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CN102836438A - 多组分生物学转运系统 - Google Patents

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CN102836438A CN2012102972738A CN201210297273A CN102836438A CN 102836438 A CN102836438 A CN 102836438A CN 2012102972738 A CN2012102972738 A CN 2012102972738A CN 201210297273 A CN201210297273 A CN 201210297273A CN 102836438 A CN102836438 A CN 102836438A
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M·D·戴克
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Revance Therapeuticals Inc
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Abstract

提供了用于递送，包括透皮递送具有生物活性的试剂的组合物和方法，所述具有生物活性的试剂是例如除了胰岛素、肉毒毒素、抗体片段和VEGF外的非蛋白非核酸治疗剂和基于蛋白的治疗剂。所述组合物和方法特别地适用于抗真菌剂和适合用于免疫的抗原试剂的局部递送。可选择地，可用用于组合物靶向递送的组分和成像组分制备所述组合物。

Description

多组分生物学转运系统
本申请是申请日为2005年3月3日、申请号为200580014006.3、发明名称为“多组分生物学转运系统”的发明专利申请的分案申请。
交叉引用相关的申请
本申请是2001年7月20日提交的美国申请09/910,432的部分继续申请案，所述美国申请09/910,432要求2000年7月21日提交的美国临时申请系列号60/220,244的优先权，其内容在此以其全文引用作参考。
关于在联邦资助建立的研究和开发下进行的发明的权利的声明不适用
发明背景
基因递送系统广泛地可分为两类：病毒和非病毒递送系统。病毒系统具有较大的毒性风险并在临床试验中已导致许多并发症和死亡。非病毒系统虽然远不如病毒途径有效，但却提供了使应用适合于提高特异性和潜在地减少毒性的可能性。非病毒策略广义上可分为基于质脂体或基于非质脂体的两类。本发明提供的策略可用于任何已存在的非病毒方法，因此此处将描述所有的非病毒方法。
最简单的非病毒系统是直接的DNA的递送。由于DNA的负电荷的原因，实际上只有非常少量的DNA进入细胞并且大部分被降解掉。事实上，在该策略中无核靶向性序列的DNA不进入细胞核。常规地，使用其它因素来增强基因/产物(DNA、RNA或更近年来的蛋白治疗剂)递送的效率，通过机械作用例如电穿孔、超声、“基因枪”和直接的显微注射，或通过电荷中和作用和使用试剂例如磷酸钙、聚赖氨酸和脂质体制剂的化学作用来增强效率。在后面的策略中，电荷中和作用已显示增加非特异性效率，超过单独的脂质体制剂的化学/机械作用的效率数倍。基于这些和类似的结果，许多人已断定，为了有效地被细胞吸收，需要对DNA和RNA进行电荷中和作用，因为DNA的负电荷基本上阻止了运输，除了通过随后的溶酶体融合进行胞浆溶解(通过加入其他试剂逃避降解)外。大多数转染剂实际上使用超过DNA净负电荷2至4倍的比例的过量正电荷。所得的带正电荷的杂合体通过离子相互作用结合带负电荷的细胞表面蛋白聚糖并且显著地增强了随后的吸收作用。一些转染剂似乎具有细胞向性(cell tropism)，最可能的原因是更有效地靶向特定蛋白聚糖的空间和电荷模式，所述蛋白聚糖在细胞型特异性模式方面是不同的。即使使用合适的试剂(即，正确的向性)，相对于病毒策略，单独的或和脂质体组合的电荷中和作用的效率仍然十分低下。因此，人们已鉴定了许多有助于复合物有效地进入细胞和通过任何内溶酶体(endolysosome)阶段的肽和肽片段。几种这样的转运因子甚至使得能够有效地进入细胞核。在一个方法中，将转运因子直接连接至目的治疗物(小药物、基因、蛋白等)。该方法要求产生、纯化和检测附着至转运因子的新药。在许多情况下，这些杂合体构成了新药，从而需要完全的检测。这样的方法导致显著增加的风险和花费。可选择地，许多策略仅仅将试剂非特异性地(或甚至在表面上特异性地)混合入作为药物/DNA/因子的载体的脂质体制剂。尽管在效率方面改进了直接或更简单的用药方案(modality)，但这些方法仍然效率低下(相对于病毒)并且远比简单的非病毒策略更有毒性。该低效率的部分原因是由于较弱的细胞核转运作用。因此，策略已逐渐发展成向上述复合物中加入作为治疗因子杂交体的部分或脂质体混合物的部分的细胞核转运信号。其他改进已包括试图降低DNA/RNA/因子的降解。
上面提出的基本策略中的最重要的改进已包括和治疗因子一起的特异性配体或其他靶向试剂。这些策略提供了大大降低非特异性毒性和显著提高效率的可能性，特别是当和上述的效能试剂组合时。然而，目前的策略基于和单个载体的共价连接，从而必需特异性的合成(以确保在替代方案的量度上的空间考量不会使单个因子比其他因子占优--即，确保各效能因子和各成像部分和各靶向部分存在于主链上)。这事实上使得许多特异性的结构不可能发生(例如，唾液酸基-lewis X和针对表面抗原的Fab片段，因为在大多数方案中，空间限制阻止一种结构或另一种结构的有效结合，从而反过来干扰了效能因子)。尽管在概念上很有前景，但这些方法代表了花费昂贵、产量极低(通过合成的话)的方法，并且还未证实能解决该问题。
很明显的是，对于非病毒基因和因子递送的发展中的每一个阶段，已经遇到了问题，在下一阶段，通过增加复杂度来解决。每一次的改进代表了超越前面标准的增加的步骤。然而，从患者护理的角度来看所述增加的复杂性带来了风险，从生产的角度来看带来了低效率和高成本。这些障碍已大大地降低了对这些在另外的情况下很有前景的潜在的治疗法的热情。
需要的是可广泛地用于各种这样的治疗剂或药妆剂(cosmeceutical agent)的组合物的新方法和组合物，所述治疗剂或药妆剂的组合物可被靶向或成像，从而使递送最大限度地到达特定位置。令人惊奇的是，本发明提供了这样的组合物和方法。
本发明还涉及这样的制剂，所述制剂用于蛋白例如胰岛素的透皮递送，还有用于更大的治疗和诊断物质的透皮递送，所述物质是例如具有50,000和更高的分子量的物质，其包括蛋白例如肉毒毒素(botulinum toxin)或其他具有生物活性的试剂例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地用于免疫的试剂。当使用术语“治疗剂”或“具有生物活性的蛋白”时，本发明明确地排除这样的抗体片段，即所述抗体片段除了只结合特异性的抗原外不具有生物活性。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍包括在本发明的合适的方面。此外，本发明也包括这样的试剂，即该试剂通过结合特异性的抗原，从而阻断配体的结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗功效。
肉毒毒素(也称作肉毒杆菌毒素或肉毒神经毒素)是由革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素。其通过阻止synoptic传递或穿过神经肌肉接头的乙酰胆碱的释放来使肌肉产生麻痹，其也被认为以其他的方式作用。其作用基本上阻断了通常导致肌肉痉挛或收缩的信号，导致麻痹或导致腺体的分泌或过量分泌例如多汗症(hyperhidrosis)或痤疮。
肉毒毒素被分为八种血清学上相关但不同的神经毒素。其中，七种可导致麻痹，即肉毒神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。通过和类型特异性抗体的中和作用来区分这些类型中的每一类型。各类型可以是天然发生的，可以是生产的重组体或通过基因工程产生的变体例如蛋白融合体。但是，对于所有这七种天然发生的活性肉毒毒素血清型或其重组体形式，肉毒毒素蛋白分子的分子量大约为150kD。因为通过细菌释放，所以肉毒毒素是包含和相关非毒素蛋白在一起的150kD肉毒毒素蛋白分子的复合物。肉毒梭菌可产生900kD、500kD和300kD形式的A型肉毒毒素复合物。B型和C型肉毒毒毒只有表观700kD或500kD的复合物产生。D型肉毒毒素可以300kD和500kD的复合物形式产生。E型和F型肉毒毒素只以大约300kD复合物的形式产生。据认为复合物(即，分子量大于大约150kD)含有非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。这两种非毒素蛋白(其和肉毒毒素分子一起组成相关的神经毒素复合物)用于为肉毒毒素分子提供对抗变性的稳定性和当毒素被摄入时提供抗消化酸的保护性。此外，更大的(大于大约150kD分子量)的肉毒毒素复合物可能导致减缓肉毒毒素从肉毒毒素复合物的肌肉注射位点的扩散速度。
肉毒毒素的不同血清型在其作用的动物种类和在其引起的麻痹严重度和持续时间上是不同的。例如，如以在大鼠中产生的麻痹率估量，已确定A型肉毒毒素比B型肉毒毒素强500倍。此外，已确定B型肉毒毒素在480U/kg的剂量(大约是灵长类动物对于A型的LD50的12倍)下在灵长类动物中是无毒的。由于肉毒毒素的分子大小和分子结构的原因，其不能穿过角质层和多层底层皮肤结构。
A型肉毒毒素据认为是已知的对人致死性最强的天然的生物学试剂。在土壤中可发现肉毒梭菌的孢子，其可在未恰当灭菌的和封闭的食物容器中生长。细菌的摄入可导致肉毒中毒，其可以是致命的。但同时，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治疗作用。肉毒毒素的受控施用已用于提供肌肉麻痹来治疗病症，例如，特征在于过度兴奋的骨骼肌的神经肌肉病症。已用肉毒毒素治疗的病症包括偏侧面肌痉挛、成人发生的痉挛性斜颈(adult onset spasmodic torticollis)、肛裂、眼睑痉挛、脑瘫、cervical dystonia、偏头痛、斜视、temperomandibular joint disorder和各种类型的肌肉痉挛和抽搐。更近以来，肉毒毒素的肌肉麻痹性作用已被用于治疗性应用和化妆品面部应用例如皱纹、眉间纹(frown lines)和面部肌肉痉挛或抽搐造成的其他结果的治疗。
肉毒中毒，由于系统性肉毒毒素暴露产生的特征性综合症状，自古以来就在欧洲存在。在1895年，Emile P.van Ermengem第一次从生腌猪肉中分离出厌氧性产孢子杆菌，该生腌猪肉获自在比利时死于肉毒中毒的猪的死后的组织。Van Ermengem发现所述疾病是由他称为肉毒芽孢杆菌(Bacillus botulinus)产生的细胞外毒素引起的(VanErmengem，Z Hyyg Infektionskr，26：1-56；Rev Infect(1897))。1922年该名称改为肉毒梭菌。名称梭菌用于反映微生物的厌氧特性，也反映其形态学特征(Carruthers和Carruthers，Can JOphthalmol，31：389-400(1996))。在1920年代，在其他食物中毒暴发后分离了A型肉毒毒素的粗提物形式。University of California，San Francisco的Dr.Herman Sommer进行了第一次纯化神经毒素的尝试(Borodic等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，7：54-60(1991))。1946年，Dr.Edward J.Schantz和其同事分离了以晶体形式存在的神经毒素(Schantz等人，In：Jankovi J，Hallet M(Eds)Therapy with Botulinum Toxin，New York，NY：Marcel Dekker，41-49(1994))。到了1949年，Burgen和其同事能够证明肉毒毒素阻断通过神经肌肉接点的冲动(Burgen等人，J Physiol，109：10-24(1949))。Allan B.Scott在1973第一次在猴子中使用肉毒毒素A(BTX-A)。Scott证实持续3个月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna，Science，130：763-772(1959))。此后很快地，报导了BTX-A成功地在人中治疗了斜视、眼睑痉挛、和痉挛性斜颈(Baron等人，In：Baron EJ，Peterson LR，Finegold SM(Eds)，Bailey&ScottsDiagnostic Microbiology，St.Louis，MO：Mosby Year Book，504-523(1994)；Carruthers和Carruthers，Adv Dermatol，12：325-348(1997)；Markowitz，In：Strickland GT(Eds)HuntersTropical Medicine，第7版，Philadelphia：W.B.Saunders，441-444(1991))。在1986年，Jean和Alastair Carruthers，由眼外科医生和皮肤科医生组成的夫妻团队，开始发展肉毒毒素-A(BTX-A)的化妆品用途，用于眉间区域中和运动相关的皱纹的治疗(Schantz和Scott，InLewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，NewYork：Academic Press，143-150(1981))。Carruthers使用BTX-A治疗皱纹在1992年导致其的关于该方法的开创性出版物问世(Schantz和Scott，In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects ofBotulinum，New York：Academic Press，143-150(1981))。到了1994年，相同的组报导了关于治疗脸上其他运动相关的皱纹的经验(Scott，Ophthalmol，87：1044-1049(1980))。这导致化妆用的BTX-A治疗法的问世。
皮肤保护身体的器官免受外界环境的威胁并充当恒温器以维持身体的温度。其由几个不同的层构成，各层具有特化的功能。主要的层包括表皮、真皮和皮下组织。表皮是覆在真皮上面的上皮细胞的层化层，真皮由结缔组织构成。表皮和真皮都进一步由皮下组织(脂肪组织内层)支持。
表皮，皮肤的最上层，只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。其由角质形成细胞构成并且基于其分化的状态分为几层。表皮可进一步分为角质层和由粒状melphigian以及基底细胞组成的活表皮层。角质层是吸湿的并且按重量计算需要至少10％的水分以维持其弹性和柔软性。吸湿性部分归因于角蛋白的保持水分的能加。角质层失去其柔软性和弹性时，其变得粗糙易碎，导致干性肤质。
正好位于表皮下面的真皮为1.5至4毫米厚。其是皮肤的三层中最厚的一层。此外，真皮也包含大多数皮肤的结构，包括汗腺和脂腺(其通过在皮肤称为毛孔或粉刺的开口分泌物质)、毛囊、神经末梢和血管及淋巴管(Inlander，Skin，New York，NY：People′s MedicalSociety，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分是胶原和弹性蛋白。
皮下组织是皮肤的最深层。其充当保持体温的绝热器和保护器官的减震器(Inlander，Skin，New York，NY：People′s Medical Society，1-7(1998))。另外，皮下组织也贮存作为能源蕴藏的脂肪。皮肤的pH一般在5和6之间。该酸性是由于存在来自皮脂腺分泌物的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸酸造成的。术语“酸性保护膜”是指皮肤的大多数区域上存在可溶于水的物质。皮肤的缓冲能力部分归因于贮藏在皮肤角质层中的这些分泌物。
皱纹，老化证据标志中的一个标志，可以是由生物化学、组织学和生理学变化造成的，所述变化是从环境的破坏中积累的(Benedetto，International Journal of Dermatology，38：641-655(1999))。此外，存在可导致面部皱纹的特征性折痕、折皱和摺痕的其他次要因素(Stegman等人，The Skin of the Aging Face CosmeticDermatological Surgery，第2版，St.Louis，MO：Mosby Year Book：5-15(1990))。这些次要因素包括重力的恒定拉力、对皮肤的经常性和恒定性定位压力(即，在睡眠期间)，和由面部肌肉的收缩产生的反复的面部活动(Stegman等人，The Skin of the Aging FaceCosmetic Dermatological Surgery，第2版，St.Louis，MO：MosbyYear Book：5-15(1990))。为了潜在地减缓一些老化的迹象，使用了不同的技术。这些技术从含有α羟酸和维生素A的面部保湿液到手术方法和神经毒素的注射。
皮肤的一个基本功能是为潜在地对正常内稳态有害的水分和物质的转运提供屏障。没有坚韧的、半透性的皮肤，身体将很快脱水。皮肤帮助防止有害物质进入身体。尽管大多数物质不能渗透过屏障，但已发展了许多策略来选择性地增加皮肤的透性并获得不同程度的成功。
因为BTX不能有效地透过皮肤，为了提供治疗有效量的BTX，目前必需将毒素注射入皮肤。美国食品和药品管理局已批准了用于这样的治疗皱纹的方法，现在市售用于该治疗的BTX产品。在这些治疗中，通过受到谨慎控制或监控的注射来施用肉毒毒素，在治疗部位上产生大的毒素源。然而，这样的治疗可能是不舒适的并且一般伴随有一些疼痛。
因为肉毒毒素的局部施用的无痛性质、更大的可覆盖的治疗表面积、配制具有更高比活性的纯毒素的能力、减少的对应用肉毒杆菌治疗剂的培训、更少的起作用所必需的剂量和不需要大量的毒素来达到治疗性临床结果，所以其提供了更安全和更想要的可选择的治疗法。
由于例如减少患者的不适感的潜能，治疗剂至血液中的直接施用和便于监控递送(通过使用特殊建造的设备和/或使用控释制剂和技术进行监控)的有利因素的原因，其他治疗剂的透皮施用也是极其吸引人的领域。想要舒适地施用的一种物质是胰岛素，其在许多情况下仍然必需通过注射(包括自我注射)施用。施用的简易性对更大的蛋白例如肉毒毒素也是有利的。不容易穿过皮肤但显著小于胰岛素或具有不同的物理化学性质的其他药剂从而在具有或不具有其他材料帮助该转移的情况下具有不同的穿过皮肤的速率和能力。各药剂和协助转移的材料的其他相互作用对于各药剂来说是独特的。
发明概述
在一个方面，本发明提供了这样的组合物，其包含下列物质的非共价复合物：
a)带正电荷的主链；和
b)至少两个选自下列的成员：
i)具有数个附着的成像部分，或可选择地数个带负电荷的成像部分的第一带负电荷的主链；
ii)具有数个附着的靶向部分，或可选择地数个带负电荷的靶向部分的第二带负电荷的主链；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子(persistence factor)的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂或带负电荷的生物学试剂的第三带负电荷的主链。
其中复合物携带净正电荷和选自i)、ii)、iii)或v)的成员中的至少一个成员。
生物学试剂，在本发明的该方面，可以是治疗剂或药妆剂。当使用术语“治疗剂”或“生物活性蛋白”时，本发明明确地排除了只结合特异性的抗原但不具有其它生物活性的抗体片段。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。此外，本发明包含通过结合特异性的抗原，从而阻断配体结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗效果的试剂。可选择地，候选试剂可用于在体内确定在这些非共价复合物中的效率。
在另一方面，本发明提供了这样的组合物，该组合物包含带正电荷的主链和至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的核酸成员的非共价复合物，所述主链具有至少一个附着的效能基团。
在另一方面，本发明提供了在受试者中将生物学试剂递送至细胞表面的方法，所述方法包括给所述受试者施用上述组合物。
在另一方面，本发明提供了用于制备药物或药妆组合物(cosmeceutical composition)的方法，所述方法包括将带正电荷的主链成分和至少两个选自下列的成员与药物或药妆可接受的载体组合形成具有净正电荷的非共价复合物，前提是所述成员中的至少一个选自i)、ii)、iii)或v)：
i)具有数个附着的成像部分，或可选择地数个带负电荷的成像部分的第一带负电荷的主链；
ii)具有数个附着的靶向部分，或可选择地数个带负电荷的靶向部分的第二带负电荷的主链；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂或药妆试剂，或带负电荷的生物学药剂或药妆试剂的第三带负电荷的主链；
在另一方面，本发明提供了用于配制药物或药妆递送组合物的试剂盒，所述试剂盒包括带正电荷的主链成分和至少两种选自上述i)组至v)组的成分，以及制备所述递送组合物的说明书。
在另一方面，本发明涉及这样的组合物，该组合物包含具有生物活性的试剂例如胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的其他蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地用于免疫的试剂，以及这样的载体，即所述载体包括具有此处描述的附着的带正电荷的分支或“效能”基团的主链的带正电荷的载体。当使用术语“治疗剂”或“生物活性蛋白”时，本发明明确地排除了只结合特异性的抗原但不具有其它生物活性的抗体片段。然而，因为适合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。此外，本发明包含通过结合特异性的抗原，从而阻断配体结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗效果的试剂。所述具有生物活性的试剂优选地是胰岛素、肉毒毒素(BTX)、用于免疫的抗原或某些抗真菌剂。合适的抗真菌剂包括，例如，两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑、制霉菌素、环吡酮等。最优选的带正电荷的载体是链较短的或链长度中等的带正电荷的多肽或带正电荷的非肽聚合物，例如，聚烯化亚胺。当具有生物活性的试剂是肉毒毒素时，本发明还涉及用于产生生物学效应的方法例如通过局部使用(优选地对需要该治疗的受试者或患者的皮肤使用)含有有效量的肉毒毒素的组合物来进行肌肉麻痹、减少分泌过多或出汗、治疗神经疼痛或偏头痛、减轻肌肉痉挛、预防或减轻痤疮、或减轻或增强免疫应答。本发明也涉及用于产生美容和/或化妆效果的方法，例如通过给脸部局部使用肉毒毒素而不是通过注射入脸部肌肉来发挥作用。当具有生物活性的试剂是胰岛素时，本发明涉及通过对受试者的皮肤或上皮施用有效量的这样的组合物来将胰岛素透皮递送入受试者的方法，所述组合物包含胰岛素或胰岛素和带正电荷的主链的组合物。下面的蛋白具有广泛不同的表面和物理化学性质，所述蛋白与该相同试剂和本发明的载体的复合物相比，明显地一般不能穿过皮肤或上皮从而是使该蛋白在降低血糖上不具有治疗效果，这通常使得不能确定提供胰岛素的透皮递送的技术是否对任何其他蛋白具有阳性结果。然而，本发明的载体令人相当吃惊地能够提供这样的其他蛋白(包括，例如肉毒毒素)的透皮递送，如此处所描述的，所述载体具有这样的带正电荷的主链，所述主链具有带正电荷的分支基团。使用检测法例如实施例描述的检测法可容易鉴定适合特定蛋白的透皮递送的特定载体。这样的蛋白可以，例如，是具有分子量超过50,000kD或低于20,000kD的大蛋白。如此处所用的，词“治疗”在血糖的意义上是指血糖水平上的降低，该降低足以在例如糖尿病患者中减轻高血糖症的急性症状或体征。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，其可包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。在本发明的某些方面，明确地排除能够获得血糖的治疗性改变的治疗性蛋白的透皮递送。如此处所用的，适合用于免疫的抗原性试剂可以是不会治疗性地改变血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核酸试剂或其杂合体。然而，编码抗原的核酸明确地不适合用于本发明的组合物。因此，所包括的试剂是适合用于免疫的抗原自身。合适的抗原包括，例如，环境试剂、病原体或生物危害物质(biohazard)的抗原。合适的试剂优选地包括，例如，和肉毒中毒、疟疾、狂犬病、炭疽、结核病相关的抗原，或和儿童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破伤风、b型嗜血杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎病毒、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、肺炎球菌属、A型肝炎和流感的免疫相关的抗原。
带正电荷的载体或具有其带正电荷的分支基团的主链，如此处所描述的，其自身为新的化合物，并形成本发明的另一方面。
本发明也提供了制备药物或药妆组合物的方法，该方法包括组合载体和具有生物活性的试剂，所述载体包含带正电荷的多肽或带正电荷的非肽聚合物例如长链聚烯化亚胺、所述多肽或非肽聚合物具有此处描述的带正电荷的分支基团或“效能”基团，所述具有生物活性的试剂是例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地用于免疫的试剂。本发明也提供了用于制备或配制包含载体和治疗性物质的此等组合物的试剂盒、和生产可用的制剂所需的其它产品或可用于生产这样的制剂的预混剂。这样的试剂盒可由施药器(applicator)或用于使用本发明的组合物或其组分以及方法的其他设备组成。如此处所用的，“设备”可以是指例如用于递送或混合的仪器或施药器或形成或使用本发明的组合物和方法的其他制备技术。
本发明也包括用于透皮施用具有生物活性的试剂的设备，所述试剂是例如胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地组合物中所包含的用于免疫的试剂，在一个实施方案中，所述组合物包含这样的载体和刚刚提到的治疗剂，所述载体包括优选地从短链至中等链长度的带正电荷的多肽或更长链的具有此处所定义的带正电荷的分支基团或“效能”基团的非肽聚合载体。这些设备在结构上可以如皮肤贴剂一样简单，或可以是更复杂的设备，包括用于分配和监控组合物分配的工具和任选地用于在一个或多个方面监控受试者的状况的工具，包括监控受试者和正被分配的物质的反应。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，该相互作用可包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。
可选择地，所述设备可只包含治疗性的具有生物活性的试剂例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地用于免疫的试剂，可以分开的方式将所述载体用于皮肤。因此，本发明也包含这样的试剂盒，其包含通过皮肤分配药物的设备和含有带正电荷的载体或主链并适合用于受试者的皮肤或上皮的材料。
一般地，本发明也包含用于给需要其的受试者或患者施用具有生物活性的试剂的方法，所述试剂是例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地用于免疫的试剂，该方法一般包括施用和带正电荷的多肽或非多肽聚合物例如聚烯化亚胺一起的有效量的所述具有生物活性的试剂，所述聚烯化亚胺具有此处描述的带正电荷的分支基团。“和......一起”是指以组合方式将两种成分-具有生物活性的试剂和带正电荷的载体-一起施用，该方法可包括将其在组合物中混合，然后再将组合物给受试者施用，或将其分开施用，但以使其一起作用，从而提供有效量的具有生物活性的试剂的必需递送的方式分开施用。例如，可首先将含有带正电荷的载体的组合物用于受试者的皮肤，然后使用含有具有生物活性的试剂的皮肤贴剂或其他装置。
本发明也涉及给上皮细胞施用具有生物活性的试剂的方法，所述试剂是例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地如此处所定义的用于免疫的试剂，所述上皮细胞包括除了皮肤上皮细胞外的上皮细胞，例如，眼上皮细胞或肠胃系统的细胞。
附图概述
图1表示用于本发明的组分的示意图。
图2表示本发明的几个实施方案的示意图。
图3-4表示含有如实施例2中所描述的大肠杆菌β半乳糖苷酶的转基因的质粒的透皮递送的结果。
图5表示含有如实施例3中所描述的大肠杆菌β半乳糖苷酶的转基因的质粒的透皮递送的结果。
图6表示含有如实施例4中所描述的大肠杆菌β半乳糖苷酶的转基因的质粒的透皮递送的结果。
图7表示含有如实施例5中所描述的肉毒毒素的透皮递送的结果。
图8是实施例6中所描述的肉毒毒素的透皮递送的结果的照片。
图9是这样的两种不同视野和不同放大倍数(图框a和b10X对图框c和d40X的放大倍数)的照片描述，其描述了实施例9的成像复合物遵从具有荧光光学成像试剂(图框b和d)的黑色素瘤色素细胞的明视野分布(图框a和c)而分布。
发明描述
总述
本发明提供了成像试剂、基因或其他治疗剂的选择性、持久性的递送的基于组分的系统。可通过在bedside制剂中设计想要的组分来选择组合物的单个性状。此外，在一个方面，在分开的带负电荷的主链上提供成像部分和特异性靶向部分，所述主链可与带正电的主链形成非共价离子复合物。通过将这些组分置于带负电荷的主链上，本发明避免了如其他策略(所述策略增加了复杂性和成本，以及将效能降低至这样的水平，即由于空间限制的原因还没有报导过成功的组合)所采用的将组分附着至带正电的主链上的精确位置上。
在另一方面，通过单独地使用某些带正电荷的载体可透皮递送某些物质，而无需带负电的主链的参与。在这些情况下，所述物质和其衍生物具有足够的负电荷和本发明的带正电荷的载体非共价结合。术语“足够的”该意义上是指可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定的结合。
图1提供了对本发明的进一步理解。在该图中，组分显示为(1)具有附着的带正电荷的基团(也称作效能基团，如附着至加黑的条块的加黑的环所示)的固体主链，例如(Gly)n1-(Arg)n2(其中下标n1是从3至大约5的整数，下标n2是从大约7至大约17的奇整数)或TAT结构域；(2)具有附着的成像部分(附着至浅色的条块的空心三角形)的短的带负电荷的主链；(3)具有附着的靶向试剂和/或治疗剂(附着至浅色的条块的空心圆)的短的带负电荷的主链；(4)寡核苷酸、RNA、DNA或cDNA(浅色的交叉影线的条块)；和(5)编码驻留因子的DNA(暗交叉影线条块)。图2举例说明多组分组合物的各种示例，其中所述基团描述于图1中。例如，在图2中，举例说明第一多组分组合物，其中带正电荷的主链和成像组分、靶向组分、寡核苷酸以及驻留因子结合。
举例说明被设计用于诊断/预后成像的第二多组分组合物。在该组合物中，带正电荷的主链和成像组分以及靶向组分结合在一起。最后，举例说明用于基因递送的第三多组分系统。在该系统中，在带正电荷的主链、靶向组分、目的基因和编码驻留因子的DNA之间形成复合物。本发明，在下面将更全面地描述，提供了许多用于治疗和诊断程序的额外的组合物。
实施方案的描述
组合物
基于上述内容，本发明在一个方面提供了包含下列物质的非共价复合物的组合物：
a)带正电荷的主链；和
b)至少两个选自下列的成员：
i)具有数个附着的成像部分或可选择地数个带负电荷的成像部分的第一带负电荷的主链；
ii)具有数个附着的靶向试剂或可选择地数个带负电荷的靶向部分的第二带负电荷的主链；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂或带负电荷的生物学试剂的第三带负电荷的主链；
其中所述复合物携带净正电荷和至少一个选自i)、ii)、iii)或v)的成员。
在一组实施方案中，所述组合物包含至少三个选自组i)至v)的成员。在另一组实施方案中，所述组合物包含来自i)、ii)、iii)和iv)组的每一个组中的至少一个成员。在另一组实施方案中，所述组合物包含来自i)和ii)组的每一个组中的至少一个成员。在另一组实施方案中，所述组合物包含来自ii)、iii)和iv)组的每一组中的至少一个成员。
优选地，带正电荷的主链的长度是来自b)组的成员的组合长度的大约1至4倍。可选择地，所述带正荷的主链的电荷是b)组的成员的组合电荷的大约1至4倍。在一些实施方案中，电荷密度是均匀的并且长度和电荷比率近似相等。可基于组分的分子研究或可从组分的质量来确定大小对大小(长度)的比率。
“带正电荷的”是指载体在至少一些溶液相条件下，更优选地在一些生理可相容的条件下具有正电荷。更确切地，此处所用的“带正电荷的”是指所述基团含有在所有pH条件都带电荷的官能团，例如季胺，或含有可在某些溶液相条件下例如pH发生变化的条件下获得正电荷的官能团，在该情况下是伯胺。优选地，此处所用的“带正电荷的”是指具有在生理可相容条件下和阴离子结合的形为的基团。对于本领域技术人员而言很明显的是具有多个带正电荷的部分的聚合物不必是同聚物。对于本领域技术人员而言，带正电荷的部分的其他示例在现有技术中是熟知的并且可容易地使用。本发明中描述的其自身不具有治疗活性的带正电荷的载体是已在例如此处描述的组合物和方法中使用的新的化合物。因此，在本发明的另一方面，我们详细描述了这些新的化合物，其包括包含这样的带正电荷的主链和其自身不具治疗性生物活性的任何载体，所述主链具有此处描述的附着的带正电荷的分支基团。当使用术语“治疗剂”或“具有生物活性的蛋白”时，本发明明确地排除了只结合特异性的抗原但不具有其它生物活性的抗体片段。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。此外，本发明包含通过结合特异性的抗原，从而阻断配体结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗效果的试剂。
在另一个实施方案中，本发明在一个方面提供了这样的组合物，该组合物包含具有生物活性的试剂，例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的试剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或可选择地用于免疫的试剂，以及包含带正电荷的主链例如带正电荷的多肽或非肽聚合物的载体，所述聚合物可以是异聚物或同聚物，例如，聚烯化亚胺、具有此处描述的带正电荷的分支基团或“效能”基团的多肽或非肽聚合物。各基于蛋白的治疗剂和非核酸非蛋白治疗剂具有独特的改变总的复合物特性的物理化学特性。这些带正电荷的载体是下面被描述为带正电荷的主链的材料中的一些材料。本发明也提供了施用治疗有效量的此处提到的具有生物活性的试剂的方法，其包括给受试者(其可以是人或其他哺乳动物)的皮肤或上皮施用具有生物活性的试剂和这样的量的具有分支基团的带正电荷的主链，所述量足以将具有生物活性的试剂透皮递送给所述受试者。在该方法中，具有生物活性的试剂和带正电荷的载体可用作预先混合的组合物，或可以分开的方式给皮肤或上皮施用(例如，所述试剂可存在于皮肤贴剂中或其他装置中，所述载体可含于液体或其他类型的组合物中，所述组合物在皮肤贴剂使用之前用于皮肤)。如此处所用的，词“治疗”在血糖的情况下是指血糖水平的降低，该降低足以在例如糖尿病患者中减轻高血糖症的急性症状或体征。在本发明的某些方面，明确地排除能够获得血糖的治疗性改变的治疗性蛋白的透皮递送。当使用术语“治疗剂”或“具有生物活性的蛋白”时，本发明明确地排除了只结合特异性的抗原但不具有其它生物活性的抗体片段。然而，因为适合于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。此外，本发明包含通过结合特异性的抗原，从而阻断配体结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗效果的试剂。如此处所用的，适合用于免疫的抗原性试剂可以是不会治疗性地改变血糖水平的基于蛋白的抗原、非蛋白非核酸试剂或其杂合体。然而，编码抗原的核酸明确地不适合用于本发明的组合物。因此，所包括的试剂是适合用于免疫的抗原自身。合适的抗原包括，例如，环境试剂、病原体或生物危害物的抗原。合适的试剂优选地包括，例如，和肉毒中毒、疟疾、狂犬病、炭疽、结核病相关的抗原，或和儿童免疫例如B型肝炎、白喉、百日咳、破伤风、b型嗜血杆菌流行性感冒、灭活的脊髓灰质炎病毒、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、水痘、肺炎球菌属、A型肝炎和流感的免疫相关的抗原。
带正电荷的主链
带正电荷的主链(也称作带正电荷的“载体”)一般是线性的原子链，其在链上具有在生理pH下携带正电荷的基团，或具有附着至从主链延伸出来的侧链上的携带正电荷的基团。优选地，带正电荷的主链自身不具有明确的酶促或生物活性。线性主链是碳氢主链，在一些实施方案中，其被选自氮、氧、硫、硅和磷的杂原子间插。大多数主链原子通常是碳。此外，所述主链通常是重复单位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基)、聚(丙烯胺)、聚烯化亚胺等)的聚合物。在一组实施方案中，带正电荷的主链是聚丙烯胺，其中许多胺的氮原子以携带正电荷的铵基(四取代的)形式存在。在另一实施方案中，带正电荷的主链是非肽聚合物，其可以是异聚合物或同聚合物，例如聚烯化亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，具有从大约10,000至大约2,500,000、优选地从大约100,000至大约1,800,000，和最优选地从大约500,000至大约1，400,000的分子量。在另一组实施方案中，所述主链已附着多个含有带正电荷基团(例如，铵基、吡啶
Figure BSA00000766336100191
基、基、锍基、胍基或amidinium基)的侧链部分。该组实施方案中的侧链部分可以在间隔上是一致的或可变的间距沿主链放置。此外，侧链的长度可以相似或不同。例如，在一组实施方案中，侧链可以是具有从1至20个碳原子并在远端(远离主链)以上面提到的带正电荷的基团中的一个结束的线性的或分支的烃链。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，所述相互作用可包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。
在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链基团(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。优选地，所述多肽具有从大约10,000至大约1,500,000，更优选地从大约25,000至大约1,200,000，最优选地从大约100,000至大约1,000,000的分子量。本领域技术人员认识到，当氨基酸用于本发明的该部分时，所述侧链在附着的中心可具有D型或L型(R或S构型)。
可选择地，所述主链可以是多肽的类似物，例如类肽(peptoid)。参见，例如，Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)；Zuckermann等人Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1992)；和Simon等人Proc.Nat′1.Acad.Sci.USA 89：9367(1992))。简而言之，类肽是多聚甘氨酸，其中侧链附着至主链的氮原子而不是附着至α碳原子。如上所述，侧链的部分通常以带正电荷的基团结尾以提供带正电荷的主链组分。在例如美国专利号5,877,278中描述了类肽的合成。如此处所用的术语，具有类肽主链结构的带正电荷的主链被认为是“非肽”，因为其不是由在α碳原子位置上具有天然发生的侧链的氨基酸构成的。
可应用例如多肽的空间或电子模拟物来使用多种其他主链，其中肽的酰胺键由替代物取代，所述替代物是例如酯键、硫代酰胺(-CSNH-)、反向硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亚甲基(-NHCH2-)或反向亚甲基氨基(-CH2NH-)、酮亚甲基(-COCH2-)、次膦酸(-PO2RCH2-)、磷酸酰胺和磷酸酰胺酯(-PO2RNH-)、反向肽(-NHCO-)、反式烯烃(-CR＝CH-)、氟代烯烃(-CF＝CH-)、二亚甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羟亚乙基(-CH(OH)CH2-)、亚甲氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、亚磺酰胺基(-SO2NH-)、亚甲亚磺酰胺基(-CHRSO2NH-)、反向亚磺酰胺基(-NHSO2-)，以及具丙二酸和/或gem-二氨基-烷基亚单位的主链，例如，由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98：763)综述的，和由其中引用的参考资料所详细描述的。许多前述的替代物产生近似电子等排的(和形成于α氨基酸的主链相比)聚合物主链。
在上面提供的各主链中，可悬挂携带带正电荷的基团的侧链基团。例如，亚磺酰胺连接的主链(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有附着至氮原子上的侧链基团。类似地，羟亚乙基(-CH(OH)CH2-)连接可携带附着至羟基取代基的侧链基团。通过使用标准的合成方法，本领域技术人员可容易地改造其他键合化学物质以使其提供带正电荷的侧链基团。
在特别优选的实施方案中，带正电荷的主链是这样的多肽，所述多肽具有独立地选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT或其片段、或触角足(Antennapedia)的蛋白转导域、或其片段或组合的分支基团(也称为效能基团)，其中下标n1是从0至20的整数，更优选地是0至8的整数，更优选地是2至5的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25、更优选地大约7至大约17、最优选地大约7至大约13的奇整数。其他优选的实施方案是这样的实施方案，在所述实施方案中，HIV-TAT片段具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q，其中下标p和q各独立地是从0至20的整数，所述片段通过片段的C端或N端附着至主链。优选的HIV-TAT片段是其中下标p和q各自独立地是0至8、更优选地2至5的整数的片段。在另一优选的实施方案中，带正电荷的侧链或分支基团是触角足(Antp)蛋白转导域(PTD)、或其保持活性的片段。优选地带正电荷的载体以至少大约0.05％(总载体重量的百分比)、优选地从大约0.05％至大约45％、最优选地从大约0.1至大约30％重量的量的包含带正电荷的侧链分支基团。对于具有式-(gly)n1-(arg)n2的带正电荷的分支基团，最优选的量是从大约0.1至大约25％。
在另一特别优选的实施方案中，所述主链部分是多聚赖氨酸，带正电荷的分支基团附着至所述赖氨酸侧链氨基。用于该特别优选的实施方案的多聚赖氨酸具有从大约10,000至大约1,500,000、优选地从大约25,000至大约1,200,000，和最优选的大约100,000至大约1,000,000的分子量。其可以是可商购获得(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)的多聚赖氨酸中的任一种，例如，具有MW＞70,000的多聚赖氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚赖氨酸、具有MW150,000至300,000的多聚赖氨酸和具有MW＞300,000的多聚赖氨酸。多聚赖氨酸的恰当选择依赖于组合物的其余组分，要足以为组合物提供总的净正电荷和提供这样的长度，该长度优选地是带负电荷的组分的组合长度的1至4倍。优选的带正电荷的分支基团或效能基团包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一优选的实施方案中，带正电荷的主链是长链聚烯化亚胺例如聚乙烯亚胺，例如，具有大约1,000,000的分子量的聚乙烯亚胺。
这样的带正电荷的主链或载体分子是新的化合物并形成本发明的方面，所述主链或载体包含具有上述分支基团的多肽或非肽聚合物例如聚烯化亚胺和上面提到的其他带正电荷的主链。
在本发明的另一个实施方案中，只有具有带正电荷的分支基团的带正电荷的载体是活性物质的透皮递送所必需的。在该情况的一个实施方案中，所述带正电荷的载体是具有多个上述的带正电荷的侧链基团的多肽(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)。优选地，所述多肽具有至少大约10,000的分子量。在该情况的另一个实施方案中，带正电荷的载体是非肽聚合物例如具有至少大约100,000分子量的具有多个带正电荷的侧链基团的聚烯化亚胺。这些聚烯化亚胺包括聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。在任一示例中，作为单独的透皮递送所唯一必需的试剂，所述带正电荷的载体分子包含带正电荷的分支或效能基团、HIV-TAT或其片段、或触角足PTD或其片段，所述分支或效能基团包含-(gly)n1-(arg)n2，其中下标n1是从0至20，更优选地从0至8，更优选地2至5的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25，更优选地从大约7至大约17和最优选地从大约7至大约13的奇整数。优选地，所述侧链或分支基团具有上述通式-(gly)n1-(arg)n2。其他优选的实施方案是这样的方案，在所述方案中，分支或效能基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数，所述片段通过该片段的C端或N端附着至载体分子。所述侧链分支基团可在附着的中心具有D型或L型(R或S构型)。优选的HIV-TAT片段是这样的片段，在所述片段中，下标p和q各自独立地是从0至8、优选地2至5的整数。其他优选的实施方案是这样的实施方案，在所述实施方案中，分支基团是保持基团活性的触角足PTD基团或其片段。这些在本领域中是已知的，例如根据Console等人，J.Biol.Chem.278：35109(2003)。
在特别优选的实施方案中，所述载体是具有附着至赖氨酸侧链氨基的带正电荷的分支基团的多聚赖氨酸。用于该特别优选的实施方案的多聚赖氨酸可以是可商购(例如Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri，USA)获得的多聚赖氨酸中的任一种，例如，具有MW＞70,000的多聚赖氨酸、具有70,000至150,000的MW的多聚赖氨酸、具有MW150,000至300,000的多聚赖氨酸和具有MW＞300,000的多聚赖氨酸。然而，优选的多聚赖氨酸具有至少大约10,000的MW。优选的带正电荷的分支基团或效能基团包括，例如，-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7)、HIV-TAT或其片段、和触角足PTD或其片段。
其他组分
除了带正电荷的主链组分外，本发明的多组分组合物还包含至少两种选自下列的组分：
i)具有数个附着的成像部分或可选择地数个带负电荷的成像部分的第一带负电荷的主链；
ii)具有数个附着的靶向试剂或可选择地数个带负电荷的靶向部分的第二带负电荷的主链；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂或带负电荷的生物学试剂的第三带负电荷的主链。
在此处描述的相关方面，在本发明的一些实施方案或组合物中，带正电荷的主链或载体可单独地用于提供某些类型的物质的透皮递送。此处描述的具有生物活性的试剂的组合，例如，胰岛素、肉毒毒素、不会治疗性地改变血糖水平的蛋白、适合用于免疫的抗原、非蛋白非核酸试剂的组合，也可用于这些组合物。
带负电荷的主链，当用于携带成像部分、靶向部分和治疗剂时，可以是具有多个在生理条件下携带负电荷的基团的各种主链(类似于上述的主链)。可选择地，具有足够表面负电荷的成像部分、靶向部分和治疗剂不需要额外的主链的附着来和带正电荷的主链通过离子相互作用结合，这对本领域技术人员来说是显而易见的。在该上下文中，足够包含有这样的意思，即成像部分、靶向部分或治疗剂的表面存在合适密度的带负电荷的基团，从而提供和上述的带正电荷的主链的离子键。在这些情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷和本发明的带正电荷的载体非共价地结合。可通过例如颗粒大小或功能分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定该上下文中的术语“足够”。合适的带负电荷的基团是羧酸、次膦酸、膦酸或磷酸、亚磺酸或磺酸等。在一些实施方案中，带负电荷的主链是寡核苷酸。在另一实施方案中，带负电荷的主链是寡糖(例如，葡聚糖)。在另一个实施方案中，带负电荷的主链是多肽(例如，聚谷氨酸、聚天冬氨酸或这样的多肽，即在所述多肽中，谷氨酸或天冬氨酸残基被不带电荷的氨基酸间插)。一般通过酯键将下面更详细地描述的部分(成像部分、靶向部分和治疗剂)附着至具有这些悬挂基团的主链。可选择地，打断带负电荷的氨基酸或悬挂在带负电荷的主链的末端的氨基酸可用于附着成像部分和靶向部分，通过例如二硫键(通过半胱氨酸残基)、酰胺键、醚键(通过丝氨酸或苏氨酸羟基)等进行附着。可选择地，在带负电荷的聚合物不存在的情况下，所述成像部分和靶向部分自身可以是小阴离子。可选择地，所述成像部分、靶向部分和治疗剂自身可通过共价修饰以提供足够的表面带负电荷的部分以和带正电荷的主链通过离子相互作用结合，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。在这两种情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共价结合。在该上下文中，术语“足够”是指可通过例如颗粒大小或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定的结合。
成像部分
许多诊断或成像部分可用于本发明并以有效的量存在，该有效量依赖于进行诊断或成像的病症、施用的途径、试剂和用于所述试剂的检测的设备的灵敏性等。
合适的成像或诊断剂的示例包括不透射线的照影剂、顺磁性照影剂、超顺磁性照影剂、光学成像部分、CT造影剂和其他造影剂。例如，不透射线的照影剂(用于X射线成像)可包括无机和有机碘化合物(例如，泛影酸盐)、不透射线的金属和其盐(例如，银、金、铂等)和其他不透射线的化合物(例如，钙盐、钡盐例如硫酸钡、钽和氧化钽)。合适的顺磁性照影剂(用于MR成像)包括二乙三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)和其衍生物，和其他钆、锰、铁、镝、铜、铕、铒、铬、镍和钴复合物，包括和1，4，7，10-四氮杂环十二烷基-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷基-N，N′，N″-三乙酸(D03A)、1，4，7-三氮杂环壬烷基-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷基-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)、羟基苄基乙烯基-二胺二乙酸(HBED)等的复合物。合适的超顺磁照影剂(用于MR成像)包括磁铁矿、超顺磁性氧化铁、单晶氧化铁，特别是可被附着至带负电荷的主链的这些试剂中的各试剂的复合形式。其他合适的成像试剂是CT照影剂，包括碘化和非碘化以及离子化和非离子化的CT照影剂，以及照影剂例如自旋标记物(spin-labels)或其他诊断上有效的试剂。合适的光学成像试剂包括例如选自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregon green 514、绿色荧光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA的基团。
诊断剂的其他示例包括编码这样的蛋白的标记基因，当所述蛋白在细胞中表达时，其可被容易地检测到，其包括，但不限于，β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、荧光素酶等。可使用各种标记物，例如放射性核素、fluors、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。其他有用的物质是用放射性物质或成分标记的物质，例如葡庚糖酸99mTc。
将成像部分附着至带负电荷的主链的选择依赖于许多条件。某些成像试剂在生理pH下是中性的，从而优选地附着至带负电荷的主链或经共价修饰以包含足够的上述带负电荷的部分，从而保持和带正电荷的载体的复合。其他成像试剂携带足够的负电荷以使即使在缺少带负电荷的主链的情况下仍保持和带正电荷的载体的复合。在这些情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷以与本发明带正电荷的载体非共价结合。术语“足够”在本上下文中是指这样的结合，即该结合可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定。这些带负电荷的成像部分的示例包括磷酸盐离子(用于磁共振成像)。
靶向试剂
许多靶向试剂用于此处描述的组合物。一般地，如上面关于成像部分所述的，将靶向试剂附着至带负电荷的主链。在某些实施方案中，靶向试剂和成像部分在结构和/或化学性质上是截然不同的。例如，成像部分和靶向试剂两者不都是磷酸盐。一般地，靶向试剂可以是任何这样的成分，即该成分使得可能指导核酸、治疗剂或组合物的其它组分转移至特定位点或改变复合物的向性(和不具有靶向试剂的复合物的向性相比)。靶向试剂可以是细胞外靶向试剂，其可以使例如核酸转移朝向某些类型的细胞或某些想要的组织(肿瘤细胞、肝细胞、造血细胞等)。这样的试剂也可以是细胞内靶向试剂，其可使治疗剂指向特定的细胞区室(例如，线粒体、细胞核等)。所述试剂最简单地也可以是小阴离子，其可凭借净电荷的分布或改变净电荷的分布来改变复合物的向性，使其从带更高负电的细胞表面和细胞外基质组分转向更多的细胞种类或甚至特异性地离开带有最多负电的表面。
根据本发明，优选地将靶向试剂共价地或非共价地和本发明的带负电荷的主链连接。根据本发明的优选的模式，优选地通过连接基团将靶向试剂共价地附着至用作带负电荷的主链成分的寡核苷酸、聚天冬氨酸、硫酸化或磷酸化的葡聚糖等。通过使用例如异双功能连接性基团(参见Pierce Chemical Catalog)将靶向试剂(以及其他生物学试剂)附着至核酸的方法对本领域技术人员来说是熟知的。在一组实施方案中，所述靶向试剂是用于提高细胞转染的融合肽，更确切地说用于促进组合物或其各种成分跨膜迁移，或者用于帮助从内体外出或穿过核膜。所述靶向试剂也可以是存在于细胞类型的表面上的受体的细胞受体的配体，例如糖、运铁蛋白、胰岛素或去唾液酸-血清类粘蛋白。这样的配体也可以是细胞内类型中的一种，例如促进转染的DNA在细胞核内的积累的核定位信号(n1s)序列。
用于本发明的内容中的其他靶向试剂包括糖、肽、激素、维生素、细胞因子、寡核苷酸、小阴离子、脂质或来源于这些成分的序列或片段并且该序列或片段使得能够和其对应的受体特异性结合。优选地，所述靶向试剂是糖和/或肽，例如抗体或抗体片段、细胞受体的配体或其片段、受体或受体片段等。更优选地，所述靶向试剂是生长因子受体、细胞因子受体或细胞凝集素受体或粘着蛋白的受体的配体。靶向试剂也可以是使得可能靶向凝集素例如去唾液酸糖蛋白受体的糖，或可选择地是使得可能靶向免疫球蛋白的Fc片段受体的抗体Fab片段。
在其他实施方案中，在缺少带负电荷的主链的情况下使用靶向试剂。在该组实施方案中，靶向试剂携带足够的带负电荷的部分以保持和上述的带正电荷的载体通过离子相互作用结合。在这些情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共价结合。术语“足够”在本上下文中是指可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定的结合。用于该组实施方案的合适的带负电荷的靶向试剂是在生理学pH下具有净负电荷的基于蛋白的靶向试剂和可促进附着特定细胞表面的靶向试剂，例如小的聚阴离子，包括例如可以基于被靶向的细胞的净表面电荷而改变靶向的磷酸、天冬氨酸和柠檬酸。
在本发明的组合物中，核酸可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸，可包含天然的或人工来源的序列。更特别地，此处所用的核酸可包括基因组DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、杂合序列或合成的或半合成的序列。这些核酸可以是人、动物、植物、细菌、病毒等来源的核酸。此外，所述核酸可通过本领域技术人员已知的任何技术获得，特别是通过基因库的筛选获得，通过化学合成或通过混合的方法获得，该混合方法包括对通过基因库的筛选获得的序列的化学或酶修饰。此外，可将核酸整合入载体，例如质粒载体。
用于本发明的脱氧核糖核酸可以是单链或双链的。这些脱氧核糖核酸也可编码治疗性基因、用于调控转录或复制的序列、反义序列、结合其他细胞成分的区域等。合适的治疗性基因基本上是编码具有治疗效果的蛋白产物的任何基因。如此被编码的蛋白产物可以是蛋白、多肽、肽等。在某些情况下，所述蛋白产物可以是和靶细胞同源的(即其是当靶细胞未表现病原性时，一般在靶细胞中表达的产物)。通过该方式，使用合适的核酸可增加蛋白的表达，使得可能例如在细胞中克服不充足的表达。可选择地，本发明提供了用于表达或可选择地过量表达蛋白的组合物和方法，所述蛋白由于修饰的原因而失活或活性很低。因此治疗性基因可以编码细胞蛋白的突变体，该突变体具有增加的稳定性、经修饰的活性等。相对于靶细胞，所述蛋白产物也可以是异源的。在该情况下，表达的蛋白可以，例如，产生或提供细胞中缺少的活性，使其能够抵抗病原或刺激免疫应答.
更特别地，用于本发明的核酸是这样的核酸，所述核酸编码酶、血液衍生物、激素、淋巴因子、白细胞介素、干扰素、TNF、生长因子、神经递质或其前体或合成的酶、或营养因子：BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、VEGF、NT3、NT5、HARP/多效蛋白(pleiotrophin)；参与脂、选自载脂蛋白A-I、A-II、A-IV、B，C-I，C-II，C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的载脂蛋白类型的代谢的蛋白、代谢酶，例如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、7-α-胆固醇羟化酶、磷脂酸磷酸酶或脂质转运蛋白例如胆固醇酯转运蛋白和磷脂转运蛋白、结合HDLs或选自例如LDL受体、乳糜微粒残留物受体(chylomicron-remnant receptors)和清除受体(scavengerreceptors)相关的蛋白、肌营养不良蛋白或minidystrophin、GAX蛋白、和粘液粘稠病相关的CFTR蛋白、肿瘤抑制基因：p53、Rb、RaplA、DCC、k-rev；参与凝血的蛋白因子：因子VII、VIII、IX；或所述核酸可以是参与DNA修复的基因、自杀基因(胸苷激酶、胞苷脱氨酶)、编码血栓调节蛋白的基因、α1-抗胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活物、超氧化物歧化酶、弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶等的基因。
用于本发明的治疗性基因也可以是反义序列或这样的基因，所述这样的基因在靶细胞中的表达使得可能控制基因的表达或细胞mRNA的转录。根据专利EP140,308中描述的技术，这些序列可以例如在靶细胞中被转录成细胞mRNA的互补RNA，从而阻止其翻译成蛋白。反义序列也包含编码能够选择性地破坏靶RNA的核酶的序列(参见EP321,201)。
如上面所表明的，具有生物活性的试剂也可以包含一种或多种能够在人或动物中产生免疫应答的抗原性肽。在该特定的实施方案中，本发明因此可能产生用于人或动物的疫苗或免疫治疗法，特别是抗微生物、病毒或癌症的疫苗或免疫治疗法。特别地，其可以是特异性针对EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(参见EP 185,573)、假狂犬病病毒或特异性针对肿瘤(参见EP 259,212)的抗原性肽。
优选地，所述核酸也包含这样的序列，所述序列使得治疗性基因或编码抗原性肽的基因在想要的细胞或器官中表达。这些序列可以是这样的序列，当所述序列能够在被感染的细胞中发挥功能时，其天然地负责被考虑的基因的表达。所述核酸序列也可以是不同来源的序列(负责其他蛋白或甚至是合成的蛋白的表达)。特别地，所述核酸可包含用于真核或病毒基因的启动子序列。例如，所述启动子序列可以是来源于想要被感染的细胞的基因组的启动子序列。类似地，所述启动子序列可以来源于病毒的基因组，例如，基因E1A、MLP、CMV、RSV等的启动子。此外，这些表达序列可通过加入激活序列、调控序列等来进行修饰。
除此之外，所述核酸也可包含(特别是在治疗性基因的上游)指导合成的治疗性产物进入靶细胞的分泌途径的信号序列。该信号序列可以是治疗性产物的天然信号序列，也可以是任何其他功能性信号序列或人工信号序列。
编码至少一种驻留因子的DNA
在一些实施方案中，组合物也包含编码至少一种驻留因子的DNA。这样的DNA的示例是编码腺病毒终端前蛋白1(Adenoviralpreterminal protein 1)的DNA(参见，Lieber，等人NatureBiotechnology 15(13)：1383-1387(1997))。腺病毒终端前蛋白1或编码其的核酸可以顺式或反式的方式提供给编码想要的治疗性转基因的核酸序列。当以这种方式提供时，终端前蛋白1或序列以稳定的核附加体形式保存治疗性核酸，从而防止了治疗性核酸的丢失，从而防止以后治疗性蛋白表达的减少。
生物学试剂
许多生物学试剂，包括治疗剂和药妆剂，可用于本发明并且以有效的量存在，所述有效的量依赖于正被治疗的病症、预防的病症或施药的途径、试剂的功效以及患者的大小和对治疗方案的易感性。
可附着至带负电荷的主链的合适的治疗剂基本上可在任何种类的试剂中找到，包括，例如，止痛药、镇喘药、抗生素、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗真菌剂、止吐药、抗高血压药、抗性无能药、抗炎药、抗肿瘤药、抗HIV药、抗病毒药、anxiolytic agents、避孕药、致育因子、抗血栓药、prothrombotic agents、激素、疫苗、免疫抑制剂、维生素等。可选择地，可将足够的带负电荷的基团引入治疗剂以提供和上述带正电荷的主链通过离子相用作用的复合。存在许多合适的方法例如磷酸化法或硫酸盐化法，这对本领域技术人员是显而易见的。
此外，某些试剂自身拥有足够的和上述带正电荷的载体结合的带负电荷的部分而不需要附着至带负电荷的主链。在这些情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共价地结合。术语“足够”在本上下文中是指可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定的结合。
合适的药妆剂包括，例如，表皮生长因子(EGF)以及人生长激素、抗氧化剂和肉毒毒素。在本发明的上下文中，术语“肉毒毒素”不仅包括肉毒杆菌血清型A、B、C、D、E、F和G，还包括其具有肉毒毒素轻链活性的片段。
更特别地，用于本发明的治疗剂包括镇痛药如利多卡因、奴佛卡因、布比卡因、普鲁卡因、丁卡因、苯佐卡因、可卡因、甲哌卡因、依替卡因、丙美卡因、罗哌卡因、丙胺卡因等；抗哮喘药例如氮卓斯汀、酮替芬、曲撤诺、皮质激素、色甘酸钠、萘多罗米、沙丁胺醇、双甲苯喘定甲磺酸盐、吡布特罗、沙美特罗、terbutyline、胆茶碱等；抗生素药例如新霉素、链霉素、氯胺苯醇、氟哌酸、环丙沙星、甲氧苄氨嘧啶、sulfamethyloxazole、β-内酰胺类抗生素、四环素等；抗抑郁药例如奈福泮、奥昔哌汀、米帕明、曲唑酮等；抗糖尿病药例如双胍、磺脲类药等；止吐药和抗精神病药例如氯丙嗪、氟奋乃静、奋乃静、丙氯拉嗪、普鲁本近、甲哌硫丙嗪、三氟丙嗪、氟派啶醇、东莨菪碱、地芬尼多曲美苄胺、曲美苄胺等；神经肌肉因子例如阿曲库、氯化米哇库铵、罗库溴铵、氯化琥珀胆碱、多沙氯铵、筒箭毒碱、和肉毒毒素(BTX)；抗真菌剂例如两性霉素B、制霉素、杀念珠菌素、依曲康唑、酮康唑、咪康唑、克霉唑、氟康唑、环吡酮、益康唑、萘替芳、特比萘芬、灰黄霉素、环吡酮等；抗高血压药例如萘心安、普罗帕酮、氧烯洛尔(oxyprenolol)、尼非地平、利血平等；抗性无能药例如一氧化氮供体等；抗炎药包括固醇类抗炎药例如可的松、氢化可的松、地塞米松、去氢氢化可的松、泼尼松、氟扎可等，和非固醇抗炎药例如吲哚美辛、布洛芬、雷米那酮、prioxicam等；抗肿瘤药例如阿霉素、环磷酰胺、放线菌素、博来霉素、duanorubicin、多柔比星、表柔比星、密吐霉素、雷帕霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、顺铂、鬼臼乙叉甙、干扰素、苯芥胆甾醇、紫杉酚(包括类似物和衍生物)、喜树碱和其衍生物、长春碱、长春新碱等；抗HIV药(例如，antiproteolytics)；抗病毒药例如金刚烷胺、甲吲噻踪、碘苷、阿糖胞苷、阿昔洛维、泛西洛维、羟甲基无环鸟苷、膦甲酸、索利夫定、三氟尿苷、伐昔洛韦、西多福韦、地达诺新、司他夫定、扎西他宾、叠氮胸苷、三氮唑核苷、金刚乙胺等；抗焦虑药(anxiolytic agents)例如硝苯呋海因、地西泮等；COX-2抑制剂；避孕药例如孕激素等；抗血栓药例如GPIIb/IIIa抑制剂、组织型纤溶酶原活化剂、链激酶、尿激酶、肝素等；prothrombotic剂例如凝血酶、因子V、VII、VIII等；激素例如胰岛素、生长激素、催乳素、EGF(表皮生长因子)等；免疫抑制剂例如环孢霉素、硫唑嘌呤、咪唑立宾、FK506、泼尼松等；血管生成因子例如VEGF(血管内皮生长因子)；维生素例如A，D，E，K等；和其他治疗性或药物活性试剂。参见，例如，GOODMAN&GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS，第9版，Hardman，等人，eds.McGraw-Hill，(1996)。
在最优选的实施方案中，所述生物学试剂选自胰岛素、肉毒毒素、VEGF、用于免疫的抗原和抗真菌剂。
如上面对于靶向试剂和成像试剂所指出的，可在缺少带负电荷的主链的情况下使用某些生物学试剂或药妆剂。这些生物学试剂或药妆剂是这样的试剂，该试剂在生理pH下一般携带净负电荷以保持和带正电荷的载体的结合。示例包括肉毒毒素(大MW蛋白)、胰岛素(小MW蛋白)、用于免疫的抗原，其可以在从非常小至非常大的范围内变化并且通常包括蛋白或糖蛋白和许多抗真菌剂。在这些情况下，所述物质或其衍生物具有足够的负电荷以和本发明的带正电荷的载体非共价地结合。术语“足够”在本上下文中是指可通过例如颗粒尺寸或功能性分光光度学上的变化(和单独的组分相比)来确定的结合。
具有附着的成像部分、靶向试剂或治疗剂的带负电荷的主链
对于上面的三组组分，包括成像部分、靶向试剂和治疗剂，单个的化合物可附着至带负电荷的主链，通过共价修饰以引入带负电荷的部分，或者可直接使用，如果该化合物含有足够的带负电荷的部分以提供和上述的带正电荷的主链的通过离子作用的结合。必要时，一般地，通过用于将特定的试剂共价地附着(通过存在于所述试剂和主链上的官能团)至主链的连接性基团进行附着。许多连接性基团可用于本发明的该方面。参见，例如，Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，CA(1996)；Wong，S.S.，Ed.，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL(1991)；Senter，等人，J.Org.Chem.55：2975-78(1990)；和Koneko，等人，Bioconjugate Chem.2：133-141(1991)。
在一些实施方案中，治疗剂、诊断剂或靶向试剂不具有可获得的用于附着连接性基团的官能团，从而可首先经修饰以引入例如羟基、氨基或硫醇取代基。优选地，在试剂的非干扰部分提供所述取代基，所述取代基可用于附着连接性基团，并且不会不利地影响试剂的功能。
在另一方面，本发明提供了这样的组合物，该组合物包含具有至少一个附着的效能基团的带正电荷的主链和至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的核酸的成员的非共价复合物。在本发明的该方面，带正电荷的主链基本上可以是上述带正电荷的主链中的任何一种，并且也包含(和上面选择的主链一样)至少一个附着的效能基团。合适的效能基团包括，例如，(Gly)n1-(Arg)n2，或TAT结构域，其中下标n1是从3至大约5的整数，下标n2独立地是从大约7至大约17的奇整数。此外，用于本发明的该方面的核酸和上面已描述的核酸相同。
胰岛素和某些更大的分子的透皮递送
已发现上述带正电荷的载体可用于胰岛素和某些其他具有生物活性的试剂的透皮递送，所述具有生物活性的试剂不会治疗性地改变血糖水平，所述具有生物活性的试剂是例如具有大约50,000和以上的分子量的蛋白，例如，肉毒毒素(BTX)，或其他具有生物活性的试剂例如基于核酸的治疗剂、非蛋白非核酸治疗剂例如某些抗真菌剂或用于免疫的试剂。带正电荷的载体的使用可使蛋白或标记基因都能运入皮肤细胞或运出皮肤细胞，和以有效量和活性形式将其递送入深层组织。例如，可将胰岛素通过皮肤递送入深层毛细管，从而运送遍布全身而无需注射。可将肉毒毒素以产生麻痹、产生松弛、减缓收缩、预防或减轻痉挛、减少腺体分泌或提供其他想要的效果的有效量递送至深层肌肉或皮肤内的腺体。与可注射的或可移植的材料相比，特别是在肉毒毒素的情况下，以这种方式进行的局部递送可减少剂量、降低毒性和使得可以为想要的效果提供更精确的剂量最优化。该实施方案可包含一些小的优选多价的阴离子，例如，磷酸盐、天冬氨酸盐或柠檬酸盐，或可在基本上缺少这样的聚阴离子的情况下进行该实施方案。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，所述非共价相互作用可包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力，或其组合。
如此处所用的，术语“肉毒毒素”是指任何已知的肉毒毒素的血清型，无论是通过细菌产生的还是通过重组技术产生的，以及以后可被发现的任何这样的类型，包括基因工程产生的变体或融合蛋白。如上面所提到的，目前，已表征了七种免疫学上不同的肉毒神经毒素，即A、B、C、D、E、F和G型肉毒神经毒素血清型，其各自通过用类型特异性抗体进行中和来区别。肉毒毒素血清型可从Sigma-Aldrich和从Metabiologics，Inc.(Madison，Wisconsin)以及从其他来源商购获得。肉毒毒素的不同血清型在其作用的动物种类和在其引起的麻痹的严重度和持续时间上是不同的。目前，至少两种类型的肉毒毒素，A型和B型，可以治疗某些病症的制剂形式商购获得。例如，在商标为的Allergan的制剂中和商标为
Figure BSA00000766336100342
的Ipsen的制剂中含有A型，而在商标为
Figure BSA00000766336100343
的Elan的制剂中含有B型。
用于本发明的肉毒毒素可以是肉毒毒素的衍生物，即其是这样的化合物，所述化合物具有肉毒毒素活性，但和天然发生的或重组的天然的肉毒毒素相比，在任何部分或任何链上包含一种或多种化学或功能性改变。例如，肉毒毒素可以是经修饰的神经毒素，即其和天然的神经毒素相比，至少具有一个氨基酸被删除、被修饰或被替代，或经修饰的神经毒素可以是通过重组产生的神经毒素或其衍生物或片段。例如，所述肉毒毒素可以是以这样的方式修饰的肉毒毒素，所述方式是例如增强其特性或减少不想要的副作用，但仍保持想要的肉毒毒素活性的方式。如上所述，肉毒毒素可以是由细菌产生的肉毒毒素复合物中的任一种。可选择地，肉毒毒素可以是使用重组或化学合成技术制备的毒素，例如，重组肽、融合蛋白或杂合的神经毒素，例如从不同的肉毒毒素血清型的亚基或结构域制备而来的(例如，参见美国专利6,444,209)。肉毒毒素也可以是完整的分子的部分，该部分经显示具有必需的肉毒毒素活性，在该情况下其自身可被使用或用作重组分子或复合分子例如融合蛋白的部分。可选择地，毒素的部分可直接地和此处描述的带正电荷的主链在具有或不具有靶向部分的情况下一起使用，因为带正电荷的主链甚至在天然的BTX结合、靶向或内化结构域不存在的情况下允许细胞内化。可选择地，肉毒毒素可以肉毒毒素前体(该前体自身可以是无毒的)的形式存在，例如无毒的锌蛋白酶，其在蛋白水解断裂后变得有毒。
本发明也涉及肉毒毒素的组合物和混合物的一般用途，不过由于其不同的性质和特性，目前一般不施用肉毒毒素血清型的混合物。
类似地，术语“胰岛素”包括从天然来源中提取的胰岛素和可通过化学或重组的方法通过合成获得的胰岛素。胰岛素也可以以经修饰的形式存在，或者以例如重组肽、融合蛋白或杂合分子的形式存在，或在特定的情况下，胰岛素可以是具有必需的活性的胰岛素分子的部分。这对于可用于这些特定的透皮组合物和方法的其他蛋白，特别是用于免疫的在物理化学性质上可发生很大变化的抗原同样如此。同样，可从天然来源获得或可合成非蛋白非核酸治疗剂，包括抗真菌剂。
本发明的组合物优选地以这样的产品形式存在，该产品被用于受试者或患者即需要特定治疗的人或其他哺乳动物的皮肤或上皮。术语“需要”是指包括药物和健康相关的需要以及想要更加美观、更具美感或主观的需要。肉毒毒素组合物也可用于例如改变或改善面部组织的外观。
通过使用本发明的带正电荷的载体，可将肉毒毒素给受试者透皮施用以治疗病症，所述病症是例如不想要的面部肌肉或其他肌肉痉挛、多汗症、痤疮或身体中其他想要减轻肌肉疼痛或痉挛的部位的病症。局部施用肉毒毒素以透皮递送至肌肉或其他与皮肤相关的结构中。可给例如腿、肩、背(包括下背部(lower back))、腋、掌、足、颈、腹股沟、手或足的背部、肘、上臂、膝盖、大腿、臀部、躯干、骨盆或想要施用肉毒毒素的身体的其他部分。
也可进行肉毒毒素的施用以治疗其他病症，包括治疗神经痛、预防或减轻偏头痛或其他头痛、预防或减轻痤疮、预防或减轻无论是主观性的还是临床性的肌张力障碍(dystonia)或肌张力障碍收缩(dystonic contractions)、预防或减轻和主观或临床多汗症相关的症状、减少分泌过多或出汗、降低或加强免疫应答、或治疗其他疾病(其是建议或进行通过注射的肉毒毒素的施用来治疗的病症)。为了免疫相关的目的，也可施用肉毒毒素、对血糖水平不具治疗性效果的其他治疗性蛋白、此处描述的用于免疫的其他抗原或其他非核酸非蛋白治疗剂，例如复合的肉毒毒素。可选择地，可制备复合物并进行局部施用以增强免疫应答，例如提供有关各种蛋白的免疫，例如，无需注射的儿童免疫或抗各种环境危害物的免疫。令人惊奇的是，也可施用此处描述的肉毒毒素或其他治疗性蛋白以降低免疫应答。本发明可使BTX和其他蛋白通过改变了的施用途径被递送并改变所述试剂的复合抗原呈递，从而可以用于减少对抗该蛋白的抗原的免疫应答，从而有助于反复施用而不会产生与免疫相关的活性上的降低。
一般地，通过将待施用的胰岛素、肉毒毒素或其他具有生物活性的试剂和带正电荷的载体和通常地一种或多种额外的药物可接受的载体或赋形剂混合来制备组合物，所述具有生物活性的试剂是例如不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的治疗剂、非蛋白非核酸治疗剂或用于免疫的试剂。在其最简单的形式中，其可包含可被缓冲的简单的水性药物可接受的载体或稀释剂，例如盐水。然而，组合物可包含一般存在于局部药物组合物或药妆组合物中的其他成分，即皮肤或药物可接受的载体、赋形剂或介质，即和其施用的组织相容的载体、赋形剂或介质。此处使用的术语“皮肤或药物可接受的”是指此处描述的组合物或其组分适合用于和这些组织接触，或用于患者而通常无过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。适当地，本发明的组合物可包含常规地用于所述领域特别是药妆和皮肤学领域中的任何组分。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，所述相互作用包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。
可预先配制组合物或在施用时制备组合物，例如，通过提供在施用时或施用前进行组装的试剂盒来进行制备。可选择地，如上面所提到的，可以分开的方式例如通过提供这样的试剂盒来给患者施用肉毒毒素或其他治疗性蛋白和带正电荷的主链或载体，所述试剂盒包含含有治疗性蛋白的皮肤贴剂或其他分配装置和含有带正电荷的载体(和任选地其他成分)的液体、凝胶、乳膏剂等。在该特定的实施方案中，通过给皮肤使用含有载体的液体或其他组合物，然后使用皮肤贴剂或其他装置来施用组合物。
如此施用本发明的组合物，以使能够施用有效量的胰岛素、肉毒毒素或其他有益物质。对于透皮递送，术语“有效量”是指提供更多的具有生物活性的试剂的透皮递送(和在缺少载体的情况下的试剂的透皮递送相比)的任何组合物或方法。对于肉毒毒素，此处使用的术语“有效量”是指如上面所定义的这样的量的肉毒毒素，该量的肉毒毒素足以产生想要的肌肉麻痹或其他效应，但该量绝对是安全的量，即低至足以避免严重的副作用的量。想要的效果包括使某些肌肉松弛，其目的在于例如减少细纹和/或皱纹(特别是在脸部的)的出现、或以其他方式例如加宽眼睛、抬高嘴角、或使从上唇散开的细纹平滑来调整面貌，或总体减缓肌肉紧张。最后提到的效果，即总体减缓肌肉紧张，可在脸部或其他部位例如在背部或腿部实现。对于胰岛素，术语“有效量”类似地是指足以产生想要的效果即在患者或受试者的血液中降低葡萄糖的胰岛素的量。对于抗原，“有效量”是指足以使受试者能够在使用或系列使用抗原后产生对抗原的免疫应答的量。对于抗真菌剂，“有效量”是指足以减少真菌感染引起的症状或体征的量。对于不会治疗性地改变血糖水平的其他具有生物活性的试剂而言，“有效量”是指这样的量，即该量足以产生表征该试剂(例如Physicians′Desk Reference等中的试剂)的经定义的生物学效果或治疗效果而不引起明显的毒性。当使用术语“治疗剂”或“具有生物活性的蛋白”时，本发明明确地排除了只结合特异性的抗原但不具有其它生物活性的抗体片段。然而，因为适合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。此外，本发明包含通过结合特异性的抗原，从而阻断配体结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗效果的试剂。
组合物可包含合适的有效量的胰岛素、肉毒毒素或其他具有生物活性的试剂(例如，不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的治疗剂、非蛋白非核酸治疗剂或用于免疫的试剂)以单剂治疗的方式进行使用，或其可以是更浓缩的，以在施用的部位进行稀释的方式或以多次施用的方式进行使用。一般地，含有肉毒毒素或其他具有生物活性的试剂(例如，不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白或基于核酸的治疗剂)的组合物可含有按重量计算从大约1x10-20至大约25％的具有生物活性的试剂和从大约1x10-19至30％的带正电荷的载体。一般地，含有非蛋白非核酸治疗剂或用于免疫的试剂的组合物可含有按重量计算从大约1x10-1至大约49.9％的抗原和从大约1x10-9至大约50％的带正电荷的载体。一般地，本发明的组合物以适合于给受试者施用的形式含有从大约0.001至大约10,000，优选地从大约0.01至大约1,000IU/g的组合物(其是包含此处描述的肉毒毒素和带正电荷的载体分子的组合物)。载体：肉毒毒素的比例优选地分别地在大约10∶1至大约1.01∶1范围内和更优选地在大约6∶1至大约1.5∶1的范围内变动。载体分子的量或其对肉毒毒素的比例依赖于所述组合物中选择使用的载体。通过，例如进行一个或多个实验例如下面描述的实验可容易地确定在给定的情况下载体分子的合适的量或比例。
本发明的组合物使得可以递送更纯的具有更高比活、潜在地提高的药物动力学的肉毒毒素。此外，带正电荷的载体减少了对外源辅助蛋白(例如，在400-600mg范围内变化的人血清白蛋白或在250-500mg范围内变化的重组血清白蛋白)和多糖稳定剂的需要并且可有益地降低对BTX的免疫应答。此外，所述组合物适合用于pH在4.5至6.3范围内变化的生理环境，因此其可具有这样的pH。所述组合物优选地可在室温下或在冷藏的条件下贮存。
一般地如此使用包含肉毒毒素的组合物或装置，以使其以这样的剂量提供肉毒毒素，即每次使用每cm2的皮肤大约1U至大约20,000U、优选地大约1U至大约10,000U的肉毒毒素。例如，优选地可将这些范围内的较高剂量和例如控释材料一起使用，或使得能够在除去前在皮肤上停留更短的时间。
在胰岛素的情况下，本发明的组合物含有从大约0.011U至大约5000U/克，优选地从大约0.1U至大约500U/克的胰岛素。包含此处描述的胰岛素和带正电荷的载体分子的形式的组合物优选地分别具有从大约30∶1至大约1.01∶1范围内和更优选地从大约6∶1至大约1.25∶1范围内变化的胰岛素：载体。同样，载体分子的量或其对胰岛素的比例依赖于所述组合物中选择使用的载体。
根据其形式，本发明的组合物可包括溶液、乳液(包括微乳液)、悬浮液、乳膏剂、洗剂、凝胶、粉剂或其他类型的固体或液体组合物(用于可使用所述组合物的皮肤或其他组织)。除了肉毒毒素、胰岛素或其他具有生物活性的试剂、和载体分子外，这些组合物可包含一般用于该产品的其他成分，例如抗微生物剂、增湿剂和水合剂、渗透剂、防腐剂、乳化剂、天然的或合成的油、溶剂、表面活性剂、去垢剂、胶凝剂、润滑药剂、抗氧化剂、芳香剂、充填剂、增稠剂、石蜡、气味吸收剂(odor absorbers)、染料、着色剂、粉剂、粘性控制剂和水，和任选地包含麻醉剂、止痒活性剂、植物萃取物、调节剂、暗化剂(darkening agent)或亮化剂(lightening agent)、吉洛特、湿润剂、云母、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、防晒剂(sunblocks)、维生素和植物药(phytomedicinals)。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，其可包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。
本发明的组合物可以控释组合物或缓释组合物的形式存在，其中将要递送的胰岛素、肉毒毒素或其他物质和载体包囊化或装入材料中，以使其在一段时间内以受控的方式释放至皮肤上。可将要递送的物质和载体装入基质、脂质体、小泡、微囊、微球体等，或装入固体颗粒材料，所有这些材料都是被选择和/或构建来在一段时间内释放所述物质的。可将治疗性物质和载体一起包囊化(例如，在相同的包囊中)或分开包囊化(在分开的胶囊中)。
当然，给受试者施用本发明的组合物是本发明的另一方面。在肉毒毒素的情况下，最优选地，或在医生的指导下或在其他专业护理人员(health professional)的指导下施用或由所述人员施用所述组合物。可以单剂治疗的方式或以一段时间内系列周期治疗的方式施用其。对于为了上述目的的肉毒毒素的透皮递送，在想要得到效果的部位上的皮肤局部施用上述组合物。因为其性质，最优选地，应当非常小心地，以可产生想要的结果但不产生任何不利的或不想要的结果的施用速率和施用频率施用所用的肉毒毒素的量。
在胰岛素的情况下，对于住院治疗的患者或门诊患者(in-officetreatments)，按照专业护理人员(health care professional)的指导进行施用或由专业护理人员进行施用，然而在其他情况下可能由患者进行施用。通过具有受控释放和/或监控的皮肤贴剂等方式的施用可能是普便的方法，因此本发明的含有胰岛素的组合物通常以包含在皮肤贴剂或其他装置中的形式提供。在适合用于免疫的抗原的情况下，最优选地，通过或在医生或其他专业护理人员的指导下施用所述组合物。其可以单次治疗的方式或以在一段时间内系列周期治疗的方式进行施用。因此，本发明也涉及缓释组合物。对于为了上述目的适合用于免疫的抗原的透皮递送，将上述的组合物局部地用于皮肤或甲板(nail plate)以及邻近的皮肤。在非蛋白、非核酸治疗剂例如抗真菌剂的情况下，优选地，在医生或其他专业护理人员的指导下施用所述组合物。其可以单次治疗或以在一段时间内系列周期治疗的方式进行施用。也涉及非蛋白、非核酸治疗剂的缓释组合物。可通过使用例如人造甲板、甲油(lacquer)、具有着色剂的指甲油、凝胶或这些材料中的任何一些材料或所有材料的组合来给指甲或脚趾指板或周围的解剖学结构施用抗真菌剂。对于为了上述目的肉毒毒素的透皮递送，将上述的组合物局部地给皮肤施用。
用于在专业护理人员指导下施用或由患者或受试者施用的本发明组合物的试剂盒也可包含适合于该目的定制的施药器。术语“定制的施药器”是指包括刚提到的用于施用抗真菌剂的手段。
在另一方面，一般地，本发明涉及用于上述的带正电荷的载体和有效量的胰岛素、肉毒毒素、适合用于免疫的抗原、抗真菌剂或其他具有生物活性的试剂的组合的局部施用的方法，所述其他具有生物活性的试剂是例如，不会治疗性地改变血糖水平的治疗性蛋白、基于核酸的治疗剂或非蛋白非核酸治疗剂。如上所述，可通过使用包含适当的类型和量的这两种物质(确切地说是载体和具有生物活性的试剂)的本发明的组合物来进行施用。然而，本发明也包括以组合的方式施用这两类物质，尽管不一定以同一组合物的形式施用。例如，可将治疗剂或具有生物活性的物质以无水的形式整合入皮肤贴剂或其他分配装置中，可在使用皮肤贴剂之前将带正电荷的载体给皮肤表面施用，这样可使所述两类物质共同作用，产生想要的透皮递送。因此，在该意义上，所述两类物质，确切地说是载体和具有生物活性的试剂，以组合的方式或结合的方式起作用，或可能相互作用以在原位形成组合物或组合。
制备组合物的方法
在另一方面，本发明提供了用于制备药物组合物的方法，该方法包括将带正电荷的主链组分和至少两种选自下列的成员与药物可接受的载体组合以形成带净正电荷的非共价复合物，条件是所述成员中的至少一个选自i)、ii)、iii)或v)：
i)具有数个附着的成像部分或可选择地数个带负电荷的成像部分的第一带负电荷的主链；
ii)具有数个附着的靶向部分或可选择地数个带负电荷的靶向部分的第二带负电荷的主链；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂或带负电荷的生物学试剂的第三带负电荷的主链；
在相关方面，如上所述，在本发明的一些实施方案或组合物中，可单独地使用带正电荷的主链或载体以提供某些类型的物质的透皮递送。包含具有生物活性的试剂例如肉毒毒素或不降低血糖的其他治疗性蛋白、包含按重量计算大约1x10-2至大约25％的所述具有生物活性的试剂和大约1x10-19至大约30％的带正电荷的载体的组合物和方法在此处是优选的。包含非核酸非蛋白的治疗剂例如抗真菌剂或适合用于免疫的抗原、包含按重量计算大约1x10-10至大约49.9％的所述抗原和大约1x10-9至大约50％的带正电荷的载体的组合物和方法也是优选的。在本发明的所有方面，载体和具有生物活性的试剂之间的结合是通过非共价相互作用结合的，该相互作用可包括，例如，离子相互作用、氢键、范德瓦尔斯力或其组合。
可容易地配制各种药物组合物的这一易配性说明了本发明的广泛的可应用性。一般地，通过将带正电荷的主链组分和想要的目的组分(例如，DNA、靶向组分、成像组分或治疗组分)按比例和顺序混合以获得具有可变的净正电荷的组合物来制备组合物。在许多实施方案中，可通过例如在bedside使用用于组合物施用的药物可接受的载体和稀释剂来配制组合物。可选择地，可通过混合合适的组分来配制组合物，然后将其冻干和贮存(通常在室温下或更低温度下)直至使用或将其配制入合适的递送载体中。
可配制组合物以提供适合于局部、皮肤、口、直肠、阴道、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、透皮等途径施用的混合物。本发明的药物组合物优选地包含这样的载体，所述载体对于可注射特别是用于直接注射入想要的器官或用于局部施用(至皮肤和/或粘膜)的制剂是药物可接受的。特别地其可以是无菌的、等渗溶液或无水组合物，特别是冷冻干燥的组合物，依赖于具体情况，其通过加入无菌水或生理盐水，可使所述冷冻干燥的组合物产生可注射的溶液。例如，可根据各种参数，特别是根据使用的施用模式、涉及的病症、要表达的基因或想要的治疗持续时间，来调整用于注射的核酸的剂数和施用的次数。
可选择地，当局部施用组合物时，例如，当想要透皮递送时，可将目的组分以无水的形式给皮肤施用，例如，通过使用皮肤贴剂施用，其中以分开的方式用带正电荷的主链或载体处理皮肤。通过该方式，所述完全的组合物基本上在原位形成并被施用给了患者或受试者。
使用组合物的方法
递送方法
可使用各种方法在体内或离体将本发明的组合物递送至受试者、细胞或靶位点。事实上，可使用一般用于将组合物导入并使其最终和要治疗的组织接触的途径中的任一途径。优选地，将组合物和药物可接受的载体一起施用。可获得施用这些化合物的合适的方法，所述方法对本领域技术人员来说是熟知的，并且，尽管可使用超过一条的途径来施用特定的组合物，但和其他的途径相比，特定的途径通常可提供更直接或更有效的反应。通过特定的要被施用的组合物和通过用于施用组合物的方法部分地确定药物可接受的载体。因此，存在许多合适的本发明的药物组合物的制剂(参见，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，1985)。
可通过例如静脉内、局部、腹膜内、subdermal、皮下、透皮、肌内、经口、关节内、肠胃外、鼻内或通过吸入进行施用。因此合适的施用位点包括，但不限于皮肤、小支气管、胃肠道、眼睛和耳朵。组合物一般包含常规的药物载体或赋形剂，并且可额外地包含其他药剂、载体、佐剂等。优选地，按重量计算，本发明的制剂占组合物的大约5％至75％，剩余部分由合适的药物赋形剂组成。可通过本领域熟知的方法(参见，例如，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990))使合适的赋形剂与特定的组合物和施用途径相适应。
制剂可采用固体、半固体、冷冻干燥的粉剂、或液体剂型的形式例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、溶液、悬浮液、乳剂、栓剂、滞留型灌肠剂、乳膏剂、软膏、洗剂、凝胶、气雾剂等。在药物组合物采用丸剂、片剂或胶囊剂的形式的实施方案中，制剂可包含具有生物活性的组合物和任何一种下列物质：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂例如淀粉或其衍生物；润滑剂例如硬脂酸镁等；和粘合剂例如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素和其衍生物。组合物可存在于单位剂量或多次剂量封闭的容器例如安瓿或小瓶中。给患者施用的剂量应当足以在一段时间内在患者中达到有益的治疗性反应。当使用术语“治疗剂”或“生物活性蛋白”时，本发明明确地排除了只结合特异性的抗原但不具有其它生物活性的抗体片段。然而，因为适合用于免疫的抗原具有其他生物活性例如产生免疫应答，因此这些仍属于本发明的适当的方面。此外，本发明包含通过结合特异性的抗原，从而阻断配体结合或改变抗原的构象而具有生物活性或治疗效果的试剂。
在一些实施方案中，可给器官或培养细胞施用缓释制剂或控释制剂，所述制剂可携带想要的组合物。可通过例如注射给生物体的组织施用缓释组合物。“缓释”，其是指使组合物(优选地编码目的转基因的核酸或生物学试剂或治疗剂)能够被周围的组织或细胞吸收更长的时间，该时间比通过施用粘性更低的介质例如盐溶液中的所述组合物所达到的时间更长。
可将组合物单独地或与其他合适的组分一起制成气雾剂制剂(即，其可被“雾化”)，从而通过吸入法进行施用。可将气雾剂制剂置于加压的可接受的推进剂例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。为了通过吸入法进行递送，也可将组合物作为干粉递送(例如，NektarTherapeutics，San Carlos，CA)。
适合肠胃外施用例如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性的、等渗无菌注射溶液和水性或非水性的无菌悬浮液，所述溶液可包含抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、和使制剂和想要的患者的血液等渗的溶质，所述悬浮液可包含悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
施药的其他方法包括，但不限于，使用血管成形气囊、导管、凝胶制剂的施用。用于血管成形气囊、导管和凝胶制剂递送的方法在本领域是熟知的。
成像方法
本领域技术人员理解，可使本发明的组合物适应各种成像应用。在一个实施方案中，可通过使用基于组分的成像系统进行虚拟结肠镜术(Virtual Colonoscopy)。目前，虚拟结肠镜术包括将造影剂注入结肠并在CT上显现图象，然后重构3-D图象。类似的技术可用于MR。然而，粪便、粘液和空气都可充当照影剂屏障，从而可给结肠壁的重建图产生人为的表面。细胞靶向照影剂的加入可帮助克服这些障碍，从而提供真实的壁重建图和帮助避免假阳性以及假阴性。存在几种可在此使用基于组分的系统的方法。最简单地，可将阳离子功效主链和单一的照影剂一起使用，例如用于CT、MR或光学方法。从而可显现出细胞表面层，任何不规则物或障碍物都详尽地显示于图象重建图中。然而，基于组分的系统提供了加入特定的第二试剂的额外选择。该试剂由阳离子功效主链、不同的成像部分和靶向组分(例如靶向两个结肠癌的特征性抗原)组成。可这样选择成像部分(从简单的成像部分至诊断剂)以使一种为CT照影剂而另一种为MR照影剂，或使两种都为MR照影剂，其中一种为T2试剂而另一种为T1试剂。以这种方式，可按照前面所述的方法重建表面，对于肿瘤抗原是特异性的任何区域可被显现和覆盖在原始的重建图上。此外，也可将治疗剂整合入靶向诊断系统中。可将类似的策略用于局限性肠炎和溃疡性结肠炎(与治疗组合)。可选择地，可在例如黑色素瘤诊断或治疗的情况下，使用优选地和荧光成像部分组合的光学成像部分和检测方法。所述光学成像剂可选自例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregon green 514、绿色荧光蛋白、6-FAM、TexasRed、Hex、TET和HAMRA。
实施例
实施例1
本实施例举例说明这样的组合物，通过使用本发明的带正电荷的主链或载体，所述组合物适合用于非常大的复合物，即包含蓝色荧光蛋白(BFP)转基因的质粒，的透皮递送。
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。将所述经修饰的主链称为“KNR2”以表示肽基载体的第二大小。对照聚阳离子是相同大小的来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。选择另外的对照聚阳离子
Figure BSA00000766336100461
(Qiagen)作为体外高转染率的参照(即体外现有技术功效对毒性的同时的正对照和参照)，该聚阳离子是被活化的基于树枝状高分子(dendrimer)的试剂。
治疗剂的选择：
使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的蓝色荧光蛋白(BFP)的完整的转基因和部分侧翼序列的8kb的质粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。BFP用作已转染细胞的可鉴定标记，然后转录和翻译该基因从而可在荧光显微镜下直接被观察到(即无需另外的染色)。因此，只有这样的细胞(即其中在有效载荷递送(payloaddelivery)前所述复合物已穿过质膜和核膜的细胞)可具有转基因表达。该特定的质粒具有大约2.64x106的分子量，从而被选择用于估计通过这些复合物进行的非常大的治疗剂的递送。
样品的制备：
在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。尽管增加电荷密度增加了大小(即每个复合物上存在更多的主链)，但每个复合物的效能因子密度上的增加可抵消这些改变。因此，最优选择可在低比率(即基于大小)或高比率(即基于效能因子的密度)时发生，此处对KNR2的这两个方面进行了估计。基于厂商的推荐和以前对最大功效的报导来选择K2的功效和Superfect的功效的最佳比率。将所有组的核酸治疗剂的剂量标准化，也对在细胞培养物中待测的组合物的总体积和终pH进行标准化。
制备下列混合物：
1)K2对0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液，比率为4∶1。
2)KNR2对0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液，比率为15∶1。
3)KNR2对0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液，比率为10∶1。
4)KNR2对0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液，比率为4∶1。
5)KNR2对0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液，比率为1.25∶1。
6)厂商推荐的Superfect对0.5mg/mL表达由CMV启动子驱动的蓝色荧光蛋白的质粒的溶液，比率为5∶1。
细胞培养方案：
由对治疗组不知情的观测者进行所有细胞培养实验。在6孔板上，向70％汇合的HA-VSMC原代人大动脉平滑肌细胞(第21代；ATCC，Rockville，MD)中加入1.0mL的各溶液并在含有10％血清的M-199中在37℃和10％的CO2下培养48小时。也对未处理的对照小孔进行估计，以每组n＝5个小孔对各组进行估计。
效率分析：
由盲测者(blinded observer)在60度、180度和200度下使用带有BFP滤镜和平场复消色差透镜(plan apochromat lense)的NikonE600落射荧光显微镜从各小孔的上部获得完整细胞板的低放大倍数照片(总计10X)。使用Image Pro Plus 3.0成像套件(image analysissuite)(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)确定总的呈阳性的细胞面积的百分比。将该结果标准化为各组的总的细胞面积，并记录为基因递送的效率(以可检测水平表达转基因的总细胞的百分比)。
毒性分析：
随后盲测者在染料排斥试验(可存活的细胞排斥染料，而不能存活的细胞不能排斥染料)中对小孔进行估计，然后将小孔中的样品溶解在0.4％的磷酸缓冲盐溶液中的SDS中。在Spectronic Genesys 5UV/VIS分光光度计中在595nm波长(蓝色)处对样品进行估计以定量估计不能存活的细胞(作为转染剂毒性的直接估量)。通过在OD595测量之前将浓度调整至与OD280值相匹配来将样品标准化成同样的细胞数目。
数据处理和统计分析：
盲测者通过使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)进行分批图象分析(batch image analysis)来确定总的阳性染色并将其标准化为总的横切面面积以确定各组的阳性染色的百分比。随后在单向ANOVA重复测量(one way ANOVA repeatedmeasures)中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
效率：
效率的结果如下(平均值±标准差)：
1)0.163±0.106％
2)10.642±2.195％
3)8.797±3.839％
4)15.035±1.098％
5)17.574±6.807％
6)1.199±0.573％
和单独的多聚赖氨酸和Superfect相比，Runs#4和#5表现出统计学上显著(P＜0.05，使用Fisher PLSD和TUKEY-A事后检测法进行单因子ANOVA重复测量)的基因递送效率的增加。
毒性：
平均毒性数据如下(在OD595下以AU记录的；低值，例如和单独的盐水一起存在，与低毒性关联，而更高的值，例如在条件1下的，表明高细胞毒性)：
盐水-0.057A；
1)3.460A；
2)0.251A；
3)0.291A；
4)0.243A；
5)0.297A；
6)0.337A。
结论：
用1.25至4.0的KNR2对DNA的比例可实现比对照(甚至目前的金标准Superfect的对照)毒性更小、效率更高的基因递送。该实验进一步确认了使用该载体将相当大的治疗性复合物递送过膜的能力。
实施例2
该实施例举例说明在一次施用后大的核酸通过本发明的载体穿过皮肤的运输。
主链选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。和前面一样，所述经修饰的主链被命名为“KNR2”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K2”，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)。选择另外的对照聚阳离子Superfect(Qiagen)作为高转染率的参照(即体外现有技术功效对毒性的同时的正对照和参照)，该聚阳离子是被活化的基于树枝状高分子的试剂。
治疗剂的选择：
对于本实验，使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的大肠杆菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整转基因和部分侧翼序列的8.5kb的质粒(基于pSport的模板，GibcoBRL，Gaithersburg，MD)。此处βgal用作已转染细胞的可鉴定标记，然后转录和翻译所述基因，在对所述外源酶进行特异性染色后可直接观察。因此，只有这样的细胞(即其中在有效载荷递送前所述复合物已穿过皮肤，然后到达靶细胞，并转位通过质膜和核膜的细胞)可具有转基因表达。该特定的质粒具有大约2,805,000的分子量。
样品的制备：
在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。基于厂商的推荐和以前确定最大效率的体外实验选择对于K2的效率、KNR2的效率和Superfect的效率的最佳比率。将所有组的核酸治疗剂的剂量标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为AK1的组：将每个终等分(即总共80微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基载体KNR2以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。为进行体内实验，将所得的组合物和1.8ml Cetaphil增湿剂混合均匀并以200微升进行等分。
标记为AL1的组：将每个终等分(即总共80微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。为进行体内实验，将所得的组合物和1.8mlCetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为AM1的组：将每个终等分(即总共80微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和Superfect以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐稀释至200微升。为进行体内实验，将所得的组合物和1.8mlCetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用肽基载体和核酸治疗剂进行一次处理后确定透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，对C57black6小鼠(每组n＝4)的背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴或四肢达到该区域)施用200微升剂量的适当处理物。动物不进行脱毛处理。动物在受控的加热环境中恢复以预防体温过低，在有所反应后，任意提供食物和水过夜。处理后24小时，通过吸入CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分分成三个等分，用10％的中性缓冲的福尔马林固定颅部分12-16小时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如先前所描述的，对中心部分进行快速冷冻并将其直接用于在37℃下在切片上进行β半乳糖苷酶染色(Waugh，J.M.，M.Kattash，J.Li，E.Yuksel，M.D.Kuo，M.Lussier，A.B.Weinfeld，R.Saxena，E.D.Rabinovsky，S.Thung，S.L.C.Woo，和S.M.Shenaq.LocalOverexpression of Tissue Plasminogen Activator to PreventArterial Thrombosis in an in vivo Rabbit Model.Proc Natl AcadSci USA.199996(3)：1065-1070.还有：Elkins CJ，Waugh JM，Amabile PG，Minamiguchi H，Uy M，Sugimoto K，Do YS，Ganaha F，Razavi MK，Dake MD.Development of a platform to evaluate andlimit in-stent restenosis Tissue Engineering 2002.Jun；8(3)：395-407)。将经处理的尾部节段进行快速冷冻以进行溶解研究。
毒性：
通过在成对的切片上进行染料排斥实验来对上述接受功效分析的组进行毒性估计。切片只进行针对效率的染色或针对毒性的染色，因为该方法对同时进行两种染色是不可靠的。对于毒性分析，将切片浸没在排斥染料中5分钟，然后在37℃下在10％的CO2下温育30分钟。在该时间期间不排斥染料的任何细胞被认为是不能存活的细胞。
数据处理和统计分析：
由盲测者进行数据收集和图象分析。在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对整个如上染色的切片照相。使用前述的ImagePro Plus软件对所得的图象进行分批图象分析处理，用手工确认法确定β半乳糖苷酶活性(蓝色，使用此处使用的底物法)或细胞毒性的阳性数。通过核固红染色法将这些结果标准化为各组的细胞的总的横切面数目，将所述结果以呈阳性染色的横切面的百分比列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准误。
结果：
结果归纳在下面的表中并在图3中进行说明。和K2(基本上为阴性对照)以及用作功效的基准标准的Superfect相比，带正电荷的肽基透皮递送载体在递送效率和转基因表达上获得了统计学上显著的增加。尽管相对于K2，Superfect确实获得了统计学上显著的提高，但在该模型系统中，和Superfec t相比，KNR2在递送效率上获得了超过一个数量级的提高。
实施例2：处理组的以总数目的百分比表示的β半乳糖苷酶呈阳性的细胞的平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  AK1   15.00   0.75
  AL1   0.03   0.01
  AM1   1.24   0.05
P＝0.0001(置信度99％时是显著的)
毒性的结果示于图4，该图描述了处理后24小时不能存活的总面积的百分比。此处，和KNR2或Superfect相比，K2表现出统计学上显著的细胞毒性，即使是在这样的剂量上亦如此，在该剂量上，前人报道K2具有较低的转运效率(Amabile，P.G.，J.M.Waugh，T.Lewis，C.J.Elkins，T.Janus，M.D.Kuo，和M.D.Dake.IntravascularUltrasound Enhances in vivo Vascular Gene Delivery.J.Am.Col.Cardiol.2001June；37(7)：1975-80)。
结论：
肽基透皮载体可高效地将大的复合物转运通过皮肤，特别是在以前所述的转基因表达和总的复合物的大小受到限制的情况下。此处使用阳性面积而非阳性数目进行分析是因为(1)所述方法被大大简化并且在图象分析中具有大的精确性，(2)已在II.B中结论性地提供了效率的点证明，(3)面积测量值为理解体内结果提供了更广的范围，因为非细胞组分占据了横切面的相当部分，和(4)有助于和更大的非肽基载体复合物的比较。
实施例3
本实施例举例说明在连续七天的应用中使用本发明的带正电荷的肽基载体将大的基于核酸的治疗剂穿过皮肤的透皮递送。
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR2”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治疗剂的选择：
对于本实验，使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的大肠杆菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整转基因和部分侧翼序列的8.5kb的质粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。该特定的质粒具有大约2,805,000的分子量，从而被选择用来估计通过肽基载体进行的非常大的治疗剂穿过皮肤的递送。
样品的制备：
在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。选择实验比例以比较前面的实验中提出的单剂实验。将所有组的核酸治疗剂的剂量标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为AK1的组：将每个终等分(即总共240微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和肽基载体KNR2以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为AL1的组：将每个终等分(即总共240微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和K2以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用肽基载体和核酸治疗剂进行7次每天一次的处理后确定累积的透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，对C57black6小鼠(每组n＝4)的背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴或四肢达到该区域)施用200微升剂量的适当处理物。动物不进行脱毛处理。将动物在受控的加热环境中恢复以预防体温过低，在有反应后，任意提供食物和水过夜。在每天大致相同的时刻每天一次地重复该处理7天。在7天的处理后，通过吸入CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分分成三个等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16小时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如前所述，对中心部分进行快速冷冻并将其直接用于在37℃下在切片上进行β半乳糖苷酶染色。将经处理的尾部节段进行快速冷冻以进行溶解研究。
数据处理和统计分析：
由盲测者进行数据收集和图象分析。在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对整个如上染色的切片照相。和前面一样，使用Image Pro Plus软件对所得的图象进行分批图象分析处理，用手工确认法确定对于β半乳糖苷酶活性是阳性的面积。将这些结果标准化为各组的总的横切面面积，将所述结果以呈阳性染色的横切面的百分比列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
将结果归纳于下面的表中并在图5中进行说明。和K2相比，肽基透皮递送载体在递送效率和转基因表达上获得了统计学上显著的增加。
实施例3：在7次每天一次的施用后各处理组的以总面积的百分比表示的累积的β半乳糖苷酶的转基因表达的平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  AK   5.004   2.120
  AL   0.250   0.060
P＝0.0012(置信度为99％时是显著的)
实施例4(非肽基载体)
本实施例举例说明在连续七天的应用中使用本发明的带正电荷的非肽基载体将大的基于核酸的治疗剂穿过皮肤的透皮递送。
主链选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至聚乙烯亚胺(PEI)MW 1,000,000来装配带正电荷的主链，通过以30％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有30个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至PEI侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“PEIR”以表示大的非肽基载体。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的PEI(称为“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治疗剂的选择：
对于本实验，使用包含由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的大肠杆菌β半乳糖苷酶(βgal)的完整转基因和部分侧翼序列的8.5kb的质粒(基于pSport的模板，Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。该特定的质粒具有大约2,805,000的分子量。
样品的制备：
在各情况下，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。将所有组的核酸治疗剂的剂量标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为AS的组：将每个终等分(即总共240微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和对照PEI以5∶1的比混合均匀并用Tris-EDTA缓冲液稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为AT的组：将每个终等分(即总共240微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和组合物非肽基载体PEI R(“PEIR”)以5∶1的比混合均匀并用Tris-EDTA缓冲液稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为AU的组：将每个终等分(即总共240微克)8微克的βgal质粒(p/CMV-sport-βgal)和高度纯化的Essentia非肽基载体PEIR(“纯的PEIR”)以5∶1的比混合均匀并用Tris-EDTA缓冲液稀释至600微升。为进行体内实验，将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用非肽基载体和核酸治疗剂进行7次每天一次的处理后确定累积的透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，对C57black6小鼠(每组n＝3)的背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴或四肢达到该区域)施用200微升剂量的适当处理物。动物不进行脱毛处理。将动物在受控的加热环境中恢复以预防体温过低，在有反应后，任意提供食物和水过夜。在每天大致相同的时刻每天一次地重复该处理7天。在7天的处理后，通过吸入CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分分成三个等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16小时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如前所述，对中心部分进行快速冷冻并将其直接用于在37℃下在切片上进行β半乳糖苷酶染色。将经处理的尾部节段进行快速冷冻以进行溶解研究。
数据处理和统计分析：
由盲测者进行数据收集和图象分析。在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对整个如上染色的切片照相。使用Image Pro Plus软件对所得的图象进行分批图象分析处理，用手工确认法确定对于β半乳糖苷酶活性是阳性的面积。将这些结果标准化为各组的总的横切面面积，将所述结果以呈阳性染色的横切面的百分比列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
将结果归纳于下面的表中并在图6中进行说明。和PEI相比，以组合物形式存在的和以超纯形式存在的非肽基透皮递送载体在递送效率和转基因表达上获得了统计学上显著的增加。PEIR的超纯形式表现出比标准的PEIR具有更高的效率的倾向，这与计算得出的该试剂的更高的比活性一致。
实施例4：在7次每天一次的施用后各处理组的以总面积百分比表示的累积的β半乳糖苷酶的转基因表达的平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  AS   0.250   0.164
  AT   2.875   0.718
  AU   3.500   0.598
P＝0.0058(置信度为99％时是显著的)
结论：
非肽基透皮载体可高效地将大的复合物转运通过皮肤，特别是在前述的转基因表达物和总复合物大小受到限制的情况下。尽管效率不如用更小的肽基载体的复合物获得的效率高，但也获得了显著的增加。值得注意的是，使用大的非肽基复合物的基因表达产物的分布几乎只位于毛囊，而肽基载体的分布结果是在整个截面上弥散。因此，大小和主链的向性可用于纳米机制的靶向递送。
实施例5
本实施例显示在一次施用后，和对照相比，肽基载体将含有完整的标记蛋白肉毒毒素的大复合物运输穿过完整皮肤的用途。
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW112,000来装配带正电荷的主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价地附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
治疗剂：
选择
Figure BSA00000766336100601
商标的肉毒毒素A(Allergan)进行本实验。其具有大约150,000的分子量。
样品的制备：
根据厂商说明书重构肉毒毒素。用经计算超过12倍摩尔量的硫代NHS-LC生物素(Pierce Chemical)对蛋白等分进行生物素化。被标记的产物称作“Btox-b”。
在各情况下，与递送高度带负电荷的大核酸复合物一样，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。净中性或净正电荷防止了来自高度负电的细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质对蛋白复合物的排斥。对所有组的Btox-b剂量进行标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为“JMW-7”的组：将每等分(即总共20U)2.0U的Btox-b和肽基载体KNR以经计算为4∶1的MW比率混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。将所得的组合物和1.8ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“JMW-8”的组：将每等分(即总共20U)2.0U的Btox-b和K以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。将所得的组合物和1.8ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用肽基载体和经标记的肉毒毒素进行一次处理后确定透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57black 6小鼠(每组n＝4)接受局部敷药，将200微升剂量的适当处理物施用于背部皮肤的颅部分(之所以选择该部分是因为小鼠不能用嘴或四肢达到该区域)。动物不进行脱毛。在最初的处理之后30分钟，通过吸入CO2对小鼠实行安乐死，由盲测者收获完整厚度的经处理的皮肤部分。将经处理的部分分成三等分，在10％的中性缓冲的福尔马林中固定颅部分12-16小时，然后贮存在70％的乙醇中直至石蜡包埋。如下面所概述的，由盲测者将中心部分进行快速冷冻并将其直接用于生物素显示。为进行溶解研究，快速冷冻经处理的尾部节段。
如下进行生物素显示。简而言之，将各切片浸没在
Figure BSA00000766336100611
缓冲液中1小时。为观察碱性磷酸酶的活性，在盐水中洗涤横切面4次，然后浸没在NBT/BCIP(Pierce Scientific)中1小时。然后在盐水中漂洗切片，在具有平场复消色差透镜的Nikon E600显微镜上对整个切片照相。
数据处理和统计分析：
由盲测者使用Image Pro Plus软件(Media Cybernetics，SilverSpring，MD)通过分批图象分析确定总的阳性染色，并将其标准化为总的横切面面积以确定各组的阳性染色百分比。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结论：
在将Btox-b与KNR(“EB-Btox”)或K(“n1”)一起进行一次局部施用后，用总面积的百分比来表示对于生物素化的肉毒毒素呈阳性的平均横切面面积。将所述结果列于下列的表中并在图7中进行说明。在图7中，在用“EB-Btox”和“n1”进行三天每天一次的处理后，将对于标记是阳性的面积测定为总面积的百分比，其中所述“EB-Btox”包含Btox-b和肽基载体KNR，而“n1”包含Btoxb和聚阳离子K作为对照。描述各组的平均值和标准差。
实施例5.在将Btox-b与KNR(JMW-7)或K(JMW-8)一起进行一次局部施用30分钟后，以总横切面的百分比表示被标记的肉毒毒素面积的平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  JMW-7   33.000   5.334
  JMW-8   8.667   0.334
P＝0.0001(置信度为99％时是显著的)
实施例6
实施例5表明在鼠类模型的完整皮肤中局部施用后，肽基透皮载体可使肉毒毒素有效地转运。然而，该实验没有表明复合蛋白肉毒毒素在转运穿过皮肤后是否以功能性形式释放。因此建立下列的实验来估计：使用该肽基载体(同样，无蛋白的共价修饰)是否可将肉毒毒素作为局部试剂递送穿过完整的皮肤仍具治疗效果。
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 112,000来装配带正电荷的主链，以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。所述经修饰的主链被命名为“KNR”。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。和在实施例5中一样使用相同的肉毒毒素治疗剂，和以相同的方式制备其。如下制备样品：
标记为“JMW-9”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和肽基载体KNR以经计算为4∶1的MW比率混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“JMW-10”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和K以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“JMW-11”的组：用磷酸缓冲盐溶液将每等分(即总共60U)2.0单位的无聚阳离子的肉毒毒素稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在用肽基载体和肉毒毒素进行一次处理后确定透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57black 6小鼠(每组n＝4)接受局部敷药，将400微升剂量的适当处理物均一地施用于脚趾至大腿中部(mid-thigh)。两只腿都进行处理，对腿的任一侧，处理都是随机的。动物不进行脱毛。在最初的处理之后30分钟，根据公开的足趾外展(digital abduction)分值(用于评价足的灵活性)(Aoki，KR.A comparison of the safety margins of botulinumneurotoxin serotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001Dec；39(12)：1815-20)就在施用肉毒毒素后足趾外展的能力对小鼠进行估计。小鼠的灵活性也通过主观估计。
数据处理和统计分析：
由两个盲测者独立地将足趾外展分值列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
将平均足趾外展分值(在肉毒毒素与KNR(“JMW-9”)、K(“JMW-10”)或无聚阳离子的稀释剂一起进行一次局部施用后获得的)示于下列的表中并在图8的代表性显微照片中进行说明。和两个对照(其相互之间是相当的)相比，肽基载体KNR提供了统计学上显著的肉毒毒素穿过皮肤的功能性递送。本发明的另外的独立重复实验(总共三个独立的实验，所有实验具有相同的结论：具有KNR的局部肉毒毒素而不是对照具有统计学上显著的麻痹作用)进一步确认了本发现和揭示了在具有K或不具有K的局部肉毒毒素(即两个对照)之间没有显著的不同。有趣的是，小鼠始终朝向被麻痹的肢体方向走动(在100％的接受处理的动物中发生该现象，在来自任一对照组的对照中发生率为0％)。如图8所示，用肉毒毒素和对照聚阳离子多聚赖氨酸或用肉毒毒素而无聚阳离子(“单独的Btox”)处理的肢体可活动足趾(当被提起时，作为防御机制)，但用肉毒毒素和肽基载体KNR(“Essentia Btoxlotion”)处理的肢体则不能活动。
实施例6.在一次局部施用肉毒毒素和肽基载体KNR(“JMW-9”)、肉毒毒素和对照聚阳离子K(“JMW-10”)、和单独的肉毒毒素(“JMW-11”)后30分钟的足趾外展分值。
P＝0.0351(置信度为95％时是显著的)
结论：
本实验表明肽基透皮载体可将治疗有效量的肉毒毒素治疗剂转运穿过皮肤而无需治疗剂的共价修饰。本实验也进一步确认当在对照中局部施用时肉毒毒素不起作用。
实施例7
本实验展示非肽基载体在本发明中的表现。
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至聚乙烯亚胺(PEI)MW 1,000,000来装配带正电荷的主链，通过以30％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有30个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至PEI侧链的游离胺基来进行该附着。经修饰的主链被命名为“PEIR”以表示大的非肽基载体。对照聚阳离子是相同大小的和来自相同批次的未经修饰的PEI(称为“PEI”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。如实施例5中那样使用相同的肉毒毒素治疗剂。
根据厂商说明书从产品重构肉毒毒素。在各情况下，与递送高度带负电荷的大核酸复合物一样，使用过量的聚阳离子装配具有过量正电荷的终复合物。净中性或净正电荷防止了来自高度负电的细胞表面蛋白聚糖和细胞外基质对蛋白复合物的排斥。对所有组的肉毒毒素剂量进行标准化，也对要局部施用的组合物的总体积和终pH进行标准化。如下制备样品：
标记为“AZ”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和超纯形式的非肽基载体PEIR以经计算为5∶1的MW混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
标记为“BA”的组：将每等分(即总共60U)2.0单位的肉毒毒素和PEI以5∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至600微升。将所得的组合物和5.4ml Cetaphil混合均匀并以200微升进行等分。
在一次处理后确定透皮递送效率的动物实验
在处理期间通过吸入异氟烷麻痹动物。在被麻痹后，C57black 6小鼠(每组n＝3)接受局部敷药，将400微升剂量的适当处理物均一地施用于脚趾至大腿中部。对两只腿都进行处理，对两侧中的任一侧来说，处理都是随机的。动物不进行脱毛处理。在最初的处理之后30分钟，根据公开的足趾外展分值(用于评价足的灵活性)(Aoki，KR.Acomparison of the safety margins of botulinum neurotoxinserotypes A，B，and F in mice.Toxicon.2001Dec；39(12)：1815-20)在施用肉毒毒素后就足趾外展的能力对小鼠进行估计。小鼠的灵活性也通过主观估计。
数据处理和统计分析：
由两个盲测者独立地将足趾外展分值列表。然后，在单向ANOVA重复测量中使用Statview软件(Abacus，Berkeley，CA)在95％的置信度下进行显著性分析来确定各组的平均值和标准差。
结果：
将在一次局部施用肉毒毒素和超纯PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和对照聚阳离子PEI(“BA”)、和重复实验(本试验的单一独立重复实验)后获得的平均足趾外展分值示于下列的表中。和对照相比，非肽基载体PEIR提供了统计学上显著的肉毒毒素穿过皮肤的功能性递送。和前面一样，观察到动物朝向被麻痹的肢体作圆周走动。
实施例7.重复实验1.在一次局部施用肉毒毒素和超纯PEIR(“AZ”)、或肉毒毒素和对照聚阳离子PEI(“BA”)后30分钟的足趾外展分值。显示平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  BA   0.833   0.307
  AZ   3.917   0.083
P＝0.0002(置信度为99％时是显著的)
实施例7.重复实验2.在一次局部施用肉毒毒素和超纯PEIR(“AZ1”)、或肉毒毒素和对照聚阳离子PEI(“BA1”)后30分钟的足趾外展分值。显示平均值和标准差。
  组   平均值   标准差
  BA1   0.333   0.211
  AZ1   3.833   0.167
P＝0.0001(置信度为99％时是显著的)
结论：
本实验表明非肽基透皮载体可将治疗剂量的肉毒毒素转运穿过皮肤而无需在之前共价修饰肉毒毒素。这些发现补充了用肽基转移试剂进行的实验。使用非肽基或肽基载体获得治疗效果的选择可使施用适合特定的情况、环境和方法，加宽了本发明的透皮递送平台的范围。
在这些实施例中，使用肽基或非肽基载体的肉毒毒素渗透对不使用所述载体的局部肉毒毒素进一步产生了透皮渗透抗原以进行免疫的用途，特别是在使用不易穿过皮肤的抗原例如肉毒杆菌进行免疫的情况下。功能性肉毒毒素的递送确保至少4个不同的抗原表位以完整的状态被透皮递送；在两个实施例中的任何一个中在缺少所述载体的情况下都不能递送功能性肉毒毒素的事实进一步证实：相对于缺少载体的试剂，所述载体提供了显著的免疫潜能。因为免疫要求抗原以足以产生免疫应答的量穿过皮肤，该方法使得能够递送用于免疫的抗原。因为该方法不要求抗原的共价修饰和不需要涉及病毒的基因转移，因此在安全稳定性和效率方面产生了许多有利方面。
实施例8
本发明详述了具有TAT效能因子的肽基和非肽基载体的产生以及这些载体和肉毒毒素的装配。
聚乙烯亚胺(PEI)和TAT片段GGGRKKRRQRRR的偶联
将缺少所有侧链保护基团的TAT片段GGGRKKRRQRRR(6mg，0.004mmol，Sigma Genosys，Houston，TX)溶解在1ml 0.1M MES缓冲液中。向其中加入EDC(3mg，0.016mmol)，然后加入50％(w∶v)的水中的PEI 400k(分子量)溶液(～0.02ml，～2.5x10-5mmol)。通过试纸测定pH为7.5。再加入1ml的0.1M MES，加入HCl将pH调整至大约为5。再加入一部分EDC(5mg，0.026mmol)，搅拌pH～5的反应物过夜。第二天早上，冷冻和冻干反应混合物。
用无菌1xPBS将Sephadex G-25柱子(直径1cm x高14cm)(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway，NJ)调成浆。通过具有19kD分子量的FITC葡聚糖(Sigma，St Louis，MO)的洗脱标准化柱子。标准物最初在5ml PBS处洗脱，在6ml处具有中间峰，在7ml处结束。将来自上面的冻干的反应混合物溶解在小体积的PBS中并加到柱上。通过连续加入1ml PBS来洗脱其。收集级分，第一级分由首先洗脱的3ml组成，包括反应物体积。随后的级分为1ml。
在280nm处测定被洗脱的级分的UV吸光率。对应于5-7ml的级分3、4和5显示出中等吸收峰。将所有级分冻干并获取红外光谱。在级分4-6中观察到TAT片段的特征性胍三重峰(2800-3000cm-1)。这些级分也显示在1700cm-1处的酰胺片段，从而进一步确定TAT片段和PEI的偶联。
使用TAT片段GGGRKKRRQRRR(11.6mg，0.007mmol)进行另一重复实验。计算该量以使30个PEI胺基中有一个预期和TAT片段反应。这非常接近上述的原始的多聚赖氨酸-寡聚精氨酸(KNR)功效因子的组成。如上所述通过I R进一步确定TAT片段与PE I胺基的成功的共价附着。
多聚赖氨酸与TAT片段的偶联：
向1ml 0.1M MES，pH～4.5中的多聚赖氨酸(10mg 1.1x 10-4mmol；Sigma)溶液中加入TAT片段(4mg，0.003mmol)，然后再加入EDC(3.5mg，0.0183mmol)。在室温下搅拌所得的反应混合物(pH～4.5)。将反应物在-78℃下冷冻过夜。第二天将反应混合物融解至室温，通过加入饱和碳酸氢钠将pH调整至～8。将反应混合物直接用于如上所述构建和标准化的Sephadex G-25柱。其洗脱于7个始于5ml后的1ml级分中。测出UV280的吸光率，在级分2、3和4中显示出相关的峰。冻干的级分的IR显示级分1-7中的特征性胍峰(2800-3000cm-1)。级分1在1730cm-1处具有很强的峰而在1600cm-1处无峰，对于级分2-6，情况正好相反。因此，进一步确定了TAT片段至肽基载体多聚赖氨酸的成功的共价附着。
随后将共价附着的TAT片段和PEI(PEIT)以及共价附着的TAT片段和多聚赖氨酸(KNT)与肉毒毒素混合以形成如下的非共价复合物：
标记为“JL-1”的组：将每等分(即总共20U)2.0单位的Btox-b和PEIT以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。
标记为“JL-2”的组：将每等分(即总共20U)2.0单位的Btox-b和KNT以4∶1的比混合均匀并用磷酸缓冲盐溶液稀释至200微升。
在非共价复合物形成后，将颗粒在12,000x g下在旋转微量离心管中离心5分钟，然后在20微升去离子水中重悬乳并在Germanium衰减全反射小室中进行蒸发以进行IR。从而进一步确认复合物中Btox-b的存在。总体而言，该实验进一步确定合成方案可用于其他效能因子，如在前面的实施例中一样，通过使用具有带正电荷的分支基团的寡聚精氨酸或效能基团的载体可将所得的载体和具有生物活性的试剂(在该情况下是肉毒毒素)结合。
实施例9
本实验展示用于特定抗原成像的肽基载体的性能。在本实验中，光学成像部分、经修饰的靶向黑色素瘤的抗体和一种Essentia肽基载体KNR2的复合物适合用于黑色素瘤的局部检测。
主链的选择：
通过将-Gly3Arg7共价地附着至多聚赖氨酸MW 150,000来装配带正电荷的肽基主链，通过以18％的饱和度(即每100个赖氨酸残基中有18个赖氨酸残基共价附着至-Gly3Arg7)将末端甘氨酸的羧基连接至赖氨酸侧链的游离胺基来进行该附着。经修饰的主链被命名为“KNR2”。对照聚阳离子是相同大小的来自相同批次的未经修饰的多聚赖氨酸(称为“K2”，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。
通过上述的EDC偶联将针对保守的人黑色素瘤结构域神经节苷脂2的鼠类单克隆抗体(IgG3，US Biologicals，Swampscott，MA)共价地附着至短的多聚天冬氨酸阴离子链(MW 3,000)以产生称为“Gang2Asp”的衍生抗体。此外，通过使用寡核酸作为聚阴离子设计阴离子成像试剂，其中序列是ATGC-J(此后称作“ATGC-J”)，“J”代表共价附着的Texas Red荧光团，(Sigma Genosys，Woodlands，TX)。为进行本实验，将6.35微克Gang2Asp和0.1712微克ATGC-J混合，然后再和17.5微克KNR2在总体积为200微升的去离子水中复合以获得5∶1∶1：：KNR2∶ATGC-J∶Gang2Asp的比例。将混合物涡旋2分钟。将所得的复合物施加于水合CellTek Human Melanoma切片和对照CellTek Cytokeratin切片(SDL，Des Plaines，IL)上，并在对相同视野中的黑色素瘤色素的荧光分布对亮视野分布进行照相测定前温育5分钟。也使用不具有ATGC-J或不具有Gang2Asp的额外的对照。
结果：
非共价复合物提供了遵从抗体衍生物的向性的光学成像试剂的分布，而不是在缺少抗体的情况下的复合物的分布。更值得注目的是，如图9中描述的，所述复合物的分布与黑色素瘤细胞的分布相一致。
结论：
本实验展示了使用适合用于局部递送的载体产生用于穿过皮肤的转运和通过光学技术显现黑色素瘤的可行复合物。可将这样的方法和例如手术边界确定法(surgical margin-setting)结合使用或可将其用于常规的黑色素瘤监视。也可容易地将类似的策略用于其他和皮肤相关的病症的局部诊断，这对本领域技术人员来说是显而易见的。假定光学成像部分具有非常高的灵敏度，那么通过这些非共价复合物可在提高对这些疾病的检测上提供远大的前景。
要理解此处描述的实施例和实施方案只是用于说明目的，要理解本领域技术人员会联想到其各种修饰或改变，所述修饰或改变在本申请的精神和范围内和在所附的权利要求的范围内。此处引用的所有出版物、专利和专利申请以其全文在此引用作为所有目的的参考。

Claims (240)

1.包含具有生物活性的蛋白和载体的组合物，所述具有生物活性的蛋白不会治疗性地改变血糖水平，所述载体包含附着有带正电荷的分支基团的带正电荷的主链并且该载体以对透皮递送有效的量存在，其中所述载体和所述具有生物活性的蛋白之间的结合是非共价结合。
2.权利要求1的组合物，其中和缺少所述载体的具有生物活性的蛋白相比，所述组合物提供更多的所述具有生物活性的蛋白的透皮递送。
3.权利要求2的组合物，其中所述具有生物活性的蛋白具有治疗活性。
4.包含非蛋白非核酸的具有生物活性的试剂和载体的组合物，所述载体包含附着有带正电荷的分支基团的带正电荷的主链并且其以对透皮递送有效的量存在，其中所述载体和所述具有生物活性的试剂之间的结合是非共价结合。
5.权利要求4的组合物，其中和缺少所述载体的具有生物活性的试剂相比，所述组合物提供更多的所述具有生物活性的试剂的透皮递送。
6.权利要求5的组合物，其中所述具有生物活性的试剂具有治疗性活性。
7.权利要求3的组合物，其中所述治疗性蛋白具有至少50,000kD的分子量。
8.权利要求1的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多肽。
9.权利要求8的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多肽。
10.权利要求8的组合物，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多肽。
11.权利要求8的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多肽。
12.权利要求8的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多聚赖氨酸。
13.权利要求12的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
14.权利要求12的组合物，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
15.权利要求12的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
16.权利要求1的组合物，其中所述主链包含带正电荷的非肽基聚合物。
17.权利要求16的组合物，其中所述非肽基聚合物主链包含带正电荷的聚烯化亚胺。
18.权利要求17的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
19.权利要求18的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约10,000至大约2,500,000的分子量。
20.权利要求18的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约100,000至大约1,800,000的分子量。
21.权利要求18的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约500,000至大约1,400,000的分子量。
22.权利要求1的组合物，其中所述载体包含带正电荷的聚合物，所述聚合物具有附着的独立选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段或混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
23.权利要求22的组合物，其中带正电荷的分支基团独立地选自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基团。
24.权利要求23的组合物，其中下标n1是从大约1至大约8的整数。
25.权利要求23的组合物，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
26.权利要求23的组合物，其中下标n2是从大约7至大约17的奇数。
27.权利要求23的组合物，其中下标n2是从大约7至大约13的奇数。
28.权利要求22的组合物，其中所述分支基团选自HIV-TAT和其片段。
29.权利要求28的组合物，其中所述附着的带正电荷的分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
30.权利要求22的组合物，其中所述分支基团是触角足PTD基团或其片段。
31.权利要求22的组合物，其中所述带正荷的聚合物包含多肽。
32.权利要求31的组合物，其中所述多肽选自多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚鸟氨酸。
33.权利要求32的组合物，其中所述多肽是多聚赖氨酸。
34.权利要求22的组合物，其中所述聚合物包含带正电荷的非肽基聚合物。
35.权利要求34的组合物，其中所述非肽基聚合物包含带正电荷的聚烯化亚胺。
36.权利要求35的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
37.权利要求4的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多肽。
38.权利要求37的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多肽。
39.权利要求37的组合物，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多肽。
40.权利要求37的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多肽。
41.权利要求37的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多聚赖氨酸。
42.权利要求41的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
43.权利要求41的组合物，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
44.权利要求41的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
45.权利要求4的组合物，其中所述主链包含带正电荷的非肽基聚合物。
46.权利要求45的组合物，其中所述非肽基聚合物主链包含带正电荷的聚烯化亚胺。
47.权利要求46的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
48.权利要求47的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约10,000至大约2,500,000的分子量。
49.权利要求47的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约100,000至大约1,800,000的分子量。
50.权利要求47的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约500,000至大约1,400,000的分子量。
51.权利要求4的组合物，其中所述载体包含带正电荷的聚合物，该聚合物具有附着的独立地选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段或混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
52.权利要求51的组合物，其中所述带正电荷的分支基团独立地选自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基团。
53.权利要求52的组合物，其中下标n1是从大约1至大约8的整数。
54.权利要求52的组合物，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
55.权利要求52的组合物，其中下标n2是从大约7至大约17的奇数。
56.权利要求52的组合物，其中下标n2是从大约7至大约13的奇数。
57.权利要求51的组合物，其中所述分支基团选自HIV-TAT和其片段。
58.权利要求57的组合物，其中所述附着的带正电荷的分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
59.权利要求51的组合物，其中所述分支基团是触角足PTD基团或其片段。
60.权利要求51的组合物，其中所述带正电荷的聚合物包含多肽。
61.权利要求60的组合物，其中所述多肽选自多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚鸟氨酸和多聚高精氨酸。
62.权利要求61的组合物，其中所述多肽是多聚赖氨酸。
63.权利要求51的组合物，其中所述聚合物包含带正电荷的非肽基聚合物。
64.权利要求63的组合物，其中所述非肽基聚合物包含带正电荷的聚烯化亚胺。
65.权利要求64的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
66.权利要求4的组合物，其包含按重量计算从大约1x10-20至大约25％的具有生物活性的试剂和从大约1x10-19至大约30％的带正电荷的载体。
67.权利要求4的控释组合物。
68.权利要求1的组合物，其中所述具有生物活性的蛋白是肉毒毒素。
69.权利要求68的组合物，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
70.权利要求68的组合物，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
71.权利要求68的组合物，其中所述肉毒毒素包括重组肉毒毒素。
72.用于将权利要求1的组合物给受试者施用的试剂盒，其包含用于递送具有生物活性的试剂和载体的装置，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，该载体以对透皮递送有效的量存在。
73.权利要求72的试剂盒，其中所述具有生物活性的试剂是肉毒毒素。
74.权利要求72的试剂盒，其中所述组合物含于用于通过皮肤或上皮将具有生物活性的蛋白施用给受试者的装置中。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述装置是皮肤贴剂。
76.用于将具有生物活性的蛋白给受试者施用的试剂盒，其包含用于将具有生物活性的蛋白递送给皮肤或上皮的装置和组合物，所述组合物包含带正电荷的载体，所述载体具有附着的独立地选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段或混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数，其中所述载体和具有生物活性的蛋白之间的结合是非共价结合。
77.权利要求76的试剂盒，其中所述装置是皮肤贴剂。
78.给受试者施用具有生物活性的蛋白的方法，所述具有生物活性的蛋白不会治疗性地改变血糖水平，该方法包括将所述蛋白和有效量的带电荷的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部地施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，其中所述载体和具有生物活性的蛋白之间的结合是非共价结合。
79.权利要求78的方法，其中和缺少所述载体的具有生物活性的蛋白相比，所述组合物提供更多的具有生物活性的蛋白的透皮递送。
80.权利要求79的方法，其中所述具有生物活性的蛋白具有治疗活性。
81.给受试者施用非蛋白非核酸的具有生物活性的试剂的方法，该方法包括将所述具有生物活性的试剂和有效量的带电荷的载体给受试者的皮肤或上皮局部地施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，其中所述载体和具有生物活性的试剂之间的结合是非共价结合。
82.权利要求81的方法，其中和缺少所述载体的试剂相比，所述组合物提供更多的具有生物活性的试剂的透皮递送。
83.权利要求82的方法，其中所述具有生物活性的试剂具有治疗活性。
84.权利要求80的方法，其中将所述具有生物活性的蛋白和载体以含有两种成分的组合物形式给受试者施用。
85.权利要求80的方法，其中将所述具有生物活性的蛋白和载体以分开的方式给受试者施用。
86.权利要求83的方法，其中将所述具有生物活性的蛋白和载体以包含两种成分的组合物的方式给受试者施用。
87.权利要求83的方法，其中将所述具有生物活性的试剂和载体以分开的方式给受试者施用。
88.权利要求80的方法，其中所述组合物是控释组合物或缓释组合物。
89.权利要求83的方法，其中所述组合物是控释组合物或缓释组合物。
90.权利要求80的方法，其中所述治疗性蛋白是肉毒毒素。
91.权利要求90的方法，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
92.权利要求90的方法，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
93.权利要求90的方法，其中所述肉毒毒素包括重组肉毒毒素。
94.权利要求90的方法，其中给受试者施用所述肉毒毒素以提供美学和/或美容益处。
95.权利要求90的方法，其中给受试者施用肉毒毒素以预防或减轻和肌肉痉挛或抽搐相关的症状。
96.权利要求90的方法，其中将肉毒毒素和所述带正电荷的载体给受试者脸上位置局部施用。
97.权利要求90的方法，其中将肉毒毒素和所述带正电荷的载体给受试者的除了脸部以外的位置局部施用。
98.包含适合用于免疫的抗原和载体的组合物，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，并且该载体以对透皮递送有效的量存在，其中所述载体和所述抗原之间的结合是非共价结合。
99.权利要求98的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多肽。
100.权利要求99的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多肽。
101.权利要求99的组合物，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多肽。
102.权利要求99的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多肽。
103.权利要求99的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多聚赖氨酸。
104.权利要求103的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
105.权利要求103的组合物，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
106.权利要求103的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
107.权利要求98的组合物，其中所述主链包含带正电荷的非肽基聚合物。
108.权利要求107的组合物，其中所述非肽基聚合物主链包含带正电荷的聚烯化亚胺。
109.权利要求108的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
110.权利要求109的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约10,000至2,500,000的分子量。
111.权利要求109的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约100,000至大约1,800,000的分子量。
112.权利要求109的组合物，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约500,000至大约1,400,000的分子量。
113.权利要求98的组合物，其中所述载体包含带正电荷的聚合物，该聚合物具有附着的独立地选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段或混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
114.权利要求113的组合物，其中所述带正电荷的分支基团独立地选自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基团。
115.权利要求114的组合物，其中下标n1是从大约1至大约8的整数。
116.权利要求114的组合物，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
117.权利要求114的组合物，其中下标n2是从大约7至大约17的奇数。
118.权利要求114的组合物，其中下标n2是从大约7至大约13的奇数。
119.权利要求113的组合物，其中所述分支基团选自HIV-TAT和其片段。
120.权利要求119的组合物，其中所述附着的带正电荷的分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
121.权利要求113的组合物，其中所述分支基团是触角足PTD基团。
122.权利要求113的组合物，其中所述带正电荷的聚合物包含多肽。
123.权利要求122的组合物，其中所述多肽选自多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚鸟氨酸。
124.权利要求123的组合物，其中所述多肽是多聚赖氨酸。
125.权利要求113的组合物，其中所述聚合物包含带正电荷的非肽基聚合物。
126.权利要求125的组合物，其中所述非肽基聚合物包含带正电荷的聚烯化亚胺。
127.权利要求126的组合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
128.权利要求98的组合物，其包含按重量计算从大约1x10-10至大约49.9％的抗原和从大约1x 10-9至大约50％的带正电荷的载体。
129.权利要求98的控释组合物。
130.权利要求98的组合物，其中所述抗原是肉毒毒素。
131.权利要求130的组合物，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
132.权利要求130的组合物，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
133.权利要求130的组合物，其中所述肉毒毒素包括重组肉毒毒素。
134.权利要求98的组合物，其中所述抗原适合进行儿童免疫。
135.用于将适合用于免疫的抗原给受试者施用的试剂盒，其包含将所述抗原递送至皮肤或上皮的装置和权利要求98的组合物。
136.权利要求135的试剂盒，其还包含定制的施药器。
137.权利要求135的试剂盒，其中所述组合物包含于用于通过皮肤或上皮将适合用于免疫的抗原施用给受试者的装置中。
138.权利要求137的试剂盒，其中所述装置是皮肤贴剂。
139.用于将适合用于免疫的抗原给受试者施用的试剂盒，其包含用于将适合用于免疫的抗原递送给皮肤或上皮的装置和组合物，所述组合物包含带正电荷的载体，所述载体具有附着的独立地选自(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段或混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数，其中所述载体和所述抗原之间的结合是非共价结合。
140.权利要求139的试剂盒，其中所述装置是皮肤贴剂。
141.给受试者施用适合用于免疫的抗原的方法，该方法包括将适合用于免疫的抗原和有效量的带正电荷的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，其中所述载体和所述抗原之间的结合是非共价结合。
142.权利要求141的方法，其中将适合用于免疫的抗原和载体以包含两种组分的组合物的形式给受试者施用。
143.权利要求141的方法，其中将所述适合用于免疫的抗原和载体以分开的方式给受试者施用。
144.权利要求141的方法，其中所述主链包含带正电荷的多肽。
145.权利要求144的组合物，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多肽。
146.权利要求144的方法，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多肽。
147.权利要求144的组合物，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多肽。
148.权利要求144的组合物，其中所述主链包含带正电荷的多聚赖氨酸。
149.权利要求148的方法，其中所述主链包含具有从大约10,000至大约1,500,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
150.权利要求148的方法，其中所述主链包含具有从大约25,000至大约1,200,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
151.权利要求148的方法，其中所述主链包含具有从大约100,000至大约1,000,000的分子量的带正电荷的多聚赖氨酸。
152.权利要求141的方法，其中所述主链包含带正电荷的非肽基聚合物。
153.权利要求152的方法，其中所述非肽基聚合物主链包含带正电荷的聚烯化亚胺。
154.权利要求153的方法，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
155.权利要求154的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约10,000至大约2,500,000的分子量。
156.权利要求154的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约100,000至大约1,800,000的分子量。
157.权利要求154的方法，其中所述聚乙烯亚胺具有从大约500,000至大约1,400,000的分子量。
158.权利要求141的方法，其中所述载体包含带正电荷的聚合物，该聚合物具有附着的独立地选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段或混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
159.权利要求158的方法，其中所述带正电荷的分支基团独立地选自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基团。
160.权利要求159的方法，其中下标n1是从大约1至大约8的整数。
161.权利要求159的方法，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
162.权利要求159的方法，其中下标n2是从大约7至大约17的奇数。
163.权利要求159的方法，其中下标n2是从大约7至大约13的奇数。
164.权利要求158的方法，其中所述分支基团选自HIV-TAT和其片段。
165.权利要求164的方法，其中所述附着的带正电荷的分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
166.权利要求158的方法，其中所述分支基团是触角足PTD基团。
167.权利要求158的方法，其中所述带正电荷的聚合物包含多肽。
168.权利要求167的方法，其中所述多肽选自多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚鸟氨酸。
169.权利要求168的方法，其中所述多肽是多聚赖氨酸。
170.权利要求158的方法，其中所述聚合物包含带正电荷的非肽基聚合物。
171.权利要求170的方法，其中所述非肽基聚合物包含带正电荷的聚烯化亚胺。
172.权利要求171的方法，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
173.权利要求141的方法，其中所述组合物是控释组合物。
174.权利要求141的方法，其中所述适合用于免疫的抗原是肉毒毒素。
175.权利要求174的方法，其中所述肉毒毒素选自A、B、C、D、E、F和G血清型肉毒毒素。
176.权利要求174的方法，其中所述肉毒毒素包括肉毒毒素衍生物。
177.权利要求174的方法，其中所述肉毒毒素包括重组肉毒毒素。
178.权利要求141的方法，其中所述抗原适合进行儿童免疫。
179.权利要求141的方法，其中施用所述适合用于免疫的抗原以提供对环境抗原的抗性。
180.权利要求141的方法，其中施用所述适合用于免疫的抗原以提供对潜在病原体的抗性。
181.权利要求141的方法，其中施用所述适合用于免疫的抗原以提供对潜在的生物危害物的抗性。
182.权利要求4的组合物，其中所述具有生物活性的试剂是抗真菌剂。
183.权利要求182的组合物，其包含按重量计算从大约1x10-10至大约49.9％的具有生物活性的试剂和从大约1x10-9至大约50％的带正电荷的载体。
184.权利要求182的控释组合物。
185.权利要求182的组合物，其中所述抗真菌剂选自两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑、制霉菌素和环吡酮。
186.用于将抗真菌剂给受试者施用的试剂盒，其包含将所述抗真菌剂递送至受试者的皮肤或上皮的装置和权利要求182的组合物。
187.权利要求186的试剂盒，其还包含定制的施药器。
188.权利要求186的试剂盒，其中所述组合物包含于用于通过甲板或邻近解剖结构将抗真菌剂施用给受试者的装置中。
189.权利要求186的试剂盒，其中所述装置是修复用甲板(prosthetic nail plate)或甲油。
190.权利要求81的方法，其中所述具有生物活性的试剂是抗真菌剂。
191.权利要求190的方法，其中将所述抗真菌剂和载体以包含两种组分的组合物的形式给受试者施用。
192.权利要求190的方法，其中将所述抗真菌剂和载体以分开的方式给受试者施用。
193.权利要求190的方法，其中所述组合物是控释组合物。
194.权利要求190的方法，其中所述抗真菌剂选自两性霉素B、氟康唑、氟胞嘧啶、依曲康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑、制霉菌素和环吡酮。
195.权利要求190的方法，其中施用所述抗真菌剂以治疗真菌感染的症状和体征。
196.权利要求190的方法，其中施用抗真菌剂以改变甲板或甲床的真菌感染的症状或体征。
197.带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其具有附着的独立地选自-(gly)n1-(arg)n2、HIV-TAT和其片段、以及触角足PTD和其片段和混合物的带正电荷的分支基团，其中下标n1是从0至大约20的整数，下标n2独立地是从大约5至大约25的奇整数。
198.权利要求197的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述带正电荷的分支基团独立地选自具有式-(gly)n1-(arg)n2的基团。
199.权利要求198的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中下标n1是从大约1至大约8的整数。
200.权利要求198的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中下标n1是从大约2至大约5的整数。
201.权利要求198的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中下标n2是从大约7至大约17的奇数。
202.权利要求198的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中下标n2是从大约7至大约13的奇数。
203.权利要求197的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述分支基团选自HIV-TAT和其片段。
204.权利要求203的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述附着的带正电荷的分支基团是具有式(gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q、(gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q或(gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q的HIV-TAT片段，其中下标p和q各自独立地是从0至20的整数。
205.权利要求197的带正电荷的多肽或非肽基聚合物，其中所述分支基团是触角足PTD基团或其片段。
206.权利要求197的带正电荷的聚合物，其中所述带正电荷的载体包含多肽。
207.权利要求206的带正电荷的聚合物，其中所述多肽选自多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚鸟氨酸和多聚高精氨酸。
208.权利要求207的带正电荷的聚合物，其中所述多肽是多聚赖氨酸。
209.权利要求197的带正电荷的聚合物，其中所述带正电荷的载体包含带正电荷的非肽基聚合物。
210.权利要求209的带正电荷的聚合物，其中所述非肽基聚合物包含带正电荷的聚烯化亚胺。
211.权利要求210的带正电荷的聚合物，其中所述聚烯化亚胺是聚乙烯亚胺。
212.一种组合物，其包含下列物质的非共价复合物：
a)带正电荷的主链；和
b)至少两个选自下列的成员：
i)具有数个附着的成像部分的带负电荷的主链或数个带负电荷的成像部分；
ii)具有数个附着的靶向部分的带负电荷的主链或数个带负电荷的靶向部分；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂的带负电荷的主链或带负电荷的生物学试剂；
其中所述复合物携带净正电荷且至少一个所述成员选自i)、ii)、iii)或v)。
213.制备药物或药妆组合物的方法，所述方法包括将带正荷的主链组分和至少两个选自下列的成员与药物或药妆可接受的载体组合以形成具有净正电荷的非共价复合物，并且其中至少一个所述成员选自i)、ii)、iii)或v)：
i)具有数个附着的成像部分的带负电荷的主链；或数个带负电荷的成像部分；
ii)具有数个附着的靶向部分的带负电荷的主链；或数个带负电荷的靶向部分；
iii)至少一个选自RNA、DNA、核酶、经修饰的寡核苷酸和编码选择的转基因的cDNA的成员；
iv)编码至少一个驻留因子的DNA；和
v)具有数个附着的生物学试剂或药妆试剂的带负电荷的主链，或带负电荷的生物学试剂或药妆试剂。
214.包含胰岛素和对胰岛素的透皮递送有效的量的载体的组合物，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，其中所述载体和胰岛素之间的结合是非共价结合。
215.权利要求214的组合物，其包含从大约30∶1至大约1.01∶1的重量比的胰岛素和带正电荷的载体。
216.权利要求214的控释组合物。
217.用于将胰岛素给受试者施用的试剂盒，其包含胰岛素和载体，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，所述载体以对透皮递送有效的量存在，其中所述载体和胰岛素之间的结合是非共价结合。
218.权利要求217的试剂盒，其中所述组合物包含于用于将胰岛素通过皮肤或上皮给受试者施用的装置中。
219.将胰岛素给受试者施用的方法，其包括将胰岛素和有效量的带正电荷的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，其中所述载体和胰岛素之间的结合是非共价结合。
220.权利要求219的方法，其中所述组合物是控释组合物。
221.包含成像部分和靶向试剂以及载体的组合物，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，所述载体以对透皮递送有效的量存在，其中所述载体和具有生物活性的蛋白之间的结合是非共价结合。
222.权利要求221的组合物，其中所述成像部分和靶向试剂在物理或化学上是不同的。
223.权利要求221的组合物，其中所述成像部分和靶向试剂不都是磷酸盐。
224.权利要求221的组合物，其中所述成像试剂是光学成像试剂。
225.权利要求224的组合物，其中所述成像试剂选自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregongreen 514、绿色荧光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA。
226.权利要求221的组合物，其中所述成像试剂适合用于磁共振成像。
227.权利要求221的组合物，其中所述靶向试剂识别黑色素瘤。
228.用于将权利要求221的组合物给受试者施用的试剂盒，其包含用于递送所述成像和靶向部分以及载体的装置，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，并且其以对透皮递送有效的量存在。
229.用于将成像部分和靶向试剂给受试者施用的方法，其包括将所述成像部分和靶向试剂与有效量的带正电荷的载体一起给受试者的皮肤或上皮局部施用，所述载体包含具有附着的带正电荷的分支基团的带正电荷的主链，其中所述载体和所述具有生物活性的蛋白之间的结合是非共价结合。
230.权利要求229的方法，其中所述成像部分和靶向试剂在物理或化学上不同。
231.权利要求229的方法，其中所述成像部分和靶向试剂不都是磷酸盐。
232.权利要求229的方法，其中所述成像试剂是光学成像试剂。
233.权利要求232的方法，其中所述成像试剂选自Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Oregon green 488、Oregon green 500、Oregongreen 514、绿色荧光蛋白、6-FAM、Texas Red、Hex、TET和HAMRA。
234.权利要求229的方法，其中所述成像试剂适合用于磁共振成像。
235.权利要求229的方法，其中所述靶向试剂识别黑色素瘤。
236.权利要求229的方法，其中将所述组合物用于筛查有患黑色素瘤风险的患者。
237.权利要求229的方法，其中将所述组合物用于帮助手术切除黑色素瘤。
238.权利要求229的方法，其中将所述组合物和照相技术或图象分析技术结合使用。
239.一种组合物，其包含下列物质的非共价复合物：
a)带正电荷的主链；和
b)至少两个选自下列的成员：
i)具有数个附着的成像部分的带负电荷的主链；或数个带负电荷的成像部分；
ii)具有数个附着的靶向试剂的带负电荷的主链；或数个带负电荷的靶向部分；和
iii)具有数个附着的生物学试剂的带负电荷的主链，或带负电荷的生物学试剂；
其中所述复合物携带净正电荷且所述成员中的至少一个选自i)、ii)、iii)或v)。
240.制备药物或药妆组合物的方法，所述方法包括将带正电荷的主链组分和至少两个选自下列的成员与药物或药妆可接受的载体组合以形成具有净正电荷的非共价复合物，条件是其中至少一个所述成员选自i)、ii)、iii)或v)：
i)具有数个附着的成像部分的带负电荷的主链或数个带负电荷的成像部分；
ii)具有数个附着的靶向试剂的带负电荷的主链或数个带负电荷的靶向部分；和
iii)具有数个附着的生物学试剂或药妆试剂的带负电荷的主链，或带负电荷的生物学试剂或药妆试剂。
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