CN102989036B - 应用于血管吻合术的含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种应用于血管吻合术的含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶及其制备方法。该水凝胶中肝素-泊洛沙姆复合物浓度为10％(W/V)-40％(W/V)，水凝胶预先封装于无菌注射器或安瓿中，或水凝胶冷冻干燥形成冻干粉灌注于西林瓶中，临用前加入注射用水溶解，形成水凝胶。本发明的含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶联合医用黏合剂应用于显微血管吻合术，不需要可溶性血管内支架或缝线辅助，增加了吻合口的密闭性能，不存在渗漏现象，并降低了血管吻合术过程的创伤性和血管栓塞的风险。

Description

应用于血管吻合术的含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及应用于血管吻合术的粘合剂及其制备方法，具体涉及一种应用于血管吻合术的水凝胶及其制备方法。

【背景技术】

近年来，随着血管扩张性疾病和血管闭塞性疾病以及血管损伤等发病率的逐渐增加，对血管移植、血管缝合与修补的技术提出了更高的要求。小血管及微血管的吻合技术，直接关系到血管远端的组织器官能否存活，在血管外科及显微外科等领域占有重要地位。随着显微外科的不断发展，对血管吻合技术的要求在不断提高，不仅要有良好的即时通畅率，还要有更好的远期通畅率和抗牵拉张力等。目前临床上常用的血管吻合方法有：缝合法、套接法、黏合法、激光焊接法、光化学组织黏合法等，这些方法各有利弊，但从临床应用的经济性和实用性角度来看，应用医用黏合剂的黏合法最具应用前景。

目前临床上常用于血管黏合的医用黏合剂主要有两种：纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯。目前医用黏合剂的安全性已得到了欧盟、北美发达国家的认可，并在临床中应用。

理想的显微血管吻合术应该具备以下性质：安全、可靠、无毒性；具有良好的生物相容性，不妨碍人体组织的自身愈合；在常温下可以实现快速黏合；具有良好的黏合强度及持久性；对人体组织无刺激性；在有血液和组织液的条件下可以使用等。

应用医用黏合剂的黏合法可以满足理想的显微血管吻合术的大部分要求，但是由于显微血管吻合口要严格对齐才能保证黏合剂不阻塞血管，因此黏合法操作要求较高。大多数临床医师在实验研究和临床应用中通常联合支架管、缝合法使用，这样做大大增加了显微血管吻合术操作复杂性。

2011年8月的Nature Medicine期刊中一篇论文(Vascular anastomosis usingcontrolled phase transitions in poloxamer gels)提出应用泊洛沙姆407凝胶结合医用黏合剂使用，解决显微血管吻合术黏合法的瓶颈。利用泊洛沙姆407的胶凝特点，替代支架管，实现快捷的显微血管吻合口对接。该方法部分解决了应用医用黏合剂的黏合法的瓶颈，但论文中提到，单用泊洛沙姆407还不能实现显微血管吻合术，必须合用白蛋白来提高其胶凝点温度。异种白蛋白是人体异抗原，容易引起排斥反应，而人源白蛋白成本较高，并且白蛋白在实行血管吻合术黏合法必需的加热过程中易变性沉淀，增加再通后的血管栓塞风险，因此该技术还存在不足。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有显微血管吻合术中黏合法的不足之处，提供一种应用于血管吻合术的含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶及其制备方法，其联合黏合法应用，提高血管吻合质量及速度，实现安全快捷的无创吻合。

泊洛沙姆(poloxamer)，商品名为pluronic，是白色或微黄色半透明蜡状固体，具有高温下胶凝的特点，但是单用泊洛沙姆还不能实现显微血管吻合术。发明人经过大量的实验，合成了接枝有肝素的泊洛沙姆新材料，该材料比泊洛沙姆有更高的胶凝的温度，在37℃以下呈液态，在40℃凝固成凝胶。以接枝有肝素的泊洛沙姆新材料为基础，经过反复实验，发明人制备了一种应用于血管吻合术的含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶，解决了现有显微血管吻合术中黏合法的不足之处，本发明采用的技术方案如下。

一种应用于血管吻合术的水凝胶，该水凝胶含有肝素-泊洛沙姆复合物，该水凝胶中所述肝素-泊洛沙姆复合物浓度为10％(W/V)-40％(W/V)。

上述的肝素-泊洛沙姆复合物具有以下通式或基于以下通式的结构组合：

Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y或Y-X-g-X-Y

其中：X为泊洛沙姆，g为间臂分子，Y为肝素，X、g、Y或者X、Y通过共价键结合。

上述的泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，即α-氢-ω羟聚(氧乙烯)_a-聚(氧丙烯)_b-聚(氧乙烯)_c嵌段共聚物，结构式为HO(CH₂CH₂O)_a(OCHCH₃CH₂)_b(CH₂CH₂O)_c，在共聚物中a和c为2～150，b为15～67。

上述的水凝胶中还含有0.1％(W/V)-5％(W/V)有机弱酸和/或氨基酸。

上述的有机弱酸包括柠檬酸、酒石酸、富马酸、硼酸、醋酸。

上述的水凝胶中肝素-泊洛沙姆复合物浓度为15％(W/V)-30％(W/V)。

上述的水凝胶在37℃以下呈流动的高分子胶液状，在37.5℃-45℃之间凝固成固态凝胶。

上述的应用于血管吻合术的水凝胶的制备方法，将肝素-泊洛沙姆复合物分散于注射用水中，肝素-泊洛沙姆复合物与注射用水的物质的量比为1∶2.5-10，完全溶解形成水凝胶。

形成水凝胶前，在加入所述泊洛沙姆的同时还加入浓度为0.1％(W/V)-2％(W/V)的氨基酸、有机弱酸、抗凝剂、促血管生长的细胞因子中的一种或几种。

上述水凝胶灌装于无菌注射器或者安瓿中，密封。

上述水凝胶也可冷冻干燥成冻干粉，灌装于无菌西林瓶中，密封。临用时加入10ml注射用水，轻微振摇，形成水凝胶。

本发明解决了现有显微血管吻合术中黏合法的不足，具有以下优点：(1)利用含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶联合医用黏合剂应用，避免了其他吻合方法所造成的吻合口狭窄问题，并替代可溶性血管内支架，使血管吻合的质量大大提高。(2)利用含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶联合医用黏合剂应用，替代缝合法吻合，增加了吻合口的密闭性能，不存在渗漏现象。(3)利用含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶，避免使用成本较高的人源白蛋白或高度纯化的异种白蛋白，无排斥反应风险，性价比高。(4)含有肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶，因保持了肝素的抗凝血作用，因此降低了显微血管吻合术过程血管栓塞的风险，并保证血管再通后不会引起栓塞，保持吻合部的的血流畅通。

具体实施方式

以下从具体实施例进一步说明本发明。

实施例一、Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备

肝素-泊洛沙姆复合物复合物有多种结构组合，本实施例选用泊洛沙姆407和低分子肝素钠为原料，先合成Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物，然后制备肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶。

Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成：称取泊洛沙姆407(相对分子量M＝12000，其中a＝c＝101，b＝56)12g，于一圆底烧瓶中，加入2mmol的丁二酐、2mmol的4-二甲基氨基吡啶及0.55ml三乙胺，并溶解于200ml二氧六环中，搅拌反应过夜，得末端为羧基的泊洛沙姆，以其为反应物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，加入10g的低分子肝素钠，搅拌反应24h。反应产物经透析袋透析3天，所得产物通过冷冻干燥得到固体粉末，即为Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物。

Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶A的制备：称取1g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.025g柠檬酸，15-20℃水浴中完全溶解，溶液灌装于一次性无菌注射器中，密封。

Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶B的制备：称取0.5g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.25富马酸，15-20℃水浴中完全溶解，溶液灌装于一次性无菌注射器中，密封。

实施例二、Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备

本实施例选用泊洛沙姆188和依诺肝素为原料，先合成Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物，然后制备肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶。

Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成：泊洛沙姆188(M＝8350，a＝c＝80，b＝27)2mmol与3ml己内酯在Sn-Oct为催化剂、Ar气保护下真空状态进行聚合，搅拌24h后停止反应，反应产物以10ml氯仿溶解，加入10倍量体积的乙醚沉淀，过滤，重复两次以纯化所得产物。将产物在4mmol丁二酐(SA)、2mmol 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、0.55ml三乙胺(TEA)，30ml二氧六环为溶剂下搅拌反应24小时，以10ml氯仿溶解，加入10倍量体积的乙醚沉淀，过滤，重复两次以纯化所得产物。利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，所得产物与依诺肝素反应，搅拌反应24h，反应最终产物经透析袋透析3天，最后透析袋内溶液通过冷冻干燥得到固体粉末，即依诺肝素-聚己内酯-泊洛沙姆-聚己内酯-依诺肝素。

Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备：称取0.75g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.15g甘氨酸，15-20℃水浴中完全溶解，冷冻干燥成冻干粉，灌装于无菌西林瓶中，密封。临用时加入5ml注射用水，轻微振摇，形成Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶。

实施例三、X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备

本实施例选用泊洛沙姆338和替地肝素为原料，合成X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物，然后制备肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶。

X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成：泊洛沙姆338(M＝15000，a＝c＝141，b＝44)15g，在100ml二氯甲烷为溶剂，0.6ml三乙胺做催化剂作用下与2mmol的室温下反应4h，然后，加入2.5mmol乙二胺，继续反应12h，反应的产物为末端氨基，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，将其与10g依诺肝素的羧基反应，搅拌反应24h，反应最终产物经透析袋透析3天，冷冻干燥，即得形成新材料为替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆。

X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备：称取1.5g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.005g精氨酸，15-20℃水浴中完全溶解，溶液灌装于一次性无菌安瓿中，密封。

实施例四、体外抗凝血实验

本实施例以上述三个实施例得到的肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶为对象，利用复钙化时间试验观察肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶体外抗凝血能力。

复钙化时间试验：上述三个实施例得到的肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶各取0.2mL，分别加入同样规格的试管内，再分别加入0.2mL血浆、0.025mol/L CaCl₂溶液0.2mL，于37℃恒温，记录当试管内出现第一条丝纤状物的时间。以同剂量的低分子肝素钠、生理盐水分别为阳性对照和空白对照组。

实验结果：对照组生理盐水的复钙化时间为128s，实施例1-3得到的肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶复钙时间比空白对照组生理盐水的复钙化时间均超过250s，统计学差异具有显著性，说明肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶具有较好的抗凝血效果。

实施例五、体外胶凝温度测定

本实施例以实施例一得到的Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶A为对象，测定胶凝温度。

取5ml Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶A在4℃下放置过夜，进行随温度变化黏度值的测定，每个浓度的溶液测定三次，求其平均值。以5ml 0.20g/ml的泊洛沙姆407作为对照组。

实验结果表明，Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶A的胶凝温度为39℃，而泊洛沙姆407的胶凝温度为26℃。因此，肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶具备在37℃以下呈流动的液体状态状，在39℃以上迅速凝固成固态凝胶的特性，满足血管吻合术的技术参数要求。

实施例六、黏合法进行动物血管吻合实验

本实施例考察肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶联合医用黏合剂在血管吻合术中的应用性能。

实验方法：取2只新西兰大白兔，采用氯胺酮(60～100mg/kg)和地西泮(6～10mg/kg)肌肉注射麻醉后，以颈部过伸位固定于手术台上。用脱毛剂脱毛，新洁尔灭酊消毒，铺无菌巾单；取颈部正中线切口，长约6cm，剪开颈阔肌及颈前肌群，于气管旁沟内游离出长约5cm的右侧颈总动脉。在颈总动脉的上、下两端用微型无创动脉夹阻断血流，中间横断血管，用生理盐水冲洗两断端，吸取残余的生理盐水后将实施例一制备的肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶B灌注到横断血管得两断端，应用精确温度定点加热器将两断端加热至40℃，横断血管断端内的肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶形成固体，将两断端准确对合，在连接处涂氰基丙烯酸酯医用黏合剂，黏合剂固化后，降低吻合口部的温度至37℃，先松开远心端动脉夹，使反流血冲过吻合口，确保吻合口通畅；再去除近心端动脉夹，完成胶粘吻合。

吻合口爆破压测定：完成黏合吻合术后，在距吻合口两端各2～3cm处剪取颈动脉，用肝素盐水冲洗管腔，一端连接于平针头并用丝线固定，另一端以止血钳夹闭。平针头通过三通管和输血导管分别与血压表和压力注射器相连接，用生理盐水持续灌注胶粘吻合的颈动脉段，当压力注射器中的液体同时被推注到血管和连接压力表的连接管内时，压力表上的读数即反映血管吻合口所承受的压力。观察吻合口处漏水情况和血压表的压力变化。记录吻合口漏水或破裂时的压力，即为吻合口爆破压。

实验结果：黏合法进行兔血管吻合实验，出血量少，血流恢复快，无渗漏，操作简便，兔颈总动脉吻合口爆破压为440mmHg，与缝合法同类实验文献报道一致，表明本发明的肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶在血管黏合吻合术法中具有较好的实用性。

在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各种修改。

Claims (4)

1.一种应用于血管吻合术的水凝胶，其特征在于：该水凝胶是由Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物制备，Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成方法为：

称取12g泊洛沙姆407，其中所述泊洛沙姆407的相对分子量M＝12000，其中a＝c＝101，b＝56，于一圆底烧瓶中，加入2mmol的丁二酐、2mmol的4-二甲基氨基吡啶及0.55ml三乙胺，并溶解于200ml二氧六环中，搅拌反应过夜，得末端为羧基的泊洛沙姆，以其为反应物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺方法，加入10g的低分子肝素钠，搅拌反应24h，反应产物经透析袋透析3天，所得产物通过冷冻干燥得到固体粉末，即为Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物；

Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备：称取1g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.025g柠檬酸，15-20℃水浴中完全溶解，溶液灌装于一次性无菌注射器中，密封；

其中所述的水凝胶在37℃以下呈流动的高分子胶液状，在37.5℃-45℃之间凝固成固态凝胶。

2.一种应用于血管吻合术的水凝胶，其特征在于：该水凝胶是由Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物制备，Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成方法为：

称取12g泊洛沙姆407，其中所述泊洛沙姆407的相对分子量M＝12000，其中a＝c＝101，b＝56，于一圆底烧瓶中，加入2mmol的丁二酐、2mmol的4-二甲基氨基吡啶及0.55ml三乙胺，并溶解于200ml二氧六环中，搅拌反应过夜，得末端为羧基的泊洛沙姆，以其为反应物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺方法，加入10g的低分子肝素钠，搅拌反应24h，反应产物经透析袋透析3天，所得产物通过冷冻干燥得到固体粉末，即为Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物；

Y-X-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备：称取0.5g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.25富马酸，15-20℃水浴中完全溶解，溶液灌装于一次性无菌注射器中，密封；

其中所述的水凝胶在37℃以下呈流动的高分子胶液状，在37.5℃-45℃之间凝固成固态凝胶。

3.一种应用于血管吻合术的水凝胶，其特征在于：该水凝胶是由Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物制备，Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成方法为：

2mmol泊洛沙姆188，其中所述泊洛沙姆188的M＝8350，a＝c＝80，b＝27，与3ml己内酯在Sn-Oct为催化剂、Ar气保护下真空状态进行聚合，搅拌24h后停止反应，反应产物以10ml氯仿溶解，加入10倍量体积的乙醚沉淀，过滤，重复两次以纯化所得产物，将产物在4mmol丁二酐、2mmol 4-二甲基氨基吡啶、0.55ml三乙胺，30ml二氧六环为溶剂下搅拌反应24小时，以10ml氯仿溶解，加入10倍量体积的乙醚沉淀，过滤，重复两次以纯化所得产物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺方法，所得产物与依诺肝素反应，搅拌反应24h，反应最终产物经透析袋透析3天，最后透析袋内溶液通过冷冻干燥得到固体粉末，即依诺肝素-聚己内酯-泊洛沙姆-聚己内酯-依诺肝素；

Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备：称取0.75g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.15g甘氨酸，15-20℃水浴中完全溶解，冷冻干燥成冻干粉，灌装于无菌西林瓶中，密封，临用时加入5ml注射用水，轻微振摇，形成Y-g-X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶；

其中所述的水凝胶在37℃以下呈流动的高分子胶液状，在37.5℃-45℃之间凝固成固态凝胶。

4.一种应用于血管吻合术的水凝胶，其特征在于：该水凝胶是由X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物制备，X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物的合成方法为：

15g泊洛沙姆338，其中所述泊洛沙姆338的M＝15000，a＝c＝141，b＝44，在100ml二氯甲烷为溶剂，0.6ml三乙胺做催化剂作用下与2mmol的对硝基氯甲酸苯酯室温下反应4h，然后，加入2.5mmol乙二胺，继续反应12h，反应的产物为末端氨基，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺方法，将其与10g依诺肝素的羧基反应，搅拌反应24h，反应最终产物经透析袋透析3天，冷冻干燥，即得替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆；

X-g-Y型肝素-泊洛沙姆复合物水凝胶的制备：称取1.5g上述合成的肝素-泊洛沙姆复合物，辐射灭菌后分散于5ml注射用水中，加入0.005g精氨酸，15-20℃水浴中完全溶解，溶液灌装于一次性无菌安瓿中，密封；

其中所述的水凝胶在37℃以下呈流动的高分子胶液状，在37.5℃-45℃之间凝固成固态凝胶。