CN102924467A - 一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素d的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，所述方法包括材料粉碎、95%工业乙醇回流提取、提取液浓缩、提取物去糖、硅胶柱层析、重结晶，其中提取物去糖工艺采用提取浓缩液的水悬浮液上D101大孔树脂，先用水洗脱，再用80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液处理。通过该处理可有效除去提取物中的糖份等杂质，提高硅胶的承载量及分离效率。硅胶柱层析工艺采用先进行一次干柱法分离，再用湿柱法分离处理。干柱法分离可缩短分离时间，减少人力投入。本发明提供的制备方法获得的鸦胆子素D纯度可达98%以上，且操作简单，可节约有毒溶剂的使用量，节省人力，节约时间。
Description
技术领域
本发明属于中药制备技术领域，涉及一种中药药物活性成分的提取制备方法，特别是涉及一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法。
背景技术
鸦胆子素D（bruceine D）是从苦木科鸦胆子属植物鸦胆子（Brucea javanica（L）Merr）中分离到的一种四环三萜类苦木素，研究表明其不仅对多种肿瘤细胞有强的抑制活性，而且对多种植物病毒的侵染和增殖具有强烈的抑制作用。鸦胆子素D不仅可以抑制烟草花叶病毒（TMV）基因组RNA及亚基因组RNA的复制，阻止病毒相关蛋白CP和MP的表达外，还可抑制烟草叶片中TMV向茎部及植株上部叶片的移动，诱导烟草产生对TMV的抗性并对感染TMV的烟草起到保护作用，是研制新型、高效、安全的植物源抗病毒剂的理想化合物。然而由于鸦胆子素D的化学结构复杂、手性碳多，难以化学合成，目前其来源仍然依赖于从植物中分离获得。通常提取纯化鸦胆子素D的方法是：材料粉碎——95%工业乙醇回流提取——提取液浓缩——有机溶剂萃取（或有机溶剂回流提取）——硅胶柱层析——重结晶。在有机溶剂萃取（或有机溶剂回流提取）工艺中，通常使用石油醚、氯仿、甲醇等有毒有机溶剂进行萃取或提取；在硅胶柱层析工艺中，最常用的是采用湿柱法进行分离，即用经有机溶剂浸泡后的硅胶粉填充层析柱，将样品加到填充层析柱上部，再用不同有机溶剂进行洗脱，分部收集洗脱液，如此反复层析直至获得纯品。整个工艺较繁琐、耗时，制备人员与有毒溶剂接触的时间长，严重损害制备人员的身体健康。
D101大孔吸附树脂是一种具有多孔海绵状结构人工合成的聚合物吸附剂，依靠树脂骨架和被吸附的分子之间的范德华力，通过树脂巨大的比表面积进行物理吸附而达到从水溶液中分离提取水溶性较差的有机物质的目的。D101树脂是一种非极性吸附剂，一般用于中草药中皂甙类物质的提取与分离，具有操作简便、成本较低、树脂可反复使用等优点。
发明内容
本发明目的在于提供一种更为简便、高效地从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，以解决当前从植物鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D效率低、费时、制备人员与有毒有机溶剂接触时间长，严重损害制备人员的身体健康等问题。
本发明是通过如下技术方案实施的：
本发明的一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，包括材料粉碎、回流提取、提取液浓缩、提取物去糖、硅胶柱层析、重结晶。
所述制备方法的具体步骤如下：
（1）材料粉碎：取新鲜鸦胆子经晒干或置烘干箱中经45℃-55℃烘干后，用植物粉碎机粉碎成粉末；
（2）回流提取：取一定量的粉末于回流烧瓶中，按样品与提取溶剂的质量体积比为1：8-10加入95%的乙醇，摇匀，安装好相应的冷凝装置，将回流烧瓶置于电热恒温水浴锅中，80℃回流1-2小时，自然冷却至室温，过滤，残渣用同样方法回流1-2次，合并滤液，即为提取液；
（3）提取液浓缩：将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至溶液成粘稠状，得到浓缩液；
（4）提取物去糖：按体积比为1：5-8于浓缩液中加入蒸馏水，80℃水浴加热并搅拌使之充分溶解，抽滤，滤液经D101大孔树脂柱层析吸附，先用2-4个柱体积的水洗脱，再用3-5个柱体积的80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至膏状，得到膏状提取物；
（5）硅胶柱层析：采用硅胶干柱层析法结合湿柱层析法对提取物进行分离，先用干柱法分离，再用湿柱法分离；采用干柱法分离时，膏状提取物先用适量甲醇充分溶解，再将溶液与硅胶拌匀，提取物与拌样硅胶的质量比为1：5-10，待甲醇挥干后，将拌样硅胶加到填好硅胶的干柱上，拌样硅胶与填柱硅胶的质量比为1：15-20，以氯仿与丙酮体积比为8：5的混合溶剂作为展开剂进行柱层析，当展开剂到达柱底部时结束展开，待层析柱中多余溶剂挥干后，根据鸦胆子素D标准品在硅胶薄层层析中所测的Rf值，推算其在层析柱上的相应位置，以该位置为中心，将柱中硅胶平均分为4-8段，每段约5-10 cm，分别取出各段硅胶并用甲醇充分洗脱，将各洗脱液进行薄层层析检测，合并含鸦胆子素D的部位，并用常规方法浓缩，得浓缩物A；将干柱法分离得到的浓缩物A再用湿柱法分离，湿柱法分离与通常采用的硅胶柱层析法相同，以氯仿、丙酮、甲醇体积比为10：2：1的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，分部收集洗脱液柱（一般为：直径3cm，长80cm的柱每约20 mL收集一份），将各洗脱液进行薄层层析检测，合并仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的部位，即可获得含鸦胆子素D的洗脱液；
（6）重结晶：将薄层层析检测仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的合并洗脱液减压浓缩后，用甲醇充分溶解，过滤，滤液静置于4℃冰箱中，待结晶析出后，滤出结晶即为鸦胆子素D纯品。
所述步骤（1）中的鸦胆子为鸦胆子植物的种子、皮、叶中的任一种。
所述步骤（5）中若不能获得纯度高的鸦胆子素D洗脱液，可用湿柱法再进行一次分离。
本发明的显著优点：
（1）在提取物去糖工艺中采用提取液浓缩后的水悬浮液上D101大孔树脂，先用水洗脱2-4个柱体积，再用80%乙醇洗脱3-5个柱体积，收集乙醇洗脱液并减压浓缩处理。通过该处理可有效除去提取物中糖份等杂质，富集提取物中鸦胆子素D等水溶性较差的有机成分，提高柱层析过程中硅胶的承载量及分离效率，避免采用有机溶剂萃取或有机溶剂回流提取工艺中有毒有机溶剂的使用。
（2）本方法通过大孔树脂和硅胶干柱层析两步处理后，可去除提取物中的大部分杂质，使目标成分鸦胆子素D得到有效的富集，显著提高分离效率，鸦胆子素D的提取率可达75%-85%。而现有技术中鸦胆子素D的提取率较低，一般为50%-70%。
（3）本发明人通过多次试验证明，采用本发明方法可从鸦胆子中提取纯化到高纯度的鸦胆子素D，纯度（采用HPLC检测）可达98%以上，可用于各种生物活性研究，具有制备方法简单、制备过程有毒有机溶剂使用量少、制备人员与有毒溶剂接触时间短等优点。
附图说明
图1为从鸦胆子种子中提取纯化的鸦胆子素D结晶。
具体实施方式
为了对本发明的一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法作进一步说明，以下介绍鸦胆子素D的具体提取制备方法，但其绝不对本发明的范围构成限制。
实施例1：:称取晒干的鸦胆子种子1.0 kg，用植物粉碎机粉碎后用10 L 95%的工业乙醇回流提取3次（条件为：80℃回流1小时），合并提取液，过滤并用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，得到约165 mL的浓缩液，加入蒸馏水至1000 mL，80℃水浴加热搅拌使之充分溶解，抽滤，滤液分3次上D101大孔树脂。每次取约300 mL悬浮液过装有1000g D101大孔树脂的层析柱（柱直径6cm，长60cm），上样流速约为10 mL/min，先用2个柱体积的水洗脱，再用3个柱体积的80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，合并3次洗脱液，减压浓缩成膏状，得膏状物46 g。将膏状物用甲醇溶解后加入260 g硅胶粉均匀吸附，待甲醇挥干后，将样品加到装有4.5 kg硅胶粉（200-300目）的干柱（柱直径8cm，长120cm）上，以氯仿：丙酮（体积比）=8：5的溶剂为展开剂进行层析，当展开剂到达柱底部时结束展开，待多余溶剂挥干后，根据薄层层析所测鸦胆子素D的Rf值，计算目标成分在柱体中的位置，将该位置及附近的硅胶分4段取出，每段约7 cm，分别用甲醇将取出的各部分洗脱并将各洗脱液进行薄层层析检测，合并含鸦胆子素D的第2、3部分洗脱液，减压浓缩成膏状，将含鸦胆子素D的浓缩物再用湿柱法分离，以氯仿、丙酮、甲醇体积比为10：2：1的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，分部收集洗脱液，将各洗脱液进行薄层层析检测，合并仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的部位，待其中溶剂挥干后即为高纯度的鸦胆子素D，用甲醇重结晶（用甲醇充分溶解，过滤，滤液静置于4℃冰箱中，待结晶析出后，滤出结晶即为鸦胆子素D纯品，下同）后最终获得纯度为99%的鸦胆子素D 78 mg，鸦胆子素D的提取率为83.7%。
实施例2：称取经55℃烘干的鸦胆子植物的皮1.0 kg，用植物粉碎机粉碎后用8 L 95%的工业乙醇回流提取3次（条件为：80℃回流1.5小时），合并提取液，过滤并用旋转蒸发仪减压浓缩至约180 mL，加入蒸馏水至1200 mL，于80℃水浴中搅拌加热使之充分溶解，抽滤，滤液分3次上D101大孔树脂。每次取约400 mL悬浮液过装有1300g D101大孔树脂的层析柱（柱直径6cm，长80cm），上样流速约为10 mL/min，先用3个柱体积的水洗脱，再用4个柱体积的80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，合并3次洗脱液，减压浓缩成膏状，得膏状物41 g。将膏状物用甲醇溶解后加入280 g硅胶粉均匀吸附，待甲醇挥干后，将样品加到装有4.3 kg硅胶粉（200-300目）的干柱（柱直径8cm，长120cm）上，以氯仿：丙酮（体积比）=8：5的溶剂为展开剂进行层析，当展开剂到达柱底部时结束展开，待多余溶剂挥干后，根据薄层层析所测鸦胆子素D的Rf值，计算目标成分在柱体中的位置，将该位置及附近的硅胶分5段取出，每段约6 cm，分别用甲醇将取出的各部分洗脱并将各洗脱液进行薄层层析检测，合并含鸦胆子素D的洗脱液，减压浓缩成膏状。将含鸦胆子素D的浓缩物再用湿柱法分离，以氯仿、丙酮、甲醇体积比为10：2：1的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，分部收集洗脱液，将各洗脱液进行薄层层析检测，合并仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的部位，待其中溶剂挥干后即为高纯度的鸦胆子素D，用甲醇重结晶后最终获得纯度为99%的鸦胆子素D 47 mg，鸦胆子素D的提取率为81.1%。
实施例3：称取经45℃烘干的鸦胆子植物的叶1.5 kg，用植物粉碎机粉碎后用15 L 95%的工业乙醇回流提取3次（条件为：80℃回流2小时），合并提取液，过滤并用旋转蒸发仪减压浓缩至约300 mL，加入蒸馏水至2000 mL，于80℃水浴中搅拌加热使之充分溶解，抽滤，滤液分5次上D101大孔树脂。每次取约400 mL悬浮液过装有1300g D101大孔树脂的层析柱（柱直径6cm，长80cm），上样流速约为10 mL/min，先用4个柱体积的水洗脱，再用5个柱体积的80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，合并5次洗脱液，减压浓缩成膏状，得膏状物62 g。将膏状物用甲醇溶解后加入320 g硅胶粉均匀吸附，待甲醇挥干后，将样品加到装有5.6 kg硅胶粉（200-300目）的干柱（柱直径8cm，长130cm）上，以氯仿：丙酮（体积比）=8：5的溶剂为展开剂进行层析，当展开剂到达柱底部时结束展开，待多余溶剂挥干后，根据薄层层析所测鸦胆子素D的Rf值，计算目标成分在柱体中的位置，将该位置及附近的硅胶分6段取出，每段约7 cm，分别用甲醇将取出的各部分洗脱并将各洗脱液进行薄层层析检测，合并含鸦胆子素D的洗脱液，减压浓缩成浓缩物A。将浓缩物A用湿柱法分离，以氯仿、丙酮、甲醇体积比为10：2：1的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，分部收集洗脱液，将各洗脱液进行薄层层析检测，合并含鸦胆子素D的部位，常规方法浓缩后获得浓缩物B，浓缩物B再用湿柱法分离一次，以氯仿与甲醇体积比为9：1的混合溶剂为洗脱剂，其余步骤与第一次湿柱法相同，合并仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的部位，待其中溶剂挥干后用甲醇重结晶后可得纯度为99%的鸦胆子素D 22 mg，鸦胆子素D的提取率为76.2%。
Claims (6)
1.一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，包括材料粉碎、95%工业乙醇回流提取、提取液浓缩、提取物去糖、硅胶柱层析、重结晶，其特征在于所述提取物去糖是采用提取液浓缩液的水悬浮液上D101大孔树脂，先用2-4个柱体积的水洗脱，再用3-5个柱体积的80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液后减压浓缩。
2.根据权利要求1所述一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，其特征在于所述硅胶柱层析是先用干柱法分离，再用湿柱法分离。
3.根据权利要求2所述一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，其特征在于所述干柱法分离中样品与拌样硅胶的质量比为1：5-10，拌样硅胶与填柱硅胶的质量比为1：15-20；所述湿柱法分离与通常采用的硅胶柱层析法相同。
4.根据权利要求1所述的一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，其特征在于：所述制备方法的步骤如下：
（1）材料粉碎：取新鲜鸦胆子经晒干或置烘干箱中经45℃-55℃烘干后，用植物粉碎机粉碎成粉末；
（2）95%工业乙醇回流提取：取一定量的粉末于回流烧瓶中，按样品与提取溶剂的质量体积比为1：8-10加入95%的工业乙醇，摇匀，安装好相应的冷凝装置，将回流烧瓶置于电热恒温水浴锅中，80℃回流1-2小时，自然冷却至室温，过滤，残渣用同样方法回流1-2次，合并滤液，即为提取液；
（3）提取液浓缩：将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩至溶液成粘稠状，得到浓缩液；
（4）提取物去糖：按体积比为1：5-8于浓缩液中加入蒸馏水，80℃水浴加热并搅拌使之充分溶解，抽滤，滤液经D101大孔树脂柱层析吸附，先用2-4个柱体积的水洗脱，再用3-5个柱体积的80%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至膏状，得到膏状提取物；
（5）硅胶柱层析：先用干柱法分离，用适量甲醇充分溶解膏状提取物，将所得溶液与硅胶拌匀，提取物与拌样硅胶的质量比为1：5-10，待甲醇挥干后，将拌样硅胶加到填好硅胶的干柱上，拌样硅胶与填柱硅胶的质量比为1：15-20，以氯仿与丙酮体积比为8：5的混合溶剂作为展开剂进行柱层析，当展开剂到达柱底部时结束展开，待层析柱中多余溶剂挥干后，根据鸦胆子素D标准品在硅胶薄层层析中所测的Rf值，推算其在层析柱上的相应位置，以该位置为中心，将柱中硅胶平均分为4-8段，每段约5-10 cm，分别取出各段硅胶并用甲醇充分洗脱，将各洗脱液进行薄层层析检测，合并含鸦胆子素D的部位，并用常规方法浓缩，得浓缩物A；将干柱法分离得到的浓缩物A再用湿柱法分离，湿柱法分离与通常采用的硅胶柱层析法相同，以氯仿、丙酮、甲醇体积比为10：2：1的混合溶剂为洗脱剂进行洗脱，分部收集洗脱液，将各洗脱液进行薄层层析检测，合并仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的部位，即可获得含鸦胆子素D的洗脱液；
（6）重结晶：将薄层层析检测仅在与鸦胆子素D标准品Rf值相同处出现点的合并洗脱液减压浓缩后，用甲醇充分溶解，过滤，滤液静置于4℃冰箱中，待结晶析出后，滤出结晶即为鸦胆子素D纯品。
5.根据权利要求4所述一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中的鸦胆子为鸦胆子植物的种子、皮、叶中的任一种。
6.根据权利要求4所述一种从鸦胆子中提取纯化鸦胆子素D的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中若不能获得获得纯度高的鸦胆子素D洗脱液，可用湿柱法再进行一次分离。
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