CN102816754A - 提取乙肝病毒核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取乙肝病毒核酸的方法，所述方法通过将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，使得偶联后的磁珠在存在乙型肝炎病毒颗粒的血清中可以特异性地吸附病毒颗粒，用简单的缓冲液即可将多余的杂质去除，之后加入病毒裂解液将病毒细胞裂解，从而得到病毒核酸。由于磁珠的引入，可以使自动化变得简单，抗原抗体的高特异性反应使得提取时间变得更短，特异性强；所用的试剂比较简单易得。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种从血清中提取乙肝病毒核酸的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)简称乙肝病毒(HBV)。是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。到目前为止，根据一些比较权威的统计结果来看，我国应该有乙型肝炎病毒（HBV）感染者1.2亿，基本上占我国总人口的9.09％，其中有1/4是慢性乙肝患者，大约是3000万。
现有技术中针对乙肝核酸检测的试剂盒非常多，其中核酸的提取方法也非常多，例如：煮沸法、柱提取法、磁珠法等。在上述这些提取方法中均存在问题，其中煮沸法较简便但引入的杂质过多，而且不能实现自动化；柱提取法提取步骤较多，虽然纯度很高，但自动化实现有困难；磁珠法实现自动化很简单，但所用试剂昂贵。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种提取乙肝病毒核酸的方法，以使提取方法既可以实现自动化，又简便可行。
基于上述目的，本发明提供的提取乙肝病毒核酸的方法包括以下步骤：
（1）活化磁珠：采用活化剂活化磁珠，并用缓冲液洗涤活化后的磁珠；
（2）抗体偶联：将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，并用缓冲液洗涤偶联后的磁珠；加入淬灭液，与偶联后的磁珠混匀，并用缓冲液洗涤；在最后一次洗涤后，将磁珠重悬于缓冲液中，置于2～8℃下保存；
（3）特异性结合：将偶联后的磁珠与血清混合并震荡混匀，使得所述磁珠与血清中的乙肝病毒颗粒进行特异性结合；作用一段时间后，用磷酸盐缓冲液对所述磁珠进行洗涤，富集和除杂质；加入裂解液裂解病毒细胞，使得 乙肝病毒核酸释放到溶液中；将所述溶液煮沸，取上清液。
可选地，所述活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺。
可选地，所述裂解液为含表面活性剂的溶液。
可选地，所述步骤（1）和（2）中洗涤时所用的缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
可选地，所述方法应用于临床样品的直接检测。
从上面所述可以看出，本发明提供的提取乙肝病毒核酸的方法通过将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，使得偶联后的磁珠在存在乙型肝炎病毒颗粒的血清中可以特异性地吸附病毒颗粒，用简单的缓冲液即可将多余的杂质去除，之后加入病毒裂解液将病毒细胞裂解，从而得到病毒核酸。由于磁珠的引入，可以使自动化变得简单，抗原抗体的高特异性反应使得提取时间变得更短，特异性强；所用的试剂比较简单易得。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
磁珠标记抗体的工作原理为：羧基磁珠表面的羧基经过活化剂活化后可以与抗体偶联。
抗原抗体反应的工作原理为：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。除两者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须密切接触，才有足够的结合力。抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导等肉眼可见的反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体比例等）的影响。
因此，本发明基于上述两种实验原理，提出一种提取乙肝病毒核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）活化磁珠：采用活化剂活化磁珠，并用缓冲液洗涤活化后的磁珠；
（2）抗体偶联：将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，并用缓冲液洗涤偶联后的磁珠；加入淬灭液，与偶联后的磁珠混匀，并用缓冲液洗涤；在最后一次洗涤后，将磁珠重悬于缓冲液中，置于2～8℃下保存；
（3）特异性结合：将偶联后的磁珠与血清混合并震荡混匀，使得所述磁珠与血清中的乙肝病毒颗粒进行特异性结合；作用一段时间后，用磷酸盐缓冲液对所述磁珠进行洗涤，富集和除杂质；加入裂解液裂解病毒细胞，使得乙肝病毒核酸释放到溶液中；将所述溶液煮沸，取上清液。
作为本发明的一个实施例，所用实验材料及装置如下：
BioMagPlus羧基磁珠，2.5mL，1.5μm，20mg/mL；
1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺（EDAC），0.10g；
15mL尖头离心管；
磁分离架；
0.05M的L-一水吗啉乙磺酸缓冲溶液（MES缓冲液，pH 5.2)，2×175mL；
淬灭液(1M Glycine,pH 8.0)，25mL；
磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液），125mL。
其中，PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，再加蒸馏水定容至1L；最后配制成0.1%Tween 20的PBS缓冲液。
裂解液：0.1mol/L Tris-HCl,（pH 8.0），0.1%TritonX-100，0.05%Tween20，1mg/ml蛋白酶K，50mmol/L KCl。
所述提取乙肝病毒核酸方法的具体操作步骤如下：
一、磁珠与抗体的偶联
（一）、活化
1、移取0.5mL(10mg)的BioMagPlus羧基磁珠至15mL尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液完全变清彻后，用吸管小心移弃上清液。
2、加5mL MES缓冲液充分混匀洗涤，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。
3、重复步骤2三次；最后一次洗涤后，将磁珠重悬于5mL MES缓冲 液中。
4、将EDAC从冷藏处取出置于室温30分钟，准确称取所需的EDAC(例如，约1.6mg EDAC/mg磁珠)加入装有磁珠的离心管内。
5、剧烈振荡摇匀。
6、室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应30分钟，反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚集在一起。
7、将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。
8、重复步骤2四次，得到活化磁珠。
（二）、活化后的磁珠与抗体偶联
1、计算需要偶联的乙肝病毒的特异性抗体量，每mg活化的羧基磁珠可以偶联20～500ug抗体。
2、将抗体加至5mL MES缓冲液中配制成抗体储液。
3、吸取50μL抗体储液于950μL MES缓冲液中，配成1:20的抗体液。
4、将抗体液加入到装有活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上进行偶联反应，所述偶联反应的时间约16～24小时。
5、将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。
6、磁珠于重悬5mL MES缓冲液中，振荡摇匀，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。
7、重复步骤6一次。
8、加入5mL淬灭液，振荡摇匀，室温下将离心管置于旋转混匀仪上30分钟。
9、将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。
（三）、洗涤和贮存偶联后的磁珠
1、在步骤（二）所得的溶液中加入5ml缓冲液，并剧烈振荡摇匀进行洗涤，将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后，用吸管小心移弃上清液。
2、重复步骤1三次。
3、最后一次洗涤后，将磁珠重悬于2ml洗涤缓冲液内，此时磁珠的浓度约为5mg/mL。
4、置于2～8℃下保存。
其中，必须注意的是：
1、偶联时不能使用含有氨基(例如，三氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris))或是羧基(例如乙酸盐、柠檬酸盐等)的缓冲液。
2、可以通过偶联后的洗涤来去除偶联时产生的非偶联吸附物。
3、延长振荡的时间有利于重悬磁珠。
二、偶联后的磁珠与血清中的乙肝病毒颗粒特异性结合并制备核酸。
1、将磁珠悬起，混合均匀，吸取50μL磁珠与100μL待测血清混合。
2、震荡混匀30s，放置5min，反复2次。
3、放置在磁分离架上，磁珠吸附1min。
4、小心将上清吸走，尽量洗干净。
5、用200μL的PBS缓冲液将磁珠重悬，混均匀。
6、重复步骤3、步骤4。
7、重复步骤5、步骤6两次。
8、加入50μL裂解液，将磁珠混匀。
9、100℃煮5min。
10、至于磁分离架上，上清即可作为模板扩增；如不用，-20℃下保存。
三、实验设计：
挑取20份含不同浓度的乙型肝炎病毒的血清样本进行提取，之后用商品化试剂盒对提取前后的血清进行检测，比较提取前后的病毒核酸数量变化。
20份血清来自于临床，用上海科华的试剂盒进行提取，扩增定量，测试结果见表1。
表1科华试剂盒测定临床血清HBV DNA拷贝数
| 序号 | HBV DNA定量值 | 序号 | HBV DNA定量值 |
| 1 | 3.77E+03 | 11 | 6.04E+07 |
| 2 | 3.61E+03 | 12 | 5.28E+07 |
| 3 | 6.25E+07 | 13 | 6.81E+03 |
[0077]
| 4 | 6.48E+07 | 14 | 6.55E+03 |
| 5 | 1.70E+03 | 15 | 3.69E+06 |
| 6 | 2.65E+03 | 16 | 5.54E+06 |
| 7 | 1.20E+08 | 17 | 2.49E+05 |
| 8 | 1.68E+08 | 18 | 4.40E+04 |
| 9 | 1.70E+05 | 19 | 6.35E+04 |
| 10 | 2.11E+05 | 20 | 5.63E+05 |
经过步骤二后，对经过核酸提取过的血清进行测定，并根据样本体积的变化进行了系数校正，测试结果见表2。
表2科华试剂盒测定临床血清（经磁珠法提取后）HBV DNA拷贝数。
| 序号 | HBV DNA定量值 | 序号 | HBV DNA定量值 |
| 1 | 1.24E+03 | 11 | 1.03E+06 |
| 2 | 1.12E+03 | 12 | 4.33E+05 |
| 3 | 4.45E+05 | 13 | 1.21E+02 |
| 4 | 7.54E+05 | 14 | 1.39E+02 |
| 5 | 8.7E+01 | 15 | 4.88E+04 |
| 6 | 1.35E+03 | 16 | 3.24E+04 |
| 7 | 2.43E+06 | 17 | 1.23E+03 |
| 8 | 2.73E+06 | 18 | 2.03E+03 |
| 9 | 2.03E+03 | 19 | 3.23E+02 |
| 10 | 3.25E+03 | 20 | 3.22E+03 |
将用磁珠法提取的核酸直接用科华试剂盒进行测定，测试结果见表3。
表3磁珠法提取测定临床血清HBV DNA拷贝数
| 序号 | HBV DNA定量值 | 序号 | HBV DNA定量值 |
| 1 | 4.86E+03 | 11 | 1.34E+08 |
| 2 | 4.03E+03 | 12 | 7.49E+07 |
| 3 | 5.89E+07 | 13 | 2.05E+04 |
| 4 | 8.33E+07 | 14 | 1.86E+04 |
| 5 | 1.87E+03 | 15 | 4.54E+06 |
| 6 | 5.72E+03 | 16 | 5.67E+06 |
[0084]
| 7 | 1.09E+08 | 17 | 5.26E+05 |
| 8 | 2.43E+08 | 18 | 5.34E+04 |
| 9 | 8.40E+05 | 19 | 7.65E+04 |
| 10 | 5.34E+05 | 20 | 6.66E+05 |
从上述三个表格：我们可以得出以下结论：
从表1和表2的数据可以看出，磁珠法提取的回收率在90%以上，其中有三份回收效率稍低在60%左右，但均可顺利检出。
从表1和表3的数据可以看出，磁珠法提取核酸质量（包括数量和杂质的去除），效果要比商业化的试剂盒要好。
需要说明的是，本发明提供的提取乙肝病毒核酸的方法可以应用于临床样品的直接检测。
本发明提供的提取乙肝病毒核酸的方法通过将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，使得偶联后的磁珠在存在乙型肝炎病毒颗粒的血清中可以特异性地吸附病毒颗粒，用简单的缓冲液即可将多余的杂质去除，之后加入病毒裂解液将病毒细胞裂解，从而得到病毒核酸。
由于磁珠的引入，可以使自动化变得简单，抗原抗体的高特异性反应使得提取时间变得更短，特异性强；所用的试剂比较简单易得。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）活化磁珠：采用活化剂活化磁珠，并用缓冲液洗涤活化后的磁珠；
（2）抗体偶联：将活化的磁珠与乙肝病毒的特异性抗体偶联，并用缓冲液洗涤偶联后的磁珠；加入淬灭液，与偶联后的磁珠混匀，并用缓冲液洗涤；在最后一次洗涤后，将磁珠重悬于缓冲液中，置于2~8℃下保存；
（3）特异性结合：将偶联后的磁珠与血清混合并震荡混匀，使得所述磁珠与血清中的乙肝病毒颗粒进行特异性结合；作用一段时间后，用磷酸盐缓冲液对所述磁珠进行洗涤，富集和除杂质；加入裂解液裂解病毒细胞，使得乙肝病毒核酸释放到溶液中；将所述溶液煮沸，取上清液。
2.根据权利要求1所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺。
3.根据权利要求1所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述裂解液为含表面活性剂的溶液。
4.根据权利要求1所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）中洗涤时所用的缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的提取乙肝病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法应用于临床样品的直接检测。
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