RU2670001C1 - Способ получения белков клеточной поверхности - Google Patents
Способ получения белков клеточной поверхности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2670001C1 RU2670001C1 RU2017145454A RU2017145454A RU2670001C1 RU 2670001 C1 RU2670001 C1 RU 2670001C1 RU 2017145454 A RU2017145454 A RU 2017145454A RU 2017145454 A RU2017145454 A RU 2017145454A RU 2670001 C1 RU2670001 C1 RU 2670001C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- cells
- surface proteins
- gram
- negative bacteria
- Prior art date
Links
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 14
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 7
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000420792 Azospirillum brasilense Sp245 Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 241000589938 Azospirillum brasilense Species 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n,n-dimethylglycinate Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropane-1,3-dithiol Chemical group SCC(N)CS DJQYYYCQOZMCRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 2
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 2
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229940079862 sodium lauryl sarcosinate Drugs 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 101001003004 Anas platyrhynchos Ferritin heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001420 bacteriolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N cetyltrimethylammonium ion Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 208000030499 combat disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- XMCTYDOFFXSNQJ-UHFFFAOYSA-N hexadecyl(methyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[NH2+]C XMCTYDOFFXSNQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- -1 lipofectamine Chemical compound 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000002306 tributylsilyl group Chemical group C(CCC)[Si](CCCC)(CCCC)* 0.000 description 1
- GLFDLEXFOHUASB-UHFFFAOYSA-N trimethyl(tetradecyl)azanium Chemical class CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C GLFDLEXFOHUASB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения поверхностных белков грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений. Способ включает предварительную промывку клеток TBS или PBS буфером, обработку 0,1-0,2%-ным раствором дезоксихолата натрия в течение 5-10 минут, фильтрацию, преципитацию экстрагированных поверхностных белков раствором трихлоруксусной кислоты с последующим осаждением, промывку преципитата ацетоном, инкубирование 60-300 мин при -18°С, осаждение поверхностных белков. Изобретение обеспечивает повышение выхода целевого продукта. 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к биохимии растений и микроорганизмов и может быть использовано в технологии выделения (получения) и исследования белков, расположенных на поверхности клеток.
Макромолекулы, локализованные частично или полностью на внешней стороне клеточной стенки, контактирующей с окружающей средой, выполняют разнообразные функции. В частности, они обеспечивают межклеточные взаимодействия между микроорганизмами, а также между бактериями и тканями высших организмов. От присутствия бактериальных поверхностно-ассоциированных белков, в частности, зависят гидрофобность клеточной поверхности, ее заряд и первичная адгезия бактерий. Когда бактерии прикрепляются к так называемой «кондиционной пленке», которая представляет собой слой адсорбированных на поверхности молекул, этот процесс определяется специфическими взаимодействиями компонентов микробной поверхности (адгезинов) с комплементарными им адгезивными молекулами матрикса. Белковые структуры на поверхности клеток обеспечивают транспорт веществ в клетку, выполняют рецепторную функцию, включая рецепторы для фагов и колицинов. У архебактерий и большинства эубактерий на поверхности клеток формируются так называемые S-слои (от surface -поверхность), представляющие собой регулярное псевдокристаллическое окружение клетки. Часто они представлены определенным образом ориентированными белками и гликопротеинами, причем специализация этих белков до конца не исследована. Предполагают, что они обеспечивают регуляцию процесса адгезии клеток к поверхностям, обеспечивают устойчивость клеток к протеолитическим ферментам, несут сайты адгезии для собственных ферментов, служат протективными антигенами, защищают клетки от фагоцитоза, а отдельные домены служат рецепторами или посредниками в связывании с лейкоцитами, что подтверждает их роль в патогенезе заболеваний.
В связи с этим исследование белков поверхности клеток представляет актуальную на сегодняшний день проблему протеомики и биохимии в целом. Следует отметить, что при исследовании протеома особые требования предъявляются к такому этапу пробоподготовки, как количественная экстракция белков. В идеальном варианте должно быть обеспечено максимальное извлечение всех белков, расположенных на поверхности клетки, поскольку оптимальная пробоподготовка позволит не только получить наиболее полное представление о качественном составе протеома поверхности, но и оценить количественные изменения содержания белков.
Белки клеточной стенки (БКС) растений в значительной степени отличаются по степени взаимодействия с поверхностью клетки. Лежащие на поверхности и практически несвязанные (слабосвязанные) белки легко переходят в экстраклеточный раствор, они выявляются в жидких питательных средах при культивировании клеточных суспензий или растительных проростков. Для их обозначения часто используют термин «лабильные белки». Большинство из них являются кислыми белками с pi от 2 до 6. Их легко экстрагировать буферами с низкой ионной силой или такими недеструктивными методами, как вакуумная фильтрация (Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics / G. Boudart [et al.] // Proteomics. 2005. V.5. P. 212-221.). Другая часть БКС может быть прикреплена к матриксу слабыми взаимодействиями, например Ван-дер-Ваальсовыми, водородными, гидрофобными или ионными силами. Такие белки, как правило, имеют основные величины pI от 8 до 11, они экстрагируются солевыми растворами или хелатирующими агентами. Наконец, часть БКС прочно связана с компонентами клеточной стенки, например, ковалентными связями, как экстенсины или гидроксипролин-богатые белки. На данный момент не разработано единого подхода к экстракции таких белков. Например, сравнение нескольких методов экстракции поверхностных белков из корней проростков ячменя показало, что использование таких экстрагентов, как 2%-ный раствор SDS в сочетании с Nonidet Р40, мочевина и Nonidet Р40, а также 4%-ный раствор SDS с последующей преципитацией ацетоном не позволяют получить максимального извлечения всех фракций и их качественного разделения при проведении двумерного электрофореза. Наилучший результат (70 - 80%) был получен после проведения фенольной экстракции с последующей преципитацией белков 5 объемами 0,1М раствора ацетата аммония в метаноле (Hurkman W.J., Tanaka С.К. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis / W.J. Hurkman, C.K. Tanaka // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 802-806.).
Исследование белков, экспонированных на поверхности клетки, имеет большое практическое значение, поскольку они зачастую являются мишенью для лекарственных средств. Кроме того, показано, что они обладают высоким вакцинным потенциалом и могут быть использованы в диагностических целях.
Поскольку вакцинация является одним из самых эффективных и действенных способов борьбы с заболеваниями, актуальным остается вопрос получения и/или разработки новых вакцин. Как правило, это напрямую связано с выделением, очисткой и идентификацией поверхностных антигенов возбудителей болезней.
Известен способ получения поверхностного оболочечного белка вируса гепатита С (Выделенный оболочечный белок HCV, способ его получения и лекарство, вакцина, фармацевтическая композиция (варианты), его содержащие / Депла Э. [и др.]. / Патент RU 2274643 С2 от 24.04.2002.). По описанному способу выделенный оболочечный белок HCV или его часть является продуктом экспрессии в эукариотических (дрожжевых) клетках. Для этого в многостадийной процедуре конструировали челночный вектор, содержащий открытую рамку считывания, которая кодирует оболочечный белок HCV или его часть.
Экспрессию специфических белков анализировали с помощью комбинации электрофореза в Na-ДДС ПААГ и вестерн-блоттинга. Выделение белков включает в себя лизис дрожжевых клеток агентом, вызывающим диссоциацию комплексов, химическую модификацию цистеиновых тиольных групп (обратимую и необратимую) и последующую аффинную хроматографию с использованием гепарина. Примерами «агентов, вызывающих диссоциацию комплексов» являются гуанидин хлорид и мочевина. Клеточные осадки ресуспензировали в 30 мМ фосфата, 6 М GuHCl, рН 7,2 (9 мл буфера/г клеток). Белок сульфонировали в течение ночи при комнатной температуре (КТ) в присутствии 320 мМ (4% масс/об.) сульфита натрия и 65 мМ (2% масс/об.) тетратионата натрия. Осветляли лизат после цикла замораживания-оттаивания центрифугированием (10000 g, 30 мин, 4°С). Добавляли Empigen ВВ (Albright & Wilson) и имидазол до конечной концентрации 1% (масс/об.) и 20 мМ, соответственно. Поскольку HCV E2s (аминокислоты 383-673) экспрессировался как белок с гистидиновой меткой, его быструю и эффективную очистку осуществляли аффинной хроматографией на установке Akta FPLC (быстрая жидкостная хроматография белков) (Pharmacia). Образец фильтровали через мембрану (ацетат целлюлозы) с порами размером 0,22 мкм и наносили на Ni-IDA-колонку (хелатирующая Sepharose FF, нагруженная Ni2+, Pharmacia), которую уравновешивали 50 мМ фосфата, 6М GuHCl, 1% Empigen ВВ, рН 7,2 (буфер А), обогащенным 20 мМ имидазола. Колонку промывали последовательно буфером А, содержащим 20 мМ и 50 мМ имидазола, соответственно, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не достигало базового уровня. Элюировали продукты с гистидиновой меткой нанесением буфера D, 50 мМ фосфата, 6 М GuHCl, 0,2% Empigen ВВ (рН 7,2), 200 мМ имидазола. Очищенный материал анализировали Na-ДДС-ПААГ-электрофорезоми и вестерн-блоттингом с использованием специфического моноклонального антитела против Е2 (IGH212).
Описанный выше способ позволяет получить очищенный препарат белка, однако он осложняется необходимостью использования специализированного оборудования. Следует также отметить, что агенты, используемые для диссоциации комплексов, представляют собой хаотропы, которые в концентрированных растворах могут денатурировать белки. Кроме того, предполагаемая на этом этапе химическая модификация тиольных групп цистеина также может быть необратимой, что приведет к потере нативных свойств белка.
Описан способ получения вакцины на основе поверхностного антигена вируса гриппа (Influenza vaccine / G.J.M. Van Scharrenburg, R. Brands / U.S. patent 5,948,410; Date of Patent: Sep. 7, 1999.). Согласно предложенному методу для культивирования вируса гриппа используют культуру клеток животных (фибробласты эмбрионов цыпленка (CEF), клетки Мадин - Дарби почек собаки (MDCK), клетки яичников китайского хомячка (СНО) и клетки Веро). Непосредственно в ферментере проводят обработку ферментам, расщепляющими ДНК (ДНКазами и нуклеазами). Затем проводят обработку катионными детергентами из группы солей цетилтриметиламмония, такими как цетилтриметиламмония бромид (С.Т.А.В., ЦТАБ), солей миристилтриметиламмония. Кроме того могут быть использования липофектин, липофектамин и DOTMA. Кроме того может быть использован неионный детергент Tween. Выделение поверхностных катионных белков после стадии обработки детергентами может включать в себя две стадии: во-первых, отделение РНП-частицы (тела вируса) от поверхностных антигенных белков, например, центрифугированием или ультрафильтрацией, и, во-вторых, удаление детергента из поверхностных антигенных белков, например, с использованием смол (таких как Amberlite XAD-4) и/или ультра(диа)фильтрацией. При выделении вируса жидкость фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,5 мкм для удаления дебриса, затем проводят концентрирование и очищают ультрафильтрацией с применением мембраны, отсекающей молекулярные массы 300000. Затем к концентрату добавляют сахарозу до конечной концентрации 30% (м/об), формальдегид до конечной концентрации 0,015% (м/об) и перемешивают при 2-8°С в течение 72 ч. Затем вирусный концентрат разбавляют в 5 раз забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) и наносят на аффинную колонку, содержащую Amicon Cellufine Sulphate. Колонку промывают ЗФР, вирус элюируют раствором 1,5 М хлорида натрия в ЗФР. Элюат концентрируют и обессоливают ультрафильтрацией с использованием мембраны с отсечением молекулярной массы 300000. Для выделения поверхностных белковых антигенов добавляют неионный детергент Твин-80 до конечной концентрации 300 мкг/мл и бромид цетилметиламмония до конечной концентрации 750 мкг/мл. Эту смесь перемешивают при 4°С в течение 3 ч, после чего РНП-частицы отделяют от поверхностных антигенных белков центрифугированием. Супернатант перемешивают с Amberlite XAD-4 в течение ночи при 2-8°С для удаления детергентов. Амберлит удаляют фильтрованием и затем фильтрат подвергают стерильному фильтрованию через фильтр 0,22 мкм.
Особенностью данного способа является использование для получения поверхностных белковых антигенов вирусных частиц, которые характеризуются своеобразным строением, не схожим со строением бактериальных клеток. В этом случае задача сводится к диссоциации комплекса РНП и белкового капсида. В то же время клетки бактерий отличаются более сложной организацией и белки в них соединены с компонентами клеточной стенки с помощью взаимодействий различного типа.
Описан способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В (Лебедин Ю.С., Тимофеева Т.В., Сучков А.В. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей Hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита В / Патент RU 2205023 от 01.10.2010.). Источником получения в данном случае служат рекомбинантные клетки дрожжей Hansenula polymorpha (штамм DL-U/pH-HBs), которые способны экспрессировать поверхностный антиген вируса гепатита В (HBs-антиген). Способ включает этап разрушения дрожжевых клеток. Для этого 20 г полученной в стадии 1 дрожжевой клеточной массы смешивают с 250 мл буфера для разрушения (0,1 М натрия фосфат, рН 7,4; 4 М мочевина; 0,2 М хлорид натрия; 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота). Смесь охлаждают до температуры +2°С на ледяной бане и подают при постоянном перемешивании со скоростью 10-15 мл/мин в гомогенизатор APV Gaulin. Камеру гомогенизатора постоянно охлаждают подачей водно-метанольной смеси с температурой - 10°С. Затем осуществляется экстракция и солюбилизация HBs антигена. На этом этапе клеточный гомогенат промывают дистиллированной водой с помощью двукратного центрифугирования. К полученному промытому осадку добавляют 0,2% (вес/объем) дезоксихолата натрия; смесь перемешивают на льду в течение 1 часа. Затем смесь центрифугируют 45 минут при 10000 g и температуре 4°С для удаления клеточных остатков. Затем для очистки целевого продукта проводят гидрофобную хроматографию в буфере, содержащем 8-14% этанола, отмывку проводят тем же буфером при температуре 30°С, элюцию проводят тем же буфером при температуре 40-42°С. Элюат подвергают ультрацентрифугированию в градиенте плотности бромида калия, после чего проводят гель-фильтрацию на кополимерном носителе. Следует отметить, что в данном способе при проведении этапа разрушения дрожжевых клеток авторы получают смесь белков, в состав которой входят не только поверхностные белки, но также и цитоплазматические и мембранные белки.
Известен способ получения белков клеточной поверхности золотистого стафилококка, обладающих способностью связывать фибронектин и фибриноген (Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability / M. Hook, K.M. Lindberg, T.M. Wadstriim / U.S. patent 5,980,908; Date of Patent: Nov. 9, 1999.). Штамм Staphylococcus aureus, обладающий необходимыми свойствами, культивировали на жидкой питательной среде TS-broth в присутствии триптиказо-соевого экстракта (Oxoid, Ltd., England). После окончания роста бактерии выделяли центрифугированием и отмывали физиологическим раствором (0,9% NaCl). Затем бактерии разрушали добавлением бактериолитического фермента LysostaphinR (Sigma) в количестве 5 мг/л культуральной среды. Из полученной смеси выделяли белки, обладающие способностью связывать, к примеру, фибронектин, при помощи аффинной хроматографии на декстрановых гелях (бромцианактивированной сефарозе CL-4B) с иммобилизованным лигандом. Элюцию осуществляли с использованием хаотропных агентов, таких как NaSCN, KSCN и/или используя кислые растворы, например, раствор уксусной кислоты с рН<3.
Недостатком данного способа является использование фермента лизостафина, который является глицил-глициновой эндопептидазой. Поскольку именно для стафилококков характерно высокое содержание пентаглициновых мостиков, данный фермент проявляет специфичность по отношению к представителям этого семейства. В связи с этим его применение для воздействия на клеточную стенку других микроорганизмов будет менее эффективным. Кроме того следует отметить, что по данным производителя, этот фермент обладает также гексозаминидазной активностью. Это может приводить к более глубокому и непредсказуемому разрушению клеточной стенки, сопровождающемуся выходом не только поверхностных белков.
V.J. Benedi и L. Martinez-Martinez предложен способ выделения белков поверхностной мембраны штаммов Klebsiella pneumoniae (Benedi V.J., Martinez-Martinez L. Outer Membrane Profiles of Clonally Related Klebsiella pneumoniae I V.J. Benedi, L. Martinez-Martinez//Methods in Molecular Medicine, vol. 48: Antibiotic Resistance Methods and Protocols. Edited by: S. H. Gillespie Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001. P. 189-197.). Ночную культуру бактерий, выращенных на питательной среде, стимулирующей сверхэкспрессию некоторых белков поверхностной мембраны, подвергали центрифугированию при 10000g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 20 мл холодного Трис - Mg-буфера и повторно центрифугировали при тех же условиях. Эту манипуляцию повторяли, после чего клеточный осадок вновь ресуспендировали в 20 мл охлажденного Трис - Mg-буфера. Разрушение клеток проводили с помощью пресса Френча при 4°С. В качестве альтернативы можно использовать обработку ультразвуком (15 циклов по 30 с каждый; каждый цикл включал шестикратную обработку ультразвуком с амплитудой 18-20 мкм по 5 с с перерывом в 1 с; перерывы между циклами составляли 30 с). Для удаления неразрушенных клеток проводили центрифугирование при 3000g в течение 10 мин. Супернатант аккуратно переносили в чистые центрифужные пробирки и отделяли ультрацентрифугированием при 100 000g в течение 1 ч с охлаждением до 4°С. Полученные осадки ресуспендировали в 10 мл 2%-ного раствора лаурилсаркозината натрия (sodium lauryl sarcosinate) в Трис - Mg-буфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Затем наружные мембраны осаждали в течение 1 ч при 70000g. Супернатант, содержащий цитоплазматические мембраны, отбрасывали, а осадок перерастворяли в буфере того же состава и повторно центрифугировали. После завершения надосадочную жидкость окончательно удаляли и осадок ресуспендировали в 0,1-0,2 мл дистиллированной воды.
Однако, как отмечают сами авторы, согласно этому способу происходит выделение не только белков наружной мембраны, но также и поринов, которые, строго говоря, являются уже белками, интегрированными в цитоплазматическую мембрану. При этом отделить порины удается, только используя модификации электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.
Следует отметить, что использование всех описанных способов разработано для осаждения белков из растворов, а не с поверхности клеток. Кроме того они не позволяют количественно преципитировать белки и имеют значительные ограничения по применению в разбавленных растворах.
Задачей данного изобретения является получение способа, позволяющего обеспечить наиболее полное и количественное выделения белков поверхности целых клеток путем их смыва, минуя этап получения отдельных мембранных фракций и/или солюбилизации мембран.
Технический результат заключается в повышении процента выхода белков клеточной поверхности, сохраняющих свою структуру, при упрощении технологии их получения.
Поставленная задача решается тем, что способ получения поверхностных белков клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений, включает в себя:
- предварительную промывку клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений TBS или PBS буфером,
- обработку грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений 0,1-0,2%-ным раствором дезоксихолата натрия в течение 5-10 минут,
- фильтрацию экстрагированных поверхностных белков,
- преципитацию экстрагированных поверхностных белков раствором трихлоруксусной кислоты,
- осаждение преципитата центрифугированием,
- промывку преципитата ацетоном, инкубирование 60-300 мин при -18°С
- осаждение поверхностных белков.
Предварительная промывка клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений может быть осуществлена TBS Tris-HCL 10-20 mM рН 7,2, либо PBS 10-20 mМ рН 7,2.
Осаждение поверхностных белков может быть осуществлено фильтрованием или центрифугированием.
Заявляемое изобретение иллюстрируется чертежами:
Фиг. 1 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A brasilense Sp245 и Sp7, экстрагированных различными агентами, где цифрами обозначены белковые спектры в присутствии: 1 - 15 мМ ТРИС-фосфатного буфера; 2 - 1М NaCl; 3 - 1М LiCL; 4 - 2М мочевины; 5-0,1% дезоксихолат натрия; 6 - маркеры молекулярных масс.
Фиг. 2 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A. brasilense Sp245, экстрагированных различными концентрациями ДОХ, где цифрами обозначены: 1 - 0,03% ДОХ; 2 - 0,05% ДОХ; 3 - 0,075% ДОХ; 4 - 0,1% ДОХ; 5 - 0,15% ДОХ; 6 - 0,2% ДОХ; 7 - белковые маркеры.
Фиг. 3 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A. brasilense Sp7 (А) и А. brasilense Sp245, экстрагированных ДОХ в течение различного времени: 1 -экстракция в течение 6 секунд; 2 - экстракция в течение 30 секунд; 3 - экстракция в течение 60 секунд; 4 - экстракция в течение 600 секунд (Юминут); 5 - экстракция в течение 3600 секунд (1 часа); 6 - белковые маркеры.
Фиг. 4 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов суспензионной культуры клеток Arabidopsis thaliana, при различном времени культивирования: треки 1,8 - белковые маркеры; трек 2 - культивирование 2 суток; 3 - культивирование 4 суток; 4 -культивирование 6 суток; 5 - культивирование 8 суток; 6 - культивирование 8 суток; 7 -культивирование 10 суток, 9 - актин Arabidopsis thaliana, 10 - актин Sp245, 11 - актин кролика.
Согласно заявляемому способу белки смывают (экстрагируют) с поверхности клеток поверхностно активным веществом (детергентом), при этом, согласно изобретению, детергентом является соль желчной кислоты дезоксихолат натрия (ДОХ). Обработку проводят 0,1-0,2% раствором ДОХ в течение 5-10 минут, а полученные белки количественно осаждают трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и промывают ацетоном для удаления ДОХ.
Использование ДОХ в концентрациях 0,1-0,2% позволяет экстрагировать поверхностные белки бактериальных и растительных клеток без их разрушения и избежать контаминации загрязнения препарата внутриклеточными цитоплазматическими белками.
Преципитация ТХУ в присутствии ДОХ обеспечивает количественное (полное) осаждение экстрагированных белков с различной молекулярной массой, в том числе минорных и низкомолекулярных.
В заявляемом решении технический результат достигается за счет использования в качестве экстрагента соли желчной кислоты - дезоксихолата натрия в концентрации ниже (или равной) критической концентрации мицеллообразования (ККМ).
Выбор экстрагента основан на результатах предварительных экспериментов, в которых использовались растворы различного состава, обычно применяемые в биохимии для выделения поверхностных белков (см. Фиг. 1, которая демонстрирует эффективность экстракции белков клеточной поверхности на примере двух штаммов грамотрицательных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Sp7).
Было показано, что наиболее эффективно экстрагировали полипептиды с поверхности бактериальных клеток мочевина и дезоксихолат натрия. В соответствующих белковых спектрах присутствует значительное количество низкомолекулярных полипептидов, которые отсутствуют в спектрах, полученных с использованием солей и ТРИС-фосфатного буфера, либо полностью или содержание этих белков незначительно. Однако следует отметить, что экстракция белков, проведенная с использованием ДОХ, оказалась более универсальной: с поверхности бактерий штамма Sp245 наибольшее количество белков экстрагируется именно дезоксихолатом натрия.
Раствор ДОХ в заявляемом способе демонстрирует выраженную способность к количественной экстракции белков с поверхности бактерий в зависимости от использованной концентрации (см. Фиг 2).
Сущность заявляемого изобретения подробно рассматривают на примере бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Sp7, и суспензионной культуре клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0).
Пример 1.
Способ заключается в том, что суспензию (V=2 мл) бактериальных клеток А. brasilense осаждали центрифугированием при 7000-9000 g в течение 3-5 минут. Для удаления компонентов культуральной среды, осадок промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS 10-20 мМ рН 7,2+150 mM NaCl или TBS Tris-HCl 10-20 мМ рН 7.2+150 mМ NaCl) и повторно центрифугировали при тех же условиях. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл PBS или TBS, добавляли ДОХ до конечной концентрации 0,1%, встряхивали на Vortex, инкубировали 5-10 мин и осаждали клетки центрифугированием при 7000-9000 g в течение 3-5 мин. Полученный супернатант количественно переносили в пробирки 1,5 мл, белки из надосадочной жидкости преципитировали добавлением ТХУ до конечной концентрации 10-12%, осаждали центрифугированием 7000-9000 g., 3-5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок для удаления ДОХ промывали ацетоном инкубировали 60-300 мин при -18°С центрифугировали 7000-9000 g., 3-5 мин., осадок хранили до проведения анализа. Время экспозиции было определено в предварительных экспериментах. Результат ДДС-ПААГ анализа поверхностных полипептидов A. brasilense Sp7 (А) и A. brasilense Sp245, экстрагированных ДОХ в течение различного времени, приведен на Фиг. 3.
Пример 2.
Суспензионная культура клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0).
Клетки перед экстракцией отделяли от культуральной среды на крупнопористом стекловолоконном фильтре, например Whatman GF-D, дополнительно отмывали на том же фильтре, изотоническим натриевым фосфатным буфером с 44-88 мМ (15-30 г/л) сахарозы. Навеску отфильтрованных клеток 500 мг помещали в пластиковую пробирку на 5 мл.
Поверхностные белки экстрагировали 0,1% ДОХом в фосфатном буфере с 43-88 мМ сахарозой, аккуратно перемешивая в течение 10 минут при соотношении 1:5-1:10 (в/об). Затем клетки отделяли фильтрованием на крупнопористом стекловолоконном фильтре, например Whatman GF-D, отбирали аликвоту фильтрата 1,0 мл, белки из надосадочной жидкости преципитировали добавлением ТХУ до конечной концентрации 10-12%, осаждали центрифугированием 7000-9000 g., 3-5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок для удаления ДОХ промывали ацетоном инкубировали 60-300 мин при -18°С центрифугировали 7000-9000 g., 3-5 мин., осадок хранили до проведения анализа. Результаты ДДС-ПААГ анализа поверхностных полипептидов суспензионной культуры клеток Arabidopsis thaliana при различном времени культивирования показан на Фиг. 4.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает количественное выделение белков с поверхности клеток без разрушения поверхностной мембраны и минуя этап получения фракции сферопластов. Подобный подход позволяет значительно снизить трудоемкость процесса, упростив и сократив процедуру получения белков поверхности. Способ применим как для микробных, так и для растительных клеток.
Воспроизводимость процедуры выделения позволяет проводить количественное и качественное сравнение (сопоставление) состава белков поверхности исследуемых объектов.
Claims (12)
1. Способ получения поверхностных белков клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений, включающий:
- предварительную промывку клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений TBS или PBS буфером,
- обработку грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений 0,1-0,2%-ным раствором дезоксихолата натрия в течение 5-10 минут,
- фильтрацию экстрагированных поверхностных белков,
- преципитацию экстрагированных поверхностных белков раствором трихлоруксусной кислоты,
- осаждение преципитата центрифугированием,
- промывку преципитата ацетоном, инкубирование 60-300 мин при -18°С,
- осаждение поверхностных белков.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительную промывку клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений осуществляют TBS Tris-HCL 10-20 mM pH 7,2.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительную промывку клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений осуществляют PBS 10-20 mМ рН 7,2.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение поверхностных белков осуществляют фильтрованием.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение поверхностных белков осуществляют центрифугированием.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145454A RU2670001C1 (ru) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | Способ получения белков клеточной поверхности |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017145454A RU2670001C1 (ru) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | Способ получения белков клеточной поверхности |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2670001C1 true RU2670001C1 (ru) | 2018-10-17 |
Family
ID=63862569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017145454A RU2670001C1 (ru) | 2017-12-25 | 2017-12-25 | Способ получения белков клеточной поверхности |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2670001C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2197264C2 (ru) * | 1997-04-09 | 2003-01-27 | Дюфар Интернэшнл Рисерч Б.В. | Способ получения поверхностных антигенных белков из вирусов гриппа, противогриппозная вакцина |
| EA200700942A1 (ru) * | 2007-04-06 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ определения качества клеточной культуры |
-
2017
- 2017-12-25 RU RU2017145454A patent/RU2670001C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2197264C2 (ru) * | 1997-04-09 | 2003-01-27 | Дюфар Интернэшнл Рисерч Б.В. | Способ получения поверхностных антигенных белков из вирусов гриппа, противогриппозная вакцина |
| EA200700942A1 (ru) * | 2007-04-06 | 2007-12-28 | Петр Генриевич ЛОХОВ | Способ определения качества клеточной культуры |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ГАЛИЦКАЯ А.А. и др. "Динамика состава поверхностных и экстраклеточных белков клеток ризосферных бактерий Azospirillum brasilense под воздействием пектиновых поли- и олиго-сахаридов".// II Всероссийская конференция, Фундаментальная гликобиология, 7-11 июля 2014, Саратов, с.85. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdulrahman et al. | Recent advances in chromatographic purification of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccines: A review | |
| CN110132801B (zh) | 高通量量化及分析口蹄病病毒及相关产物的方法 | |
| CN106279410B (zh) | 一种二型登革热病毒ns1蛋白多价纳米抗体及制备方法 | |
| Almasia et al. | Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies | |
| JP7060522B2 (ja) | ボツリヌス神経毒素の精製及び活性化のための方法 | |
| Tamaru et al. | Application of the arming system for the expression of the 380R antigen from red sea bream iridovirus (RSIV) on the surface of yeast cells: a first step for the development of an oral vaccine | |
| CN110669141A (zh) | 一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法 | |
| JPH11511335A (ja) | 液体組成物からのウィルスの吸着方法 | |
| CN116970601A (zh) | 一种Cas蛋白体系分离DNA的方法 | |
| Shang et al. | Production of human blood group B antigen epitope conjugated protein in Escherichia coli and utilization of the adsorption blood group B antibody | |
| CA2537102A1 (en) | A process for proteolytic cleavage and purification of recombinant proteins produced in plants | |
| CN102031263A (zh) | 应用家蚕生物反应器制备人DNA聚合酶δ的方法 | |
| RU2670001C1 (ru) | Способ получения белков клеточной поверхности | |
| JP2016529908A5 (ru) | ||
| CN105624082B (zh) | 表达单链抗体scFV或多肽适配体的功能化细菌磁颗粒及其应用 | |
| JP2014512843A (ja) | 細胞からの抽出 | |
| CN111303251B (zh) | 一种口蹄疫病毒样颗粒体外组装的方法及其应用 | |
| CN104293823B (zh) | 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白的制备方法和应用 | |
| CN102086450B (zh) | 一种用于分离纯化高酶活人类DNA聚合酶δ的免疫亲和层析柱及分离纯化方法 | |
| CN114380897B (zh) | 一种结核分枝杆菌包涵体蛋白复性的方法及其专用复性缓冲液 | |
| CN110846326A (zh) | 一种貉细小病毒vp2基因、表达载体、重组菌、制备vp2蛋白的方法和组装方法 | |
| JP3017887B2 (ja) | プリオネン、ウイルス及び他の感染因子の不活化方法 | |
| CN113527463B (zh) | Ifitm3蛋白相关物质在制备禽呼肠孤病毒所致疾病药物中的应用 | |
| CN113788880B (zh) | 一种人巨细胞病毒重组抗原的纯化方法 | |
| CN102981002A (zh) | 采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照物的间接免疫检测方法及试剂盒 |