CN102906247A

CN102906247A - 用于培养干细胞的制剂和方法

Info

Publication number: CN102906247A
Application number: CN2010800545573A
Authority: CN
Inventors: K·拉亚拉; R·M·塞佩宁; O·霍瓦塔; H·斯科特曼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-01-30
Also published as: JP2013512667A; EP2507360A1; KR20130009943A; CA2782296A1; FI20096288A0; WO2011067465A1; AU2010326512A1

Abstract

本发明涉及适用于干细胞衍生、维持和分化的血清替代制剂和适用于干细胞衍生、维持和分化的培养基，其包括共轭亚油酸、二十碳五烯酸、活化素A和/或硬脂酸。

Description

用于培养干细胞的制剂和方法

技术领域

本发明涉及用于干细胞（如人类胚胎干细胞）衍生、维持和分化的不含异源物的制剂。

背景技术

人类胚胎干细胞（hESCs）是多潜能细胞，其具有分化成人体的所有细胞类型的潜能。人类ESCs具有重大的治疗意义，因为它们能够在培养中无限增殖，并因此能够为替代失效的或有缺陷的人体组织提供细胞和组织。在未来，很高的期望在于人类ESCs将会增殖和定向分化成特定的细胞类型，所述特定的细胞类型能够移植到人体中用于治疗目的或者用作药物发现和毒理学研究中的细胞模型。

胚胎干细胞是难以在培养中维持，因为它们倾向于遵循其自然的细胞命运，并自发地分化。大多数的培养条件导致一定水平的不必要的分化。干细胞分化是由于许多内在和外在因素，所述因素包括生长因子、细胞外基质分子和成分、环境应激源和直接的细胞-细胞间的相互作用。长期的增殖能力、经过持久培养后多潜能发育潜能以及核型稳定性是有关干细胞培养实用性方面的关键特征。

hESCs的未分化阶段能够通过判断细胞的形态特征来监控。未分化的hESCs具有非常小而紧凑的细胞的特征形态。而一些分化的细胞通常出现在hESCs集落的边缘，最佳的培养方法提供了具有最少量的分化细胞的生长支持。有几个生化标记物用于追踪hESCs分化阶段的状态，所述生化标记物如转录因子Oct4和Nanog，以及作为细胞表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3/4。当hESCs开始分化成任意细胞系时，这些标记将丢失。

创建和培养hESCs的基本技术已被描述。然而，对于目前用于培养hESCs的许多程序而言，存在着限制和缺点。典型地，胚胎干细胞已经在含有动物血清（特别是胎牛血清）或其它动物衍生产品的培养基中衍生和增殖，以允许在该培养过程中所需的增殖。hESC培养基中的动物衍生产品的存在有几个问题。首先，动物衍生产品可能含有引发接受者的免疫应答的毒性蛋白质或免疫原，并因此导致对移植的排斥（Martin等人,Nat Med.2005Feb；11(2):228-32）。其次，动物产品的使用增加了受到动物病原体（如病毒、支原体和朊病毒）污染的风险，这可能会造成细胞治疗和其他临床应用中严重的健康风险（Healy等人,Adv Drug Deliv Rev.2005 Dec 12；57(13):1981-8）。事实上，政府机构正在越来越多地调控、劝阻甚至禁止含有动物衍生产品（其可能含有该病原体）的细胞培养基的使用。第三，细胞培养物中不确定的成分危害到细胞模型实验的重复性，例如在药物发现和毒理学研究中。

为了克服使用血清或动物提取物的缺点，已经开发了一些无-血清的培养基。Price等人在美国专利申请2002/0076747中公开了血清替代物，在hESC培养中频繁使用的Knockout^TM SR培养基（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。然而，这种制剂含有动物衍生产品，如牛血清白蛋白，因此并不是完全不含异源物衍生化成分的。目前可获得几种不含异源物的血清替代物和培养基（X-Vivo 10、X-Vivo 20、SSS、Lipumin、Serex、Plasmanate、SR3）。这些血清替代物通常是特殊调配的以支持单一细胞类型的培养。此外，Thomson等人在美国专利申请2006/0084168中公开了无-血清并且不含异源物的细胞培养基，据称其支持培养中ESCs的生长。

不幸地，Rajala等人在Hum.Reprod.,2007,22(5):1231-1238中指出，所有上述制剂仅仅允许hESCs培养在对于新培养基的适应阶段过程中传代数次而不发生严重的分化，在后续的传代中迅速分化。

国际专利申请公布WO2008/148938公开了不含异源物的血清替代物，其包含视黄醇和包含用于ESCs维持和衍生的所述血清替代物的培养基。然而，仍然需要有用于培养多潜能（pluripotent）和多能（multipotent）干细胞的改进的不含异源物的制剂。

已经开发了几种用于hESCs的不含饲养层（feeder）的培养方法。这些不含饲养层的方法中的许多种利用了动物衍生成分。此外，这些方法遭受重现性不足的影响，并且目前无法用于具有稳定和正常的核型的未分化的hESCs的长期维持。对于hESCs而言，采用酶传代的不含饲养层的培养也可能是苛刻的以至于它们变得更加倾向于异常。

因为这些问题与目前已知的用于hESCs的培养基有关，迫切需要一种确定的不含异源物的培养基，其可重现地长期支持hESCs的茁壮生长不发生本质的分化而是维持多潜能性以及正常的细胞核型，并且这与管理临床安全性和有效性的预期监管准则以及用于在药物发现和毒理学验证中所使用的体外细胞模型的标准化方法相兼容。

发明内容

本发明提供了用于临床-级干细胞衍生、维持和分化的手段和方法。更具体地，本发明涉及血清替代物、包含所述血清替代物的最终培养基及其用途。

本发明的一个目的在于提供一种不含异源物的血清替代物，其包含至少一种选自共轭亚油酸和二十碳五烯酸的脂肪酸。在一些实施方案中，共轭亚油酸（CLA）的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.5mg/l至大约5mg/l的CLA，并且二十碳五烯酸（EPA）的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约1mg/l至大约10mg/l的EPA，所述最终培养基是补充有所述血清替代物的基础培养基。

在一些实施方案中，血清替代物可以进一步包含活化素A和/或视黄醇。在一些其他的实施方案中，活化素A的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.001mg/l至大约0.02mg/l的活化素A，和/或视黄醇的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.25mg/l至大约1.0mg/l的视黄醇。

在另外一些其他的实施方案中，血清替代物可以进一步包含硬脂酸。在一些其他的实施方案中，硬脂酸的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.5mg/l至大约5mg/l的硬脂酸。

本发明的另一个目的在于提供一种不含异源物的细胞培养基，细胞培养基包括基础培养基和根据本发明的实施方案的血清替代物。

本发明的另一个目的涉及本血清替代物或细胞培养基用于干细胞维持、增殖或分化的用途。

此外，本发明的目的涉及本血清替代物或细胞培养基用于干细胞衍生或分离的用途。

本发明的另一个目的在于提供一种用于在体外初始化（initiate）新干细胞的方法。所述方法包含a）提供所需来源的分离的干细胞，b）用本发明的不含异源物的培养基接触所述细胞，和c）在适合于干细胞培养的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，培养可以在饲养细胞层上进行。在一些实施方案中，所述分离的细胞是胚胎来源的、成人躯体来源的或间叶细胞来源的。

本发明的另一个目的在于提供一种用于培养干细胞的方法。所述方法包含a）用本发明的不含异源物的培养基接触所述干细胞，和b）在适合于干细胞培养的条件下培养所述细胞。在一些实施方案中，培养可以在饲养细胞层上进行。本发明的培养基能够支持干细胞以基本上未分化的状态体外传代数次的维持和增殖。此外，在根据本发明的培养基中培养的干细胞是基本上未分化的，保留其多潜能性或多能性并且维持其基因组完整性。

另外，本发明的一个目的在于提供一种用于分化干细胞的方法。所述方法包含a）采用补充有致分化剂，如生长因子或致分化细胞（differentiating cell）（如END2细胞）的本发明的不含异源物的培养基接触所述干细胞，和b）在适合于干细胞分化的条件下培养所述细胞。

通过如下附图、详细描述和实施例，本发明的其他目的、实施方案、细节和优势将变得显而易见。

附图说明

接下来，将通过参考有关附图的优选实施方案来更加详细地描述本发明，其中

图1A-1D是在不同的同渗容摩中在根据本发明的培养基中培养传代五次的hESC系HS401的光学显微图像：260mOsm（图1A）、290mOsm（图1B）、320mOsm（图1C）和350mOsm（图1D）。比例尺500μm。

图2A-2B显示了在根据本发明的的培养基中并且在脂质和脂质衍生物存在的条件下培养的hESCs的形态学和分化阶段。UD、PD和DIFF分别代表了未分化的、部分分化的和分化的hESC集落。图2A）在补充有不同的脂质和脂质衍生物的根据本发明的培养基中培养的HS401细胞系。图2B）在补充有不同的脂质和脂质衍生物的对照hES培养基中培养的HS401细胞系。

图3A-3F说明了干细胞标记物的增殖和表达对于视黄醇应答的增加。图3A）在不含视黄醇的根据本发明的培养基中培养传代五次的hESCs（Regea 07/046）于第3天的亮-视野显微图像。图3B）在含有2.0μM视黄醇的根据本发明的培养基中培养传代五次的hESCs（Regea 07/046）于第3天的亮视野显微图像。当与不含视黄醇培养的集落相比时，存在视黄醇的集落的尺寸更大。比例尺500μm。图3C-D）在含有2.0μM视黄醇的根据本发明的培养基中培养传代12次的hESCs（HS401）显示出Nanog和TRA-1-81阳性表达的荧光显微图像。嵌入物（inset）代表DAPI染色。比例尺200μm。图3E）在不含和存在有0.5、2.0和3.5μM视黄醇的根据本发明的培养基中培养传代10次的hESC系Regea 07/046的细胞增殖分析。图3F）在不含和存在有0.5、2.0和3.5μM视黄醇的根据本发明的培养基中培养传代10次的hESC系Regea 07/046中Oct4、GDF3、DNMT3B、TDGF1和Nanog表达的定量RT-PCR分析。

图4A-4C说明了干细胞标记物的增殖和表达对于活化素A应答的增加。图4A）在不含和存在有5ng/ml和10ng/ml活化素A的根据本发明的培养基和hES对照培养基中培养传代10次的hESC系Regea 07/046的细胞增殖分析。图4B）在不含和存在有5ng/ml和10ng/ml活化素A的根据本发明的培养基和hES对照培养基中培养传代10次的hESC系Regea 07/046中Nanog、Oct4、GDF3、DNMT3B、GABRB3和GDF3表达的定量RT-PCR分析。图4C）在不含和存在有5ng/ml和10ng/ml活化素A的根据本发明的培养基和hES对照培养基中培养传代十次的hESC系Regea 07/046的SSEA4和TRA-1-60干细胞标记物的FACS分析。

图5A-5J展示了在根据本发明的培养基中长期衍生和培养的hESC系的特征。图5A）展示了hESC系（第36代Regea 07/046、第25代Regea 08/013和第71代Regea 06/040）的正常核型的吉姆萨条带核型图（Giemsa band karyogram）。图5B）表明hESC系的SSEA-4和TRA-1-81于第7天的表达的定量FACS分析。第45代Regea 07/046、第41代Regea 08/013和第26代Regea 06/040。图5C）hESC系第29代Regea 06/040、第53代Regea 07/046和第41代Regea 08/013的细胞增殖分析。图5D）hESC系第52代Regea 07/046、第45代Regea 08/013和第33代Regea06/040中Nanog、Oct4、GABRB3、GDF3、DNMT3B和TDGF1表达的定量RT-PCR分析。图5E）显示了hESC系07/046(p33)1在根据本发明的培养基中冷冻和后续的融化之后在第1代时未分化的集落形态学的亮视野显微图像（比例尺，500μm）。图5F）显示了用于AFP和SOX-17（内胚层标记物）、α-心脏肌动蛋白和T(Brachyury；中胚层标记物）、SOX-1和PAX6（外胚层标记物）和作为看家基因对照（housekeepingcontrol）的β-肌动蛋白的转录物的体外-衍生的EB的RT-PCR分析。道1，50-bp的DNA阶梯（ladder）。第42代Regea 07/046、第35代Regea 08/013和第101代Regea 06/040。图5G）来自于采用心脏肌钙蛋白T阳性染色的hESC系Regea 08/013的分化的心肌细胞。比例尺是100μm。图5H）来自于采用心室肌球蛋白重链阳性染色的hESC系Regea 08/013的分化的心肌细胞。比例尺是100μm。图5I）衍生自在根据本发明的培养基中培养的hESC系Regea 08/013的神经球的RT-PCR分析，其显示出神经前体标记物Musashi、巢蛋白和PAX6；神经标记物MAP-2、NF68和OTX2；和星形细胞标记物GFAP的表达。没有检测到多潜能标记物Oct4和Nanog的表达，也没有检测到内-AFP或者中胚层标记物T/Brachyury的表达。图5J）从层状神经球中迁移出的大多数细胞对于神经标记物MAP-2染色呈阳性并且少数细胞对于星形细胞标记物GFAP呈阳性。比例尺是100μm。

图6A-6C展示了在根据本发明的培养基中培养的人类诱导的多潜能干细胞（iPS细胞）的特征。图6A）表明在hES培养基中和在根据本发明的培养基中培养的人类iPS细胞的SSEA-4和TRA-1-81的表达的定量FACS分析。在hES培养基中培养的细胞样品来自于6天龄的集落，来自在根据本发明的培养基中培养的iPS细胞系A的细胞样品来自于7天龄的集落以及来自iPS细胞系B的样品来自于8天龄的集落。在hES培养基中的第15代，在根据本发明的培养基中的第14代的细胞系A以及在hES培养基中第16代，在根据本发明的培养基中第7代的iPS细胞系B。图6B）在hES培养基中第10代，在根据本发明的培养基中第7代的iPS细胞系A以及在hES培养基中第11代，在根据本发明的培养基中第8代的iPS细胞系B的第6天的集落的Nanog、Oct4、GABRB3、GDF3、DNMT3B和TDGF1表达的定量RT-PCR分析。图6C）显示了用于AFP和SOX-17（内胚层标记物）、α-心脏肌动蛋白和T（Brachyury；中胚层标记物）、SOX-1和PAX6（外胚层标记物）和作为看家基因对照（housekeeping control）的β-肌动蛋白的转录物的体外衍生的EB的RT-PCR分析。道1，50-bp的DNA阶梯。两种细胞系均为第10代。

图7A-7E展示了在根据本发明的培养基中培养的人类脂肪干细胞（ASCs）的特征。图7A）在含有人类血清的培养基（HS）中培养的ASCs于第8天的形态学。（比例尺500μm）。图7B）在根据本发明的培养基中培养的ASCs于第8天的形态学。（比例尺500μm）。图7C）在HS培养基中培养的ASCs于第11天的形态学。（比例尺500μm）。图7D）在根据本发明的培养基中培养的ASCs于第11天的形态学。（比例尺500μm）。图7E）WST-1增殖分析。在HS培养基中和根据本发明的培养基中于第1、4、7和11天的时间点分析来检测ASCs的增殖。图表中的数据表示为平均值±SD。*p<0.05（n=具有4个重复孔的7个供体）。

具体实施方式

本发明涉及用于临床-级干细胞衍生、维持和分化的手段和方法。更具体地，本发明涉及不含异源物的血清替代物制剂并且涉及包含所述血清替代物的培养基。此外，本发明涉及用于干细胞衍生、培养、维持和分化的方法。

因此，本发明提供了一种确定的不含异源物的血清替代物制剂或组合物，其可以用于补充在干细胞体外衍生、维持、增殖或分化中使用的任何适宜的基础培养基。取决于应用，所述血清替代物可以用于补充或者无-血清或者含-血清的基础培养基，或其任何组合。当采用本发明的不含异源物的血清替代物补充不含异源物的基础培养基时，最终的培养基也是不含异源物的。

文中的术语干细胞既包括多潜能的又包括多能的干细胞。胚胎干细胞（ESCs）是能够分化成各种各样的不同细胞类型的多潜能细胞。真正的胚胎干细胞系（i）能够在体外以未分化状态下无限增殖；（ii）能够分化成所有三种胚胎胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的衍生物，甚至在持久培养之后；和（iii）贯穿持久培养始终地维持正常的核型。因此，胚胎干细胞被称为是多潜能的。

诱导的多潜能干细胞（iPS细胞）是多潜能干细胞的另一个实例。iPS细胞产生自分化的细胞，典型地通过发展重组（developmental reprogramming）产生自成人体细胞如成纤维细胞。这种细胞已经在例如WO 2008/151058和US 2008/076176中有所描述。

多能干细胞包括，但不限于，造血干细胞和间充质干细胞（MSCs），其是能够分化成各种细胞类型的成人干细胞。MSCs可以从不同的来源包括骨髓和脂肪组织中分离。衍生自脂肪组织的MSCs被称为脂肪干细胞（ASCs）。

本领域充满了胚胎和成人干细胞的信息。根据本发明培养的干细胞（包括hESCs）能够通过使用任何适当的技术（包括，但不仅限于，免疫外科）从任何适宜的来源获得。例如，美国专利号6,090,622描述了用于分离和增长人类胚胎干细胞的过程。美国专利号5,843,78和国际专利申请公布WO96/22362描述了用于获得猕猴和其他非-人类的灵长类动物胚胎干细胞的过程。此外，Thomson等人描述了用于分离猕猴胚胎干细胞的方法（1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7844-7848）。卵裂球活检是一项有吸引力的新技术，其允许胚胎干细胞的分离和传播而不损害供体胚胎。在领域中能够轻易地得到用于获得干细胞的其他方法。

文中提供的手段和方法适用于衍生自任何所需动物的干细胞，优选包括灵长类的哺乳动物如人类、猴子和猿，以及非-灵长类哺乳动物如小鼠、大鼠、马、绵羊、熊猫、山羊和斑马。

术语不含异源物的在文中是指当培养人类干细胞时，试剂的来源不是来自于外源，即不包含非-人类的动物来源材料。同样，例如，鼠干细胞的培养必须在无任何小鼠衍生的材料存在的情况下完成以便是不含异源物的。用于培养人类干细胞的适合的不含异源物来源可能包括来自于细菌、酵母、真菌、植物和人类的兴趣试剂的化学合成或者合成制剂或者分离、制备或纯化。

术语“血清替代物”在文中是指在最终细胞培养基中可以用于替代动物血清的制剂。典型地，常规的血清替代物包含维生素、白蛋白、脂质、氨基酸、转铁蛋白、抗氧化剂、胰岛素和微量元素。最终细胞培养基可能进一步包含直接加入到基础培养基中或者进一步包含于血清替代物中的生长因子、非-必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺和/或抗生素。

如今，令人惊讶的发现是共轭亚油酸（CLA）和/或二十碳五烯酸（EPA）在未分化状态下在维持干细胞方面提供了优异的结果。在被测试的各种脂质和脂质衍生物中，这两种脂肪酸在维持未分化的形态学、增加未分化的集落的数目和保留干细胞的多潜能或多能方面是优越的。

因此，根据本发明的血清替代物是不含异源物的制剂，其包含至少一种选自共轭亚油酸和二十碳五烯酸的脂肪酸。血清替代物中CLA的优选浓度范围是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.5mg/l至大约5mg/l，更具体地大约2.5mg/l的CLA。血清替代物中EPA的优选浓度范围是如此的，以至于最终培养基包含从大约1mg/l至大约10mg/l，更具体地大约5mg/l的EPA。因此，在采用20%（体积/体积）的血清替代物补充基础培养基以便得到最终培养基的实施方案中，所述血清替代物包含从大约2.5mg/l至大约25mg/l，更具体地大约12.5mg/l的CLA和/或从大约5mg/l至大约50mg/l，更具体地大约25mg/l的EPA。对于本领域技术人员而言，显而易见的是血清替代物可能以采用不同百分比加入到基础培养基中的形式来提供，因此个别成分的浓度会相应地改变。

在血清替代物中使用的次优脂肪酸是硬脂酸。血清替代物中硬脂酸的优选浓度范围是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.5mg/l至大约5mg/l，更具体地大约2.5mg/l的硬脂酸。因此，在采用20%（体积/体积）的血清替代物补充基础培养基的实施方案中，所述血清替代物包含从大约2.5mg/l至大约25mg/l，更具体地大约12.5mg/l的硬脂酸。

令人惊讶的发现是活化素A，特别是与CLA和/或EPA组合促进了干细胞的增殖和干细胞标记物如Nanog、Oct4、GDF3、DNMT3B、GABRB3和GDF3的表达。

因此，根据本发明的血清替代物可以进一步包含活化素A。血清替代物中活化素A的优选浓度范围是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.001mg/l至大约0.02mg/l，更具体地大约0.005mg/l的活化素A。因此，在采用20%（体积/体积）的血清替代物补充基础培养基的实施方案中，所述血清替代物包含从大约0.005mg/l至大约0.1mg/l，更具体地大约0.025mg/l的活化素A。

此外，人们发现视黄醇（即维生素A）支持了在非常低的浓度下干细胞的未分化生长。视黄醇的有效浓度范围比WO 2008/148938中所公开的浓度范围低大约10倍。当视黄醇与CLA和/或EPA结合使用时，获得特别好的结果，并且在活化素A存在的条件下，甚至获得更好的结果。血清替代物中视黄醇的优选浓度范围是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.25mg/l至大约1.0mg/l，更具体地大约0.57mg/l的视黄醇。因此，在采用20%（体积/体积）的血清替代物补充基础培养基的实施方案中，所述血清替代物包含从大约1.25mg/l至大约5.0mg/l，更具体地大约2.85mg/l的视黄醇。

表1.不同成分对干细胞的影响

在一些优选的实施方案中，根据本发明的血清替代物包含活化素A和CLA和/或EPA。在其他的优选实施方案中，血清替代物包含视黄醇和CLA和/或EPA。在进一步优选的实施方案中，血清替代物包含活化素A、视黄醇和CLA和/或EPA。这些成分的优选浓度如上给出。根据这些实施方案的各个和每个血清替代物可以还包含硬脂酸。

在其他另一个实施方案中，血清替代物包含除如上给出的成分以外的至少一种成分（优选不含内毒素），所述成分选自脂质或脂质衍生物、维生素、白蛋白或白蛋白代用品、氨基酸、维生素、转铁蛋白、转铁蛋白代用品、抗氧化剂、胰岛素或胰岛素代用品、微量元素和生长因子。这种成分以足以支持本质上未分化状态下的干细胞的增殖，同时保持细胞的多潜能性和核型的浓度存在于血清替代物制剂中。

因此，根据本发明的血清替代物可以进一步包含至少一种其他的脂质或脂质衍生物，包括，但不限于，如极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）和胆固醇的脂蛋白类；如磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺的磷脂类；如亚油酸、γ-亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸、二十二碳六烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、肉豆蔻酸及其衍生物如前列腺素的脂肪酸。

根据本发明的各种实施方案，血清替代物可以包含例如至少两个、至少三个或至少四个如上给出的脂质或脂质衍生物。

血清替代物可以还含有除视黄醇以外的其他维生素，如抗坏血酸、生物素、氯化胆碱、D-Ca泛酸盐/酯、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12，维生素D2。典型地，几种维生素包括在基础培养基中并且额外的维生素补充能够加入到最终培养基中。典型地，在根据本发明的细胞培养基中，硫胺素以大约9mg/l的浓度使用，而抗坏血酸以大约50μg/ml的浓度使用。

适合于在本发明中使用的白蛋白替代品包括任何化合物，其可以用来代替白蛋白并且具有与白蛋白基本上类似的作用。血清替代物中和根据本发明的最终培养基中白蛋白或白蛋白替代品的适宜浓度能够轻易地由使用本领域熟知的常规方法的技术人员来确定。典型地，白蛋白或白蛋白替代品在从大约1mg/ml至大约20mg/ml，优选从大约5mg/ml至大约15mg/ml的范围内在最终培养基中使用。在一个实施方案中，白蛋白以大约10mg/ml存在于根据本发明的细胞培养基中。

胎球蛋白、α-胎蛋白及其任何组合可以用来代替血清替代物中的白蛋白。然而，由于其价格高，与白蛋白结合使用可能是可行的。在一个优选的实施方案中，血清替代物包括大约0.5mg/ml的胎球蛋白和大约0.25mg/ml的α-胎蛋白。在该实施方案中，采用20％的血清替代物补充基础培养基。通常，典型的最终细胞培养基包含从约0.01mg/ml至大约1mg/ml的胎球蛋白和/或α-胎蛋白。

适合于在本发明中使用的氨基酸包括，但不限于，氨基酸，如甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、及其D-型形式和衍生物。氨基酸的适宜浓度能够轻易地由技术人员使用本领域熟知的常规方法来确定。典型的浓度范围列于表3。根据本发明的血清替代物可以含有额外的非-必需氨基酸，如L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、及其D-型形式和衍生物。这种额外的非-必需氨基酸可以包括在血清替代物中或者直接加入到根据本发明的最终细胞培养基中。非-必需氨基酸可以作为商业上可获得的混合物，如由Invitrogen公司提供的MEM非-必需氨基酸（NEAA）来提供。典型地，根据本发明的最终培养基中所述混合物的浓度大约是1％。

优选将L-谷氨酰胺作为一种稳定的、二肽形式的L-谷氨酰胺如Glutamax（Invitrogen公司，2mM）加入到根据本发明的细胞培养基中。如果需要，L-谷氨酰胺可以包括在根据本发明的血清替代物中。

转铁蛋白涉及将铁递送到细胞中，控制生物体液中游离铁的浓度以及预防铁-介导的自由基毒性。适合于在本发明中使用的转铁蛋白替代品包括任何化合物，其可以被用来代替转铁蛋白并且具有与转铁蛋白基本上类似的作用。该替代品包括，但不限于，铁盐和螯合物（例如，柠檬酸铁螯合物或硫酸亚铁）。血清替代物中和根据本发明的最终培养基中转铁蛋白或转铁蛋白替代品的适宜浓度能够轻易地由技术人员使用本领域熟知的常规方法来确定。典型地，根据本发明的最终培养基中转铁蛋白或转铁蛋白替代品的适宜的范围是大约1μg/ml至大约1000μg/ml，优选大约5μg/ml至大约100μg/ml，并且更优选，大约5μg/ml至大约10μg/ml。在一个实施方案中，根据本发明的细胞培养基中的转铁蛋白以大约8μg/ml的浓度存在。

适合于在本发明中使用的抗氧化剂包括，但不限于谷胱甘肽和抗坏血酸。血清替代物中和根据本发明的最终培养基中抗氧化剂的适宜浓度能够轻易地由技术人员使用本领域熟知的常规方法来确定。根据一个实施方案，根据本发明的细胞培养基中的谷胱甘肽以大约1.5μg/ml的浓度存在并且抗坏血酸以大约50μg/ml的浓度存在。

适用于在本发明中使用的胰岛素替代品包括任何化合物，其可以用来代替胰岛素并且具有与胰岛素基本上类似的作用。血清替代物中和根据本发明的最终培养基中胰岛素或胰岛素替代品的适宜浓度能够轻易地由技术人员使用本领域熟知的常规方法来确定。典型地，最终培养基中胰岛素的适宜范围是大约1μg/ml至大约1000μg/ml，优选大约1μg/ml至大约100μg/ml，更优选大约50μg/ml至大约15μg/ml。在一个实施方案中，胰岛素以大约10μg/ml的浓度存在。

适合于在本发明中使用的微量元素包括，但不限于Mn²⁺、Si⁴⁺、Mo⁶⁺、V⁵⁺、Ni²⁺、Sn²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Ba²⁺、Br^-、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、F^-、Ge⁴⁺、I^-、Rb^+、Zr⁴⁺和Se⁴⁺及其盐类。微量元素或其盐类的适宜浓度能够轻易地由技术人员使用本领域熟知的常规方法来确定。也可以使用商业上可获得的微量元素组合物如由CellGro Mediatech Inc提供的Trace Elements B和C。如果需要，可以包括例如以商业上可获得的由CellGro Mediatech Inc提供的Trace Element A组合物的形式的微量元素Cu²⁺和/或Zn²⁺。

此外，本发明已经表明氯化锂可能对胚胎干细胞有害，导致其分化。因此，在一个具体的实施方案中，血清替代物是缺乏氯化锂的。

适合于在本发明中使用的生长因子包括成纤维细胞生长因子（FGF）如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF-2）。根据本发明的最终培养基中FGF的适宜范围大约是1ng/ml至约1000ng/ml，优选大约2ng/ml至大约100ng/ml，并且更优选大约4ng/ml至约20ng/ml。在一个实施方案中，FGF以大约8ng/ml的浓度存在。虽然优选使用FGF，可以使用其他的材料来代替FGF，如旨在激活成纤维细胞生长因子受体的某些合成小分子肽（例如重组DNA变体或突变体产生的）。生长因子可以包括在根据本发明的血清替代物中或者它们可以单独加入到根据本发明的最终细胞培养基中。

还可以使用抗生素来避免根据本发明的血清替代物或培养基受到污染。对于本领域技术人员而言，适宜的抗生素或其组合，以及适宜的浓度是显而易见的。然而，如果在用于临床应用的细胞培养中使用培养基，那么可能需要避免使用抗生素。

此外，β-巯基乙醇可以包括在根据本发明的血清替代物中或者它可以单独加入到根据本发明的最终培养基中。典型地，培养基中β-巯基乙醇的最终浓度大约是0.1mM。

在本发明的明显实施方案中，上述血清替代物中的任何成分都可以直接加入到基础培养基中以提供最终细胞培养基而并非是在根据本发明的血清替代物中提供。

本发明进一步提供了用于干细胞体外衍生、维持、增殖和分化的确定的不含异源物的培养基。所述培养基包含基础培养基和如文中所述的血清替代物组合物。适合于在本发明中使用的基础培养基包括，但不限于KnockOut Dulbecco's ModifiedEagle's培养基（KO-DMEM）、Dulbecco's Modified Eagle's培养基（DMEM）、MinimalEssential培养基（MEM）、Basal Medium Eagle（BME）、RPMI 1640、F-10、F-12、a Minimal Essential培养基（aMEM）、Glasgow's Minimal Essential培养基（G-MEM）、Iscove's Modified Dulbecco's培养基和HyQ ADCF-MAb（HyClone）及其任何组合。根据一个优选的实施方案，基础培养基是KO-DMEM。

术语“基础培养基”是指能够支持干细胞生长的任何培养基，并且通常提供标准的无机盐、维生素、葡萄糖、缓冲体系和必需氨基酸。优选地，能够采用大约1g/L至大约3.7g/L的碳酸氢钠补充基础培养基。优选地，采用大约2.2g/L的碳酸氢钠补充基础培养基。

采用血清替代物补充的基础培养基它本身可以是不含异源物的或者它可以采用例如血清进一步补充。

培养的同渗容摩影响干细胞培养的成功和活力。同渗容摩，以毫-渗透压摩尔计量，是溶液中溶解的颗粒数目的度量，其是溶液产生的渗透压的一种衡量标准。正常人的血清具有大约290毫-渗透压摩尔的同渗容摩。用于其他哺乳动物细胞体外培养的培养基在同渗容摩上是不同的，但一些培养基具有高达330毫-渗透压摩尔的同渗容摩。优选地，根据本发明的培养基的同渗容摩在大约280和大约330mOsmol之间。然而，培养基的同渗容摩能够低至大约260mOsmol并且高达大约340mOsmol。在根据本发明的一个实施方案中，hESCs在大约320-330毫-渗透压摩尔的同渗容摩中生长。

根据一个实施方案，脂质、白蛋白、氨基酸、维生素、转铁蛋白、抗氧化剂、胰岛素和微量元素包括在血清替代物中，而生长因子、非-必需氨基酸、β-巯基乙醇、L-谷氨酰胺和抗生素直接加入到细胞培养基中。一个优选的培养基的最终组成如表2所示。

表2.一些优选的根据本发明的培养基制剂的最终组成采用星号标记的成分以根据本发明的血清替代物的形式提供。

根据本发明的血清替代物或培养基可能以液体或干燥的形式来提供。此外，它们可以作为任何适宜的浓缩制剂来提供。作为实例，可以采用10％、15％或20％（体积/体积）的血清替代物补充基础培养基从而达到如上给出的成分的最终浓度。需要时，血清替代物或培养基的成分可以分成兼容的亚制剂（subformulation）。

根据本发明的血清替代物和培养基可用于众多用途。根据本发明的血清替代物和培养基也可以用于新干细胞系如ESCs、ASCs和iPS细胞系的初始化，即衍生或分离。因此，本发明提供了一种用于该目的的方法。方法包含提供所需来源的已分离的干细胞，采用根据本发明的实施方案的不含异源物的培养基接触所述细胞，和在适合于细胞培养的条件下培养所述细胞的步骤。在一个实施方案中，采用层粘连蛋白（如人胎盘层粘连蛋白）和纤连蛋白（如人血浆纤连蛋白）补充培养基。优选地，以大约5μg/ml的浓度使用层粘连蛋白和纤连蛋白。

本发明的这一方面也可以表述为本发明涉及血清替代物或培养基用于初始化新干细胞系的用途。因此，本方法的所有实施方案适用于血清替代物或培养基的所述用途。

血清替代物和最终培养基适合于支持在基本上未分化状态下（优选经历数次体外传代）干细胞的维持和增殖。更具体地，所述制剂可以用于维持和增殖干细胞至少大约20代，优选至少大约30代，并且更优选至少大约50代。如实施例4所述，干细胞已被成功地维持在基本上未分化状态下甚至经历80代。所述干细胞保留其多潜能，或者多能性。例如，胚胎干细胞保持其分化为内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能。此外，所述干细胞保留其基因组完整性，所述基因组完整性例如提供其不变的核型来判断。

对于治疗应用而言，根据本发明的培养基包含无成分（如饲养层细胞）、条件培养基（从非人类的动物来源中纯化的血清或其他培养基成分）。更优选地，培养基包含使用重组或化学方法合成的成分。

因此，本发明提供了一种用于在如上所述的不含异源物的培养基中培养和维持干细胞的方法。所述方法包含采用根据本发明的培养基接触干细胞，和在适合于干细胞培养的条件下培养所述细胞。这种条件对于本领域技术人员而言是显而易见的。

本发明的这一方面也可以表述为本发明涉及血清替代物或培养基用于培养和维持干细胞系的用途。因此，本方法的所有实施方案适用于血清替代物或培养基的所述用途。

本发明的培养基也可以用于研究细胞增殖和分化，包括研究、识别和/或筛选分子，如候选药物，其i）影响未分化干细胞的增殖，ii）影响干细胞的分化，和iii）调节组织的再生。培养基也可以用于在遗传学上改造的干细胞或由此获得的分化的细胞中生产各种药剂（如治疗性蛋白质）。

血清替代物和最终培养基可以进一步用于将干细胞分化成所需的细胞系，特别是用于治疗目的。这可以通过向本发明的培养基中加入适当的和足够的浓度的致分化剂来实现。致分化剂的非限制的实例包括Noggin，其可以用于分化少突胶质细胞；sonig hedgehog和维甲酸，其可以用于分化运动神经元；bFGF，其可以用于分化视网膜细胞系；和BMP2，其可以用于分化心肌细胞；活化素A和IGF2，其可以用于分化产生胰岛素的细胞；以及活化素A、BMP2和BMP4的，其可以用于分化肝细胞。此外，致分化剂可以是致分化细胞，如END2，其可以用于分化心肌细胞。其他致分化剂是本领域所熟知的。本发明的这一方面也可以表述为本发明涉及一种用于将干细胞分化成所需的细胞系的方法。方法包含采用补充有致分化剂的根据本发明的培养基接触干细胞和在适合于干细胞培养的条件下培养所述细胞。目前的分化方案利用了各种未确定的产品和培养基，其可能对细胞的特征和分化具有未知的影响。本发明的制剂、分化方法和用途不共享这些缺点。

根据本发明的制剂、方法和用途可以任选地用于培养和/或初始化饲养细胞层上的干细胞系。适宜的饲养层细胞包括但不限于成纤维细胞，如人包皮成纤维细胞，例如CRL-2429（ATCC，Mananas，美国）。

在一些实施方案中，根据本发明的制剂、方法和用途用于干细胞的不含饲养层细胞的培养。

实施例

实施例1.培养基同渗容摩对hESCs的影响。

为了改善不含异源物的制剂的性能，我们优化了根据本发明的培养基的同渗容摩。采用5M的NaC调整同渗容摩。我们测试了5次传代人类胚胎干细胞（hESCs）培养物中各种不同的同渗容摩并且在每次传代之后检查细胞的形态。采用320mOsm的同渗容摩获得最佳性能（图1C）。采用260mOsm的同渗容摩（图1A）形成不均匀的小集落并且尽管采用290mOsm的同渗容摩（图1B）改善了集落的形态，但是集落的尺寸小。350mOsm的同渗容摩明显地限制了集落的增长（图1D）。

实施例2.具体的脂质和脂质衍生物增强了hESCs的未分化的生长。

在根据本发明的培养基（RegES）中和含有的KO-SR的常规hES培养基（Knockout血清替代物，Invitrogen公司）中测试各种脂质和脂质衍生物。在基于视觉感知的每一次传代之前评价未分化集落的一般形态，以及大小和厚度（表3）。根据结果，共轭亚油酸、二十碳五烯酸、棕榈油酸、亚油酸，亚油-油-花生四烯酸混合物并且特别是视黄醇改善了在hES培养基和根据本发明的培养基二者中未分化的集落的形态（表3）。此外，硬脂酸、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、前列腺素F2和DL-异丙肾上腺素导致hES培养基中的不良形态和/或过度分化，而在根据本发明的培养基中，这些补充物导致令人满意的形态。

此外，hESC集落被分为三类；未分化的、部分分化的和分化的。在每一次传代之前计算每一种集落类型的数目。随后，计算每一种集落类型占集落总数的百分比值（图2）。在根据本发明的培养基中，当相比于在对照hES或含有替代人血清白蛋白的Albumax的Albumax-RegES培养基（Invitrogen公司）中培养的集落时，在共轭亚油酸、二十碳五烯酸、硬脂酸、视黄醇、亚油-油-花生四烯酸混合物、DL-异丙肾上腺素、棕榈油酸和亚油酸存在的条件下，未分化集落的数目增加并且分化集落的数目减少。在hES培养基中，当相比于在对照hES培养基中培养的集落时，在胆固醇、花生四烯酸、共轭亚油酸、视黄醇和磷脂酰胆碱存在的条件下，未分化集落的数目增加并且分化集落的数目减少。

结果发现，视黄醇和共轭亚油酸整体改善了两种培养基中未分化集落的集落形态和数目。除了视黄醇和共轭亚油酸以外；二十碳五烯酸，通过增加根据本发明的培养基中未分化集落的数目导致优良的性能。因此，共轭亚油酸和二十碳五烯酸是包括在不含异源物的血清替代物中的最优选的脂肪酸。采用硬脂酸在根据本发明的培养基中观察到第三最佳性能。

表3.已评价的脂质和脂质衍生物

*评价了未分化集落的一般形态、大小和厚度。-集落的过度分化，不良形态。+不良形态，集落中不均匀的边缘，薄和/或小的集落。++令人满意的形态，集落中可以存在一些不均匀的边缘，集落具有中等厚度和大小。+++优良形态，均匀，厚和大的集落。

实施例3.视黄醇增加了干细胞标记物的增殖和表达。

视黄醇被选择用于在未分化的hESCs的维持中进一步被评价。初步研究表明，浓度为0.1-0.5μM的视黄醇是无效的并且没有看到未分化集落的形态或数目上的改善。然而，进一步的评价显示，浓度为2.0μM或以上的视黄醇改善了hESCs的增殖以及诱导了hESC特异性标记物的表达（图3）。在2.0μM视黄醇存在的条件下，集落的生长较早开始并且在第3天集落的大小已经较大（图3A-3B）。增殖分析表明，当相比于在不含视黄醇或者存在0.5μM视黄醇的条件下培养的hESCs时，在存在2.0μM或3.5μM视黄醇的条件下培养的hESCs具有几乎2倍的增殖速率（图3E）。在存在视黄醇的条件下培养的hESCs的免疫细胞化学染色显示了干细胞标记物Nanog和TRA-1-81的表达（图3C-3D）。此外，视黄醇增加了多潜能性支持基因（特别是Nanog）的表达，在存在2.0μM和3.5μM视黄醇的条件下，其相对表达水平在二十倍以上（图3F）。

实施例4.活化素A进一步提高了根据本发明的培养基的性能。

增殖分析表明，当相比于在不含活化素A培养的hESCs时，在根据本发明的培养基中存在5或10ng/ml活化素A的条件下培养的hESCs具有几乎2倍的增殖速率并且增殖速率可比于在对照组hES培养基中培养的hESCs（图4A）。荧光激活细胞分选（FACS）和定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析表明，活化素A增加了的多潜能性支持标记物在转录和翻译两个水平上的表达（图4B-4C）。

实施例5.根据本发明的培养基中hESCs的衍生、长期培养和特征。

使用根据本发明的培养基，新hESC系（07/046和08/013）已经从捐赠用于干细胞研究的盈余的劣质人类胚胎中成功地衍生得到。人类ESC系已经连续培养了超过80代。这些细胞系的核型已经被有规律地确定并且显示出正常的二倍体核型（图5A）。荧光激活细胞分选（FACS）和定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析表明，这些细胞系以与使用hES培养基衍生和培养的hESC系Regea 06/040相当水平表达干细胞标记物（图5B，D）。细胞增殖的分析显示，Regea 07/046和Regea 08/013细胞系的细胞增殖速率与Regea 06/040的细胞增殖速率相当（图5C）。根据本发明的培养基也能够用于hESCs的冻结和融化（图5E）。

为了确认新生细胞系在体外保持其多潜能性，我们进行胚体（EB）分析。来自于细胞系Regea 07/046和08/013的EB-衍生的细胞表达了来自于三种不同的胚胎细胞系（内胚层，外胚层和中胚层）的标记物（图5F）。我们还测试了在不含异源物的条件下衍生和长期培养的hESCs是否能够分化成心肌细胞和神经细胞系。在心脏分化开始后12-16天之后观察自发性跳动区域。分离的，自发性跳动的细胞具有条纹状图案并且采用肌钙蛋白T和心室肌球蛋白重链标记物染色呈阳性（图5G-5H）。为了生成神经元细胞，将在根据本发明的培养基和hES培养基中培养的hESC集落分割成小簇并且在悬浮液中培养长达20周。分化的细胞在RT-PCR中表达了神经前体标记物、神经元标记物和星形细胞标记物（图5I）。免疫组化染色证实了细胞的神经元和神经胶质命运（图5J）。这些结果表明，hESC系的在根据本发明的不含异源物的培养基中衍生和培养的hESC系保持了其多潜能性并且此外心肌细胞和神经元细胞能够从这些细胞系中产生。

实施例6.根据本发明的培养基中iPS细胞的培养和特征。

为了进一步说明用于人类多潜能细胞而开发的根据本发明的培养基的性能，我们在这些条件下，在人类饲养层细胞上培养了两种人类诱导的多潜能干细胞（iPS细胞）系。细胞的形态和干细胞标记物表达类似于在hES培养基中培养的细胞（图6A-6B）。此外，EBs的分析表明，在根据本发明的培养基中培养的iPS细胞维持了它们分化成所有三种胚层的能力（图6C）。

实施例7.根据本发明的培养基中ASCs的培养和特征。

从脂肪组织样品中分离的ASC用于评估用于间质干细胞的培养的根据本发明的培养基的性能。为了确定根据本发明的培养基和含有人类血清的培养基（HS培养基）中生长的ASCs的增殖速率，在几个时间点（第1、4、7和11天）进行WST-1增殖分析。七种ASC系用于在两种条件下分析。同时，通过光学显微检测观察细胞形态以确认增殖分析的结果（图7A-7D）。增殖分析显示，与HS培养基相比，含有根据本发明的培养基的培养物在第4天展示出更高的ASCs增殖速率（图7E）。随后，与HS培养基相比，ASCs在根据本发明的培养基中于第7天和第11天继续以较高的速率增殖。在第4天（p=0.035）、第7天（p=0.022）和第11天（p=0.018）观察到根据本发明的培养基和HS培养基之间增殖速率的显著性差异（图7E）。

进行流式细胞表征来比较在根据本发明的培养基和HS培养基中扩增的ASCs的表面标记物表达特征（表4）。四种细胞系用于分析每一种培养条件。虽然两种培养条件都保持了ASCs的特征性表面标记物表达谱，统计学分析显示，在HS培养基和根据本发明的培养基中培养的ASCs的唾液黏蛋白样黏附分子CD34（p=0.043）、白细胞共同抗原CD45（p=0.017）、黏附分子CD105的（p=0.020）和MHC I型同种型HLA-ABC（p=0.021）的表达的显著性差异。

表4.在HS培养基和根据本发明的培养基中培养的ASCs的表面标记物表达特征

在HS培养基中培养的细胞系5/08、19/08、24/08和25/08处于第2-3代并且在根据本发明的培养基中培养的细胞系9/08、11/08、25/08和31/08处于第3-4代。数据表示为来自于在括号中显示的供体/样本的数目的平均值±标准差。*p<0.05。

对于本领域技术人员显而易见的是，随着技术的进步，能够通过各种方式实施发明构思。本发明及其实施方案非但没有限制在上述实施例中，反而可以在权利要求的范围中变化。

将所有引用的参考文献并入文中以供参考。

Claims

1.一种不含异源物的血清替代物，其包含至少一种选自共轭亚油酸和二十碳五烯酸的脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的血清替代物，其进一步包含活化素A。

3.根据权利要求1或2所述的血清替代物，其进一步包含视黄醇。

4.根据上述任意项权利要求所述的血清替代物，其进一步包含硬脂酸。

5.根据上述任意项权利要求所述的血清替代物，其中，共轭亚油酸（CLA）的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.5mg/l至大约5mg/l的CLA，并且二十碳五烯酸（EPA）的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约1mg/l至大约10mg/l的EPA，所述最终培养基是补充有所述血清替代物的基础培养基。

6.根据上述任意项权利要求所述的血清替代物，其中活化素A的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.001mg/l至大约0.02mg/l的活化素A，所述最终培养基是补充有所述血清替代物的基础培养基。

7.根据上述任意项权利要求所述的血清替代物，其中视黄醇的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.25mg/l至大约1.0mg/l的视黄醇，所述最终培养基是补充有所述血清替代物的基础培养基。

8.根据上述任意项权利要求所述的血清替代物，其中硬脂酸的浓度是如此的，以至于最终培养基包含从大约0.5mg/l至大约5mg/l的硬脂酸，所述最终培养基是补充有所述血清替代物的基础培养基。

9.一种不含异源物的细胞培养基，其包含基础培养基和根据权利要求1-8中任一项所述的血清替代物。

10.根据权利要求9所述的细胞培养基在干细胞维持、增殖或分化中的用途。

11.根据权利要求9所述的细胞培养基在干细胞衍生或分离中的用途。

12.一种用于在体外初始化新干细胞的方法，其包含

a）提供所需来源的已分离的细胞，

b）采用根据权利要求9所述的不含异源物的培养基接触所述细胞，和

c）在适合于干细胞培养的条件下培养所述细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述已分离的细胞是胚胎来源的、成人躯体来源的或间叶细胞来源的。

14.一种用于培养干细胞的方法，其包含

a）采用根据权利要求9所述的不含异源物的培养基接触所述干细胞，和

b）在适合于干细胞培养的条件下培养所述细胞。

15.根据权利要求12或14所述的方法，其中所述培养在饲养细胞层上进行。

16.一种用于分化干细胞的方法，其包含

a）采用补充有致分化剂的根据权利要求9所述的不含异源物的培养基接触所述干细胞，和

b）在适合于干细胞分化的条件下培养所述细胞。