CN102812038A

CN102812038A - 胃肠道病症的治疗

Info

Publication number: CN102812038A
Application number: CN201080060997XA
Authority: CN
Inventors: M.G.卡里; A.弗雷岑; M.克斯勒; D.P.齐默
Original assignee: Ironwood Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ironwood Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-11-09
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2030-11-09
Also published as: NZ599751A; JP5913115B2; BR112012011730A2; US20140179607A9; EP2499154A1; MX350046B; AR078950A1; IL219596A0; ZA201203342B; CL2012001186A1; US20140024593A1; UY33018A; AU2010314866A1; US20130085107A1; MX2012005368A; US20110118184A1; US8507447B2; ES2620153T3; TWI482626B; PH12012500916B1

Abstract

本发明提供对治疗胃肠道病症有用的肽。本发明还提供治疗胃肠道病症的组合物和方法与实现治疗胃肠道病症的药物组合物。在一些实施方案中，这些药物组合物包括口服剂量形式。

Description

胃肠道病症的治疗

发明领域

本发明涉及用于治疗上胃肠道病症的肽、组合物和方法。

优先权要求

本申请案要求2009年11月9日提交的美国申请第61/259,264号的优先权。前面提到的申请的全部内容以引用的方式并入本文。

序列表

本申请案通过引用的方式将名称为“IW077US_ST25.txt”(6.64千字节)的序列表并入在内，该序列表文件创建于2010年11月3日且随本文以电子档形式提交。

背景

功能性消化不良(FD)和胃轻瘫(GP)是共同地以包括胃气涨、上腹部(epigastric/upper abdominal)疼痛及/或烧心、恶心、呕吐和早期饱胀(early satiation)的症状为特征的上胃肠道(GI)病症。对于FD和GP患者的治疗选择是非常有限的，原因在于现有的治疗缺乏效力并具有较差的安全特征。消化不良被定义为存在被认为起源于胃十二指肠区域的一种或多种消化不良症状(上腹部疼痛、烧心、令人讨厌的食后发胀和早期饱胀)，但缺乏可能解释这些症状的任何器官的、全身的或代谢的疾病(参见Drossman，D.A.编著，Rome III：The FunctionalGastrointestinal Disorders(功能性胃肠道病症)，第3版，McLean，VA：Degnon Associates，Inc.，2006)。FD指在包括上内视镜检查的标准的医学检查之后无结构性解释的消化不良。可能涉及FD的病理生理学机制尤其包括：胃排空延迟、胃容纳障碍、对胃胀高敏、十二指肠对脂质或酸的敏感性改变和十二指肠空肠运动异常。也在一些FD和GP患者中观察到十二指肠延长的酸接触，且这一接触可能减慢胃排空并引起FD或GP样症状。消化不良是常见的综合征，其占胃肠病学家所见病例的约30％，FD代表全部的这些消化不良病例的约60％。

GP指在不存在机械性阻塞时以延迟的胃排空为特征的胃运动异常。GP可能是特发性的或可能是由多种病况和某些药物引起，所述病况包括I型或II型糖尿病、病毒感染、硬皮病、神经系统病症如帕金森氏症、代谢病症如甲状腺功能减退、术后肠梗阻，所述药物包括麻醉镇痛药物、三环抗抑郁剂和钙通道阻断剂。对于癌症的治疗，包括化学治疗药和对胸部及腹部的放射，也会引起暂时的或永久的胃轻瘫。最常见的症状是恶心、呕吐、胃气胀、上腹部疼痛、体重减轻和早期饱胀。胃轻瘫是会导致频繁住院、生活质量降低和残疾增加以及在严重情况下死亡率增加的慢性病况。症状严重的GP常见于患有糖尿病的个体，仅在美国就影响患者总人口1百万的糖尿病患者的5-10％。

FD和GP以及其它上胃肠道病症的常规治疗选择对于许多患者具有有限的效力。因此，对于治疗FD、GP和其它胃肠道病症的新的化合物和方法仍然存在需要。

概述

本发明的特征在于用于治疗上胃肠道病症和病况(例如，消化不良、GP、术后胃肠梗阻(post-operative gastric ileus)、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、胃食管反流疾病(GERD)或十二指肠溃疡或胃溃疡)以及本文描述的其它病况和病症的肽、组合物和相关的方法。组合物的特征是在上GI活化鸟苷酸环化酶C(GC-C)但在下GI对GC-C的活化作用相对较弱或完全无作用的肽。不受限于任何具体的理论，本发明的肽是有用的，因为它们可以在足以减少上GI症状的剂量水平和给药频率下减轻上GI病症的症状(总体上或部分上是通过增加上GI运动及/或减少上腹部疼痛/不适和胃气胀)，而不会在下GI道中造成显著影响(例如，肠排便习惯的剂量限制改变，包括腹泻)。本发明的肽还对减轻胃肠疼痛和不适有用。

本发明的一方面提供肽或其药学上可接受的盐，其中肽包含氨基酸序列：

Xaa₁ Xaa₂ Xaa₃ Xaa₄ Cys₅ Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇，或其药学上可接受的盐；其中

Xaa₁是Asn、D-Asn、Gln、D-Gln、Pro、Ala、β-Ala、D-Ala、Val、D-Val、Gly、Thr、D-Thr、Asp、D-Asp、γ-羧化的Asp、Glu、D-Glu、γ-羧化的Glu、α-氨基辛二酸(Asu)、α-氨基己二酸(Aad)、α-氨基庚二酸(Apm)，或不存在；

Xaa₂是Asp、γ-羧化的Asp、Glu、γ-羧化的Glu、Asu、Aad、Apm，或不存在；

Xaa₃是Asp、γ-羧化的Asp、Glu、γ-羧化的Glu、Asu、Aad、Apm，或不存在；

Xaa₄是Cys或D-Cys；

Xaa₆是P-Ser、P-Thr、P-高-Ser、4-羟基缬氨酸磷酸酯、P-高-Thr、P-Cys或P-Tyr；

Xaa₇是Tyr、Leu、Phe或Ile；

Xaa₈是Cys或D-Cys；

Xaa₁₄是Thr、Ala或Phe；

Xaa₁₆是Cys或D-Cys；以及

Xaa₁₇是Tyr、D-Tyr或不存在；

其中：

如果存在Xaa₁，Xaa₁可以用甲基、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸或辛二酸在其氨基上修饰；

如果不存在Xaa₁且存在Xaa₂，那么Xaa₂可以用甲基、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸或辛二酸在其氨基上修饰；或

如果Xaa₁和Xaa₂都不存在，那么Xaa₃可以用甲基、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸或辛二酸在其氨基上修饰。

本发明的第二方面提供包含本发明的肽的药物组合物。

本发明的第三方面提供用于治疗胃肠道病症的方法，其包括施用根据本发明的药物组合物。

本发明的一个或多个实施方案的细节在附随的描述中列出。

附图简述

图1A说明本发明的示例性肽与碱性磷酸酶的反应。

图1B说明用磷酸酶水解对照的对硝基苯基磷酸酯。

图2呈现了显示肽2和肽4促进十二指肠液分泌的实例。

图3呈现了关于肽2、去磷酸化肽2和肽3在小鼠肠(空肠)液中的稳定性研究的结果。

图4呈现了关于肽2和肽3对STZ诱导糖尿病大鼠中液体胃排空的影响研究的结果。

这些图式通过实施例的方式提供，而不意图限制本发明的范围。

详述

鸟苷酸环化酶C(GC-C)是位于胃和肠中的上皮细胞的顶表面的跨膜受体。该受体具有细胞外的配体结合域、单个跨膜区域和C-末端的鸟苷酸环化酶结构域。当配体结合GC-C的细胞外结构域时，细胞内催化结构域催化由GTP产生cGMP。在体内，这种细胞内cGMP的增加起始导致以下事件的级联：增加的氯化物和碳酸氢盐分泌进入肠内腔，增加的腔内pH，降低的腔内钠吸收，增加的液体分泌和肠运输的加速。也已经显示从上皮双向地分泌进入粘膜和内腔的cGMP缓冲传入的C纤维熔结(C fiber firing)，表明观察到的GC-C激动剂对内脏痛的镇痛作用的潜在机制。

利那洛肽(Linaclotide)是一种口服施用的且目前在用于治疗伴随便秘的肠易激综合征(IBS-c)和慢性便秘(CC)的临床试验中的肽GC-C激动剂，其对下GI生理学具有许多效果，包括(1)减少内脏痛，(2)减少胃气胀，和(3)增加GI运输，这可以导致大便频率增加和大便稠度改善。口服施用的利那洛肽通过在内腔表面活化GC-C局部地起作用；在以治疗剂量水平口服施用之后，在全身未见可检测水平的利那洛肽。因此，利那洛肽的临床试验的结果以及用利那洛肽和相关的肽进行的临床前研究表明可以在治疗上使用GC-C肽激动剂。

服用GC-C激动剂将是有用的，其可以用于减轻上GI病症和症状(例如，功能性消化不良(FD)和胃轻瘫(GP))而不会促成可能由于GI道的下部中GC-C的刺激引起的对肠排便习惯的显著影响。这种GC-C激动剂可以减少包括改变肠排便习惯和腹泻的下GI不利事件的可能性。本文描述的GC-C肽激动剂在上GI道(例如，胃和十二指肠)具有更大的活性，而在下GI道中活性较差。这些激动剂将通过以下作用使患有上GI病症(例如，FD和GP)的患者受益：(1)通过cGMP产生及/或其它机制减少内脏痛，(2)减少胃气胀，(3)增加胃排空及/或上小肠运输(例如，十二指肠运输)，和(4)通过促进碳酸氢盐分泌中和十二指肠中的酸。重要地，这些激动剂，由于它们对上GI的靶向活性，将能够减轻FD和GP的症状而不引起对肠排便习惯的显著的影响(例如，这些影响可源于GI道的下部中GC-C的刺激)。

在一方面，本发明提供了对治疗胃肠道病症，具体地上GI病症如FD和GP有用的新的GC-C肽激动剂。GC-C肽激动剂被设计为在包括食管、胃和上小肠(十二指肠)的上GI中具有活性，但当其经过小肠的剩余部分和大肠时活性降低。本发明的肽还对减轻胃肠疼痛和不适有用。GC-C激动剂肽含有磷酸氨基酸，例如磷酸丝氨酸，以代替其它GC-C激动剂肽中发现的保守的谷氨酸或天冬氨酸。磷酸氨基酸-OPO₃ ^2-如磷酸丝氨酸的磷酸酯能够作为谷氨酸或天冬氨酸的COO-的生物模仿物(biomimetic)，以致含磷酸氨基酸的肽能够结合并活化GC-C。含磷酸氨基酸的肽可以通过肠碱性磷酸酶脱去磷酸，这大大地降低了肽的GC-C结合和激动剂活性。肠内碱性磷酸酶存在于GI道各处，且在包括小肠的碱性腔内环境中最具活性。含磷酸氨基酸的肽能够在包括酸性胃环境和上GI道的上GI道中活化GC-C，以促进液体和碳酸氢盐分泌。当肽在上GI中促进增加的液体和碳酸氢盐分泌时，肠内腔的碱性变得更强，因而活化碱性磷酸酶活性。因而，通过肽对GC-C的作用以及肽移动通过肠，肽的磷酸氨基酸被转化成脱去磷酸的氨基酸，由此当其从上GI向下GI转移时，其作为GC-C激动剂的活性被降低。

如本文所用，在氨基酸或其三字母缩写之前的术语“P-”指磷酸氨基酸。例如，术语“P-Ser”、“P-Thr”、“P-Tyr”、“P-Cys”、“P-高-Cys”、“P-高-Ser”和“P-高-Thr”分别指磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、磷酸半胱氨酸、磷酸高半胱氨酸、磷酸高丝氨酸和磷酸高苏氨酸。如本文所用，磷酸氨基酸指氨基酸与磷酸的酯或硫酯；例如，醇或硫醇官能团上的氢被-P(O)(OH)₂替代。例如，P-Ser具有结构P-Thr具有结构

P-Tyr具有结构

且P-Cys具有结构

在一方面，本发明提供肽或其药学上可接受的盐，其中肽包含以下氨基酸序列：

Xaa₄是Cys或D-Cys；

Xaa₇是Tyr、Leu、Phe或Ile；

Xaa₈是Cys或D-Cys；

Xaa₁₄是Thr、Ala或Phe；

Xaa₁₆是Cys或D-Cys；以及

Xaa₁₇是Tyr、D-Tyr或不存在；

其中：

在一些实施方案中，Xaa₂和Xaa₃都不存在。在其它实施方案中，Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃不存在。在又一些其它实施方案中，Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃是Asp或Glu。

在一些实施方案中，Xaa₇是Tyr或Leu。

在一些实施方案中，Xaa₁₄是Thr。

在一些实施方案中，Xaa₁₇是Tyr或不存在。

在一些实施方案中，Xaa₁是Asn、D-Asn、Gln、D-Gln、Pro、Ala、β-Ala、D-Ala、Val、D-Val、Gly、Thr、D-Thr、Asp、D-Asp、Glu或D-Glu。在进一步的实施方案中，Xaa₁是Asp、D-Asp、Glu或D-Glu。

在一些实施方案中，Xaa₆是P-Ser或P-Thr。在进一步的实施方案中，Xaa₆是P-Ser。

在一些实施方案中，Xaa₁、Xaa₂和Xaa₃不存在且Xaa₄是D-Cys或Cys。在进一步的实施方案中，Xaa₇是Tyr或Leu。在进一步的实施方案中，Xaa₁₄是Thr。在进一步的实施方案中，Xaa₁₇是Tyr或不存在。在进一步的实施方案中，Xaa₆是P-Ser。

在一些实施方案中，Xaa₄、Xaa₈或Xaa₁₆中的至少一个是Cys。在一些实施方案中，Xaa₄、Xaa₈或Xaa₁₆中的至少二个是Cys。在一些实施方案中，Xaa₄、Xaa₈和Xaa₁₆都是Cys。在一些实施方案中，Xaa₄、Xaa₈或Xaa₁₆中的至少一个是D-Cys。在一些实施方案中，Xaa₄、Xaa₈或Xaa₁₆中的至少二个是D-Cys。在一些实施方案中，Xaa₄、Xaa₈和Xaa₁₆都是D-Cys。

在一些实施方案中，提供了肽或其药学上可接受的盐，其中肽包含以下氨基酸序列：

Cys₄ Cys₅ P-Ser₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Thr₁₄ Gly₁₅Cys₁₆ Xaa₁₇，其中Xaa₇是Tyr或Leu。

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly CysTyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly CysTyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；或

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys。

在一些实施方案中，提供了肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽包括包含不多于50、40、30或20个氨基酸的肽。在进一步的实施方案中，肽包含不多于19、18、17、16、15或14个氨基酸。

在另一方面，本发明提供肽或其药学上可接受的盐，其中肽由以下氨基酸序列组成：

Xaa₄是Cys或D-Cys；

Xaa₇是Tyr、Leu、Phe或Ile；

Xaa₈是Cys或D-Cys；

Xaa₁₄是Thr、Ala或Phe；

Xaa₁₆是Cys或D-Cys；以及

Xaa₁₇是Tyr、D-Tyr或不存在；

其中：

如果Xaa₁和Xaa₂都不存在，那么Xaa₃可以用甲基、乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸或辛二酸在氨基上修饰。

在一些实施方案中，Xaa₂和Xaa₃都不存在。在其它实施方案中，Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃不存在。在又一些其它实施方案中，其中Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃是Asp或Glu。

在一些实施方案中，Xaa₇是Tyr或Leu。

在一些实施方案中，Xaa₁₄是Thr。

在一些实施方案中，Xaa₁₇是Tyr或不存在。

在一些实施方案中，提供了肽或其药学上可接受的盐，其中肽由以下氨基酸序列组成：

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly CysTyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly CysTyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；或

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys。

在一些实例中，肽是经过分离的。在其它实例中，肽是经过纯化的。

在一些实施方案中，Xaa₆是可以被磷酸化的任何氨基酸。

在一些实施方案中，提供了肽的药学上可接受的盐。在一些实例中，药学上可接受的盐是盐酸盐。

变体肽

在一些情况中，用结合并活化肠内GC-C受体的变体肽治疗患者是需要的，但是变体肽与非变体形式的肽相比活性更高或更低。减少的活性可源于对受体的亲和力降低或结合之后活化受体的能力降低或肽的稳定性降低。增加的活性可源于对受体的亲和力增加或结合之后活化受体的能力增加或肽的稳定性增加。

在一些肽中，通常形成二硫键的一对或两对Cys残基的一个或两个成员可以用高半胱氨酸、青霉胺、3-巯基脯氨酸(Kolodziej等，1996Int J Pept Protein Res 48：274)；β，β-二甲基半胱氨酸(Hunt等，1993 IntJ Pept Protein Res 42：249)或二氨基丙酸(Smith等，1978 J Med Chem21：117)代替以在正常的二硫键的位置形成可选的内部交联。在其它实施方案中，二硫键可以用烃交联代替(Schafmeister等，2000 J Am ChemSoc 122：5891，Patgiri等，2008 Acc Chem Res 41：1289，Henchey等，2008 Curr Opin Chem Biol 12：692)。

肽的产生

在一种实施方案中，本发明的肽或前体肽可以在任何已知蛋白表达系统中重组产生，所述系统包括但不限于，细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、昆虫细胞系统(例如，果蝇(Drosophila)Sf9细胞系统)、酵母细胞系统(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、酵母(S.saccharomyces))或丝状真菌表达系统或动物细胞表达系统(例如，哺乳动物细胞表达系统)。本发明的肽或前体肽也可以进行化学合成。

如果肽或变体肽通过(例如)大肠杆菌重组产生，编码肽的核酸分子也可以编码允许成熟的肽从细胞分泌的前导序列。因而，编码肽的序列可以包括，例如，天然存在的细菌ST肽的前序列(pre sequence)和原序列(pro sequence)。可以从培养基中纯化被分泌的成熟的肽。

本文描述的编码肽的序列可以被插入能够在细菌细胞中递送和维持核酸分子的载体。DNA分子可以被插入自主复制载体(合适的载体包括，例如，pGEM3Z和pcDNA3及其衍生物)。载体核酸可以是细菌DNA或噬菌体DNA，如噬菌体λ或M13及其衍生物。可以在含有本文描述的核酸的载体的构建之后转化宿主细胞如细菌。合适的细菌宿主包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)和沙门氏菌(Salmonella)。除了编码核酸分子之外，基因构建体也包括允许表达的元件，如启动子和调控序列。表达载体可以包含控制转录起始的转录控制序列，如启动子、增强子、操作子和抑制子序列。许多转录控制序列是本领域的技术人员熟知的。表达载体也可以包括翻译调控序列(例如，非翻译的5′序列、非翻译的3′序列或内部核糖体进入位点)。载体可以是能够自主复制，或其可以整合进入宿主DNA以保证肽产生期间的稳定性。

包括本文描述的肽的蛋白编码序列也可以被融合到编码肽亲和标签的核酸上以便于纯化，所述肽亲和标签例如为谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、FLAG标签、六聚组氨酸、myc标签或流行性感冒HA标签。亲和标签或报告基因融合将受关注的肽的读框连接到编码亲和标签的基因的读框，以产生翻译融合。融合基因的表达引起包括受关注的肽和亲和标签的单个肽的翻译。在其中使用亲和标签的一些实例中，编码蛋白酶识别位点的DNA序列将被融合到亲和标签的读框和受关注的肽的读框之间。

适合用于在除了细菌的蛋白表达系统中产生本文描述的肽和变体的不成熟和成熟形式的基因构建体和方法，且对于本领域的技术人员熟知的基因构建体和方法，也可以用于在生物系统中产生肽。

重组产生的肽可以使用本领域的技术人员已知的方法磷酸化。在一些实施方案中，肽被重组产生，从其被表达的细胞中分离，然后使用蛋白激酶例如丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶磷酸化。大量的激酶是本领域已知的且可以用于这一目的。本领域的技术人员将认识到不同的激酶具有不同的底物特异性，且将根据肽的序列挑选激酶使用。在其它实施方案中，肽在也表达将磷酸化肽的丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶的细胞中重组产生。在其它实施方案中，肽可以通过结合磷酸氨基酸被重组产生。本领域已知用于修饰tRNA的方法，包括但不限于修饰反密码子、氨基酸附着位点及/或接受柄(accepter stem)以允许并入非天然的及/或任意氨基酸(Biochem.Biophys.Res.Comm.(2008)372：480-485；Chem.Biol.(2009)16：323-36；Nat.Methods(2007)4：239-44；Nat.Rev.Mol.Cell Biol.(2006)7：775-82；Methods(2005)36：227-238；Methods(2005)36：270-278；Annu.Rev.Biochem.(2004)73：147-176；Nuc.Acids Res.(2004)32：6200-6211；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)100：6353-6357；Royal Soc.Chem.(2004)33：422-430)。

在一些实施方案中，肽可以用化学方法产生。肽可以通过许多不同的方法合成，所述方法包括使用传统的BOC或FMOC保护的液相和固相合成。例如，可以使用连续的氨基酸偶联在2-氯三苯甲基氯树脂或王树脂(Wang resin)上合成肽。可以使用以下保护基：芴甲氧羰基或叔丁氧羰基(α-氨基，N-端)；三苯甲基或叔丁基(Cy的巯基)；叔丁基(如果存在，谷氨酸的γ-羧基和苏氨酸的羟基)；三苯甲基(如果存在，天冬酰胺侧链的β-氨基官能团(amid function)和酪氨酸的酚基)；三苯甲基或叔丁基二甲基甲硅烷基(如果存在，丝氨酸的羟基)和叔丁氧羰基(在随后的侧链修饰之前的N-端)。可以在叔胺的存在下用DIC和HOBt完成偶联，且可以将肽去保护并使用cocktail K(三氟乙酸81％、苯酚5％、茴香硫醚5％、1，2-乙二硫醇2.5％、水3％、二甲基硫2％、碘化铵1.5％ w/w)从固体载体上将其分开。除去三氟乙酸和其它挥发物之后，可以使用有机溶剂将肽沉淀。使用二甲基亚砜(Tam等(1991)J.Am.Chem.Soc.113：6657-62)或使用空气氧化方法可以形成Cys残基之间的二硫键。生成的肽可以通过反相色谱法纯化，并冻干。

磷酸氨基酸，例如磷酸丝氨酸可以通过本领域技术人员已知的任何方法引入肽(参见，例如，G.K.Toth等(2007)，Current OrganicChemistry 11：409-426)。在一些实施方案中，受保护的磷酸氨基酸类似物例如磷酸丝氨酸类似物可以作为固相上肽组装体(peptideassembly)的一部分被引入；例如作为Fmoc-Ser[PO(OBzl)OH]-OH(T.Wakamiya等(1997)，Bioorganic and Medicinal Chemistry 5：135-145，1997)或作为Fmoc-Ser[PO(O芳基/烷基)₂]-OH(G.K.Toth等(2007)Current Organic Chemistry，11：409-426)。在另一实施方案中，受保护的氨基酸类似物，例如，受保护的丝氨酸类似物，可以作为固相上肽组装体的一部分被引入(例如，用三苯甲基保护羟基侧链的Fmoc-保护的丝氨酸)。肽链的完全组装之后，Ser[Trt]或Ser[SiMe₂tBu]可以选择性地脱保护，且可以使用亚磷酰胺/氧化方法引入磷酸酯基团(G.Shapiro等(1994)Tetrahedron Letters 35：869-872；P.Hormozdiari等(1996)Tetrahedron Letters，37：8227-8230)。在其它实施方案中，化学产生的肽可以使用如上面描述的丝氨酸/苏氨酸激酶或酪氨酸激酶磷酸化。

肽可以呈游离碱的形式或作为其药学上可接受的盐被制备、分离或使用。盐的实例包括但不限于肽的乙酸盐、盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐。

肽和GC-C受体激动剂的组合物

在另一方面，提供了组合物，其中肽可以单独地或结合地与任何药学上可接受的载体或介质组合。肽可以与当向患者施用时不产生不利的、过敏的或其它不期望的反应的物质组合。使用的载体或介质可以包括溶剂、分散剂、包衣、吸收促进剂、控释剂和一种或多种惰性赋形剂(其包括淀粉、多元醇、制粒剂、微晶纤维素(例如，celphere、Celphere

)、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂以及类似物)等。如果需要，公开的组合物的片剂制剂可以通过标准的含水或无水技术包覆。

用作药学上可接受的载体和药学上可接受的惰性载体的赋形剂以及前面提到的其它成分的实例包括，但不限于：粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、抗微生物剂和包衣剂。

如本文所用，术语“粘合剂”指在本发明的实践中可以使用的任何药学上可接受的粘合剂。药学上可接受的粘合剂的实例包括但不限于：淀粉(例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉和预糊化淀粉(例如，STARCH

和STARCH 1500

由Colorcon，Ltd.出售)和其它淀粉)、麦芽糊精、明胶、天然的和合成的胶如阿拉伯胶、粉状黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如，甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素)、乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、粉状纤维素、微细纤维素、微晶纤维素(例如，AVICEL^TM，如AVICEL-PH-101^TM、-103^TM和-105^TM，由美国宾夕法尼亚州MarcusHook市的FMC Corporation出售))、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(例如，聚乙烯吡咯烷酮K30)，及其混合物。

可以具体地用于药物组合物的粘合剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、淀粉、麦芽糊精或纤维素醚(如，例如，甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素)。

如本文所用，术语“填充剂”指在本发明的实践中可以使用的任何药学上可接受的填充剂。药学上可接受的填充剂的实例包括但不限于：滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、磷酸氢钙、正磷酸钙、硫酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素(例如，Avicel PH101或CelphereCP-305)、微细纤维素、粉状纤维素、葡聚糖结合剂(dextrates)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉(例如，Starch1500)、预糊化淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽酮糖醇(isomalt)、棉子糖、麦芽糖醇、松三糖、水苏糖、乳糖醇、直辉中基性岩(palatinite)、木糖醇、肌醇及其混合物。

可以具体地用于包覆所述肽的药学上可接受的填充剂的实例包括但不限于滑石、微晶纤维素(例如，Avicel PH101或CelphereCP-305)、粉状纤维素、葡聚糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预糊化淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽酮糖醇、磷酸氢钙、棉子糖、麦芽糖醇、松三糖、水苏糖、乳糖醇、直辉中基性岩、木糖醇、甘露醇、肌醇及其混合物。

如本文所用，术语“添加剂”指任何药学上可接受的添加剂。药学上可接受的添加剂包括但不限于崩解剂、分散添加剂、润滑剂、助流剂、抗氧化剂、包衣添加剂、稀释剂、表面活性剂、调味添加剂、保湿剂、吸收促进添加剂、控释添加剂、抗结块添加剂、抗微生物剂(例如，防腐剂)、着色剂、干燥剂、增塑剂及染料。如本文所用，“赋形剂”是任何药学上可接受的添加剂、填充剂、粘合剂或药剂。

本发明的组合物也可以任选地包括其它治疗成分、抗结块剂、防腐剂、增甜剂、着色剂、调味剂、干燥剂、增塑剂、染料、助流剂、抗粘着剂、抗静电剂、表面活性剂(润湿剂)、抗氧化剂、薄膜包衣剂以及类似物。任何这些任选的成分必须是与本文描述的化合物相容的，以保证制剂的稳定性。组合物可以包含其它所需的添加剂，包括例如乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、麦芽糖醇、松三糖、水苏糖、乳糖醇、直辉中基性岩、淀粉、木糖醇、甘露醇、肌醇以及类似物，及其水合物，和氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸和甜菜碱，以及肽和蛋白，例如白蛋白。

组合物可以包括，例如，各种附加的溶剂、分散剂、包衣、吸收促进添加剂、控释添加剂和一种或多种惰性添加剂(其包括，例如，淀粉、多元醇、制粒添加剂、微晶纤维素、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解添加剂以及类似物质)等。如果需要，公开的组合物的片剂制剂可以通过标准的含水或无水技术包覆。组合物也可以包括，例如，抗结块添加剂、防腐剂、增甜添加剂、着色剂、调味剂、干燥剂、增塑剂、染料以及类似物。

合适的崩解剂包括，例如，琼脂、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯淀粉或木薯淀粉、其它淀粉、预糊化淀粉、粘土、其它藻胶、其它纤维素、胶及其混合物。

合适的润滑剂包括，例如，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇，其它二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂、syloid硅胶(美国马里兰州巴尔的摩市W.R.Grace Co.的AEROSIL 200)、合成二氧化硅的凝聚型气溶胶(美国德克萨斯州Plano市的Evonik Degussa Co.)、热解二氧化硅(美国马萨诸塞州波士顿市Cabot Co.的CAB-O-SIL)及其混合物。

合适的助流剂包括，例如，亮氨酸、胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石和正磷酸钙。

合适的抗结块添加剂包括，例如，硅酸钙、硅酸镁、二氧化硅、胶体二氧化硅、滑石及其混合物。

可以使用的合适的抗微生物添加剂，例如作为肽组合物的防腐剂，包括例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、西吡氯铵、甲酚、三氯叔丁醇、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、苯酚、苯乙醇、苯氧基乙醇、苯基醋酸汞、苯基硝酸汞、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞(thimersol)、百里香酚(thymo)及其混合物。

合适的抗氧化剂包括，例如，BHA(丁羟基茴香醚)、BHT(丁羟基甲苯)、维生素E、没食子酸丙酯、抗坏血酸及其盐或酯、生育酚及其酯、α-硫辛酸和β-胡萝卜素。

合适的包衣添加剂包括，例如，羧甲基纤维素钠、醋酸邻苯二甲酸纤维素、乙基纤维素、明胶、药用釉料、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、聚乙二醇、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、虫胶、蔗糖、二氧化钛、巴西棕榈蜡、微晶蜡及其混合物。合适的保护性包衣包括Aquacoat(例如，Aquacoat乙基纤维素水分散体，15％ w/w，FMC Biopolymer，ECD-30)、Eudragit(例如，Eudragit E PO PE-EL，Roehm Pharma Polymers)和Opadry(例如，Opadry AMB分散体，20％ w/w，Colorcon)。

在某些实施方案中，肽组合物的合适的添加剂包括蔗糖、滑石、硬脂酸镁、交聚维酮或BHA中的一种或多种。

本发明的组合物也可以包括其它赋形剂，药剂及其类别，包括但不限于L-组氨酸、

泊洛沙姆(如

和泊洛沙姆188)、抗坏血酸、谷胱甘肽、渗透增强剂(例如，脂质、胆酸钠、酰基肉毒碱、水杨酸盐、混合的胆盐、脂肪酸微团、螯合剂、脂肪酸、表面活性剂、中链甘油酯)、蛋白酶抑制剂(例如，大豆胰蛋白酶抑制剂、有机酸)、pH降低剂以及对促进生物利用度有效的吸收增强剂(包括但不限于描述在US 6086918和US 5912014中的那些)、用于咀嚼片的材料(如右旋糖、果糖、一水乳糖、乳糖和阿斯巴甜、乳糖和纤维素、麦芽糊精、麦芽糖、甘露醇、微晶纤维素和瓜尔胶、结晶山梨醇)；肠胃外剂(parenterals)(如甘露醇和聚维酮)；增塑剂(如癸二酸二丁酯、用于包衣的增塑剂、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯)；粉状润滑剂(如甘油山嵛酸酯)；软胶胶囊(如山梨醇特种溶液)；包衣用球(如糖球)；搓圆剂(如甘油山嵛酸酯和微晶纤维素)；混悬剂/胶凝剂(如角叉菜胶、结冷胶、甘露醇、微晶纤维素、聚维酮、羟基乙酸淀粉钠、黄原胶)；增甜剂(如阿斯巴甜、阿斯巴甜和乳糖、右旋糖、果糖、蜂蜜、麦芽糊精、麦芽糖、甘露醇、糖蜜、结晶山梨醇、山梨醇特种溶液、蔗糖)；湿法制粒剂(如碳酸钙、无水乳糖、一水乳糖、麦芽糊精、甘露醇、微晶纤维素、聚维酮、淀粉)、焦糖、羧甲基纤维素钠、樱桃乳酪调味剂和樱桃调味剂、无水柠檬酸、柠檬酸、糖粉(confectioner’s sugar)、D&C红色33号，D&C黄色10号铝色淀、依地酸二钠、乙醇15％、FD&C黄色6号铝色淀、FD&C蓝色1号铝色淀、FD&C蓝色1号、FD&C蓝色2号铝色淀、FD&C绿色3号、FD&C红色40号、FD&C黄色6号铝色淀、FD&C黄色6号、FD&C黄色10号、硬脂酸棕榈酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、靛胭脂、卵磷脂、甘露醇(manitol)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、甘草酸单铵、天然的和人工的橙调味剂、药用釉料、泊洛沙姆188、聚葡萄糖、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚维酮、预糊化玉米淀粉、预糊化淀粉、红色氧化铁、糖精钠、羧甲基醚纤维素钠(sodium carboxymethyl ether)、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸钠、草莓调味剂、合成的黑色氧化铁、合成的红色氧化铁、二氧化钛和白蜡。

在一些实施方案中，提供了包含本文描述的肽和一种或多种选自Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺、其组合及/或空间位阻伯胺的稳定剂的药物组合物。在进一步的实施方案中，所述剂是Mg²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺或其组合。在一些实施方案中，提供了阳离子，不限于乙酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、乙酸钙、氯化钙、磷酸钙、硫酸钙、乙酸锌、氯化锌、磷酸锌、硫酸锌、乙酸锰、氯化锰、磷酸锰、硫酸锰、乙酸钾、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、乙酸铝、氯化铝、磷酸铝或硫酸铝。在进一步的实施方案中，提供阳离子为：氯化镁、氯化钙、磷酸钙、硫酸钙、乙酸锌、氯化锰、氯化钾、氯化钠或氯化铝。在其它实施方案中，提供阳离子为氯化钙、氯化镁或乙酸锌。

在另一个实施方案中，稳定剂是空间位阻伯胺。在进一步的实施方案中，空间位阻伯胺是氨基酸。在又一实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在又进一步的实施方案中，天然存在的氨基酸选自由以下组成的组：组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甘氨酸和缬氨酸；又进一步，天然存在的氨基酸是亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸。在另一个实施方案中，空间位阻伯胺是非天然存在的氨基酸(例如，1-氨基环己烷羧酸)。在进一步的实施方案中，空间位阻伯胺是环己基胺、2-甲基丁基胺或聚合胺，如壳聚糖。在另一个实施方案中，可在组合物中使用一种或多种空间位阻伯胺。

在一些情况下，空间位阻伯胺具有式：

其中R₁、R₂和R₃独立地选自：H、C(O)OH、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷基醚、C₁-C₆烷基硫醚、C₁-C₆烷基羧酸、C₁-C₆烷基羧酰胺和烷基芳基，其中任何基团可以用卤素或氨基单次或多次地取代，且条件是R₁、R₂和R₃中至多两个是H。在另一个实施方案中，R₁、R₂和R₃中至多一个是H。

在其它实施方案中，提供了包含药学上可接受的载体、肽、阳离子和空间位阻伯胺的药物组合物，所述阳离子选自Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺或其混合物。在一种实施方案中，阳离子是Mg²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺或其混合物。在进一步的实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的粘合剂及/或药学上可接受的助流剂、润滑剂或同时具有助流剂和润滑剂及/或抗氧化剂作用的添加剂。在一些实施方案中，药物组合物施加于载体上。在一些实施方案中，载体是填充剂。

在一些情况下，施加于载体的水溶液中阳离子∶空间位阻伯胺∶肽的摩尔比是5-100∶5-50∶1。在一些情况下，阳离子∶空间位阻伯胺的摩尔比可以等于或大于2∶1(例如，在5∶1和2∶1之间)。因而，在一些情况下，施加于载体的阳离子∶空间位阻伯胺∶肽的摩尔比是100∶50∶1、100∶30∶1、80∶40∶1、80∶30∶1、80∶20∶1、60∶30∶1、60∶20∶1、50∶30∶1、50∶20∶1、40∶20∶1、20∶20∶1、10∶10∶1、10∶5∶1或5∶10∶1。当粘合剂，例如，甲基纤维素存在于施加于载体的GC-C激动剂肽溶液中时，其可以按重量计0.5％-2.5％(例如，0.7％-1.7％或0.7％-1％或1.5％或0.7％)存在。

已经发现：选自Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺和Al³⁺的阳离子对在贮存期间抑制GC-C受体激动剂多肽的氧化产物的形成有用。还发现：空间位阻伯胺对在贮存期间抑制GC-C受体激动剂多肽的甲醛亚胺加合物(“甲醛亚胺产物”)的形成有用。因而，包含选自Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺的阳离子-例如，选自Zn²⁺、Mg²⁺和Ca²⁺的二价阳离子-及/或空间位阻伯胺如氨基酸的GC-C受体激动剂多肽制剂具有用于制造、贮存和配给药物的足够的贮存期(通过色谱纯度及/或通过重量/重量测定确定)。此外，虽然空间位阻胺单独存在会在贮存期间增加利那洛肽的水解产物的形成，但是空间位阻伯胺和阳离子的组合，例如但不限于亮氨酸和Ca²⁺的组合，在贮存期间抑制GC-C受体激动剂多肽的水解产物的形成以及GC-C受体激动剂多肽的氧化产物的形成，产生通过重量/重量测定及/或通过色谱纯度确定的甚至更大的总稳定度。

在进一步的实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的粘合剂及/或药学上可接受的助流剂、润滑剂或同时起助流剂和润滑剂及/或抗氧化剂作用的添加剂。

取决于期望的用途，根据本发明的合适的药物组合物一般包括一定量的活性化合物与药学上可接受的稀释剂或赋形剂如无菌水溶液，以得出最终浓度范围。制备工艺一般是本领域熟知的，如Remington′sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)(第18版，Mack PublishingCompany，1995)所示例。

对于胃肠病症的治疗，按以下形式优选地口服施用本文描述的肽，例如，作为片剂、胶囊、包含预定量的活性成分丸剂的小袋、凝胶剂、糊剂、糖浆、大丸剂、药糖剂、膏剂、散剂、冻干粉、颗粒剂，作为含水液体或非水液体中的溶液或混悬液；作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂，经脂质体制剂(参见，例如，EP 736299)或以一些其它形式。口服施用的组合物可以包括粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂、调味剂和保湿剂。口服施用的制剂如片剂可以任选地被包覆或被压痕，且可以被配制以提供其中活性成分的持续的、延长的或控制的释放。肽可以与用于治疗胃肠病症的包括但不限于本文描述的药剂的其它药剂一起共施用。

在另一个方面，合适的药物组合物可以包含一种或多种其它治疗剂。这些治疗剂包括但不限于止痛剂；抑制分泌剂，包括质子泵抑制剂、酸泵拮抗剂、H2受体拮抗剂；PDE5抑制剂；GABA-B拮抗剂；胆汁酸螯合剂；蠕动促进剂或促动力剂(promotility agent)；抗抑郁剂；抗生素；止吐药和粘膜保护剂。

治疗方法

在本发明的一些实施方案中，提供用于胃肠道病症的治疗方法。

在一些实施方案中，胃肠道病症是上GI病症。在进一步的实施方案中，病症是GP、术后胃肠梗阻、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、胃食管反流疾病(GERD)、乳糜泻、粘膜炎或十二指肠溃疡或胃溃疡。

在一些实施方案中，胃肠道病症是GP。在进一步的实施方案中，GP是特发性GP、糖尿病GP或术后GP。

在一些实施方案中，胃肠道病症是术后胃肠梗阻。

在一些实施方案中，胃肠道病症是功能性食管病症。

在一些实施方案中，功能性食管病症是功能性胃灼热、假定的食管源性功能性胸痛、功能性吞咽困难或球状感(globus)。

在一些实施方案中，胃肠道病症是功能性胃十二指肠病症。

在一些实施方案中，功能性胃十二指肠病症是FD、嗳气病症、恶心或呕吐病症或反刍综合征。在进一步的实施方案中，功能性胃十二指肠病症是FD。在一些实施方案中，FD是食后不适综合征或上腹痛综合征。在一些实施方案中，嗳气病症是吞气症或非特异性过度嗳气(unspecified excessive belching)。在一些实施方案中，恶心或呕吐病症是慢性特发性恶心、功能性呕吐或周期性呕吐综合征。

在一些实施方案中，胃肠道病症是胃食管反流疾病(GERD)。

在一些实施方案中，胃肠道病症是乳糜泻。

在一些实施方案中，胃肠道病症是粘膜炎。

在一些实施方案中，胃肠道病症是十二指肠溃疡或胃溃疡。

可以单独地或联合治疗地使用本文描述的肽和激动剂用于治疗、预防或减少与上胃肠道病症关联的内脏痛或与本文描述的另外的病症关联的疼痛。

本文描述的GC-C受体激动剂可以与其它药剂联合施用。例如，肽可以与止痛肽或止痛化合物一起施用。止痛肽或止痛化合物可以共价地连接到本文描述的肽上，或其可以是在联合治疗中与本文描述的肽一起施用或按顺序施用的独立药剂。本文描述的GC-C受体激动剂也可以与用于治疗上GI病症的其它药剂联合施用，其它药剂包括抗抑郁剂、促动力剂或蠕动促进剂、止吐药、抗生素、质子泵抑制剂、酸阻断剂(例如，组织胺H2受体拮抗剂)、酸泵拮抗剂、PDE5抑制剂、GABA-B激动剂、胆汁酸螯合剂和粘膜保护剂。

在一些实施方案中，可以与本文描述的肽一起使用的有用的止痛剂包括Ca通道阻断剂(例如，齐考诺肽)、5HT受体拮抗剂(例如，5HT3、5HT4和5HT1受体拮抗剂)、5HT4激动剂(例如，替加色罗莫沙必利、甲氧氯普安、扎考必利、西沙必利、伦扎必利、苯并咪唑酮衍生物如BIMU 1和BIMU 8，和利沙必利)、5HT1激动剂(例如，舒马曲坦和丁螺环酮)、类阿片受体激动剂(例如，洛呱丁胺、非多托秦、脑啡肽五肽、吗啡、苯乙哌啶(diphenyloxylate)、氟雷法胺、曲美布汀和芬太尼)、CCK受体激动剂(例如，氯谷胺和右氯谷胺)、NK1受体拮抗剂(例如，阿瑞吡坦、沃氟匹坦、依洛匹坦、R-673(Hoffmann-La Roche Ltd)、SR-48968和SR-14033(Sanofi Synthelabo)、CP-122，721(Pfizer，Inc.)、GW679769(Glaxo Smith Kline)和TAK-637(Takeda/Abbot))、NK2受体拮抗剂(例如，奈帕坦特、沙瑞度坦、GW597599(Glaxo Smith Kline)、SR-144190(Sanofi-Synthelabo)和UK-290795(Pfizer Inc))、NK3受体拮抗剂(例如，奥沙奈坦(SR-142801；Sanofi-Synthelabo)、SR-241586和他奈坦)、去甲肾上腺素-5羟色胺再摄取抑制剂(NSRI)(例如，米那普仑)、辣椒素和大麻素(cannabanoid)受体激动剂、涎福林(sialorphin)和涎福林相关的肽。在文献中描述了各种类型的止痛剂。

在一些实施方案中，一种或多种其它治疗剂可以与本文描述的肽联合使用。这些治疗剂包括抗抑郁剂、促动力剂或蠕动促进剂、止吐药、抗生素、质子泵抑制剂、酸阻断剂(例如，组织胺H2受体拮抗剂)、酸泵拮抗剂、PDE5抑制剂、GABA-B激动剂、胆汁酸螯合剂和粘膜保护剂。

抗抑郁剂的实例包括但不限于三环抗抑郁剂如阿米替林

地昔帕明

丙咪嗪

阿莫沙平

去甲替林；选择性5羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)如帕罗西汀

氟西汀

舍曲林

和西酞普兰(citralopram)和其它，如多塞平

和曲唑酮

促动力剂和蠕动促进剂的实例包括但不限于伊托必利、奥曲肽、氨基甲胆碱(bethanechol)、甲氧氯普安

多潘立酮

红霉素(及其衍生物)和西沙必利

止吐药的实例包括但不限于丙氯拉嗪。

可以使用的抗生素的实例包括可以用于治疗幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)感染的那些，如阿莫西林、四环素、甲硝唑或克拉霉素。其它抗生素如红霉素及其衍生物也可以与本文描述的肽联合使用。

质子泵的实例包括但不限于奥美拉唑

艾美拉唑兰索拉唑

泮托拉唑

和雷贝拉唑H2受体阻断剂的实例包括但不限于西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁和尼扎替丁。酸泵拮抗剂的实例包括但不限于瑞法拉赞、CS-526(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2007)323：308-317)、PF-03716556(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2009)328(2)：671-9)和YH1885(Drug Metab.Dispos.(2001)29(1)：54-9)。

PDE5抑制剂的实例包括但不限于阿伐那非、罗地那非、米罗那非、柠檬酸西地那非、他达拉非、伐地那非和乌地那非。GABA-B激动剂包括但不限于巴氯芬和XP19986(CAS登记号847353-30-4)。胆汁酸螯合剂的实例包括但不限于GT102-279、考来烯胺、考来维仑、盐酸考来维仑、熊去氧胆酸、考来替泊、考来替兰、司维拉姆、与表氯醇交联的聚二烯丙基胺、交联葡聚糖的二烷基氨基烷基衍生物和N-(环烷基)烷基胺。粘膜保护剂的实例包括但不限于硫糖铝(Carafate)、替普瑞酮、聚普瑞锌、西曲酸酯和次水杨酸铋。

通过施用两种或更多种药剂，例如，本文描述的GC-C受体激动剂和另外的治疗性肽或化合物，可以完成联合治疗，所述药剂各自单独配制并施用，或通过以单一制剂施用两种或更多种药剂。联合治疗也包括其它联合。例如，两种药剂可以配制在一起，并结合包含第三种药剂的单独的制剂施用。虽然联合治疗中的两种或更多种药剂可以同时施用，但是它们不必需如此。例如，施用第一种药剂(或药剂的组合)可以在施用第二种药剂(或药剂的组合)之前的数分钟、小时、天或星期。因而，两种或更多种药剂可以在相互几分钟之内或相互1、2、3、6、9、12、15、18或24小时之内或相互1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天之内或相互2、3、4、5、6、7、8、9或10周之内被施用。在一些情况下，间隔甚至可能更长。虽然在许多情况下期望联合治疗中使用的两种或更多种药剂同时存在于患者体内，但这不必需如此。

剂量

成人的剂量范围一般可以是5μg/天至100mg/天口服本文描述的GC-C肽激动剂。以分散单位提供的片剂、胶囊或其它外观形式可以方便地包含一定量的本文描述的化合物，在该剂量或该剂量的倍数下其是有效的，例如含有25μg至2mg或约100μg至1mg的单位。向患者开出处方的化合物的准确的量将是巡诊医生的责任。然而，使用的剂量将取决于许多因素，包括患者的年龄和性别、治疗的确切病症和其严重性。

在各种实施方案中，剂量单位与食物一起在白天的任何时间被施用，在白天的任何时间不与食物一起施用，与食物一起在过夜禁食之后(例如，与早餐一起)施用，在低脂零食之后在睡前施用。在一种具体的实施方案中，剂量单位在食物消耗(例如，进餐)之前或之后施用。在进一步的实施方案中，剂量单位在食物消耗之前约15分钟至1小时施用。在各种实施方案中，剂量单位一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次或一天六次施用。在某些实施方案中，剂量单位和日剂量是相等的。

在本发明的联合治疗实施方案中，剂量单位中的两种或更多种活性成分的各自精确的量将取决于期望的各组分的剂量。因而，产生这样的剂量单位可能是有用的：当根据具体的剂量方案(例如，详细说明某数量的单位和具体的施用时间的剂量方案)被施用时，其将递送与患者仅用单组分治疗时将施用的相同的剂量的各组分。在其它情况下，可能期望产生这样的剂量单位：其将递送的一种或多种组分的剂量小于患者仅用单组分治疗时将施用的剂量。最后，可能期望产生这样的剂量单位：其将递送的一种或多种组分的剂量大于患者仅用单组分治疗时将施用的剂量。

药物组合物可以包括附加成分，其包括但不限于本文描述的活性成分和赋形剂。在某些实施方案中，剂量单位的一种或多种治疗剂可以存在于缓释制剂或控释制剂中，且附加的治疗剂可以不存在于缓释制剂中。例如，本文描述的肽或激动剂可以控释制剂或缓释制剂与另外的药剂存在于相同的剂量单位，所述另外的药剂可以是或不是控释制剂或缓释制剂。因而，在某些实施方案中，期望提供本文描述的一种或多种药剂的即释和一种或多种其它药剂的控释。

本发明已经参考其特定的示例性实施方案来描述。然而，以除了那些上面描述的示例性实施方案之外的具体形式实施本发明是可能的，这对于本领域的技术人员将是非常显然的。这可以在不偏离本发明的精神下得以完成。示例性实施方案仅是说明性的，且在任何情况下都不应视为是限制性的。本发明的范围由所附权利要求和它们的等效权利要求限定，而非在前的说明书。

实施例

本文描述的GC-C激动剂肽或其药学上可接受的盐由AmericanPeptide Company(加州Sunnyvale市)通过固相化学合成和自然折叠(空气氧化)制备。肽和它们的序列在下面显示(其中氨基酸序列是标准的单字母代码且“pS”是磷酸丝氨酸)：

肽名称	氨基酸序列
		肽1	CCpSLCCNPACTGCY
去磷酸化肽1	CCSLCCNPACTGCY
		肽2	CCpSLCCNPACTGC
去磷酸化肽2	CCSLCCNPACTGC
		肽3	CCELCCNPACTGCY
肽4	CCEFCCNPACTGCY
		肽5	DDCCpSLCCNPACTGCY
肽6	DDCCpSYCCNPACTGCY

实施例1：碱性和酸性磷酸酶对肽底物的影响

对于碱性磷酸酶反应，在0.1M Tris-HCl pH 8中以1mg/mL制备肽原液，将其在-20℃贮存直到进行测定。对于酸性磷酸酶反应，在50M磷酸钠pH 6中以1mg/mL制备肽原液，将其在-20℃贮存直到进行测定。

碱性磷酸酶反应

从马萨诸塞州Ipswich市的New England BioLabs获得牛小肠碱性磷酸酶(CIP)，目录号M0290S。通过用缓冲液(50mM KCl，10mMTris-HCl pH 8，1mM MgCl₂，50％甘油)稀释至0.5单位/μL制备CIP反应溶液。碱性磷酸酶反应溶液以20μL的量配制，其包含：

2μL 10X CIP缓冲液(1M NaCl，500mM Tris-HCl pH 8，100mMMgCl₂)

2μL肽原液(1mg/mL)

12μL H₂O

4μL碱性磷酸酶(0、0.5或2单位)

将反应溶液轻轻地混合并在37℃孵育90分钟。这些反应溶液在-20℃贮存直到分析。分析时，将反应溶液用水中0.1％的甲酸从7.5μL的CIP处理的肽稀释至50μL，至10μM的最终浓度。然后用下面表1中所示的条件通过LCMS分析20μL的最终溶液。

配制用于酶活性的包含10mM对硝基苯基磷酸酯代替肽的对照反应。孵育之后，将反应用0.1mL的100mM硼酸盐缓冲液pH 9稀释并在405nm的吸光度读数以监测对硝基苯酚的出现。

酸性磷酸酶反应

从密西西比州St.Louis市的Sigma获得马铃薯酸性磷酸酶(PoAP)，目录号P1146，且从俄亥俄州Solon市的MP Biochemicals获得人前列腺酸性磷酸酶(HuPrAP)，目录号153872。使用50mM乙酸钠pH 5、0.2mM MgCl₂将酸性磷酸酶溶解以提供包含0.5单位AP/μL的溶液。酸性磷酸酶反应以20μL的量配制，其包含：

2μL 10X酸性磷酸酶缓冲液(500mM乙酸钠pH 5，2mM MgCl₂)

2μL肽原液(1mg/mL)

12μL H₂O

4μL酸性磷酸酶(0.5或2单位)

将反应溶液轻轻地混合并在37℃孵育90分钟。反应溶液在-20℃贮存用于随后的分析。分析时，用水中0.1％甲酸将7.5μL酸性磷酸酶反应稀释至50μL，至10μM的最终浓度。用下面表1中所示的条件通过LCMS分析20μL的最终反应。配制酶活性对照反应，并稀释至10mM的代替肽的对硝基苯基磷酸酯。孵育之后，将反应用0.1mL的100mM硼酸盐缓冲液pH 9稀释，并在405nm的吸光度读数以监测对硝基苯酚的出现。

表1：LCMS分析

表2和表3显示在测定所用条件下，0.5单位的牛小肠碱性磷酸酶(pH 8)和0.5单位的马铃薯酸性磷酸酶或人前列腺酸性磷酸酶(pH 5)有效地水解对硝基苯基磷酸酯。

利用由LC-MS分析反应产物评估肽1和肽2对磷酸酶处理的敏感性。表2和表3显示在pH 8牛小肠碱性磷酸酶有效地去磷酸化肽1和肽2。与碱性磷酸酶相反，马铃薯酸性磷酸酶和人前列腺酸性磷酸酶在它们有效地水解对硝基苯基磷酸酯(表2)的条件下在去磷酸化肽1中效果极差。人前列腺酸性磷酸酶在去磷酸化肽2(表3)中效果也极差。

作为单独的对照，在用和不用牛小肠碱性磷酸酶情况下处理肽3，并通过LC-MS分析所得的反应。肽3不受CIP处理的影响(数据未显示)。

表2：肽1的去磷酸化

表3：肽2的去磷酸化

实施例2：用于GC-C活性分析的T84细胞中cGMP积聚

对于cGMP测定，使4.5x10⁵个细胞/mL的T84细胞在24孔组织培养板上生长过夜。第二天，将T84细胞用1mL的DMEM+20mMMES(pH 5)或DMEM+50mM碳酸氢钠(pH8)洗涤两次，其中这些缓冲液不含有血清。第二次洗涤之后，将细胞与450μL的1mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)一起在pH 5或pH 8缓冲液中在37℃孵育10分钟，以抑制任何磷酸二酯酶活性。然后将肽在pH 5或pH 8缓冲液中稀释至10x浓度。用T84细胞将50μL的肽溶液稀释至500μL的最终体积，使各肽浓度为1x。对各肽进行十一点曲线分析，在各测定中在nM：10000、3000、1000、300、100、30、10、3、1、0.3、0.1检测最后的肽浓度。

不存在用于确定cGMP的内源性水平的肽对照。在37℃将肽孵育30分钟。30分钟之后，除去上清液并将细胞用0.1M HCl裂解。在冰上将细胞裂解30分钟。30分钟之后，将裂解产物吸出并放入96孔HPLC板并在10,000xg旋转10分钟以除去任何细胞碎片。取出来自之前旋转的上清液，并放入新的96孔HPLC板。用等体积的1M乙酸铵(pH 7)稀释样品以中和样品用于更佳的色谱法。在0.1M HCl中准备2x cGMP标准曲线，然后用等体积的1M乙酸铵稀释，具有以下最终浓度以nM计：1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1。

使用表4中的LC/MS条件和计算的标准曲线确定各样品的cGMP浓度。从用GraphPad Prism软件生成的浓度反应曲线计算EC₅₀值。

表4：LC/MS条件：

肽1和肽2及它们的去磷酸化形式在pH 5在人T84细胞中刺激cGMP合成的能力通过将细胞与肽一起孵育，随后利用LC-MS测定积聚的细胞内cGMP来进行测试。表5显示：肽1和肽2在pH 5下刺激cGMP合成中具有类似于肽3的潜力。然而，去磷酸化的肽1和肽2在T84测定中的效力比肽3差。

表5：T84细胞的cGMP反应

肽	在pH 5的EC₅₀(nM)
		肽3	16
肽1	9.8
		去磷酸化肽1	128
肽2	10.4
		去磷酸化肽2	78.1

T84细胞对肽5和肽6的cGMP反应也按与上面描述的类似的方式进行重复两份测定。在pH 5肽5的EC₅₀是14.7nM且在pH 5肽6的EC₅₀是39.2nM。

实施例3：T84细胞上的竞争性放射性配体结合

将来自美国典型菌种收藏所(ATCC；弗吉尼亚州Manassas市)的完整的人T84细胞用于竞争性放射性配体结合实验。使T84细胞在T-150塑料瓶上在Dulbecco改良的Eagle培养基：Ham’s F-12 50/50培养基(DMEM/F12)+5％胎牛血清(FBS)中以单层生长至60-70％汇合。通过用细胞刮棒轻刮采集细胞，并通过在4℃在2000g离心10分钟收集细胞。通过轻轻地重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将细胞洗涤两次，并通过如上面的离心收集它们。

通过将一百微克(100μg)的NTFYCCELCCNPACAGCY(Enterotoxin STp；Bachem H-6248)溶解在0.5mL水中并送到Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences(马萨诸塞州的N.Billerica市)使用乳酸过氧化物酶方法碘化来制备[¹²⁵I]-STp放射性配体，所述乳酸过氧化物酶方法记载在(Marchanolis，J.J.，“Anenzymic method for the trace iodination of immunoglobulins and otherproteins(用于免疫球蛋白和其它蛋白的痕量碘化的酶方法)”，Biochem.J.1969，113，299-305)中。Perkin-Elmer使用之前用10mM乙酸铵pH5.8平衡的Waters C-18 μBondapak色谱柱(25em)通过HPLC纯化标记示踪物。从0至25％乙腈的梯度在60min内施加于色谱柱，随后25％乙腈等度洗脱另20min。这一方法将两种单碘化形式相互分离，并从未标记的前体中分离。64min之后洗脱的并符合第四酪氨酸的碘化的第二种单碘化峰(峰2)在测定中用作标记示踪物。标记示踪物具有2200Ci/mmol的比活性。到达之后，将示踪物按等分试样在-20℃贮存。

重复两份配制包含2.5x10⁵个T84细胞(0.25mg蛋白)、200,000cpm[¹²⁵I]-STp(41fmol，200pM)、0.1至3,000nM竞争者和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的0.2mL结合反应。在pH 5.0在DMEM/20mM 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中进行结合测定。在pH 8.0在DMEM/20mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)/50mM碳酸氢钠中进行结合测定。对照反应不包含竞争者(总)或无细胞。

首先制备缓冲溶液，然后将无蛋白酶的BSA加到0.5％。将放射性配体加到0.001μCi/μL的最终浓度。竞争者肽原液的制备通过在50mM磷酸钠pH 6.0中将肽溶解到1mg/mL进行。从分析证明书中提供的肽分子量计算浓度。在50mM磷酸钠pH 6.0中进行竞争者稀释，其包含20倍的结合反应中测试的肽的最终浓度(20X竞争者)。

结合反应按以下顺序配制：

i.缓冲溶液中放射性配体和BSA

ii.10μL的20X竞争者

iii.T84细胞。

将结合反应轻轻地混合并在37℃孵育1h。通过将结合反应施加到使用真空过滤的2.5cm Whatman GF/C玻璃纤维过滤器(用PBS中1％聚乙烯吡咯烷酮预处理)进行膜结合的放射性配体从游离放射性配体的分离。将过滤器用5mL冰冷的PBS缓冲液浸洗两次，且在闪烁计数器中进行捕获的放射性配体的测定。通过从各样品的结合放射性减去来自包含过量竞争者(1μM)的反应的结合放射性进行特异性结合的测定。使用GraphPad Prism(加州圣地亚哥的GraphPad Software)生成竞争性放射性配体结合曲线，并且用非线性回归分析数据以计算产生50％放射性配体结合的竞争者的浓度(IC₅₀)。从对放射性配体的IC₅₀值和前面确定的解离常数的估算值，K_d≌15nM，使用(Cheng和Prusoff，(1973)Biochem.Pharmaco1.22(23)3099-3108)的方法，获得各竞争者的表观解离平衡常数(K_i)。与其解离常数相比，测定中使用的200pM的放射性配体浓度非常小，计算的IC₅₀和K_i值(表5)实际上是相等的。

表6：竞争性放射性配体结合测定

肽	pH 5的Ki(nM)
		肽3	1.2
肽1	1.1
		去磷酸化肽1	10.5
肽2	0.6
		去磷酸化肽2	4.5

表6显示肽1和肽2在pH 5的结合中具有类似于肽3的潜力。然而，去磷酸化的肽1和肽2在结合测定中对于GC-C的亲和力低于肽3。

实施例4：小鼠中的胃肠运输

本测定的目的是测试鸟苷酸环化酶C激动剂肽在小鼠中对体内鼠中增加炭进食(charcoal meal)的％行进距离。

对于测定，将重25-30g的雌性CD-1小鼠(n＝10每组)禁食过夜，并随意供给水。将活性炭(20g；100目；Sigma目录号242276)悬浮在200mL的阿拉伯胶(100mg/mL)中，并搅拌至少一小时。在20mM TrispH 6.9媒介物中制备测试肽。

通过口服灌胃法以200μL剂量施用测试的肽和媒介物。测试肽给药之后七分钟，通过口服灌胃法进行200μL的炭/阿拉伯胶混悬液给药。15分钟之后，通过CO₂过量处死小鼠。取出从食管到盲肠的胃肠道。测定从幽门接点到回肠接点的小肠总长度。测定从幽门接点到炭前端的炭行进的距离。行进距离(％)被确定为(炭行进距离/小肠的总长度)x100。将数据录入GraphPad Prism软件程序，并由此通过ANOVA使用Bonferroni多重比较检验分析。还使用GraphPad Prism软件包确定数据和ED₅₀的曲线图。

在雌性CD小鼠中测定肽4、肽1、肽2、肽1的去磷酸化形式和肽2的去磷酸化形式的急性剂量对GI运输的剂量依赖性影响。七分钟之后炭前端行进的距离表达为小肠总长度的百分数，被用于计算ED₅₀值(表7)。

表7：小鼠中上GI运输的加速

肽	ED₅₀(μg/kg)
		肽4	2.06
肽1	5.61
		去磷酸化肽1	12.7
肽2	2.47
		去磷酸化肽2	6.03

表7显示肽1和肽2的去磷酸形式当在小鼠的上GI运输模型中口服施用时与它们各自的肽相比显示出减少的潜力。

实施例5：大鼠肠袢中的液体分泌

通过将本文描述的GC-C激动剂肽直接注入野生型大鼠的分离的袢中，研究GC-C激动剂肽对分泌的影响。

通过手术结扎大鼠小肠中的三个袢来分离袢。用于结扎的袢形成的方法类似于(London等，1997，Am J Physiol，第G93-105页)中描述的方法。将袢以1-3cm的长度大致集中。向袢注射200μl的肽/GC-C激动剂(0.1-5μg)或媒介物(20mM Tris，pH 7.5或Krebs Ringer，10mM葡萄糖，HEPES缓冲液(KRGH))。在多达90分钟的恢复时间之后将袢切除。在除去其中包含的液体之前和之后记录各袢的重量。还记录各袢的长度。计算各袢的重量长度比(W/L)以确定本文描述的GC-C激动剂肽对分泌的影响。还测定袢液体积。

图2和表8中示出显示大鼠结扎的十二指肠袢中液体分泌增加、pH增加和碳酸氢盐分泌的数据。图2显示肽2在结扎的大鼠十二指肠袢中液体积聚的诱导方面具有与肽4相似的效力。表8提供了每袢使用2.5μg肽的结扎的大鼠十二指肠袢中的结果。

表8：液体分泌、pH增加和碳酸氢盐分泌

实施例6：小鼠空肠袢液中的体外代谢

本研究的目的在于确定小鼠空肠袢液中磷酸化肽的稳定性。研究中使用肽2、去磷酸化肽2、肽3和同位素标记的肽2。同位素标记的肽2用¹³C、¹⁵N标记的丙氨酸和亮氨酸(即，具有序列CCpS[¹³C_6， ¹⁵N]LCCNP[¹³C_6， ¹⁵N]ACTGC)合成。

每一种肽由American Peptide Company，Inc.合成且脱水贮存在-20℃。即将执行小鼠肠袢液测定之前，在1M三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH 8中制备每种未标记肽的1mg/mL溶液。在水中0.1％甲酸中制备¹³C、¹⁵N标记的肽2的500ng/mL溶液，并用来稀释空肠样品以供进行测定后的LC-MS/MS分析。

为了研究肽2、去磷酸化肽2和肽3的体外代谢，将肽在从小鼠小肠结扎的袢中提取的小鼠空肠液中孵育。为了采集液体，使小鼠禁食过夜，随意取用水。然后将它们用异氟烷麻醉用于手术，并进行剖腹手术，供取出小肠。利用相距胃幽门括约肌7cm处开始的缝合造出3至4cm长的空肠袢。一旦形成袢，就向它们注射200μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(10mM，pH 7.4)。接着缝合动物的腹壁和皮肤，并使动物恢复30分钟。恢复之后，处死动物，接着切除袢，回收内部的液体并贮存在-80℃直至使用。

对于每种肽，将25μL 1mg/mL的肽原液添加至含有500mMTris-HCl、1M氯化钠(NaCl)、0.1mM氯化镁(MgCl₂)pH 8的25μL 1MTris-HCl和25μL 10x小牛肠磷酸酶(CIP)缓冲液。通过添加175μL小鼠空肠袢液或175μL用于对照反应的1M Tris-HCl pH8缓冲液起始反应。每种肽的终浓度是100μg/mL。将反应在板振荡器上连续混合并维持在37℃。在添加小鼠肠袢液后0、2、5、10、20、30、60、90和120分钟，取25μL等分试样，添加至25μL的4℃12％三氯乙酸以停止反应。将另一200μL在水中的0.1％甲酸添加至这些反应达到稀释的目的。通过取20μL的每种样品并将它添加至480μL含有500ng/mL内标13C、15N标记肽2的水中0.1％甲酸，进一步稀释这些样品。

样品中肽2、去磷酸化肽2和肽3的浓度由LC-MS/MS测定。所有样品使用配备有高效液相色谱(HPLC)系统的AppliedBiosystems/MDS SCIEX API 4000三重四极杆质谱仪分析。质谱仪以多反应监测(MRM)模式操作，分辨率设为1.2Da。用于每种化合物的仪器和色谱参数总结在表9中。

表9：肽2、去磷酸化肽2、肽3和¹³C、¹⁵N标记肽2(同位素标记肽2)的LC-MS/MS方法参数

LC-MS/MS数据使用1.4.2版Analyst软件(AppliedBiosystems/MDS SCIEX)处理。使用峰面积比(分析物峰面积与内标峰面积的比)计算每种肽的剩余百分比。

图3展示在37℃小鼠空肠液中和对照反应(1M Tris-HCl)中120分钟孵育期间测定的九个时间点处肽2、去磷酸化肽2和肽3的剩余百分比。在小鼠空肠袢液中孵育之后，仅5.3％的肽2在120分钟后剩余。在此反应中形成代谢物去磷酸化肽2并且在前20分钟浓度增加，接着在剩余时间显示缓慢减小。在对照反应中，肽2未被代谢，因而无去磷酸化肽2形成。在小鼠空肠液中孵育之后，仅5.6％的去磷酸化肽2在120分钟后剩余。相比而言，去磷酸化肽2在对照反应中未被代谢。在小鼠空肠液中肽3被快速代谢并且在90分钟之后已经检测不到。在对照反应中，肽3未被代谢。

肽2、它的代谢物去磷酸化肽2和肽3在小鼠空肠袢液中发生代谢。当肽2在37℃小鼠空肠袢液中孵育时观察到去磷酸化肽2的形成。去磷酸化肽2和肽3在小鼠肠液中的降解比肽2快。

实施例7：链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中的液体胃排空

研究了在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠中经由口服灌胃法施用的肽2和肽3对液体胃排空(LGE)的影响。将重～300g的成年雄性大鼠(Sprague-Dawley；n＝60)(Taconic提供)图养在室温(22℃)和光(12∶12h光暗循环)的控制条件，自由取用食物和水。在一周的驯化周期之后，起始用于诱导I型糖尿病的STZ方案。

为了在STZ实验组(n＝50)的动物中诱导I型糖尿病，施用包含在柠檬酸盐缓冲液中的STZ(20mg/kg)的腹膜内注射液的每日方案，持续5天。对照组按相同的注射时间表接受等体积的媒介物(n＝10)。所有动物被给定9周来发展糖尿病/从注射中恢复。5天的STZ注射后第0天(即第6天)和第1周、第2周和第10周(即第10周的开始-实验当日)监测血糖水平。从尾静脉取血样，但液体胃排空(LGE)实验当日(第10周的开始)除外，是直接从心脏取血。

LGE程序涉及6个组(n＝10/组)，其中5组是糖尿病的，1组是非糖尿病的。LGE实验之前，禁止采食过夜，而水是在开始胃排空程序之前2小时禁止饮用。

将肽3和肽2单独溶解在含有0.1mg/ml酚红的20％蔗糖溶液的媒介物中。使用的化合物的药物剂量为(以mg/kg为单位)：0.1(肽2和肽3)，0.3和1.0(仅肽2)。为了测试它们对LGE的影响，随后经由18号灌胃针(6cm长)将0.5ml体积的药物溶液递送至糖尿病动物或对照动物的胃中。糖尿病实验组的每只动物接受单次药物剂量的Ironwood化合物(肽2或肽3)。在非糖尿病组中，仅向动物施用相似体积的媒介物溶液。所有动物有15分钟的时间发生胃排空，之后用异氟烷实施安乐死。

安乐死之后，经由剖腹手术进入胃部并在每只动物的下食管括约肌和幽门括约肌处结扎。接着，通过在横隔膜的切口暴露心脏，取血样并利用血糖仪评估血糖水平。然后从动物切除胃并在含有95％乙醇的10ml试管中贮存过夜。接着，将组织匀化，离心(在40,000g两次，30min)并在分光光度计(Thermospectronic，Inc.的BioMate 3)中在410nm波长测试上清液的吸光度。将结果与向立即处死的动物胃施用蔗糖/酚红溶液所得到的“零值”相比较并取出它的胃以确定每组的“保留百分比”。

就15min时间点时处死的动物中保留的液体的平均百分比(±SEM)来分析数据。使用ANOVA和Student-Newman-Keuls事后比较检验确定统计显著性。统计显著性建立在P＜0.05。

STZ糖尿病动物和对照动物的空腹血糖水平在胃排空实验当日都是＞300mg/dL。在实验当日，STZ糖尿病动物的总重明显少于(平均约150g)非糖尿病动物。两组动物在STZ治疗时都开始于大约300g；未治疗动物在LGE处理之前整个10周平均增重130g，而STZ糖尿病动物停留在恒重(～300g)直至禁食(平均约280g)。

执行实验来确定肽2和肽3对STZ诱导的糖尿病大鼠中LGE的影响(9周)。评价一种剂量的肽3(0.1mg/kg)和三种剂量的肽2。数据(图4)表明：

STZ诱导的糖尿病大鼠展现与对照大鼠相比，15min的媒介物施用之后液体进食的胃排空的显著延迟(88.24+7.12％保留，相比于对照中的45.34+7.1％)。

STZ糖尿病动物与对照动物之间的这种显著差异也扩展到被施用肽2和肽3的那些糖尿病动物，如通过Student-Newman-Keuls多重比较事后检验所计算。对于肽2，与仅接受媒介物溶液的糖尿病动物相比，较高的两种剂量(0.3和1.0mg/kg)显著增强LGE。

本研究的结果显示，与非糖尿病对照动物相比(给予媒介物)STZ诱导的糖尿病动物中LGE的速率存在显著延迟。此外，采用事后多重比较检验(Student-Newman-Keuls)的单因素方差分析(ANOVA)数据表明，与接受肽3(0.1mg/kg)或肽2(0.3或1.0mg/kg)的动物相比，在口服施用媒介物溶液的STZ糖尿病动物之间的LGE存在统计学显著差异。然而，与仅接受媒介物溶液的非糖尿病对照相比，这些前述的差异是不明显的。

这些观察结果证明，肽3在所研究的剂量(0.1mg/kg)对于将LGE恢复到非糖尿病对照水平是有效的。类似地，口服给药剂量0.3和1.0mg/kg的肽2将STZ诱导的糖尿病动物的LGE恢复到了正常对照的水平。最低剂量(0.1mg/kg)的肽2未统计上显著地将LGE恢复到正常对照的水平，不过结果显示出朝液体保留百分比减小的方向发展的视觉趋势。

其它实施方案

本公开内容引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，其引入的程度与各单个出版物或专利申请被特别地和单独地指出通过引用并入相同。当通过引用并入的任何专利或出版物中术语的含义与本公开内容中使用的术语的含义相矛盾时，应以本公开内容中的术语的含义为准。此外，前面的讨论仅公开和描述了本发明的示例性实施方案。本领域的技术人员将容易地从这些讨论和附图和权利要求中认识到：其中可以作出各种改变、改进和修改，而不偏离所附权利要求定义的本发明的精神和范围。

Claims

1. 一种肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽包含以下氨基酸序列：

Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Cys₅Xaa₆ Xaa₇ Xaa₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Xaa₁₆ Xaa₁₇，或其药学上可接受的盐；其中

Xaa₄是Cys或D-Cys；

Xaa₇是Tyr、Leu、Phe或Ile；

Xaa₈是Cys或D-Cys；

Xaa₁₄是Thr、Ala或Phe；

Xaa₁₆是Cys或D-Cys；以及

Xaa₁₇是Tyr、D-Tyr或不存在；

其中：

2. 根据权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₂和Xaa₃都不存在。

3. 根据权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃不存在。

4. 根据权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃是Asp或Glu。

5. 根据权利要求1-4中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₇是Tyr或Leu。

6. 根据权利要求1-5中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₄是Thr。

7. 根据权利要求1-6中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₇是Tyr或不存在。

8. 根据权利要求1-7中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁是Asn、D-Asn、Gln、D-Gln、Pro、Ala、β-Ala、D-Ala、Val、D-Val、Gly、Thr、D-Thr、Asp、D-Asp、Glu或D-Glu。

9. 根据权利要求8所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁是Asp、D-Asp、Glu或D-Glu。

10. 根据权利要求1-9中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₆是P-Ser或P-Thr。

11. 根据权利要求10所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₆是P-Ser。

12. 根据权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁、Xaa₂和Xaa₃都不存在。

13. 根据权利要求12所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₇是Tyr或Leu。

14. 根据权利要求12或13所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₄是Thr。

15. 根据权利要求12-14中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₇是Tyr或不存在。

16. 根据权利要求12-15中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₆是P-Ser。

17. 根据权利要求16所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽包含以下氨基酸序列：

Cys₄ Cys₅ P-Ser₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Thr₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇，其中Xaa₇是Tyr或Leu。

18. 根据权利要求1所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽包含以下氨基酸序列：

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；或

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys。

19. 根据权利要求1-18中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽包含不多于50、40、30或20个氨基酸。

20. 根据权利要求19所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽包含不多于19、18、17、16、15或14个氨基酸。

21. 一种肽或其药学上可接受的盐，所述肽由氨基酸序列Xaa₁Xaa₂Xaa₃Xaa₄Cys₅Xaa₆ Xaa₇ Cys₈ Cys₉ Asn₁₀ Pro₁₁ Ala₁₂ Cys₁₃ Xaa₁₄ Gly₁₅ Cys₁₆ Xaa₁₇组成；其中

Xaa₄是Cys或D-Cys；

Xaa₇是Tyr、Leu、Phe或Ile；

Xaa₈是Cys或D-Cys；

Xaa₁₄是Thr、Ala或Phe；

Xaa₁₆是Cys或D-Cys；以及

Xaa₁₇是Tyr、D-Tyr或不存在；

其中：

22. 根据权利要求21所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₂和Xaa₃都不存在。

23. 根据权利要求21所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃不存在。

24. 根据权利要求21所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₂是Asp或Glu且Xaa₃是Asp或Glu。

25. 根据权利要求21-24中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₇是Tyr或Leu。

26. 根据权利要求21-25中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₄是Thr。

27. 根据权利要求21-26中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₇是Tyr或不存在。

28. 根据权利要求21-27中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁是Asn、D-Asn、Gln、D-Gln、Pro、Ala、β-Ala、D-Ala、Val、D-Val、Gly、Thr、D-Thr、Asp、D-Asp、Glu或D-Glu。

29. 根据权利要求28所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁是Asp、D-Asp、Glu或D-Glu。

30. 根据权利要求21-29中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₆是P-Ser或P-Thr。

31. 根据权利要求30所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₆是P-Ser。

32. 根据权利要求21所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁、Xaa₂和Xaa₃都不存在。

33. 根据权利要求32所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₇是Tyr或Leu。

34. 根据权利要求32或33所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₄是Thr。

35. 根据权利要求32-34中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₁₇是Tyr或不存在。

36. 根据权利要求32-35中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中Xaa₆是P-Ser。

37. 根据权利要求36所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：

38. 根据权利要求32所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽由以下氨基酸序列组成：

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Asp Asp Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；

Cys Cys P-Ser Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys；

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr；或

Cys Cys P-Ser Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys。

39. 根据权利要求1-38中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽或其药学上可接受的盐是经过分离的。

40. 根据权利要求39所述的肽或其药学上可接受的盐，其中所述肽或其药学上可接受的盐是经过纯化的。

41. 一种药物组合物，其包含根据权利要求1-40中任一项所述的肽或其药学上可接受的盐。

42. 一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体、根据权利要求1-40中任一项所述的肽和选自以下的一种或多种试剂：(i)选自Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺的阳离子，或(ii)空间位阻伯胺。

43. 根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述试剂是Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺。

44. 根据权利要求42或43所述的药物组合物，其中将所述Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺作为乙酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、乙酸钙、氯化钙、磷酸钙、硫酸钙、乙酸锌、氯化锌、磷酸锌、硫酸锌、乙酸锰、氯化锰、磷酸锰、硫酸锰、乙酸钾、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、乙酸铝、氯化铝、磷酸铝或硫酸铝提供。

45. 根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述试剂是空间位阻伯胺。

46. 根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述空间位阻伯胺是氨基酸。

47. 根据权利要求46所述的药物组合物，其中所述氨基酸是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或氨基酸衍生物。

48. 根据权利要求47所述的药物组合物，其中所述天然存在的氨基酸是组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸或缬氨酸，或所述非天然存在的氨基酸是1-氨基环己烷羧酸、lanthanine或茶氨酸。

49. 根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述空间位阻伯胺具有式：

，其中R₁、R₂和R₃独立地选自：H、C(O)OH、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷基醚、C₁-C₆烷基硫醚、C₁-C₆烷基羧酸、C₁-C₆烷基羧酰胺和烷基芳基，其中任何基团可以被卤素或氨基单次或多次地取代，且条件是R₁、R₂和R₃中至多一个是H。

50. 根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述空间位阻伯胺是环己胺或2-甲基丁胺。

51. 根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述空间位阻伯胺是聚合胺。

52. 根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述聚合胺是壳聚糖。

53. 根据权利要求45-52中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺。

54. 根据权利要求50所述的药物组合物，其中将所述Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺或Al³⁺作为乙酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、乙酸钙、氯化钙、磷酸钙、硫酸钙、乙酸锌、氯化锌、磷酸锌、硫酸锌、乙酸锰、氯化锰、磷酸锰、硫酸锰、乙酸钾、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、乙酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、乙酸铝、氯化铝、磷酸铝或硫酸铝提供。

55. 根据权利要求42-54中任一项所述的药物组合物，还包含抗氧化剂。

56. 根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂是BHA、维生素E或没食子酸丙酯。

57. 根据权利要求42-56中任一项所述的药物组合物，还包含药学上可接受的粘合剂或添加剂。

58. 根据权利要求57所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的粘合剂或添加剂选自：聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、淀粉、麦芽糊精或纤维素醚。

59. 根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的粘合剂或添加剂是聚乙烯醇。

60. 根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的粘合剂或添加剂是纤维素醚。

61. 根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述纤维素醚选自：甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。

62. 根据权利要求42-61中任一项所述的药物组合物，还包含药学上可接受的填充剂。

63. 根据权利要求62所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的填充剂是纤维素、异麦芽酮糖醇、甘露醇、乳糖或磷酸氢钙。

64. 根据权利要求63所述的药物组合物，其中所述纤维素选自：微细纤维素和微晶纤维素。

65. 根据权利要求41-64中任一项所述的药物组合物，还包含附加的治疗剂。

66. 根据权利要求65所述的药物组合物，其中所述附加的治疗剂选自以下中的一种或多种：止痛剂、抗抑郁剂、促动力剂或蠕动促进剂、止吐药、抗生素、质子泵抑制剂、酸阻断剂、PDE5抑制剂、酸泵拮抗剂、GABA-B激动剂、胆汁酸螯合剂或粘膜保护剂。

67. 一种剂量单位，其包含根据权利要求41-67中任一项所述的药物组合物。

68. 根据权利要求67所述的剂量单位，其中所述剂量单位是胶囊或片剂。

69. 根据权利要求69所述的剂量单位，其中每个所述剂量单位包含5 μg至1 mg的所述肽。

70. 一种用于治疗胃肠道病症的方法，其包括施用根据权利要求41-69中任一项所述的药物组合物。

71. 根据权利要求70所述的方法，其中所述胃肠道病症是胃轻瘫、术后胃肠梗阻、功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、胃食管反流疾病(GERD)、乳糜泻、粘膜炎或十二指肠溃疡或胃溃疡。

72. 根据权利要求71所述的方法，其中所述胃肠道病症是胃轻瘫。

73. 根据权利要求72所述的方法，其中所述胃轻瘫是特发性胃轻瘫、糖尿病胃轻瘫或术后胃轻瘫。

74. 根据权利要求71所述的方法，其中所述胃肠道病症是术后胃肠梗阻。

75. 根据权利要求71所述的方法，其中所述胃肠道病症是功能性食管病症。

76. 根据权利要求75所述的方法，其中所述功能性食管病症是功能性胃灼热、假定的食管源性功能性胸痛、功能性吞咽困难或球状感。

77. 根据权利要求71所述的方法，其中所述胃肠道病症是功能性胃十二指肠病症。

78. 根据权利要求77所述的方法，其中所述功能性胃十二指肠病症是功能性消化不良、嗳气病症、恶心或呕吐病症，或反刍综合征。

79. 根据权利要求78所述的方法，其中所述功能性消化不良是餐后不适综合征或上腹痛综合征。

80. 根据权利要求78所述的方法，其中所述嗳气病症是吞气症或非特异性过度嗳气。

81. 根据权利要求78所述的方法，其中所述恶心或呕吐病症是慢性特发性恶心、功能性呕吐或周期性呕吐综合征。

82. 根据权利要求71所述的方法，其中所述胃肠道病症是胃食管反流疾病(GERD)。

83. 根据权利要求71所述的方法，其中所述胃肠道病症是十二指肠溃疡或胃溃疡。