KR101896803B1

KR101896803B1 - 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법 및 이에 의해 생성된 중간엽 줄기세포

Info

Publication number: KR101896803B1
Application number: KR1020160168938A
Authority: KR
Inventors: 이은주
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2016-12-12
Filing date: 2016-12-12
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2036-12-12
Also published as: KR101896803B9; KR20180067330A

Abstract

본 발명은 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 분화 유도함에 있어서 생산율을 현저히 증가시킬 수 있는 방법에 관한 것으로, 이종 지지체 및 이종 단백질을 첨가하지 않은(xeno-free) 배지에서 인간 만능줄기세포에서 48시간 내에 세포구체를 형성시키는 단계; 상기 세포구체를 조직배양접시에 부착 후 이종 단백질을 첨가하지 않은 배지에서 자연적으로 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하는 단계; 및 상기 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 이종 유래 단백질을 첨가하지 않은 배지에서 계속 증식 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명은 재생의학 및 세포치료분야에서 필요로 하는 중간엽 줄기세포를 지속적으로 대량 공급하는 것을 가능하게 함으로써, 세포치료제의 실용화를 용이하게 하고, 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법 및 이에 의해 생성된 중간엽 줄기세포 {METHOD FOR INCREASING THE RATE OF INDUCING DIFFERENTIATION OF HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS TO MESENCHYMAL STEM CELLS, AND MESENCHYMAL STEM CELLS PRODUCED BY THEREOF}

본 발명은 짧은 시간 내에 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 분화 유도함에 있어서 생산율을 현저히 증가시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화(differentiation)할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 분화가 완료되어 세포분열이 정지된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 복제(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totiportent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포 (embryonic stem cell, ESC) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및/또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있다.

배아줄기세포는 배아발생초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)로부터 형성되며, 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 가지고 있어 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며, 성체줄기세포와 달리 배세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).

인간 배아줄기세포는 인간 배아 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어진 것이다. 모든 세포로 분화될 수 있는 전분화능을 가진 인간 배아줄기세포를 세포치료제로 이용하기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만 아직 암발생의 위험과 면역거부반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하고 있는 실정이다.

이에 대한 보완책으로 최근 보고 되고 있는 것으로 유도만능줄기세포 (iPS) 가 있다. 만능줄기세포의 개념으로 포함되고 있는 iPS 는 분화가 끝난 성체세포를 여러 가지 방법으로 역분화시켜, 분화 초기 단계인 배아줄기세포로의 상태로 회귀시킨 세포이다. 현재까지 역분화 세포는 유전자 발현과 분화능에서 만능줄기세포인 배아줄기세포와 거의 동일한 성격을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 하지만 이러한 iPS의 경우도 자가 세포를 이용하여 면역거부반응의 위험성은 배제할 수 있으나, 암 발생의 위험성은 여전히 해결해야 할 과제로 남아있다.

최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역조절기능과 함께 암발생의 위험성이 없는 중간엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 등으로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 중간엽 줄기세포는 다양한 조직에서 분리 및 배양이 가능하나 각 기원에 따른 능력 및 세포표면 표지자가 조금씩 다르기 때문에 중간엽 줄기세포를 명확히 정의하는 것은 용이하지 아니하다. 다만 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태를 가지고, 기본적인 세포표면 표지자인 CD73 및 CD105 양성 발현, CD34 및 CD45 음성 발현하는 경우 일반적으로 중간엽 줄기세포로 규정하고 있다.

한편, 중간엽 줄기세포가 세포치료제로 이용되기 위해서는 재생의학 및/또는 세포치료분야에서 요구되는 최소 세포수(약 1X10⁹ 정도)를 만족시켜야 하는데, 적정조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 고려한다면 필요한 세포수는 더욱 늘어나게 된다. 따라서 기존의 다양한 기원의 중간엽 줄기세포로부터 이 정도의 양을 공급하려면 in vitro(시험관내) 실험에서 최소 10번 정도의 계대가 필요하게 되며 이 경우 세포가 노화되고 변형되어 더 이상 세포치료제로서의 목적을 달성하기에는 적합하지 아니할 수 있고, 결국 임상에 적용되는 세포와 품질평가 진행 세포가 달라질 수밖에 없어 사후 검증 형태의 과정으로 일어나는 risk를 배제할 수 없는 단점을 가지고 있다.

이러한 성체 유래 중간엽 줄기세포의 대안으로, 인간 만능줄기세포에서 중간엽 줄기세포로의 분화 유도방법이 제시되고 있으나 현재까지 알려진 방법은 많은 비용이 소요되며, 농도 조절이 필요한 특정 사이토카인(예를 들어 BMP)에 의한 유도과정 또는 xeno pathogen의 위험이 있는 xono feeder의 유도, FBS(Fetal Bovine Serum) 의 사용, 만능줄기세포에서 중간엽 줄기세포로의 분화 유도에 오랜 시간이 요구되는 점 등의 단점을 내포하고 있다. 또한 현재까지 사용된 대부분의 인간 만능줄기세포는 xeno pathogen의 문제가 될 수 있는 xeno feeder 위에서 배양되거나 nonGMP시설하에서 만들어진 것들이다.

이에, 중간엽 줄기세포의 세포치료제로의 상용화와 대중화를 보다 앞당기기 위해서는 xeno pathogen의 위험에 따른 문제점을 해소함과 동시에 단시간에 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 방법의 개발이 절실한 상황이다.

이에 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 짧은 시간 내에 xeno pathogen 문제가 없는 만능 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포의 분화를 유도하는 방법을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 이종 지지체(xeno feeder) 없이 미분화 상태로 유지시킨 인간 만능줄기세포를 bFGF (basic fibroblast growth factor) 가 첨가되지 않은 배지에서 48시간 이내로 배양하여 세포구체로 형성시킨 다음, bFGF 및 FBS (fetal bovine serum)가 첨가되지 않은 배지에서 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하고, 이를 증식 배양하여 생산량이 현저하게 증대된 중간엽 줄기세포를 얻는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 분화된 중간엽 줄기세포 및 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법을 제공한다:

a) 인간 만능줄기세포를 bFGF (basic fibroblast growth factor) 가 첨가되지 않은 배지에서 36 시간 내지 48 시간 배양하여 세포구체를 형성시키는 단계;

b) 상기 36 시간 내지 48 시간 배양으로 형성된 세포구체를 bFGF 및 FBS (fetal bovine serum)가 첨가되지 않은 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및

c) 상기 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양시키는 단계로,

상기 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 보유한 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 6일 이내에 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 c) 단계의 중간엽 줄기세포는 FBS가 첨가되지 않은 배지에서 배양되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 중간엽 줄기세포를 제공한다.

이에 더하여, 본 발명은 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포 및 심근세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 형성하기 위한 것이다.

본 발명은 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 분화 유도함에 있어서 생산율을 현저히 증가시킬 수 있는 방법에 관한 것으로, 인간 만능줄기세포를 사용하여 재생의학 및 세포치료분야에서 필요로 하는 중간엽 줄기세포를 지속적으로 대량 공급하기 위하여 시간당 생산량을 현저하게 증가시킨 중간엽 줄기세포를 제공할 수 있는 장점이 있다.

또한, 시간당 생산량이 현저하게 증가된 중간엽 줄기세포의 공급으로 인해 경제적인 효과가 우수한 특징이 있으므로 세포치료제의 실용화를 용이하게 하고, 나아가 심혈관계질환, 신경계질환 등의 난치병 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 방법에 따른 중간엽 줄기세포 분화유도 및 증식 배양 과정을 도식화한 것이며, 도 1b는 종래 방법에 따른 중간엽 줄기세포 분화유도 및 증식 배양 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 이종 물질이 첨가되지 않은(xeno-free) 배양 배지에서 세포구체 배양시 자연적으로 중간엽 줄기세포로의 분화유도가 이루어짐을 나타내는 그림이다.
도 3은 중간엽 배지에서 배양한 중간엽 줄기세포가 오랜 시간 계대 배양하여도 장기간 활성을 유지함을 나타내는 그림이다.
도 4는 중간엽 줄기세포가 중간엽 특이적 마커(양성 표지자)를 발현함을 나타낸 것이다.
도 5는 중간엽 줄기세포가 중간엽 특이적 마커(음성 표지자), 내배엽 마커, 만능줄기세포 마커를 발현하지 않음을 나타낸 것이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법에 관한 것으로, a) 이종 지지체 (xeno feeder) 없이 인간 만능줄기세포를 bFGF (basic fibroblast growth factor) 가 첨가되지 않은 배지에서 36 시간 내지 48 시간 배양하여 세포구체를 형성시키는 단계; b) 상기 36 시간 내지 48 시간 배양으로 형성된 세포구체를 bFGF 및 FBS (fetal bovine serum)가 첨가되지 않은 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및 c) 상기 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 보유한 중간엽 줄기세포이다.

상기 본 발명의 방법은 모든 단계에서 이종 지지체 없이(xeno feeder free), 사이토카인 및 이종 물질 무첨가 배지에서 수행되는 것을 특징으로 한다. 또한, 종래 방법에 따르면 약 30일 가량이 소요되는 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 기간을 획기적으로 감소시켜 6일 이내에 중간엽 줄기세포로 분화를 유도할 수 있을 뿐 아니라, 분화된 중간엽 줄기세포를 증식 배양하여 30일이면 대량 공급이 가능한 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있는 특징이 있다(도 1a 참조).

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이:transit') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. 이러한 줄기세포는 다양한 방법으로 분류할 수 있다. 그 중 가장 흔히 이용되는 방법 중 하나는 줄기세포의 분화능에 따른 것으로 3배엽으로의 분화가 가능한 만능줄기세포(pluripotent stem cells), 특정 배엽 이상으로의 분화로 한정되는 다분화능 줄기세포(mutipotent stem cells) 및 특정 배엽으로만 분화가 가능한 단분화능 줄기세포(unipotent stem cells)로 나눌 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '만능줄기세포'라 함은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화될 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭하며, 일반적으로 배아줄기세포와 유도만능줄기세포(iPS)가 이에 해당된다. 성체줄기세포는 다분화능 또는 단분화능 줄기세포로 구분할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명에서 사용된 용어 ‘세포구체 (cell aggregate)’ 는 만능줄기세포의 분화를 유발시켜 생성된 응집체이다. 만능줄기세포를 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)를 제거한 배아줄기세포 배양배지에서 지지체 없이 부유 상태로 배양시키면 세포구체가 생성될 수 있다. 이러한 방법으로 만들어지는 세포구체는 내배엽, 중간엽, 외배엽의 개체 형성시 필요한 모든 세포로의 분화가 가능함이 보고된 것으로 만능줄기세포의 전능성을 나타내는 체외에서의 증명 방법 중의 하나이다.

본 발명은 배양 36 내지 48시간의 세포구체를 선택하여 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 bFGF가 없는 배아줄기세포배지(ESM)에서 부유 상태로 인간 만능줄기세포를 배양하여 형성된 배양 세포구체를 선택하여 중간엽 줄기세포로의 분화 유도에 사용할 수 있다. 종래의 인간 만능줄기세포(일반적으로는 인간 배아줄기세포)로부터 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 방법에서는 일반적으로 배양 14일째의 배아체를 사용하였다(도 1b 참조). 그러나 본 발명자는 배양 36시간 내지 48시간째의 세포구체를 선택함으로써 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 분화 유도하는 데 있어서 생산율을 현저하게 증가시킬 수 있다는 사실을 최초로 발견하였다. 이와 관련하여, 36시간 내지 48시간째의 세포구체를 선택하여 부착한 후 배양 2일째 및 4일째 세포구체의 모습을 살펴본 결과, 중간엽 줄기세포로 분화가 유도됨을 확인하였다(도 2 참조).

따라서 본 발명은 배양 36 시간 내지 48 시간째의 세포구체를 조직배양접시에 부착한 후 bFGF가 첨가되지 않은 배지에서 배양하여 자연적으로 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 또한, 인간 만능줄기세포에서 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 경우, 일반적으로 외부에서 사이토카인인 BMP (bone morphogenic protein) 등을 첨가하여 분화 유도를 개시하는 것이 일반적이다. 그러나 본 발명에서는 BMP 등의 첨가 없이 일반적인 세포배양배지를 사용하여 상기 세포구체를 배양하여도 중간엽 줄기세포로 분화가 자연스럽게 유도됨을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는 bFGF가 첨가되지 않은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 성분을 포함하는 배아줄기세포배지(ESM)를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 bFGF 및 FBS (fetal bovine serum) 가 첨가되지 않은 xeno-free 중간엽 배지에서 유지 및 증식 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일실시예에서는 중간엽 배지(Mesenchymal medium)로 FBS가 첨가되지 않은 STEMPRO^® MSC SFM 배지(GIBCO, Cat no. A10334;A10333)를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 이종 단백질과 같은 이종 물질이 포함되지 않은(xeno-free) 중간엽 배지를 사용할 수 있다. 중간엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 상기에서 설명한 바와 같이 충분한 양의 세포를 공급하는 것이 우선되어야 하는데, 이를 위해서는 중간엽 줄기세포의 계대배양이 필요하다. 그러나 계대배양을 계속하게 되면 중간엽 줄기세포가 노화되어 분열능력이 없어지고 그 활성(분화능)을 잃어버리게 되는 문제가 있다. 이와 관련하여 본 발명자는 FBS 무첨가 배지에서도 체외배양시 중간엽 줄기세포의 활성이 오래 유지될 수 있음을 확인하였다(도 3 참조).

따라서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 분화된 중간엽 줄기세포 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공할 수 있다. 중간엽 줄기세포는 finger print pattern 형태와 기본적인 세포표면 표지자 CD73(+), CD105(+), CD34(-), CD45(-) 등의 발현 정도로 규정하고 있으며, 골세포, 연골세포, 근육세포 등으로 분화가 가능하다. 이에, 상기 세포치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 형성 및 환경에 따라 다양한 세포로의 분화 등에 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

단시간 내 인간 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 방법

<1-1> 세포구체 형성

이종 지지체 없이(xeno feeder free) Vitonectin(VTN-N, Recombinant Human Protein, Truncated GIBCO, Cat no. A14700) 5μg/ml(0.5μg/cm²)을 코팅한 60Ф 배양접시에서 배아줄기세포배지(Essential 8™ Medium(GIBCO, Cat no. A1517001) + 50x Supplement; Essential 8™: DMEM F12 + L-Scorbic Acid + NaHCO₃ + Selenium + Transferrin + Insulin + TGFβ1 + FGF)를 사용하여, 미분화 상태로 유지되던 인간 배아줄기세포에 대하여 단백질분해효소(dispase, 2mg/ml)를 처리하고 미세 작업으로 분리한 다음, 인간 만능줄기세포의 미분화 유지인자인 bFGF가 없는 배아줄기세포배지(ESM)에서 부유 상태로 36~48시간 배양하여 세포구체를 형성시켰다. 보다 상세하게, 상기 세포구체 형성은 36~48시간 배아줄기세포를 부유 배양한 것으로, 세포 구체형성 배지는 다음과 같다: Essential 6™ Medium(GIBCO, Cat no. A1517001) + 50x Supplement; Essential 6™ Medium: DMEM F12 + L-Scorbic Acid + NaHCO₃ + Selenium + Transferrin + Insulin.

<1-2> 중간엽 줄기세포로의 분화 유도

36~48시간의 부유 배양으로 만들어진 세포구체를 조직배양접시에 부착시킨 다음 bFGF가 첨가되지 않은 배지(Essential 6™ Medium, GIBCO, Cat no. A1516401) 또는 중간엽(Mesenchymal) 배지(STEMPRO^® MSC SFM. GIBCO, Cat no. A10334;A10333) 에서 6일간 배양하면서 자연적으로 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포구체 부착 후 2일째 및 4일째 관찰 결과, 섬유아세포증식인자(bFGF)가 포함되어 있지 아니하며 FBS가 없는 일반적인 배양 배지에서 세포구체 배양시 자연적으로 중간엽 줄기세포로 분화유도가 개시된다는 것을 확인하였다.

상기로부터, 이종 단백질 없이도(xeno-free) 본 발명의 사용배지로 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로 분화를 유도할 수 있음을 확인하였다.

<1-3> 분화유도된 중간엽 줄기세포의 유지 및 증식 배양

상기 실시예 <1-2>에서 세포구체 부착 후 6일간 배양하여 분화유도된 중간엽 줄기세포를 다시 100Ф 조직배양접시 1개로 sub-culture하여 배양하였으며, 이때의 세포 계대를 p2로 하였다. 이때, 배양 배지는 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가되지 않은 중간엽 배지(STEMPRO^® MSC SFM. GIBCO, Cat no. A10334;A10333)를 이용하여 37℃에서 계대(passage) 배양함으로써 중간엽 줄기세포를 유지 및 증식 배양시켰다.

상기 계대 배양시 중간엽 줄기세포의 활성 유지여부와 관련하여, 장기간 배양에도 중간엽 줄기세포의 동일성 및 그 활성이 계속 유지될 수 있는 지를 조사하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 p4, p10, p15 배양한 후의 세포를 관찰한 이미지로, 여전히 중간엽 줄기세포의 전형적인 패턴인 finger printing pattern의 성장 모양을 나타나 중간엽 줄기세포의 활성이 지속적으로 유지됨을 알 수 있다.

상기로부터, 이종 단백질의 첨가 없이(xeno-free) 중간엽 배지로 계대 배양시 중간엽 줄기세포의 동일성 및 활성이 장기간 지속될 수 있음을 확인하였다.

[ 실시예 2]

중간엽 줄기세포의 세표표면 표지자 분석

상기 실시예 1의 방법으로 분화된 중간엽 줄기세포에 대하여 특이적인 세포표면 표지자의 발현 유무를 분석하였다. 항원-항체 반응을 실시 후 형광세포분석기를 이용하여 얻은 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 중간엽 줄기세포 특이 표지자인 CD90, CD73, CD44, CD105 및 CD29가 발현됨을 확인하였다.

반면, 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 중간엽 줄기세포 음성(negative) 표지자인 CD34 및 CD45는 발현되지 않았고, 인간 만능줄기세포 표지자(hESCs markers)인 TRA-1-60도 발현되지 않은 것으로 나타나 미분화 세포가 남아있지 않음을 알 수 있었다. 또한, 혈관세포 표지자인 CD31도 발현되지 않은 것으로 나타나 중간엽 줄기세포가 아닌 다른 세포로는 분화하지 않았음을 알 수 있었다.

결론적으로, 본 발명의 방법에 따르면 단시간내에 인간 만능줄기세포로부터 선택적으로 중간엽 줄기세포만을 분화유도하고 아울러 장기간의 증식 배양시에도 여전히 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지할 수 있음을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법:
a) 이종 지지체(xeno feeder) 없이 인간 만능줄기세포를 bFGF (basic fibroblast growth factor) 가 첨가되지 않은 배지에서 36 시간 내지 48 시간 부유배양하여 세포구체(cell aggregate)를 형성시키는 단계;
b) 상기 36 시간 내지 48 시간 배양으로 형성된 세포구체를 bFGF 및 FBS (fetal bovine serum)가 첨가되지 않은 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 단계; 및
c) 상기 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양시키는 단계로,
상기 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 보유한 중간엽 줄기세포이고,
상기 중간엽 줄기세포는 CD73+, CD44+, CD34- 및 CD45- 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 b) 단계는 6일 이내에 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계의 중간엽 줄기세포는 FBS가 첨가되지 않은 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 배지는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), 아스코르브산, 탄산수소나트륨, 셀레늄, 트랜스페린 및 인슐린으로 이루어진 첨가물을 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, a) 단계의 인간 만능줄기세포는 이종 지지체(xeno feeder) 없이 비토넥틴(vitonectin)을 코팅한 배양접시에서 배아줄기세포 배지를 사용해 미분화 상태로 유지되던 인간 만능 줄기세포를 분리한 것을 특징으로 하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 배아줄기세포 배지는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium), 아스코르브산, 탄산수소나트륨, 셀레늄, 트랜스페린, 인슐린, TGFβ1 및 FGF로 이루어진 첨가물을 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는, 방법.
하기를 포함하는, 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율 증가용 배지 세트:
a) 인간 만능줄기세포를 부유배양하여 세포구체(cell aggregate)를 형성하기 위한 bFGF (basic fibroblast growth factor) 가 첨가되지 않은 이종 지지체(xeno feeder) 없는 배지;
b) 세포구체를 중간엽 줄기세포로 분화유도하기 위한 bFGF 및 FBS (fetal bovine serum)가 첨가되지 않은 배지; 및
c) 상기 중간엽 줄기세포의 동일성을 유지하면서 증식 배양하기 위한 배지,
단, 상기 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 및 심근세포를 포함하는 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotency)을 보유한 중간엽 줄기세포이고,
상기 중간엽 줄기세포는 CD73+, CD44+, CD34- 및 CD45- 인 것을 특징으로 함.