CN102827819A - 一种β-木糖苷酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β-木糖苷酶及其应用，包括有a）序列为SEQ ID NO：1的酶；）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本发明筛选出的β-木糖苷酶在木聚糖降解为低聚木糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产木二糖，具有工业生产应用价值。而且筛选出的β-木糖苷酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达木糖苷酶的重组菌。
Description
技术领域
本发明属于遗传酶工程技术领域，具体涉及一种β-木糖苷酶及其应用。
背景技术
β-木糖苷酶（β-xylosidase,EC 3.2.1.37），是一种木聚糖裂解酶。可与木聚糖酶协同作用，将木聚糖彻底分解，是木聚糖降解的关键酶之一。β-木糖苷酶主要以外切方式作用于木二糖或低聚木糖的非还原端木糖苷键并释放出木糖，因此在整个协同水解过程中可以降低木聚糖的水解产物从而可以较大程度的解除产物对木聚糖酶的抑制，是木聚糖水解过程中的限速酶。β-木糖苷酶在将单糖或乙醇连接到木糖单元或从木糖单元中切割下来的葡基转移反应中也是有效的。β-木糖苷酶还可以作用于萜类、甾体等甙元与木糖形成的糖苷键，释放出甙元。
β-木糖苷酶的水解反应和葡基转移反应在降解和利用农业废物中具有重要经济价值，例如在木糖、木糖寡聚物和木糖醇的产生过程中（这些物质在食品、蜜饯和药物中作为增甜剂，特别是作为糖替代品是有用的）。并且，此酶或其产物可以用作面包改进剂并可用于啤酒酿制工业中。在造纸工业的纸浆漂白中，β-木糖苷酶与木聚糖酶协同作用可以有效提高漂白性能；在医药行业中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可产生在医药行业具有重要应用价值的中间转化产物。因此对于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有广泛而重要的用途。
研究发现，不同来源的β-木糖苷酶存在作用效果上的差异，因此，筛选出不同来源的β-木糖苷酶，除了可以研究其酶学特性以外,还可以为研究糖苷水解酶家族特征及酶的体外定向改造提供理论上的指导。并可为工业生产性能优良的纤维素及半纤维素水解酶提供新型酶制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-木糖苷酶及其应用，即一种具有工业应用价值的新型β-木糖苷酶，从而弥补现有技术的不足。
本发明一个方面涉及一种木糖苷酶，包括有：
a）序列为SEQ ID NO：1的酶；
b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
编码上述木糖苷酶的核苷酸，其一种序列为SEQ ID NO：2。
本发明还提供用于表达上述木糖苷酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ IDNO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
本发明还涉及携带有表达上述木糖苷酶的重组表达质粒的重组菌。
本发明的木糖苷酶用于制备木二糖。
本发明提供的重组菌所产β-木糖苷酶主要为胞外酶，发酵进行到第5天时，发酵液酶量达到24.78U/ml。其最适温度为50℃，最适pH为6.6。
本发明筛选出的β-木糖苷酶在木聚糖降解为低聚木糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产木二糖，具有工业生产应用价值。而且筛选出的β-木糖苷酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达木糖苷酶的重组菌。
附图说明
图1：本发明的β-木糖苷酶基因DNA电泳图谱；
图2：本发明的质粒pGm-x449的构建图；
图3：本发明木糖苷酶在不同温度下的相对活力；
图4：本发明木糖苷酶在不同pH值下的相对活力。
图5：本发明木糖苷酶在不同温度下的热稳定性。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
一、本发明的β-木糖苷酶的分离
1、纸状葡萄穗霉菌总DNA提取
（1）将纸状葡萄穗霉菌(购自中国微生物菌种保管委员会普通微生物中心,CGMCC3.5365)用CMC液体培养基在30℃，200rpm，摇床培养48h；
（2）用无菌纱布过滤得菌丝体，将菌丝体在液氮中磨成粉末。
（3）与提取方法参考试剂盒Fungal DNA kit（购自OMEGA bio-tek)。
2、β-木糖苷酶基因的克隆和筛选
根据纸状葡萄穗霉菌全基因组分析得到的β-木糖苷酶基因序列即SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，设计一对寡核苷酸引物P1和P2，其序列为：
P1:5′-CCATTACGTAAGAATGCTGACCTCTCTTGTACTCCTG-3′
P2:5′-CTAGTCTAGATTATGCAACCTCACGGGCCGTC-3′
取实施例1提取的基因组DNA溶液1.5μl作为模版扩增β-木糖苷酶基因。
反应混合物（50μl）如下：
dd H2O、34μl；KOD buffer、5μl；MgCl2 buffer、2μl；dNTP Mix、4μl；P1引物、1.0μl；P2引物、1.0μl；基因组DNA、1.5μl；KOD、1μl。
反应程序如下：第一阶段变性95℃，3min；第二阶段变性94℃，30s，退火58℃，30s，延伸68℃3min，共进行25个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。
PCR产物用SnaBⅠ和XbaⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受太大肠杆菌（E.coli）DH5α后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37℃培养14-16小时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4ml LB液体培养集中进行培养（含Amp），14-16小时后，提取质粒鉴定和测序。将重组质粒pGm-x449转入表达宿主黑曲霉G1，含有该重组质粒的重组菌株为G1-pGm-x449。
其中的酶切及连接反应均参照表1。
表1酶切体系及连接体系
3、转化黑曲霉及重组子筛选鉴定
（1）将黑曲霉G1孢子用CMC液体培养基，30℃培养过夜。
（2）将（1）中获得的菌体用6层无菌纱布过滤，并用Solution A冲洗
（3）将（2）中获得的菌丝体放入加有0.6g Lysing Enzymes和40mlSolution B的无菌三角瓶中，混匀，30℃，150rpm，1小时后，将转速改为80rpm，1小时。
（4）然后用两层无菌神奇滤布过滤，将滤液分装到50ml无菌离心管中，加Solution B至45ml，4000rpm，离心10min。弃上清；加20ml SolutionB混匀，4000rpm，离心5min，弃上清；再加20ml Solution B混匀，4000rpm，离心5min，弃上清。
（5）加100μl Solution B混匀，加10μl实施例3得到的重组质粒；再加12.5μl Solution C混匀，冰上静置20min。
（6）加2ml Solution B，1ml Solution C和8ml adms上层培养基，混匀，倒入3个adms下层培养基平板中，30℃恒温箱培养。3-4天后，观察有无转化子长出。
（7）将长出的转化子转接adms二次验证培养基平板中，30℃恒温箱培养，并进行菌落PCR验证，获得阳性菌株。经测序鉴定，获得的β-葡糖苷酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。同来源于Verticilliumalbo-atrum VaMs.102的β-木糖苷酶（GenBank索引号为EEY17154.1）具有较高同源性，为51%。
4、重组菌株的培养和β-木糖苷酶的表达
将获得的阳性菌株接种于液体培养基中，于30℃ 200rpm摇床培养。
5、β-木糖苷酶的活性测定
以对-硝基苯酚-β-D-木糖苷（pNPX）为底物测定β-木糖苷酶的活性，以每分钟催化pNPX生成1微摩尔对-硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量为一个酶活单位（IU）。
5.1、测定本发明木糖苷酶在不同温度下的比活力：
反应体系为：在100μl缓冲液中加适当稀释浓度的粗酶液50μl再加入4mM pNPX 50μl。混匀，分别置于30-80℃水浴中，准确计时15min；反应结束后，迅速、准确地加入1M碳酸钠溶液100μl，摇匀，然后在410nm下测定吸光值。测定结果参见图3。从该图中可以看出，木糖苷酶的最适反应温度为50℃
5.2、测定本发明木糖苷酶在不同pH下的比活力：
反应体系与测定本发明木糖苷酶在不同温度下的比活力相同，缓冲液的pH值设为2.4-7.8，反应温度为50℃。测定结果参见图4。从该图中可以看出，木糖苷酶的最适反应pH为6.6
5.3、测定本发明木糖苷酶的热稳定性
将一定浓度的粗酶液放入40、50和60℃水浴中温浴，每隔一小时取出一部分酶做酶活反应。
反应体系为：在100μl缓冲液中加适当稀释浓度的粗酶液50μl再加入4mM pNPX50μl。混匀，置于50℃水浴中，准确计时15min；反应结束后，迅速、准确地加入1M碳酸钠溶液100μl，摇匀，然后在410nm下测定吸光值。测定结果参见图5。
6、β-木糖苷酶的应用实例
以桦木木聚糖为底物，加入木聚糖酶(11.25U/g)和β-木糖苷酶(10U/g)进行水解试验，以单独木聚糖酶水解为对照。发现加入β-木糖苷酶后，桦木木聚糖分解为木二糖的量由30%增加到70%，这表明本发明的β-木糖苷酶在木聚糖降解为低聚木糖的过程中发挥了十分重要的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种β-木糖苷酶，包括有：
a）序列为SEQ ID NO：1的酶；
b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸用于编码权利要求1所述的β-木糖苷酶。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的序列为SEQ ID NO：2。
4.一种用于表达权利要求1所述的β-木糖苷酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5.一种重组菌，其特征在于所述的重组菌携带有权利要求4所述的重组表达质粒。
6.权利要求1所述的β-木糖苷酶的应用，其特征在于，所述的β-木糖苷酶用于制备木二糖。
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