CN105079822B - Fam3c的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用 - Google Patents
Fam3c的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了FAM3C的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用。在本发明中，所述的FAM3C的反义核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。本发明针对FAM3C活跃表达的卵巢癌细胞系，通过反义核苷酸序列稳定沉默上皮性卵巢癌细胞中FAM3C基因的表达，特异性阻断上皮性卵巢癌细胞发生上皮‑间质转化，可以引起肿瘤细胞侵袭和转移能力的下降，降低了肿瘤的恶性程度，提高了患者的生存率和预后。将FAM3C的反义核苷酸应用于上皮性卵巢癌细胞侵袭转移抑制药物的制备中，能够为上皮性卵巢癌的生物治疗提供新的药物选择和靶向性治疗方案，提高了肿瘤治疗的特异性，为转移性卵巢癌的治疗提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明涉及序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)的反义核苷酸的新用途，具体涉及FAM3C的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。
背景技术
卵巢癌的致死率位居所有妇科肿瘤的首位，是一种严重危害女性生命健康的疾病。卵巢癌按照其来源不同分为：上皮性卵巢癌、性索间质性卵巢癌、生殖细胞性卵巢癌和转移性卵巢癌，而上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常见的类型，约占所有卵巢癌病例的90％。由于卵巢癌早期缺乏明显的临床表现，因此往往被拖延，直至出现侵袭转移，发展为晚期才被首次诊断。在临床，约75％的患者被确诊为卵巢癌晚期，尽管临床针对早期卵巢癌患者的治疗效果尚可，但是对晚期患者的治疗效果则十分有限。
肿瘤转移是引起临床肿瘤治疗失败和患者死亡的关键因素之一，在卵巢癌中，肿瘤转移的意义更为突出。根据国际妇产联合会(FIGO)的分期标准，肿瘤的转移，尤其是在腹腔中的转移，是卵巢癌发展进入晚期的标志之一。因此，侵袭转移极大地推进了卵巢癌发展的进程，增加了肿瘤的恶性程度，降低肿瘤患者的生存期。因此，针对卵巢癌侵袭转移的干预策略能够为临床治疗该肿瘤提供新思路。
越来越多的研究显示，上皮-间质转化(EMT)可以在多种肿瘤，包括上皮性卵巢癌中促进肿瘤细胞的侵袭和转移，并且临床数据显示上皮-间质转化与卵巢癌患者的不良预后有显著的关联。说明上皮-间质转化在卵巢癌中能够调节肿瘤的侵袭转移并发挥重要作用。
序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)在2006年首次被报道能够诱导鼠乳腺上皮细胞发生上皮-间质转化，因此也被命名为白介素类似的上皮-间质转化诱导因子(ILEI)。有文献报道FAM3C与结直肠癌的上皮-间质转化表型具有相关性，提示其在人类肿瘤中同样是一个潜在的上皮-间质转化促进因子，但FAM3C与卵巢癌的关系尚未见报道。人FAM3C基因位于染色体7q31，我们前期的研究表明，其在正常的卵巢组织中表达量很低，但在上皮性卵巢癌尤其是转移灶中表达量明显升高，提示FAM3C与卵巢癌的侵袭转移密切相关。
目前临床针对上皮性卵巢癌的治疗采用包括手术切除或减瘤，辅以紫杉醇和铂类药物的联合化疗等传统治疗方法，缺乏较强的特异性。针对肿瘤细胞的特点进行特异性治疗，有的放矢，可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性。本发明发明人发现通过靶向基因沉默FAM3C基因的表达，可以反转卵巢癌中上皮-间质转化过程并抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，是一种特异性的肿瘤生物治疗策略，可以为临床提供针对FAM3C高表达的上皮性卵巢癌侵袭转移治疗手段研发的基础。
发明内容
目前，临床针对卵巢癌转移的治疗效果有限，因此提供一种靶向稳定沉默基因FAM3C的生物治疗策略，通过反义核苷酸序列沉默FAM3C基因的表达，能够特异性地阻断上皮性卵巢癌发生上皮-间质转化(EMT)，进而抑制卵巢癌的侵袭和转移的进程。
为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明的技术方案针对上皮性卵巢癌，应用慢病毒转染反义核苷酸序列对肿瘤细胞中FAM3C基因进行靶向稳定沉默，有效抑制FAM3C基因在RNA和蛋白水平上的表达，从而引起上皮-间质转化的逆转以及肿瘤细胞迁移和侵袭能力的下降。
1.上皮性卵巢癌细胞的常规培养
选择人上皮性卵巢癌细胞OVCAR3作为研究对象，该细胞系购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，具有相对较高的FAM3C基因的表达基础。
2.应用反义核苷酸序列对FAM3C基因进行靶向稳定沉默
选择使用两条针对FAM3C基因的不同的反义核苷酸序列以及其相应的对照序列构建成的慢病毒质粒(购自广州复能基因有限公司)作为材料。
(1)人胚胎肾细胞293TN的常规培养；
(2)利用FAM3C靶向反义核苷酸序列和对照序列的质粒进行慢病毒包裹；
使用Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit(购自广州复能基因有限公司)进行慢病毒的包裹；
(3)利用包裹好的慢病毒上清液分别感染上皮性卵巢癌OVCAR3细胞；
(4)应用嘌呤霉素对感染后的OVCAR3细胞进行药物筛选，获得稳定感染的细胞克隆。
3.FAM3C稳定沉默后的表达情况检测
(1)利用半定量RT-PCR技术在RNA水平检测稳定沉默后对照细胞克隆和FAM3C稳定沉默后的两个实验组细胞克隆的基因沉默效果；
(2)利用Western Blot技术在蛋白水平检测稳定沉默后对照细胞克隆和FAM3C稳定沉默后的两个实验组细胞克隆的基因沉默效果。
4.检测FAM3C基因稳定沉默后对细胞EMT过程的影响
通过检测细胞中上皮以及间质细胞标志物的表达情况可以判断细胞上皮-间质转化的进程。我们运用Western Blot的方法，选择上皮细胞标志物E-cadherin、Occludin(均购自Santa Cruz公司)和间质细胞标志物N-Cadherin、Vimentin(购自BD公司)和Twist(购自Abcam公司)，对这些分子的蛋白水平进行检测。
5.检测FAM3C基因稳定沉默后对细胞迁移能力和侵袭能力的影响
(1)运用划痕愈合实验(Wound-Healing)检测FAM3C基因稳定沉默后的细胞克隆相对于对照组克隆在迁移能力上的改变；
(2)运用人工基底膜侵袭实验检测FAM3C基因稳定沉默后的细胞克隆相对于对照组克隆在细胞侵袭能力上的改变；
应用BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber(购自BD公司)进行人工基底膜侵袭实验。
以上方案可以有效地在上皮性卵巢癌细胞中靶向沉默FAM3C，使其在细胞中RNA和蛋白水平的表达明显下降；在稳定沉默FAM3C后，可以检测到肿瘤细胞发生了从间质细胞形态到上皮细胞形态的转变，即上皮-间质转化的逆过程，并且显著地抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭的能力。
在此研究的基础上，本发明提供了序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)的反义核苷酸的一种新的用途，即序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其中，所述的序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
在本发明中，优选的，所述的上皮性卵巢细胞为上皮性卵巢癌OVCAR3细胞。
在本发明中，优选的，所述的药物是通过靶向沉默上皮性卵巢癌细胞中FAM3C基因的表达，特异性阻断上皮性卵巢癌细胞发生上皮-间质转化，进而达到抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的目的。
本发明取得的有益效果：
本发明针对肿瘤转移在上皮性卵巢癌临床进程中的重要推进作用，提出了一种靶向特异性抑制FAM3C基因的生物治疗方法。通过使用反义核苷酸序列对上皮性卵巢癌细胞中FAM3C基因表达的靶向沉默，可以有效地阻断上皮性卵巢癌细胞的EMT转化，并有效抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，以实现在上皮性卵巢癌中有针对性地对肿瘤转移进行干预，降低肿瘤的进展及恶性程度，提高患者的生存率及预后。
附图说明
图1是用RT-PCR技术检测FAM3C基因沉默后与对照组相比RNA水平表达下降的情况图；其中，shctrl：对照组，seq1：反义核苷酸序列1，seq3：反义核苷酸序列3；
图2是用Western Blot技术检测FAM3C基因沉默后与对照组相比蛋白水平表达下降的情况图；其中，shctrl：对照组，seq1：反义核苷酸序列1，seq3：反义核苷酸序列3；
图3是用Western Blot技术检测FAM3C基因沉默后与对照组相比上皮、间质标志物蛋白水平的表达改变图；其中，shctrl：对照组，seq1：反义核苷酸序列1，seq3：反义核苷酸序列3；
图4是对FAM3C基因沉默后与对照细胞相比划痕实验的结果图(倒置相差显微镜下观察拍摄的图片)；其中，其中，shctrl：对照组，seq3：反义核苷酸序列3；
图5是利用Image J软件测量划痕实验的拍摄图片，以统计柱状图表示FAM3C基因沉默后与对照细胞相比，划痕覆盖百分比的情况图；其中，shctrl：对照组，seq3：反义核苷酸序列3，＊＊＊：P<0.001；
图6是人工基底膜侵袭实验中FAM3C基因沉默后与对照细胞相比，24小时后侵袭的穿膜细胞的显微镜下拍摄图片；其中，shctrl：对照组，seq1：反义核苷酸序列1，seq3：反义核苷酸序列3；
图7用统计柱状图表示人工基底膜侵袭实验中FAM3C基因沉默后与对照细胞相比，穿膜细胞的数量变化图；其中，shctrl：对照组，seq1：反义核苷酸序列1，seq3：反义核苷酸序列3，＊＊＊：P<0.001。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
试验例1
1.上皮性卵巢癌肿瘤细胞的常规培养
选择人上皮性卵巢癌细胞OVCAR3作为研究对象，该细胞系购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，具有相对较高的FAM3C基因的表达基础。在37℃恒温孵箱中，5％CO2浓度的条件下，以含10％胎牛血清(FBS，购自PAA公司)的RPMI-1640培养基进行培养。
2.应用反义核苷酸序列对FAM3C基因进行靶向稳定沉默
使用的FAM3C基因沉默shRNA克隆质粒中包含的两条反义核苷酸序列如下：
Seq1：GATGTGGCACCATTTATTG(SEQ ID NO:1所示)；
Seq3：ATGGAGCAACCAAACTCAA(SEQ ID NO:2所示)。
(1)人胚胎肾细胞293TN的常规培养
在37℃恒温孵箱中，5％CO2浓度的条件下，以含10％胎牛血清(FBS，购自PAA公司)的DMEM培养基进行培养。
(2)利用FAM3C靶向反义核苷酸序列和对照序列的质粒进行慢病毒包裹
按照Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit(购自广州复能基因有限公司)的操作步骤，FAM3C基因沉默质粒和对照组质粒(购自广州复能基因有限公司，两条反义核苷酸序列的设计合成，载体质粒骨架的合成和片段连接均由广州复能基因有限公司完成)均按如下方法分别同时操作，将293TN细胞接种于6孔板，使其铺满孔面的50～60％；次日，按照说明书要求将1ug质粒、1μl Lenti-Pac HIV mix和3μl EndoFectinLenti试剂在无血清OPTI-MEM(购自Invitrogen公司)培养基中进行均匀混合，室温孵育10～25分钟；将混合体系直接加入293TN细胞孔中，轻轻摇晃混匀，于37℃孵箱培养过夜；次日(约12小时后)，弃去培养基，并加入含0.2％Titer Boost的DMEM培养基2ml，后放置于恒温孵箱中继续培养。
(3)利用包裹好的慢病毒上清液分别感染上皮性卵巢癌OVCAR3细胞
提前以60～70％铺板密度接种OVCAR3细胞，待上述293TN自加入转染混合体系60小时后，收集含慢病毒的培养上清液，于常温，1000转/分，5分钟离心，保留病毒上清液；后弃去OVCAR3旧培养基，将病毒上清和RPMI-1640培养基(含10％的FBS)1：1混合，向OVCAR3孔中加入2ml该含病毒培养基，并加入Polybrene(聚凝胺)使其终浓度达到8ug/ml，在恒温孵箱中培养24小时。用RPMI-1640完全培养基替换含病毒培养基继续培养48小时。
(4)应用嘌呤霉素对感染后的OVCAR3细胞进行药物筛选稳定
病毒感染72小时后，细胞加入确定浓度的嘌呤霉素(购自Sigma-Aldrich公司)，2～3天更换含相同嘌呤霉素浓度的培养基。30天后观察到有散在的细胞克隆，大部分细胞均已死亡。将不同组别的细胞克隆用胰酶消化，转移至24孔板。待孔内细胞长至70～80％密度时再经胰酶消化转移至6孔板内培养。待6孔板内细胞生长至70～80％时转移至培养瓶中继续培养。得到稳定转染的细胞组和对照组培养至铺满培养瓶，后续进行细胞的常规培养。
3.FAM3C稳定沉默后的表达情况检测
(1)利用半定量RT-PCR技术在RNA水平检测稳定沉默后对照细胞克隆和FAM3C稳定沉默后的两个对照细胞克隆的基因沉默效果
检索NCBI Gene数据库，获得FAM3C、GAPDH的基因序列，应用NCBI primer blast在线平台设计基因特异性引物。所用引物由Invitrogen公司合成，序列如下：
hFAM3C-F：5'-AACGTGGTGGGACCCAAAATC-3'
hFAM3C-R：5'-TCCATCTTGTATGGCCTTCAGAA-3'
hGAPDH-F：5'-AGGAGCGAGATCCCTCCAAA-3'
hGAPDH-R：5'-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3'
用Trizol Reagent(购自Invitrogen公司)，按照说明书的方法，常规提取细胞的总RNA。并使用RocheTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(购自Roche公司)按照说明书操作制备第一链cDNA。用Nanodrop进行浓度测量，并严格调平不同组间的浓度，按照以下成分配置PCR反应体系：
并按照98℃，5分钟；随后98℃，15秒，58℃，15秒，72℃，30秒循环35次；72℃，5分钟；16℃，室温维持进行PCR反应。每个样本取5μl的反应产物，与1μl Gel red缓冲液进行混匀，加入琼脂糖凝胶孔中，以150V电压进行电泳，30分钟后，于MultilmageTMLight CabinetFilter Positions中进行观察和拍摄。
结果如图1所示，以FAM3C shRNA的两条序列seq1、seq3沉默后，OVCAR3的FAM3CRNA表达水平明显下降。
(2)利用Western Blot技术在蛋白水平检测稳定沉默后对照细胞克隆和FAM3C稳定沉默后的两个对照细胞克隆的基因沉默效果
利用常规Western Blot技术检测FAM3C蛋白的表达水平。依次进行常规蛋白质提取，蛋白质浓度的测定，SDS-PAGE凝胶电泳，Western Blot分析，用针对FAM3C特异性抗体(购自Sigma-Aldrich公司)检测不同细胞中FAM3C的蛋白表达情况。
结果如图2所示，以FAM3C shRNA的两条序列seq1、seq3沉默后，OVCAR3的FAM3C蛋白表达水平明显下降。
4.检测FAM3C基因稳定沉默后对细胞EMT过程的影响
通过检测细胞中上皮以及间质细胞标志物的表达情况可以判断细胞上皮-间质转化的进程。我们运用常规Western Blot的方法，对上皮细胞标志物E-cadherin、Occludin和间质细胞标志物N-Cadherin、Vimentin、Twist的蛋白水平进行检测。
结果如图3所示，FAM3C基因沉默后，OVCAR3上调上皮细胞标志物E-cadherin、Occludin的表达，而下调间质细胞标志物N-Cadherin、Vimentin、Twist，即由间质细胞表型向上皮细胞表型转变，即发生了EMT的逆转。
5.检测FAM3C基因稳定沉默后对细胞迁移能力和侵袭能力的影响
(1)运用划痕愈合实验(Wound-Heal)检测FAM3C基因稳定沉默后的细胞克隆相对与对照组克隆在迁移能力上的改变细胞迁移能力的变化。
将处于对数生长期的不同组细胞各自用胰酶消化接种到六孔板中，让其充分贴壁和伸展。次日，用200μl移液器吸头在生长至80％～90％的单层细胞上划一条直线，PBS冲掉悬浮的细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，倒置相差显微镜下拍照，并做好标记。之后，将六孔板放入37℃孵箱中继续培养。24小时后于标记位置再次镜下观察，拍照。对比细胞迁移能力的变化。并利用Image J软件对拍摄的图片进行分析，绘制统计柱状图。
显微镜下拍摄照片如图4所示，可以直观观察到，沉默FAM3C基因的OVCAR3细胞相较于对照组其划痕的愈合程度下降。利用Image J软件分析并统计作图的结果如图5所示，用两组间t检验进行统计，P<0.001，有显著差异，表明FAM3C基因沉默后，OVCAR3的迁移能力明显下降。
(2)运用人工基底膜侵袭实验检测FAM3C基因稳定沉默后的细胞克隆相对与对照组克隆在侵袭能力上的改变
应用BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber对FAM3C基因沉默细胞以及对照细胞进行人工基底膜侵袭实验。从-20℃取出侵袭小室放入24孔板中，室温放置，向24孔板和Transwell小室加入热的(37℃)500μl无血清1640培养基，放入CO2孵箱中于37℃条件下水化2小时。水化后，小心的将液体移出，不要碰到matrigel基底膜。分别取加入抑制剂和对照组细胞，PBS冲洗1次，胰酶消化，用无血清1640培养基重悬细胞。吸取部分细胞悬液进行细胞计数。依细胞浓度吸取适量细胞悬液，以无血清1640培养基稀释细胞悬液至使细胞含量为1×105个细胞/ml，待用。向24孔板中加入750μl全培养基，之后，将小室放入24孔板中，注意小室膜下不要产生气泡。迅速加入500μl细胞悬液(5×104个细胞/孔)，镜下观察，吹打均匀。37℃孵箱中，培养72小时。每种细胞种3个复孔。取出24孔板，用干净的棉签轻轻擦除小室膜上未穿过膜的细胞。膜在无水甲醇中固定1分钟，水洗两遍。Giemsa染色10分钟，水洗干净。晾干，用手术刀片将膜切下，光镜下观察，拍照(做完后最好立即照相)，计数200倍镜下每个视野下穿过细胞(呈紫色染色)的数量，并绘制统计柱状图。
镜下拍摄图如图6所示，可以直观观察到FAM3C基因沉默后，发生侵袭的OVCAR3细胞数量相较于对照组明显减少；将计数结果绘制成柱状图，如图7所示，并运用多组间单因素ANOVA分析，随后在两两间运用Student-Newman-Keuls(SNK)test进行统计分析，得到两条沉默序列进行FAM3C沉默后，其P均小于0.001，具有显著意义，表明沉默FAM3C基因后，OVCAR3细胞的侵袭能力相较于对照细胞有明显下降。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用，所述的序列相似性蛋白家族3成员C(FAM3C)的反义核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的上皮性卵巢细胞为上皮性卵巢癌OVCAR3细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是通过靶向沉默上皮性卵巢癌细胞中FAM3C基因的表达，特异性阻断上皮性卵巢癌细胞发生上皮-间质转化，进而达到抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的目的。
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