CN102827816A - 一种α-淀粉酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种α-淀粉酶及其应用，所述的α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明筛选出的α-淀粉酶在淀粉水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的α-淀粉酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达α-淀粉酶的重组菌。
Description
技术领域
本发明属于酶基因工程技术领域，具体涉及一种α-淀粉酶及其应用。
背景技术
真菌来源的α-淀粉酶可以粗略的按酶学性质或作用条件分为3种类型：中性真菌α-淀粉酶、耐酸或耐热性真菌α-淀粉酶、具有生淀粉酶活力的真菌α-淀粉酶。α-淀粉酶是重要的工业用酶，其被用于生产产品诸如高麦芽糖浆、焙烤制品。在啤酒酿制行业（提高麦芽汁的可发酵性）、黄酒酿制行业（改善酒质，提高出酒率）以及低聚异麦芽糖生产等行业均有不同程度的应用。
已报道有多种真菌α-淀粉酶基因在不同宿主中得到表达,其中真菌α-淀粉酶基因的异源表达主要集中在真核表达系统,尽管绝大多数报道中异源表达真菌α-淀粉酶的表达水平不高,但异源表达是实现真菌α-淀粉酶单一酶活的最好途径。
我国在真菌α-淀粉酶的研究方面虽然开展较晚，但研究成果对提升我国酶制剂工业有积极意义。与其它淀粉水解酶系的研究水平相比，我国真菌α-淀粉酶的研究水平不高，所有研究几乎没有涉及基因的克隆与表达，发酵生产方式也未从固态发酵向液体发酵转变，发酵生产水平与国际先进水平也存在较大差距。酶制剂产品为多种α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷酶的混合产品，往往无法有效的进行目的产物的生成。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-淀粉酶及其应用，即一种具有工业应用价值的新型α-淀粉酶，以弥补现有技术的不足。
本发明一个方面涉及一种α-淀粉酶，包括有：
a）序列为SEQ ID NO：1的酶；
b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
编码上述α-淀粉酶的核苷酸，其一种序列为SEQ ID NO：2。
本发明还提供用于表达上述α-淀粉酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ IDNO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
本发明还涉及携带有表达上述α-淀粉酶的重组表达质粒的重组菌。
本发明筛选出的α-淀粉酶在淀粉水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的α-淀粉酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达α-淀粉酶的重组菌。
附图说明
图1：用于表达本发明的α-淀粉酶的pGm-Pamy质粒图谱，
图2：本发明的α-淀粉酶的SDS-PAGE凝胶图；
图3：本发明的α-淀粉酶在黑曲霉宿主中的pH稳定性；
图4：本发明的α-淀粉酶在在黑曲霉宿主中的温度稳定性。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
1、α-淀粉酶Pamy的合成
从绳状青霉（Penicillium Funiculosum）全基因组测序得到的蛋白序列中找到绳状青霉淀粉酶（Penicillium Funiculosum amylase）序列。将该序列在NCBI中blast,与已知序列alpha-amylase,putative[Penicillium marneffei ATCC 18224]的最高相似度为86%,将绳状青霉淀粉酶（Penicillium Funiculosum amylase）的蛋白序列进行密码子优化并翻译成相应的核酸序列Pamy，使Pamy不被XhoⅠ和XbaⅠ两个酶切位点切断，在Pamy核酸序列两端加XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点，将文本序列送至生物公司（上海生工）合成，合成的Pamy被连接在载体PSG-TS上,插入位点为t-a克隆，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。其中本发明的α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
2、α-淀粉酶Pamy基因重组载体的构建
将连在PSG-TS载体上的Pamy基因用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段。与同样用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α后，涂于含有Amp的LB固体培养基上。37℃培养14-16小时，进行菌落PCR验证，有正确条带的，挑取单克隆转接到4ml LB液体培养基中进行培养（含Amp），培养14-6小时后，提取质粒，将重组质粒pGm-Pamy转入表达宿主黑曲霉G1，含有该重组质粒的重组菌株命名为G1-pGm-Pamy。
其中的酶切及连接反应均参照表1。
表1酶切体系及连接体系
3、转化黑曲霉及重组子筛选鉴定
（1）将装有100ml CMA的250ml4-挡板摇瓶用新鲜的黑曲霉G1菌株孢子接种，在30℃、200rpm条件下使培养物生长12小时。
（2）将（1）中获得的菌体用4层无菌纱布过滤，先用无菌水冲洗3次，再用溶液A冲洗3次。
（3）在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到原生质体溶液中并在30℃、200rpm温育2小时，显微镜观察监测原生质体化进展。
（4）用无菌Micra-Cloth将原生质体化反应滤入至两个50ml无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45ml，4000rpm离心10min。弃上清；向管中加20ml溶液B，混匀，4000rpm离心5min，弃上清；再向管中加20ml溶液B，混匀，4000rpm离心5min，弃上清。
（5）加100μl溶液B重悬原生质体，原生质体的浓度应达到1×107个/100μl。在冰上，将100μl原生质体溶液转移到预冷的15ml管中，每个转化反应一管。以不超过10μl的体积向管中加入10μg DNA，并加入12.5μl溶液C，温和混匀并在冰上温育20分钟。
（6）将MMSA上层培养基（每管8ml）熔化并保持在55℃。从冰中移出原生质体，向原生质体中加入1ml溶液C和2ml溶液B，并与一管MMSA上层培养基温和混匀，将混合液分别倒入三个amds下层培养基平板中30℃恒温培养4-7天。
（7）将长出的转化子转接至adms二次验证培养基平板，30℃恒温培养，并进行菌落PCR验证，获得的阳性菌株经测序鉴定正确，α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
溶液A（每500ml）－2.5ml 1M K2HPO4;2.5ml 1M KH2PO4;48.156g无水MgSO4(FW 120.37)；加入dlH2O至终体积500ml，pH5.5。将溶液过滤灭菌并在室温下保存。
原生质体化溶液—将0.6g的β-D-葡聚糖酶（InterSpex Products，Inc,CA）或者450mgβ-D-葡聚糖酶和150mg Driselase（InterSpex Products，Inc.）溶解于40ml溶液A中，并将溶液过滤灭菌，0.2微米。
溶液B（每500ml）—5ml 1M Tris，pH7.5；2.77g CaCl2（FW 110.99）；109.32g山梨醇（FW 182.2；1.2M）；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌并在室温下保存。
溶液C(每500ml)—250g PEG4000；2.77g CaCl2；5ml 1M Tris，pH7.5；加入dlH2O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌。
MMSA琼脂—将0.59g/L乙酰胺；3.4g/L CsCl；0.52g/L KCl；1.52g/L KH2PO4；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L痕量元素；10g/L琼脂（顶层琼脂中的低熔点琼脂糖）溶解于1L dlH2O，高压灭菌。灭菌后，在无菌条件下加入10ml50%葡萄糖和1.25ml 20% MgSO4·7H2O。
CMA（1升）=20g无水葡萄糖；20g麦芽膏（Difco Brand Malt Extract），1g蛋白胨（Bacto Peptone）；20g琼脂（Bacto Agar）
4、α淀粉酶的活性测定
将获得的阳性菌株接种于液体发酵培养基中，于30℃、200rpm摇床培养。α淀粉酶酶活用Megazyme Alpha-amylase Ceralpha method（MegazymeInternational Ireland）试剂盒测定。转入了pGm-Pamy质粒的黑曲霉G1在pH5.4、40℃条件下测定的淀粉酶酶活可达到135.64CU/ml。
4.1、测定本发明α淀粉酶在不同pH下的酶活：
将测酶活的反应缓冲液pH分别设定为pH2.4、pH3.0、pH3.6、pH4.2、pH4.8、pH5.4、pH6.0、pH6.6、pH7.2、pH7.8，测定在这些pH条件下α淀粉酶的酶活，测定结果参见图三。从该图中可以看出，α淀粉酶的最适反应pH为6.6。
4.2、测定本发明α淀粉酶在pH6.6、不同温度下的酶活：
将反应pH设定为6.6，测反应温度分别设定为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、。测定结果参见图四。从该图中可以看出，α淀粉酶的最适反应温度为40℃。
5、α-淀粉酶的应用实例
通过研究面包硬度的变化与α-淀粉酶添加量之间的关系，发现α-淀粉酶有一定的抗老化效果。结果表明，在适当的添加范围内(0.5～1.5ml/100g面粉)，α-淀粉酶可以明显地增加面包的比容，减小面包皮和面包心的硬度，改善面包质地，提高面包的焙烤品质。α-淀粉酶能改进面包的体积，改良面包的口感，使面包等产品体积更大，颗粒更柔软，对提高面包的品质有着重要的意义。本发明为α-淀粉酶作为面包添加剂应用到面包工业中提供了一定的理论依据。
Claims (6)
1.一种α-淀粉酶，其特征在于，所述的α-淀粉酶包括有：
a）序列为SEQ ID NO：1的酶；
b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸用于编码权利要求1所述的α-淀粉酶。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列为SEQ IDNO：2。
4.一种用于表达权利要求1所述的α-淀粉酶的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将序列为SEQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌携带有权利要求4所述的重组表达质粒。
6.权利要求1所述的α-淀粉酶作为面包添加剂的应用。
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