CN102911938B - 一种靶向抑制POLD1基因表达的siRNA序列 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列的正义链和反义链的3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰，将本发明作用于肿瘤细胞，检测POLD1基因被POLD1siRNA抑制后，肿瘤细胞在增殖、运动转移及细胞周期方面的变化，经实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹方法检测，发现POLD1siRNA1、POLD1siRNA4可显著下调POLD1 mRNA及蛋白水平的表达，并在人小细胞肺癌NCI-H446细胞上验证了设计合成的POLD1 siRNA对肿瘤细胞增殖、运动转移等生物学特性的影响，为POLD1 siRNA临床应用于肿瘤的治疗奠定基础。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子生物学与生物医药领域，尤其涉及一种靶向抑制POLD1基因表达的siRNA序列。
【背景技术】
DNA复制是细胞正常分裂、增殖的关键一步。DNA聚合酶δ(polδ)是真核生物DNA复制的最主要复制酶，在哺乳动物细胞中，polδ由4个亚基组成，分别是p125、p50、p68、p12。p125亚基是它的催化亚基，具有5′-3′聚合酶活性和3′-5′核酸外切酶活性,这使该酶在DNA复制、修复、维持基因组稳定性、重组及细胞周期调控中都起到重要作用。癌的恶性增殖需要DNA的大量复制满足其持续的细胞分裂活动。近年来，polδ与细胞癌变之间的关系逐渐被研究者重视。国内外实验研究发现，p125的表达与肝肿瘤的恶性程度、肿瘤细胞分化程度、静脉侵袭和肝内转移密切相关。p125高表达的肝癌细胞系Hep3B和HepG2的侵袭能力明显强于p125低表达的Huh7细胞系。p125的表达与POLD1mRNA(POLD1是编码DNA聚合酶δ催化亚基p125的基因)表达呈正相关，在转录水平上沉默POLD1基因表达，能明显降低肝癌细胞的侵袭能力。POLD1基因是多种增殖性调控基因最终产生效应的基因，也可能自身的变化就是细胞癌变的重要原因。在肝癌细胞HepG2中,POLD1基因的第472密码子由酪氨酸突变为组氨酸;乳腺癌易感基因BRCA1/2的热点突变区就潜伏在POLD1基因上；POLD1基因的突变使乳腺癌的发生率增加了2倍。在小鼠体内将POLD1基因一个等位基因的ExoII功能区D400位点突变后，能够诱发小鼠淋巴癌及上皮癌。此外，在结肠癌、宫颈癌中也发现了POLD1基因的高表达。因此，通过进一步研究阐明POLD1基因表达或p125功能活性被抑制后直接阻断癌细胞增殖的机理，分离鉴定阻断癌细胞异常增殖的有效作用靶点,为新药开发提供最确切的理论依据。
小RNA干扰(small interference RNA,RNAi)技术是近几年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法。RNAi作用的高度特异性，有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常等位基因功能,所以RNAi在基因治疗上有广阔的应用前景。RNAi作用机制是双链RNA(dsRNA)导入细胞后，在Dicer酶的作用下，降解为21-23bp,3’端带有2个突出碱基的siRNA，并与细胞内核酸内外切酶、解链酶、Argonaute蛋白等结合，形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物-RISC(RNA-inducing silencing complex)，高效递进式介导细胞内源性的同源mRNA的降解。哺乳动物细胞内，导入长双链RNA可导致基因表达广泛抑制，直接应用短双链的siRNA同样高效介导RNAi，并避免非特异性基因抑制效应。且短双链siRNA通过化学方法易合成，操作简便、转染效率高，对细胞的或者组织的毒副作用小，可大规模制备，临床应用方便，在药物开发方面具有不可替代的优势。
但是，由于siRNA的碱基分布，两端自由能大小及靶mRNA的二级结构等因素的影响,靶向同一基因mRNA不同靶点的siRNA，封闭基因表达的效果明显不同。在siRNA沉默特定基因的实验中，为保证siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要针对靶基因设计合成多条不同序列的siRNA，从中筛选出有效序列。有效siRNA序列的设计筛选是siRNA介导RNAi实验的关键点之一。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题在于提供一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，能高效抑制POLD1基因的表达，从而抑制肿瘤的生长、增殖和运动转移，促进肿瘤细胞死亡。
本发明是这样实现的：
一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八条序列中的至少一条：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链5’为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA2序列，其正义链为5’GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5’AUAAUGGUCAAUCUCCAAC3’；
POLD1siRNA3序列，其正义链为5’CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反义链为5’AUGAUACGGAUGAAGGUGG3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’；
POLD1siRNA5序列，其正义链为5’CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反义链为5’UUUGUACCUUGAGGGUCUG3’；
POLD1siRNA6序列，其正义链为5’GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反义链为5’UGAACUGAUCCUCAGUCAGGC3’；
POLD1siRNA7序列，其正义链为5’GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反义链为5’UGUGUACUUAGACUCCACC3’；
POLD1siRNA8序列，其正义链为5’GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反义链为5’UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3’。
进一步地，所述siRNA序列包括以下三条序列：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链5’为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA2序列，其正义链为5’GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5’AUAAUGGUCAAUCUCCAAC3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’。
进一步地，所述siRNA序列包括以下两条序列：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链5’为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’。
本发明具有如下优点：
首先，POLD1基因是肿瘤基因治疗的良好靶点，应用siRNA介导的RNAi技术可以比以往的任何手段更高效、特异、方便的抑制靶基因的表达。本发明提供能高效抑制POLD1基因表达的siRNA序列，并作用于肿瘤细胞，检测POLD1siRNA抑制POLD1基因表达后，肿瘤细胞在增殖、运动转移、细胞周期等方面的变化，为POLD1siRNA应用于恶性肿瘤的临床治疗奠定重要基础。
其次，本发明提供能高效抑制POLD1基因表达的siRNA序列，为POLD1基因功能的进一步研究奠定重要基础，从而抑制肿瘤的生长、增殖和运动转移，促进肿瘤细胞死亡。通过研究癌细胞中对POLD1基因癌性表达和p125功能活性癌性表现的抑制，寻找癌细胞增殖阻断的靶点，为发展最有效的新的抗癌或抗细胞增殖性疾病药物提供理论基础。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为MTT法检测POLD1siRNA抑制癌细胞增殖结果图；
图2为荧光实时定量PCR测POLD1siRNA对POLD1mRNA表达的抑制作用结果图；
图3A为蛋白质电泳图；
图3B为P125蛋白质的相对表达量图。
图4为显微镜观察细胞形态变化结果图；
图5为HE染色观察细胞核形态变化结果图；
图6为克隆形成实验结果图；
图7为Transwell检测细胞运动转移能力结果图；
图8为AnnexinV-PI双染流式细胞术检测凋亡结果图；
图9为PI单染，流式细胞术分析细胞周期结果图。
【具体实施方式】
本发明涉及一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八条序列中的至少一条：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链5’为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA2序列，其正义链为5’GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5’AUAAUGGUCAAUCUCCAAC3’；
POLD1siRNA3序列，其正义链为5’CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反义链为5’AUGAUACGGAUGAAGGUGG3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’；
POLD1siRNA5序列，其正义链为5’CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反义链为5’UUUGUACCUUGAGGGUCUG3’；
POLD1siRNA6序列，其正义链为5’GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反义链为5’UGAACUGAUCCUCAGUCAGGC3’；
POLD1siRNA7序列，其正义链为5’GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反义链为5’UGUGUACUUAGACUCCACC3’；
POLD1siRNA8序列，其正义链为5’GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反义链为5’UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3’。
较优的，所述siRNA序列包括以下三条序列：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链5’为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA2序列，其正义链为5’GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5’AUAAUGGUCAAUCUCCAAC3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’。
较优的，所述siRNA序列包括以下两条序列：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链5’为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’。
所述siRNA序列中的各正义链和反义链的3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰。本发明siRNA序列的获得方式如下：
根据生物信息学方法在genebank获取人POLD1mRNA序列(LOCUSNM_002691.2)，采用RNA structure分析软件对POLD1mRNA序列的二级结构进行预测，总结以往提出的siRNA设计原则，综合分析其GC含量、两端自由能大小、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性的要求等，设计siRNA系列。根据该软件对设计出的siRNA系列的评价，进一步采用NCBI GenBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能，初步筛选出8条siRNA序列，并委托上海吉玛制药技术有限公司代为合成上述8条siRNA序列。
所述8条siRNA序列的碱基序列、作用位点、GC含量以及评估等级如表1所示。
表1
下面结合各实施例，对本发明做进一步说明。
实施例1：MTT法测定POLD1siRNA序列抑制癌细胞增殖
将对数生长期的人小细胞肺癌NCI-H446细胞，按5×103个/孔的密度接种于96孔板中，37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养18h,细胞汇合约40%，进行POLD1siRNA转染。吸尽上清培养液，每孔加入100μL无血清Opti-MEM培养液。用无血清Opti-MEM培养液分别稀释混匀POLD1siRNA和脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogen)，室温静止5min后，将POLD1siRNA与脂质体溶液等体积混匀，室温再静止20min后，逐滴加入96孔板中，每孔终体积150μL,POLD1siRNA终浓度分别为50nmol/L,脂质体lipofectamineTM2000终体积为0.25μL/孔,培养8h后，更换为含10%小牛血清的DMEM培养液。另设空白对照组及单纯脂质体组。再培养72h后，每孔加入10μLMTT溶液(生理盐水配制成1mg/mL；Sigma)，继续孵育4h后，吸掉上清液，每孔加入150μLDMSO溶剂，振荡15min，全自动酶联免疫检测仪550nm波长下测定吸光度OD值，电脑自动记录和保存数据。按下列公式计算POLD1siRNA对NCI-H446细胞生长的抑制率。每个样品设6个复孔，实验重复3次，计算平均值和标准差。抑制率＝(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值×100%。
如图1所示，8组POLD1siRNA对NCI-H446细胞的增殖均有抑制作用，特别是POLD1siRNA1、POLD1siRNA2和POLD1siRNA4对NCI-H446细胞的增殖有明显的抑制作用，增殖抑制率分别为50.69±0.72%、35.35±0.68%和64.03±0.85%。
实施例2：荧光实时定量PCR检测POLD1siRNA对POLD1mRNA表达的抑制作用
将对数生长期的NCI-H446细胞，按8×104个/孔密度接种到12孔板中，培养18h转染POLD1siRNA方法同上。孵育48h后，用Trizol Reagent(Invitrogen)提取总RNA(由此开始在冰上进行操作),具体操作按其说明书进行。用BioMate(Thermo,USA)测定RNA纯度和浓度，立刻进行反转录：加入5×RT缓冲液10μL,dNTP(2.5mmol/L)4μL,Rnasin(40U/μL)1μL,RTase(200u/μL)1μL,Oligo18(50μmol/L)0.1μL,RNA 2μg,补充ddH2O到50μL,充分混匀后42℃孵育60min。用Realtime PCR(ABI,USA)对POLD1mRNA表达水平进行定量，内参为GAPDH。操作按Zoman的“2×SYBR Green qPCR kit”方案进行，即模板2μL,上、下游引物(10μM)1μL,2×Mix 10μL，补充ddH2O到20μL。扩增条件为：95℃4min→(94℃45s,55℃45s,72℃45s)40cycle→meltcurve。
如图2所示，POLD1siRNA1、POLD1siRNA4对POLD1mRNA的抑制率分别为70%和80%，图2中NC为阴性对照的抑制率为0，说明POLD1siRNA在转录水平上能够抑制了POLD1基因的表达，特别是POLD1siRNA1、POLD1siRNA4在转录水平上可有效抑制POLD1基因的表达。
实施例3：蛋白质免疫印迹法检测POLD1siRNA对p125蛋白表达的抑制作用
将2mL处于对数生长期的NCI-H446细胞(1×105个/mL)接种于6孔板中，培养18后,转染POLD1siRNA，72h后收集细胞。加入100μL细胞裂解液(0.15M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.5%脱氧胆酸钠，0.02%叠氮化钠，1%NP-14，2.0μg/mL aprotinin，100mM PMSF)冰上裂解30min。12000×g离心30min,取上清用MicroBCA试剂盒定量蛋白浓度。加入5×SDS凝胶上样缓冲液后，煮沸10min。将等量的蛋白(60μg)加入到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，分离后的蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,加入1:1000稀释的羊抗人p125抗体(C-20,SantaCruz),4℃孵育过夜。TBST洗涤三次，每次5min。加入1:500稀释的HRP标记的驴抗山羊IgG(Santa Cruz)，室温孵育2h，TBST洗涤三次，每次5min。ECL显色液显色,凝胶电泳分析系统拍照，用Quantity one软件分析目标带的分子量和净光密度值。以β-actin作为内参照。
如图3A和图3B所示，所述图3A和图3B中的1、2、3、4代表以下实验数据：1:对照；2:阴性对照；3:POLD1siRNA1;4:POLD1siRNA4。POLD1siRNA1、POLD1siRNA4对POLD1基因编码的蛋白产物p125表达的抑制率分别为42.60%±1.56%和49.42%±3.31%,说明POLD1siRNA1、POLD1siRNA4在蛋白水平上有效抑制了POLD1基因的表达，进而说明POLD1siRNA在蛋白水平上能够抑制POLD1基因的表达。
实施例4：显微镜下观察POLD1siRNA对NCI-H446细胞形态的影响
将2mL处于对数生长期的NCI-H446细胞(1×105个/mL)接种于6孔板中，培养18后,转染POLD1siRNA，培养72h后在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
如图4所示，所述图4中的A、B、C、D代表以下实验数据：A:对照；B:阴性对照；C:POLD1siRNA1;D:POLD1siRNA4。与对照组比较，阴性对照组细胞形态和数量没有明显的变化，POLD1siRNA1和POLD1siRNA4处理组细胞数量少，分布稀疏，细胞变大，部分细胞变圆浮起。这些结果说明，POLD1siRNA1和POLD1siRNA4能明显改变NCI-H446细胞形态，抑制NCI-H446细胞增殖，即POLD1siRNA能改变NCI-H446细胞形态，抑制NCI-H446细胞增殖。
实施例5：HE染色检测POLD1siRNA对NCI-H446细胞核形态的影响
将对数生长期的NCI-H446细胞，按1×104个/孔密度接种于预先置有爬片的24孔板中，培养18h后,转染POLD1siRNA，再培养72h后取出细胞爬片，进行HE染色。PBS洗3次，体积比为3：1的甲醇：冰乙酸固定液室温固定30min，PBS洗3次;0.5%TritonX-100透膜10min,PBS洗3次;苏木精染色15min，温水蓝化5min;伊红染色2min，甘油封片。显微镜下观察，细胞质呈红色，细胞核呈紫色。
如图5所示，所述图6中的A、B、C、D代表以下实验数据：A:对照；B:阴性对照；C:POLD1siRNA1;D:POLD1siRNA4。对照组和阴性对照组，大部分细胞单核，核呈规则的椭圆形。POLD1siRNA1和POLD1siRNA4处理组细胞明显变大，且出现了小的多核，并且多核细胞活性低，部分核脱落死亡。进一步说明POLD1siRNA能够诱导NCI-H446细胞经有丝分裂灾难方式死亡。
在DNA发生损害时，细胞无法进行完全的分裂从而导致四倍体或多倍体的现象称为细胞有丝分裂灾难。对于细胞有丝分裂灾难的形态学特点描述并不是很完全，但主要是巨细胞的形成，内有多个小核，染色质凝聚。DNA发生损害时，如果细胞不能有效地阻断其细胞周期的进行，会导致染色体的异常分离，这些非正常分裂的细胞在下一轮有丝分裂中会继续导致细胞多倍体的形成从而成为癌变的基础。而细胞有丝分裂灾难作为一种死亡机制可以使这种非正常分裂的细胞死亡。POLD1siRNA诱导NCI-H446细胞经有丝分裂灾难方式死亡，可能是由于DNA聚合酶Polδ活性受到抑制，引起DNA复制压力，导致DNA损伤所致。
实施例6：克隆形成实验检测POLD1siRNA对NCI-H446细胞克隆形成能力的影响
转染POLD1siRNA 24h后，用胰酶消化收集NCI-H446细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为150个/mL接种于6孔板中，每孔2mL。孵育15天后收板，用10%甲醇溶液固定，行0.1%的结晶紫染色30min，自来水冲洗10min，显微镜下观察拍照。
如图6所示，所述图6中的A、B、C、D代表以下实验数据：A：对照组；B：阴性对照；C：50nmol/L POLD1siRNA1；D：50nmol/L POLD1siRNA4。POLD1siRNA明显抑制了NCI-H446细胞克隆形成的数量及克隆大小。
实施例7：Transwell检测POLD1siRNA对NCI-H446细胞运动转移能力的影响
在8孔径Transwell小室(Coming公司)的下室中预先加入600μL含10％小牛血清的DMEM培养基，37℃平衡1h;收集POLD1siRNA作用48h的NCI-H446细胞,用PBS洗3次,重悬于无血清的DMEM培养基中，取密度为2.5×l05个/mL的细胞悬液100μL加入Transwell小室上室。37℃、5%CO2条件下培养22h取出transwell小室，PBS冲洗后用0.1%的结晶紫染色20min,用自来水洗去多余的染料，用棉棒擦净未穿透微孔滤膜的细胞。在200倍显微镜下计数滤膜下表面的细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复3次，以运动转移细胞的数目来表示肿瘤细胞的运动转移能力。
如图7所示，所述图7中的A、B、C、D代表以下实验数据：A：对照；B：阴性对照；C：50nmol/LPOLD1siRNA1；D：50nmol/L POLD1siRNA4。POLD1siRNA转染72h后，POLD1siRNA1、POLD1siRNA4处理组发生运动转移的细胞数量相对于未转染组分别下降了64.68±8.26%和85.85±10.32%。这些结果说明POLD1siRNA能显著抑制NCI-H446肿瘤细胞的运动转移能力。
实施例8：Annexin Ⅴ-FITC/PI双染实验检测POLD1siRNA对NCI-H446细胞凋亡的影响
转染POLD1siRNA 72h后，收集NCI-H446细胞进行Annexin V-FITC/PI染色，具体操作见Annexin V-FITC/PI(德国Merck公司)试剂盒说明书。调整细胞浓度为1.0×106/mL，取500μL细胞悬液用于流式细胞仪(BDFACSCalibur)检测，每个样品检测20000个细胞，实验重复三次。Annexin Ⅴ-/PI-为活细胞，Annexin Ⅴ+/PI-细胞为早期凋亡细胞，Annexin Ⅴ+/PI+为凋亡晚期细胞，Annexin Ⅴ-/PI+为坏死细胞。
如图8所示，所述图8中的A、B、C、D代表以下实验数据：A：对照；B：阴性对照;C:50nmol/L POLD1siRNA1;D:50nmol/L POLD1siRNA4。POLD1siRNA1和POLD1siRNA4处理组死亡细胞(早期凋亡+晚期凋亡+坏死细胞)的比例分别为17.19%和42.47%。NCI-H446经POLD1siRNA处理后，细胞膜的完整性明显被损伤，细胞早期凋亡、晚期凋亡的比例明显增加。
实施例9：PI染色，流式细胞术分析POLD1siRNA对NCI-H446细胞周期的影响
转染POLD1siRNA 72h后，收集NCI-H446细胞。用预冷的PBS洗细胞2次，1000×g离心5min后弃上清，细胞重悬于300μL 1×PBS，混匀后徐徐加入700μL预冷的无水乙醇，4℃固定18h以上。用预冷的PBS洗一次后，将细胞重悬于500μL含有40μg/mL RNase A的PBS中，37℃水浴消化RNA 30min。加入PI使其浓度达到10μg/mL，室温避光染色30min后上流式细胞仪测定，每次检测20000个细胞。激发波长488nm，统计发射光波长在620nm以上的细胞，利用CELLQuest软件分析凋亡细胞(亚二倍体细胞)及处于各个细胞周期(G1、S、G2)的细胞比例，凋亡率数据以表示，细胞周期比例数据为3次以上重复实验的代表结果。
如图9所示，所述图9中的A、B、C、D代表以下实验数据：A：对照；B：阴性对照；C：50nmol/L POLD1siRNA1；D：50nmol/L POLD1siRNA4。阴性对照处理组G1、S和G2/M期细胞比例与对照组没有明显区别，而POLD1siRNA1和POLD1siRNA4处理组，G1期细胞比例明显降低，S期细胞比例分别上升到36.09%和37.98%。这些结果说明，POLD1siRNA延缓了NCI-H446细胞S期的进程。
综上所述，本发明所述的POLD1siRNA，特别POLD1siRNA1、POLD1siRNA4转染肿瘤细胞后，能够通过高效抑制细胞内POLD1基因的表达而阻断肿瘤细胞的增殖，抑制其运动转移、阻滞细胞周期停滞于G2/M期，诱导细胞有丝分裂灾难而死亡，为POLD1siRNA应用于恶性肿瘤的基因治疗奠定了重要的实验基础。此外，POLD1siRNA序列能高效沉默细胞内POLD1基因的表达，为POLD1基因功能的进一步研究奠定基础。
本发明中所涉及的POLD1siRNA1的正义链序列如SEQ ID NO：1所示，POLD1siRNA1的反义链序列如SEQ ID NO：2所示，POLD1siRNA2的正义链序列如SEQ ID NO：3所示，POLD1siRNA2的反义链序列如SEQ ID NO：4所示，POLD1siRNA3的正义链序列如SEQ ID NO：5所示，POLD1siRNA3的反义链序列如SEQ ID NO：6所示，POLD1siRNA4的正义链序列如SEQ ID NO：7所示，POLD1siRNA4的反义链序列如SEQ ID NO：8所示，POLD1siRNA5的正义链序列如SEQ ID NO：9所示，POLD1siRNA5的反义链序列如SEQ IDNO：10所示，POLD1siRNA6的正义链序列如SEQ ID NO：11所示，POLD1siRNA6的反义链序列如SEQ ID NO：12所示，POLD1siRNA7的正义链序列如SEQ ID NO：13所示，POLD1siRNA7的反义链序列如SEQ ID NO：14所示，POLD1siRNA8的正义链序列如SEQ ID NO：15所示，POLD1siRNA8的反义链序列如SEQ ID NO：16所示，具体情况参见序列表。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (2)
1.一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，其特征在于：所述siRNA序列为以下两条序列：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’， 其反义链5’ 为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’ 。
2.一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，其特征在于：所述siRNA序列为以下两条序列：
POLD1siRNA1序列，其正义链为5’CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’， 其反义链5’ 为AUCUAUGGCUGAUGGUGGG3’；
POLD1siRNA4序列，其正义链为5’CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5’UUCUGGAUGUUGUAACCGG3’；
所述siRNA序列中的各正义链和反义链的3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰。
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