,5- dimethylthiazol- 2-yl]-2,5-diphenylte-trazolium bromide (MTT)购自sigma。

8.1. 2. MTT实验

A549 细胞经PBS洗涤种于96孔板(5 × 10⁴/well in 200 μl). 加入不同浓度IDO抑制剂（8-硝基色胺酮，1-MT）在37 ℃ and 5% CO₂培养箱内孵育24小时后加入MTT溶液，继续孵育4 h, 然后倒掉 MTT溶液; 加入150 μl DMSO后于37 °C for 振摇10 min。最后, 每孔的密度使用SPECTRAmax 250 酶标仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)于570 nm 检测. 细胞活力按下式计算：(1 – 实验组平均吸光值/空白组平均吸光值) ×100%.

8.2. 结果

8-硝基色胺酮对A549细胞有强力杀伤作用，在80 μM 的浓度下A549细胞活力下降82%，而1-MT对A549几乎没有杀伤效力。

Claims (6)

1.一种色胺酮类化合物作为吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂的用途，其特征在于所述色胺酮类化合物为8-硝基色胺酮。

2.一种如权利要求1所述的用途，其特征在于所述8-硝基色胺酮具有如下结构式：

   。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述8-硝基色胺酮作为IDO抑制剂在治疗肿瘤中的应用。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于述8-硝基色胺酮作为IDO抑制剂使肿瘤动物模型中异常高的IDO活性有效下调。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述8-硝基色胺酮在制备预防和/或治疗具有吲哚胺2, 3－双加氧酶介导的色氨酸代谢紊乱的病理学特征的疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述具有吲哚胺2, 3－双加氧酶介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病，包括但不限于癌症、阿尔茨海默病、抑郁症。