CN102803297B - 糖胺聚糖类(gag)与生物活性分子的缀合物的合成方法、聚合缀合物及其相关用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖胺聚糖类(GAG)与具有不同特性的生物活性分子(包含小分子和大分子)的缀合物的合成方法。本发明特别涉及透明质酸(HA)及其衍生物与具有生物作用的多肽类和蛋白质例如干扰素、红细胞生成素、生长因子、胰岛素、细胞因子、抗体和激素的缀合。本发明的目的还涉及通过GAG与被保护的氨基醛类在上述举出的缀合过程中部分或完全反应得到的可分离的中间体。

Description

糖胺聚糖类(GAG)与生物活性分子的缀合物的合成方法、聚合缀合物及其相关用途

本发明涉及糖胺聚糖类(GAG)与具有不同特性的生物活性分子(包含小分子和大分子)的缀合物的合成方法。本发明特别涉及透明质酸(HA)及其衍生物与具有生物作用的多肽类和蛋白质例如干扰素、红细胞生成素、生长因子、胰岛素、细胞因子、抗体和激素的缀合。

聚合物在生物医学领域的应用完全是一般和广泛的。例如，使用聚合物基质的水凝胶常用于减轻腹部外科手术中的手术粘连、再建和整容手术、凝胶基质组成的控释系统或作为生物材料。

另一个重要的实例是用聚合物链衍生具有药理学作用的分子，从而改善溶解度和掩蔽该分子的降解过程，从而延迟其作用。

在本文上下文中最典型的实例是聚乙二醇(PEG)，尽管不存在于活生物体中，但是它是完全生物相容性的且无免疫原性。PEG常用于执行生物药物(治疗蛋白)性能。聚乙二醇化α-干扰素或聚乙二醇化-干扰素是值得举出的，例如，它已经替代了简单的蛋白质重组形式，从而变成了用于病毒性肝炎的选择疗法并且成为一个真正的巨型炸弹(欧洲专利EP0809996)。用PEG使蛋白质官能化的局限受限于得到具有无规律官能团的缀合物，或者，在任何情况下，得到多元分散体系形式。此外，得到的不同异构体的特征可能在于不同的生物活性、生物利用度、半衰期、免疫原性能力。

由于这一原因，在九十年代，引入了聚乙二醇化方法，以便得到仅在特定位置修饰的蛋白质；其中N-末端是最易于接近的，结果是其pKa相对于存在于蛋白质中的其他氨基相当不同。

在这方面，Pepinsky等人(Pepinsky RB，Le Page DJ，Gill A等人JPharmac Exp Ther，2001297(3)：1059-1066)已经特别研究了通过从PEG醛衍生物中得到的还原烷基化在β1干扰素(用于治疗多发性硬化)N-末端引入PEG链。得到的加合物因半衰期增加而在体内显示更好的效力。

另一种归因于这种方法的被PEG修饰的蛋白质是G-CSF、生长因子和Kinstler等人在N-末端官能化的中性粒细胞活化(US 6,153,655专利)。相应的产物(培非司亭)自从2002年以来已经在市场上销售。

在生物医学领域中的聚合物组中，生物聚合物受到特别关注。其中的一些天然存在于人体组织中并且具有生物相容性和无免疫原性的特性，其代表了在这方面的重要的附加值。在这些生物聚合物中，糖胺聚糖类(GAG)特别受到关注，即具有高分子量、由二糖重复单元组成的无支链的多糖类。例如，GAGs具有在结缔组织、腱和软骨中的结构功能或它们作为抗凝血药起作用。

透明质酸(HA)是GAG，其可以在具有涉及细胞运动性过程的结构作用的胞外基质中发现，而且具有粘弹性的功能，还是水化和增殖剂。由于这些特别的特征，所以HA及其衍生物用作生物材料(EP 216453)和控释系统(美国专利申请号US4582865和美国专利申请号US 4636524；K.Motokawa等人，Journal of Biomedical Materials Research Part A，(2006)，459页)的基质。

HA还涉及分子识别和调节机制，因为它被细胞受体例如RHAMM(CD168)、CD44、LYVE1、Layilin识别。HA与D44的相互作用特异性特别重要。实际上，该受体在大部分上皮来源的实体癌中超表达；通过具有抗癌活性的药物结合HA，可以利用生物聚合物的活性寻靶作用，使得抗癌药胞吞和释放入肿瘤细胞内部(国际专利申请WO2009001209)。

具有水溶性聚合物(例如GAG)的治疗剂的衍生化特别用于多肽类、多肽激素和蛋白质的情况。这类分子实际上具有对甚至小的修饰极其敏感的结构，所述小的修饰因其中存在它们的环境导致。此外，多肽类和蛋白质通常具有其极短半衰期所限制的功效时间期限。这就是为什么其被水溶性聚合物官能化极其重要的原因，也改善了溶解度、生物利用度和减低了免疫原性。

GAG与蛋白质通过二乙烯基砜(专利US 7,034,127，特别称作IFN)、二硫键(专利US 7417021)的缀合方法是本领域公知的。能够控制衍生位置的唯一方法是通过形成二硫键的反应；在这种情况中，聚合物自身可以结合相应的还原形式的半胱氨酸残基。

如果多肽链仅带有可利用和还原形式的单一半胱氨酸残基，则衍生方法实际上是特异性的，而这是十分罕见的情况。实际上，蛋白质通常具有大量半胱氨酸残基，而尤其是它通常发生这些残基已经参与二硫键的情况，其还原涉及明显的重排，这些重排可以导致蛋白质功能性缺失。

已知技术中无一方法能够得到明确的官能化模式、恰当维持蛋白质的生物活性、由此成为有效的单一分散和有效的产物。

基于上述，利用生物活性分子例如蛋白质和多肽类与GAG(即HA)的缀合方法而不损害蛋白质功能性的必要性是显而易见的。

本发明的作者目前已经建立了具有能够克服现有技术局限的生物活性分子(即蛋白质和多肽类)的糖胺聚糖类的缀合方法，因为它能够使得GAG(例如HA)在不改变蛋白质基本结构和危害其功能性的情况下被结合。区别本发明GAG与治疗剂(TA)缀合物与现有技术状态下已知缀合物的另一个特征实际上在于本发明的缀合方法导致几乎单一分散体系的加合物形成，而不会导致具有不同化学、物理、生物特征的产物的异构体混合物形成，其性能、治疗效力和毒理学特性可变。

此外，通过适当改变一些加工参数(即pH)，也能够选择糖胺聚糖所结合的生物活性分子的氨基；例如，能够使水溶性聚合物HA特异性结合N-末端。

在药物例如蛋白质和多肽类的情况中，与氨基偶合通常通过酰化进行，导致形成酰胺类，其氮不再能够参与酸-碱平衡。

本发明缀合方法的特征在于它并非意味着存在于活性成分种类上的净电荷的任何改变，导致伯胺转化成维持交换质子的能力的仲胺。这是维持TA生物活性的明显的优点。

甚至更令人意外地，本发明作者已经发现本发明的生物缀合物能够增加缀合的药物的效力和随时间维持它(参见实施例10的HA缀合物-胰岛素)。

治疗剂与水溶性聚合物的缀合改善了其特性，使得它更可溶、生物可利用和更具有活性。不同于现有技术状态中所述的水溶性聚合物(例如聚乙二醇，PEG)，糖胺聚糖类的应用使得得到的递药系统极佳，它们能够以使用其他类型聚合物所不能达到的特异性使治疗剂定向。这种特异性由包括GAG的受体相互作用复合系统决定。此外，尽管与细胞受体发生相互作用，但是不会强化免疫应答的生物聚合物的应用导致具有更高效力的协同作用。

本发明描述了糖胺聚糖类(GAG)与生物活性分子的缀合物的合成方法，包含下列步骤：

a)通过GAG与间隔分子(SP)反应用至少一个醛基(CHO)衍生GAG，其中所述间隔分子包含：一个或多个醛基(SP-CHO)作为第一种官能团，所述醛基(SP-CHO))任选被保护；和适合于缀合GAG的亲核基团作为第二种官能团；

a1)当所述一个或多个醛基被保护时，用酸水水解活化的中间体；

b)使步骤a)或a1)中得到的加合物与至少一种生物活性分子(TA)反应，所述生物活性分子的特征在于它包含能够与醛基反应的官能团。

被氨基或醛基(被保护或未保护的)官能化的透明质酸组成的水凝胶是现有技术状态中已知的，然而，这些衍生物随后与其他相同的多糖分子交联，所述多糖分子可能被不同的官能团衍生，例如与起始官能化透明质酸的氨基或醛基反应(EP1757314；Bulpitt P等人J of Biomedical MaterialsResearch，199947(2)：152-169)。

如上所述，糖胺聚糖类(GAGs)是具有高分子量、由二糖重复单元组成的无支链多糖类。GAGs的常见特征在于每个二糖单元中存在一个羧酸官能团，其在性质上可以显示酸或皂化形式，由此生成聚阴离子。在本发明中，首字母简略词GAG一般表示多糖类的酸形式或皂化形式，而在这种情况中，大部分典型的抗衡离子是碱金属和碱土金属，例如钠、钾、镁、钙。分类为GAG的聚合物包含：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸类肝素。本发明中使用的GAG可以是天然形式或半合成衍生物形式，包括季铵盐、羧酸酯类、O-酯类、酰胺类、过羧酸化衍生物、O-硫酸化衍生物、N-脱乙酰化衍生物、N-硫酸化衍生物或特征在于同时存在这些修饰的混合衍生物。首字母简略词GAG在下文中用于表示举出的天然形式的聚合物或相应半合成衍生物。

尽管在通常作为结构式表示的GAG类不携带任何醛基，但是值得注意的是在还原端的开放形式与封闭形式之间的溶液中建立的天然平衡经过了形成醛基。然而，这种存在在定量上非常有限，因为聚合物链的长度产生的还原端量低。另一方面，当GAG的分子量减小时，可利用的醛形式的还原端的相对量递增，直到它变成定量地用于GAGs寡聚体；这是唯一的情况，其中还原端可以有效地用于进行本文件中所述的缀合过程。

在所有其他情况中，认为醛基甚至在温和条件下也相当不稳定，便利地以合成方式将其以被保护醛的形式引入水溶性聚合物。在这种方式中，能够分离活化的中间体，然后使其与TA反应，不必使全部成分接触单一反应混合物。

本发明的缀合物与治疗剂TA的关联在于治疗剂结合作为仲胺或叔胺的水溶性聚合物。作为能够形成治疗剂与GAG之间的键的方式和申请人制备和本文件中示例的方法，醛基(可能如a)步骤中所述被保护)的存在应被视为本发明的特征。

由此在步骤a)中得到的加合物的稳定性足以使其能够被分离，而一旦释放了醛基，则可利用于与所关注的治疗剂的衍生反应。

得到的缀合物可以描述为下式：

GAG-SP-TA

其中GAG表示糖胺聚糖，SP是间隔臂，TA是治疗剂。

翻译这种衍生方法的符号，得到如下：

步骤a.GAG+SP-(CHO)→GAG-SP-(CHO)

步骤a1.GAG-SP-(CHO)→GAG-SP-CHO

步骤b.GAG-SP-CHO+TA→GAG-SP-TA

其中CHO表示醛基官能团，如果在括号内，则被保护。

这种保护易于使用本领域技术人员已知的有机合成技术得到。例如，保护的便利形式在于使用半缩醛类或乙缩醛类，其通过醛类与如下成分的反应得到：脂族或芳基脂族醇或二元醇类，包含，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、异丁醇、乙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇和结构类似的分子，且能够与醛类反应，形成可分离的缩醛类。步骤(a)的产物代表定义为“活化的中间体”或“活化的、但可分离的半合成中间体”。

每次可以使用存在于聚合物或相应半合成衍生物上的官能团即羧基、羟基(每个重复单元4个)、有时以烷基或O-硫酸化酯类、N-乙酰基、N-硫酸化基团选择用于用间隔臂使GAG官能化以得到活化的中间体的化学。此外，GAG与间隔臂之间的偶合条件必须例如不改变醛基或在存在时除去其保护。

间隔臂必须包含适合于与GAG共价结合的官能团，优选亲核基团，例如胺或醇基。游离形式或被适合的盐盐化的胺基因其更大的亲核性而优选。间隔分子SP-(CHO)优选是氨基-醛，甚至更优选被保护为乙缩醛。

可以用作GAG-SP-(CHO)型的间隔臂的分子的实例包含氨基-醛缩醛类，由此包含：

·游离或盐形式的胺基

·烃链，优选带有1-20的多个碳原子的脂族基团

·醛基，优选乙缩醛形式

根据下列反应路线，其中n为1-20，而R和R’可以是脂族或芳基-脂族残基，相同或不同，或携带不同羟基的同一链

除反应路线化的线性外，脂族链可以是支链的或包含芳基。

申请人已经验证便利的偶合方法在于形成酰胺类，其中GAG作为羧酸参与且间隔臂作为胺参与。这种类型的反应根据本领域技术人员公知的有机合成技术进行，且例如可以借助于促进对羧酸的亲核攻击的缩合试剂进行。这些试剂包括可以在均匀或不均匀相中的肽合成中使用的那些。这些试剂的实例是羰基二咪唑、碳酸二-琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺类例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)；N，N’-二环己基碳二亚胺；N-烯丙基-N’-(β-羟乙基)碳二亚胺；N-(α-二甲氨基丙基-N’-叔丁基碳二亚胺；N-(α-二甲氨基丙基)-N’-(β-溴烯丙基)碳二亚胺；1-(3-二甲氨基丙基)-3-(6-苯甲酰基氨基己基)碳二亚胺；环己基-β-(N-甲基吗啉)乙基碳二亚胺对-甲苯磺酸酯(CMC)和类似产物。

该反应可以在水性介质或在有机溶剂中、在-10-70℃温度下进行，这取决于所用的活化类型。当在非水介质中进行制备时，便利地使用在这些条件下更可溶的GAG盐，例如四-烷基铵盐。这些抗衡离子在任何情况下都必须通过离子交换法被除去，该离子交换法在其分离前对衍生的聚合物进行。

GAG的四烷基铵盐(特别是HA盐)通常可溶于无质子极性溶剂，例如N-甲基-吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)，其适合于作为反应介质。这些溶剂的应用便利地与作为缩合试剂的羰基二咪唑的应用结合，其作用得益于因少量强酸的适度酸性环境，例如在溶液或甲磺酸中发泡的气态盐酸。适合于进行这类活化中间体合成的其他有机溶剂是包含碳酸丙烯酯、碳酸二乙酯的有机碳酸酯类，且一般是被脂族、芳族或芳基-脂族链取代的有机碳酸酯类。

通过添加饱和碱性卤化物溶液例如NaCl、NaBr、KCl、KBr中断反应。该反应混合物的水化使得形成酰胺键的促进剂失活，而以相对于GAG重复单元的摩尔数远过量这样的量加入的盐导致有效的离子交换。通过添加0.5％-30％体积且优选5-15％体积用量的饱和碱性卤化物溶液得到远过量的化学计算需求。

然后通过透析纯化相应活化的中间体的碱式盐，然后冷冻干燥。尽管该产物是可分离和稳定的，但是它相对于随后与包含对醛类的反应敏感的官能团的治疗剂的官能化反应而言是活性的。

活化的中间体的可替代纯化/分离方法在于将具有足够极性的溶剂混合物应用于沉淀-洗涤循环。例如，可以使用醇类例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和高级同系物、可能是与水的混合物进行沉淀-洗涤；其他适合的溶剂是丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、二噁烷、乙腈、无质子极性溶剂(例如二甲基甲酰胺、二甲亚砜、正甲基吡咯烷酮、正甲基乙酰胺)、有机碳酸酯类。上述举出的溶剂各自可以单独使用或以与任意其他溶剂或水的混合物使用，以便得到具有更大准确性的极性和其他物化特性。优选包含上述醇类、丙酮和水的混合物。

描述GAG-SP-(CHO)与TA之间偶合的步骤(b)通过释放醛基(当被保护时)的第一步a1)进行，在于通过用酸水根据本领域技术人员公知的标准技术处理进行的水解乙缩醛。

所述用酸水对活化的中间体以释放醛基的水解步骤a1)优选在pH 1.5-3.0、优选pH 2.0-2.5、在25-65℃、优选40-60℃的温度下进行至少30分钟。

游离醛目前对通过存在于TA分子上的胺基活化的治疗剂部分上的亲核攻击敏感，导致形成亚胺，其通过典型地用于还原氨基化的无机氢化物还原成胺，例如氢化氰硼、氢化铝锂、硼氢化钠等。

本发明范围内具有药物作用的活性成分包含，例如具有药理学作用的“小分子”和/或多肽类、激素、蛋白质、糖蛋白、酶、细胞因子、生长因子或细胞分化因子、抗体、治疗聚合物、核酸或其组合。根据本发明的优选实施方案，可以使用本发明中所述技术与HA缀合的“活性成分种类”包含：

多肽类和/或蛋白质，特别是：

-免疫调节剂，特别是属于干扰素家族的蛋白质，例如I型干扰素即除包含IFNβ和IFNω的IFNα外自身还结合相同的IFNα受体的那些；II型和III型干扰素，即自身分别结合IFNγ和IFNλ受体的干扰素。

-生长因子，特别是：

1.促血红细胞生长素和一般鉴定为ESA(红细胞生成-刺激因子)的分子，其包含重组人肾红细胞生成素α和重组人肾红细胞生成素β、重组人肾红细胞生成素ω、重组人肾红细胞生成素δ、促红血球生成素、CERA和从其中生成或衍生的物质，例如通过刺激红细胞生成产生的融合蛋白；

2.刺激造血作用的因子，例如GM-CSF G-CSF因子，其还可以用于肿瘤学领域；

3.用于骨和软骨的生长因子，包含属于骨形态发生蛋白(BMP)家族的蛋白质例如BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7(在文献中也表示为OP1)、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15、也称作GDF2(生长分化因子2)的BMP9、属于TGF-β超家族的蛋白质、VEGF、PDGF、属于FGF家族的蛋白质；

-细胞因子及其受体拮抗剂，例如IL2、具有其可溶性受体或相关单克隆抗体的TNF；IL1-ra(IL1-受体拮抗剂，用于治疗关节炎和类风湿性关节炎)和一般促炎细胞因子的可溶性受体；

-糖蛋白，特别是润滑素(lubricin)；

-酶：特别是超氧化剂物歧化酶(SOD)；核糖核酸酶和葡糖脑苷脂酶；

-抗体：特别是单克隆抗体或其缀合物或融合蛋白；发挥抗肿瘤作用的单克隆抗体；发挥抗炎作用的单克隆抗体；

-激素：蛋白质激素或至少部分包含多肽链，特别是降钙素、胰岛素及其类似物和生长激素(GH或hGH)。

包含并非生物功能基础的胺基的治疗剂：

-抗肿瘤药，特别是：

1.紫杉烷类、长春花生物碱类；喜树碱；

2.取代的脲类；

3.铂、金、银和其他用于肿瘤或骨关节炎和/或类风湿性关节炎疗法的金属或制菌剂/抗菌剂；

4.甲氨蝶呤、三甲曲沙、培美曲塞、四氢叶酸酯；

5.嘧啶类似物；胞苷、嘌呤；

6.肿瘤抗生素和类似物；蒽二酮类；

-抗病毒药和抗生素；

-蛋白酶和聚合酶抑制剂；

-具有中枢或外周作用的抗炎、止痛、麻醉、止痛药；

-麻醉品阿片剂或非-阿片剂；

-类固醇；

-米诺地尔(通常用于皮肤病)。

核酸，特别是

1.小干扰RNA(或短干扰RNA，常称作siRNA，它是20-25个核苷酸长度的RNA分子。更具体地说，siRNA涉及抑制单一基因表达，其在治疗黄斑变性中的应用目前处于实验阶段)。

2.微小RNA(microRNAs、miRNAs是调节特异性靶基因表达的小的未编码RNA分子。它们由此可以作为对特异性有害造血形式的肿瘤抑制物起作用)。

3.反义RNA

上述举出的物质在下文中称作“治疗剂”(缩写为TA)或“活性成分种类”。

TA的分子结构必须携带能够与醛类反应的官能团，例如胺基。如果该基团不存在于TA上，则可以通过本领域技术人员公知的合成有机化学引入它。按照这种方式，实际上能够使任意的分子结合GAG。

在本发明范围内，透明质酸(HA)及其上述盐的应用特别得到关注。用于本发明的HA可以衍生自任意的来源；例如，可以通过发酵或生物技术提取鸡冠花产生并且具有400-3x10⁶Da的分子量，优选1x10³Da-1x10⁶Da，甚至更优选10,000-750,000Da。

本发明的衍生反应可以照此应用于多糖类和相同的上述修饰。由此从可变修饰的透明质酸、根据公知方法且特别是如下的成分得到分子网状结构：

-用有机和/或无机碱成盐的HA(EP 138572B1)；

HA与脂族、芳基-脂族、脂环族、芳香、环状和杂环系列的醇类的酯类，其中酯化百分比可以根据所用醇的类型和长度的不同而改变，优选20-80％，而可以使用有机和/或无机碱使其余百分比的未酯化的HA成盐(EP 216453)；

HA与脂族、芳基-脂族、脂环族、芳香、环状和杂环系列的醇类的酰胺类，其中酰胺化百分比为0.1-50％，而可以使用有机和/或无机碱使其余百分比的未进行酰化的HA成盐(EP 1095064)；

-至多第4硫酸化度的HA的O-硫酸化衍生物(EP 702699)；

酯化百分比不高于20％、优选0.05-10％酯化的HA内酯，而可以使用有机和/或无机碱使其余百分比的未酯化的HA成盐(EP 341745)；

-HA的脱乙酰化物：它们衍生自存在于上HA的N-乙酰葡糖胺残基的脱乙酰化，其中脱乙酰化百分比优选0.1-30％，而可以使用有机和/或无机碱使全部HA的羧基成盐(EP 1313772)；

-HYOXX^TM：获自具有0.1-100％且优选25-75％过羧化度的N-乙酰葡糖胺部分的伯羟基氧化的HA的过羧酸衍生物。可以使用有机和/或无机碱使全部HA的羧基成盐(EP 1339753)。

根据本发明的优选实施方案，HA与治疗剂之间的缀合过程包含下列步骤：

a)HA与被保护氨基-醛类SP-(CHO)的衍生反应，其中HA参与与羧基的反应，与氨基-醛的胺形成酰胺。该过程优选从HATBA(HA的四丁铵盐)或另一种可溶于有机无质子极性溶剂(DMSO、NMP、DMF、有机碳酸酯类)的盐开始进行。活化的但可分离的中间体获自该过程。

a1)水解活化的中间体即HA-SP-(CHO)→HA-SP-CHO以释放醛基：与磷酸在1.5-3、优选pH 2.0-2.5范围内、在25-65℃、优选40℃-60℃温度下的反应进行至少30分钟；

b)活化的中间体与TA分子优选蛋白质的缀合反应。通过在使用硼氢化钠的还原条件下添加蛋白质，形成亚胺，由此形成胺。如果所选择的治疗剂是多官能化化合物，则可能生成具有不同化学、物理和生物特性的不同位置异构体。这种条件典型地在蛋白质的情况中得以验证，其中具有12个潜在结合位置的干扰素代表了一个实例。通过改变该反应进行时的pH值，优选在N-末端生成特异性官能化(pH＝6.0)，其中这就是意味的全部的优点，或使用不可再现的方案，使用在不同点结合蛋白质的HA官能化(pH≥7.5)。

用于制备本发明缀合物的化学能够有效地选择官能化模式。

达到这一重要的结果归因于醛基的应用，其相对于亲核攻击的特别反应性相对于进入的基团的亲核能力具有足够的选择性。根据情况与情况的不同通过渐进的优化确定用于便利地发挥这种选择性的特定条件。返回至最重要的多功能活性成分种类的实例即蛋白质，可以在具有不同易接受性的位置上可以发现亲核胺基，但尤其是可以区别于其作为碱的强度，表示为pKa。存在于赖氨酸残基上的ε位置上的胺基典型地显示pKa 9.3-9.5，而在羧基上α的胺基具有典型地在7.6-8的pKa。为了有利于ε上的胺的反应，偶合过程必须在高于8.0的pH下进行，优选8.5-9.0；另一方面，为了有利于N-末端上的胺类的反应性，pH必须在5.0-6.5，优选5.5-6.2。第二种情况是最重要的情况，因为蛋白质典型地仅在N-末端具有1个游离α-胺基。建立反应条件以便普遍与该胺基反应导致形成几乎单分散体系的GAG与蛋白质之间的缀合物。

尽管所示的pH值代表本发明所关注的蛋白质，但是它们是指示性的，因为它们可以因不同分子而适度改变。

该合成方法能够得到生物活性缀合物，其具有相对于本领域状态已知的缀合物基本上更高的性能。通过研究这些新缀合物的生物特性，申请人实际上已经发现相对于本领域状态已知的聚合物缀合物基本上更高的特性。

特别地，使用透明质酸衍生后得到的本发明缀合物维持活性成分和起始多糖的生物活性，而其特征在于不同的机械和流变特性。在进行偶合过程下的条件是例如在不改变TA的生物功能性下进行。

申请人实际上将本发明的合成方法应用于合成新的生物缀合物：

·透明质酸(HA)与干扰素(IFNα)

·透明质酸与生长激素(hGH)

·透明质酸(HA)和核糖核酸酶A

·透明质酸与胰岛素

·透明质酸与鲑降钙素(HA-sCT)

·透明质酸与IL1-ra

·透明质酸与润滑素，

由此其用于本发明的目的。

HA-IFNα缀合物的制备描述在实施例3中。重组人IFNα2a是具有约20kDa分子量的蛋白质，其结构的特征在于形成2个二硫键和12个胺基(其中赖氨酸残基的侧链上11个)的4个半胱氨酸+N-末端。应注意存在于天然蛋白质上的在残基29与138之间包括的两个二硫键是生物活性的基础，因此对应用US专利7,417,021的方法必不可少的还原条件是有害的。

所用的合成条件是，例如为了得到几乎单分散的体系的缀合物，使HA广泛结合细胞因子的N-末端。这种特异性反映在维持和/或增加IFN和/或其他生物缀合物的生物活性上，已经研发了实施例4的方法用于其测定。

对相同的HA-IFN缀合物进行荧光体层摄影术实验，以观察静脉内施用后的体内生物分布。为了能够使用这项技术使其得到揭示，根据实施例6制备生物缀合物，以便包括共价结合的荧光探针。所发现的生物分布(实施例7)显示在相当快的时间范围内，荧光普遍以肝水平蓄积且在胸部区域中达到较低程度，这是因在肺微循环中的非特异性俘获所致。在更长的时间中，还观察到了在骨盆、特别是膀胱区域中的蓄积，证实在生物缀合物的正常吸收-排泄机制中并非如此巨大，而是缓慢水解和释放荧光探针。这种主要的肝和肺蓄积证据揭示出了另一个有意义的特性，它并非由本领域状态中已知的缀合物所呈现，即，使治疗种类特异性定向于确定类型的组织的可能性。

本发明的另一个目的由此涉及本发明的缀合物在医学领域特别是抗病毒和抗肿瘤疗法中的用途。本发明优选的实施方案，本发明的目的涉及HA-IFN缀合物作为用于刺激相对于病毒类型感染的免疫系统的系统的用途，所述的病毒类型感染例如肝炎(优选通过静脉内施用)或病毒病原体导致的病理学情况，例如唇疱疹、生殖疱疹和能够导致疣(优选通过局部施用)或宫颈癌HPV(人乳头瘤病毒)导致的感染。HA-IFN缀合物由此可以有利地用作抗肿瘤剂。

正如实施例10中所示，HA-胰岛素缀合物不仅使治疗剂的药理学功效倍增，而且维持胰岛素控制随时间改变的基础血糖水平的能力。在这种情况中，揭示出所述生物缀合物的另一个特性，即在于生成治疗剂的控释系统。

在示例生物缀合物HA-核糖核酸酶A的制备的实施例9中，维持结合酶的生物活性甚至更为显著，因为在使用分光光度技术浓缩底物后直接测定酶活性。

申请人还验证了一旦与HA缀合和通过静脉内施用，则治疗剂显示快速和定量的肝和肺蓄积。本发明的这一目的使得其应用特别有利于病理学情况相关的疗法，所述的病理学情况关注肝，例如与病毒相关的肝病、肝纤维化、肝硬化、戈谢病、肝和肺肿瘤。缀合物的肝和肺俘获的动力学和有效性依赖于HA，通过改变其分子量，可以改变蓄积特性，直到它变成可忽略不计。

另一方面，静脉内施用并非唯一的可能途径。申请人实际上验证了皮下施用缀合物有效地减缓TA释放(实施例10)。

实施例11示例了生物缀合物HA-降钙素的制备方法：降钙素是32-氨基酸的线性多肽激素，其主要由甲状腺的滤泡旁细胞在人体内产生，这种激素参与钙(Ca²⁺)和磷代谢。由于其特异性，所以降钙素以4种方式影响血Ca²⁺水平：

·通过肠抑制Ca²⁺吸收

·抑制骨中的破骨细胞活性

·抑制肾小管的磷酸盐重吸收

·增加肾小管的绝对Ca²⁺和Mg²⁺重吸收，降钙素是肾Ca-保存激素。

因此，降钙素用于治疗：

·绝经后骨质疏松

·低钙血症

·佩吉特病

·骨转移灶

降钙素分别具有10-15分钟和50-80分钟的短吸收和消除半衰期。鲑降钙素主要和几乎唯一地在肾中降解，形成无药物活性的分子片段。

新生物缀合物HA-降钙素由此极其重要，这是因如实施例11中所述的事实所致，它揭示出相对于游离激素的更长低钙化作用，能够产生使我们研究新临床应用的更为显著的效果，例如为保护变性病理学情况例如类风湿性关节炎和关节病中的软骨和骨的关节内施用。

实施例13示例了生物缀合物HA-润滑素的合成方法：润滑素存在于滑液中和关节软骨表面上，且由此在关节润滑和滑液动态平衡中起重要作用。已经证实人滑液成纤维细胞产生润滑素。

滑膜关节的最佳功能性取决于关节连接组织之间极低的摩擦系数。通常紧密的充分润滑的表面维持在关节软骨上。然而，在骨关节炎(OA)中，减少的润滑促使软骨基质降解和纤维性颤动；它们由此促使关节功能障碍和疼痛。减少的润滑还导致其他形式关节炎包括类风湿性关节炎(RA)中的关节功能障碍和疼痛。还检测了润滑素的表达和在腱、关节盘、肺、肝、心脏、骨、韧带、肌肉和皮肤中定位的蛋白质。

就这些组织而言，润滑的表面也贡献了最佳的功能性。除需要润滑的表面外，正常的腱功能还需要防止细胞与腱表面粘连。

因此，申请人描述了新生物缀合物HA-润滑素作为例如滑膜关节、关节盘、腱、腹膜、心包和侧甲的润滑剂、抗粘连剂和/或关节内补充剂的新生物缀合物的应用，使得原位停留时间长于对未缀合TA所描述的且有效性高于它。

在本文的上下文中，本发明的缀合物可以有利地用作TA的控制释放。这些系统特别用于具有由有限寿命限制的治疗有效窗的TA。具有这些特性的TA的典型实例是包含细胞因子的治疗蛋白质、生长因子、酶、激素例如GH、葡糖脑苷脂酶、SOD、IL1-ra、胰岛素和类似物、GM-CSF、GCSF、EPO且一般是上述ESA，I、II、III型干扰素、单克隆抗体、融合蛋白等等。例如，胰岛素是第一种生物技术药物且持续具有主要的重要性，因为它是患有糖尿病的人的增长数量的基础。长效胰岛素目前可得到，但递药系统市场上未出现(与聚合物、微纳米粒缀合)。

如实施例10中所示，本发明的缀合方法适合于生成控释系统，其有效地减缓活性形式的TA释放和延长其作用、使其治疗有效性倍增。此外，需要考虑到的是与患者依从性相关的另一个方面，即在本治疗方案中必须进行不同的每日皮下施用在其社会生活中显然的不便性和适合于注射的部位的逐渐耗尽性。类似的考虑也在本文件中列举的其他治疗物质中得到确认。

本发明透明质酸(优选其衍生物)与治疗剂之间的缀合物由此可以有利地用于制备具有高度有效性、生物依从性、生物利用度、使TA针对特定类型细胞或器官组织可能性和通过控释和增加TA寿命改善药代动力学特性可能性的生物材料。

本发明透明质酸与治疗剂之间的缀合物可以有利地用于制备适合于胃肠外或非胃肠外施用的药物组合物，包含口服应用制剂、通过真皮内、静脉内、肌内、皮下、动脉内、鞘内、心内、滑膜内、腹膜内、膀胱注射的可注射溶液或凝胶、霜剂、软膏剂、泡沫、干粉、喷雾剂、用于局部应用的皮肤或透皮硬膏剂，还有用于直肠、阴道内、舌下、眼内应用的药物制剂。

根据本发明的优选实施方案，药物组合物适合于对肝和/或肺定位的静脉内给药。根据另一个优选的实施方案，药物组合物适合于通过控释系统皮下施用。

本发明的缀合物维持其中包含的活性成分的生物功能，而相对于这些分离形式，它们可以用作其媒介化工具(vehiculation)和控释系统。通过适当选择GAG或半合成衍生物的类型得到定向于特定组织或类型细胞的媒介化工具，而通过GAG或半合成衍生物与活性成分种类之间的键的性质调节释放动力学。

最终，本发明涉及特征在于包含如上述所定义的缀合物的基质的生物材料。

现在根据优选实施方案、特别参照公开的附图为示例而非限制性目的描述本发明，其中：

图1显示为示例透明质酸(HA)目的的代表的醛化GAG的合成路线，而携带所代表的被保护的醛基的间隔臂原型是4-氨基-丁醛-二乙缩醛。

图2显示醛化透明质酸的H-NMR光谱。这是在重水中存在的质子NMR光谱。存在于HA中的乙酰基的甲基质子信号(1.88ppm)位于另一个信号侧翼，归因于乙缩醛的甲基质子(1.05ppm)。

图3显示在小鼠中静脉内施用用荧光探针标记的HA-IFN缀合物后的荧光体层摄影图像。

图4显示用HA-IFN对人卵巢癌初级细胞系(pdOVCA1)进行的细胞毒性试验(ATPlite)结果，所述人卵巢癌初级细胞系对IFN的抗增殖作用敏感。

图5显示分别显示游离和缀合的IFN的HA-IFN缀合物的色谱图。

图6显示分别显示游离和缀合的hGH的HA-hGH缀合物的色谱图。

图7显示分别显示游离和缀合的RNAsi酶的HA-核糖核酸酶缀合物的色谱图。

图8显示分别显示游离和缀合的胰岛素的HA-胰岛素缀合物的色谱图。

图9显示通过测定相对于对照组和未治疗动物所治疗的动物血糖水平皮下给予5μg或20μg剂量胰岛素的HA-胰岛素缀合物的体内生物活性。

图10显示生物缀合物HA-IFN与IFN与未处理产品相比的体内功效。

图11显示使用GF-250柱(Agilent，4，6x 25cm)、以0.3mL/min的速率的HA-sCT尺寸排阻分析。洗脱液：缓冲液Na₂HPO₄0.1M、NaCl 0.2M、pH 7.2，其包含20％乙腈。通过测定在280nm的吸光度监测来自柱的流出液。在9.2min洗脱的降钙素被完全除去。注射运行的缓冲液以证实在11min的峰相当于所用柱的分离体积结束。

图12表示静脉内施用sCT、HA-sCT、HA和盐水溶液后血钙水平分布。数据代表三只大鼠的平均值且使用标准偏差的相对平均值表示。

图13显示使用GF-250柱(Agilent，4，6x 25cm)、以0.3mL/min的速率的HA-IL1-ra尺寸排阻分析。洗脱液：缓冲液Na₂HPO₄0.1M、NaCl 0.2M、pH 7.2，其包含20％乙腈。通过测定在280nm的吸光度监测来自柱的流出液。在9.75min洗脱的IL-1-ra被完全除去。

现在为提供更好理解和示例可能的实施方案的目的在下列实施例中更详细地描述本发明，但不限制其可能的应用，在任何情况下，这些实施方案都可以在不危害其基本精神的情况下由本领域技术人员改变。

实施例

图1中的合成路线示例上述GAG-TA缀合物的合成方法的连续反应，描述了所涉及的种类的分子结构。透明质酸(HA)是用于作为示例目的的GAG的代表，而携带所代表的被保护醛基的间隔臂原型是4-氨基-丁醛-二乙缩醛。

实施例1：具有200kDa平均分子量的HA醛衍生物的合成

将5.00g透明质酸钠盐发酵来源的hyalastine部分(MW 200kDa)溶于250ml水，通过预装填四丁铵形式的100cm³Dowex树脂的玻璃柱渗滤得到的溶液。收集洗脱的TBA的HA盐溶液，冷冻干燥。得到7.50g产物，将其溶于400ml的N-甲基-吡咯烷酮(NMP)。

在完全溶解HA盐后，加入300mg羰基-二咪唑(CDI)、450μl甲磺酸和387mg的4-氨基丁醛二乙缩醛，将该混合物在40℃、在适度搅拌下反应过夜。通过添加0.1体积的饱和NaCl水溶液终止反应，30分钟后，将该溶液加入到3体积的无水乙醇中，以根据图1从反应混合物中分离HA衍生物。

再用乙醇洗涤沉淀，最终在40℃高度真空干燥。得到4.49g衍生物，其包含相对于HA的重复单元13％以摩尔计的被保护的醛基。该产物的NMR光谱如图2中所示，其合成如本文所述进行。

实施例2：具有100kDa平均分子量的HA醛衍生物的合成

将具有100kDa平均分子量的提取来源的4.00g透明质酸钠盐溶于500ml注射制备用水。使得到的溶液达到4℃温度，然后加入290mg(15％以摩尔计)EDC、175mg的NHS和245mg的4-氨基丁醛二乙缩醛。反应18小时后，通过添加4体积的无水乙醇沉淀产物，用具有增加乙醇含量直到达到无水乙醇的水醇混合物洗涤。证实产物以11.9％摩尔/摩尔被取代。

实施例3：HA-干扰素缀合物的合成

在60℃温度将实施例1的3.00g HA的醛衍生物(活化的中间体)以10mg/ml浓度溶于磷酸存在的酸性环境2小时。将4x10^-5摩尔重组人干扰素α2a、4x10^-4摩尔氢化氰硼加入到预先冷却的水解产物中，将pH调节至6.0。在24h反应后，通过对水透析纯化加合物，然后冷冻干燥。通过尺寸排阻色谱法验证纯度(GPC)，相应色谱体图如图5中所示。

使用人抗-IFNα抗体使生物缀合物HA-IFN进行SDS-PAGE+蛋白质印迹。通过密度计技术揭示出存在低于5％的游离蛋白质。结果与从尺寸排阻色谱法显示的相关(图5)。

实施例4：HA-IFN缀合物生物活性的体外测定

通过特别准备的方法测定HA-IFN缀合物的生物活性。

对IFN抗增殖作用敏感的人卵巢癌初级细胞系(pdOVCA1)进行本实验。将细胞以10,000个细胞/孔的浓度接种，单独和在如下的存在下温育：

-如实施例3中制备成作为等效IFN单位的1,000、500、250U/ml浓度的HA-IFN生物缀合物；

-1,000、500、250U/ml浓度的重组人干扰素α2a；

-具有200kDa分子量的HA，即同样用于制备缀合物，浓度为323.5、162.75、81.375μg/ml。

5天温育后，通过ATPlite细胞毒性试验测定细胞存活率。将得到的结果概括在图4中，而将细胞存活率表示为相对于单独温育细胞得到的水平百分比。

正如可以观察到的，重组人干扰素α2a相对于该细胞系发挥显著的细胞毒性作用。这种特性几乎可以在所述缀合物中定量维持，而未缀合的HA不能发挥这种作用。

实施例5：缀合物HA-IFN的生物活性的体内测定

使用腹膜内接种3x10⁶细胞/小鼠的卵巢癌细胞系(pdOVCA1)(对IFN的抗增殖作用敏感)在属于SCID F组的小鼠中进行实验。使用3个不同的动物组、每组6只小鼠进行本实验：

第1组：在第7天、第14天和第21天使用作为阳性对照的重组人干扰素α2a(IFN)以1,000U/ml的浓度治疗；

第2组：在第7天、第14天和第21天使用作为等效IFN单位的实施例3中所述制备的本发明生物缀合物(HA-IFN)以1,000U/ml的浓度治疗；

第3组：代表非药物治疗的对照组，但仅接种pdOVCA1s。

将结果概括在图10中：上述实验清楚地显示生物缀合物HA-IFN与参比药物IFN相比更大的体内功效。作为结果的另一个证实，统计学评价显示生物缀合物与未处理的对照品相比显著性意义，而获自阳性对照与未处理产品相比得到的结果未揭示出统计学显著性。

实施例6：荧光探针标记的HA-干扰素缀合物的合成

在无菌条件下谨慎取样以进行每次传代，用0.5mg Cy5、根据从提供者(GE Healthcare)接受的说明标记12.5mg重组人干扰素α2a。使用标记的蛋白质进行偶合反应，通过对水彻底透析、根据实施例3中提供的说明纯化。得到90.4mg产物。

实施例7：荧光探针标记的HA-干扰素缀合物的荧光体层摄影术的体内生物分布

通过临床前光学显像系统Explore Optix(GE Healthcare)体内测定静脉内施用后缀合物的生物分布。该系统由用于测定生物发光的设备组成，这种生物发光适合于体层摄影重建小啮齿动物的整体影像。所用技术是“时间相关单光子计数”，以便测定荧光探针的吸收和荧光(随其寿命)，从而能够对其进行三维定位。图3中所示的影像代表实施例6的标记缀合物在麻醉小鼠中的接种实验结果。接种前未发现信号。接种后即刻观察到肝蓄积，这与相邻肺区域内的荧光强度下降相关，主要因肺微循环中的非特异性俘获导致。骨盆区中蓄积与这些信号相关，在较长时间期限内导致膀胱蓄积。

实施例8：HA-hGH缀合物的合成

在60℃温度将实施例1的1.00g HA的醛衍生物以10mg/ml浓度溶于磷酸存在的酸性环境2小时。将2x10^-5摩尔重组人生长激素、2x10^-4摩尔氢化氰硼加入到预先冷却的水解产物中，将pH调节至6.0。24h反应后，通过对水透析纯化加合物，然后冷冻干燥。

实施例9：HA-RNAsi A缀合物的合成

在50℃温度将实施例1的1.00g HA的醛衍生物以8mg/ml浓度溶于磷酸存在的酸性环境2小时。将pH调节至6.0，将2x10^-5摩尔核糖核酸酶A和2x10^-4摩尔氢化氰硼加入到预先冷却的水解产物中。在该pH下反应特别在蛋白质N-末端进行。24h反应后，通过对水透析纯化加合物，然后冷冻干燥。可以在图7中找到实施例14中所述的条件下记录的相应GPC色谱图。这种类型的缀合物最佳地适合于使用基于评价287nm随时间吸收增加的特异性试剂盒测定体外酶的残留活性，所述的基于评价287nm随时间吸收增加通过水解特异性合成底物环2’，3’-胞苷一磷酸(2’，3’-CMC)确定。

游离或与HA结合的形式的酶的残留活性的比较产生了如下结果：

产物	％相对酶活性
		RNAsi A	100
HA-Ac-RNAsi A	95.23

酶活性的定量维持显示缀合反应决不降解蛋白质。

实施例10：HA-胰岛素缀合物的合成和体内活性

在60℃温度将实施例1的3.00g HA的醛衍生物(活化中间体)以10mg/ml的浓度溶于磷酸存在的酸性环境2小时。向预先冷却的水解产物中加入4x10^-5摩尔的胰岛素、4x10^-4摩尔的氰基硼氢化钠，将pH调节至6.0。24h反应后，通过尺寸分离色谱法纯化和分析加合物；相关色谱图如图8中所示。在大鼠中诱导的I型糖尿病模型中在以70mg/Kg剂量施用链佐星后评价缀合物的体内活性。

以5或20μg当量的胰岛素的剂量皮下施用HA-胰岛素缀合物。通过测定用商品试剂盒II，LifeScan，Johnson & Johnson)测定的动物血液中的葡萄糖水平测试缀合物的生物活性。对照组由健康大鼠(第1组)和具有用胰岛素治疗的诱导的糖尿病的大鼠(第2组)组成。结果如图9中所示例。

属于第2组的用胰岛素治疗的大鼠显示血液中的葡萄糖水平突然降低，然而，以相对快速的时间等级恢复至高值。HA-胰岛素缀合物具有更缓慢发挥的效应，随时间具有相当的延长期限，在5小时时间期限内使葡萄糖浓度降至低于用单独的胰岛素治疗的组的水平并且维持该效应24小时实验期限。

这些结果表明本发明的生物缀合物能够使缀合的药物有效性倍增(在这种特别的胰岛素情况中)，并且随时间而得以维持。

试验由此显示本发明的生物缀合物或由它们制备的生物材料适合于生产延长释放治疗剂包括治疗蛋白质的系统，这是因其增加治疗有效性、随时间得以维持的能力所致。

实施例11：缀合物HA-降钙素(HA-sCT)的合成和生物活性的测定

在60℃温度将10mg HA-乙缩醛以10mg/ml浓度溶于10mM，pH 2.1的磷酸1小时。在用0.1N的NaOH将pH调节至6.0和保持该溶液冷却至室温后，向水解产物中加入1.25x10^-3m摩尔的鲑降钙素(sCT)，30分钟后，加入5.8x10^-2m摩尔氰基硼氢化钠。48h反应后，通过使用具有50kDa截止值的膜对磷酸盐缓冲液0.1M，pH 6.5(2L)透析24小时纯化和分析该加合物。透析后，冷冻干燥产物，通过双金鸡宁酸测定法和在280nm的吸收测定蛋白质浓度(BCA；Sigma Aldrich)。

通过凝胶过滤色谱法(GPC)验证缀合物纯度，相应的色谱图如图11中所示。

在缀合物中降钙素的载量为9.1％(w/w)。

按照大鼠中静脉内施用后测定的降血钙效应评价缀合的降钙素(HA-sCT)的体内活性。

对具有180-250g体重的Sprangue-Dawley大鼠进行实验。将大鼠分成4组，每组3只动物，对每组施用不同的制备物：sCT、HA-sCT、HA和盐水溶液。将sCT和HA-sCT和HA溶于生理盐水溶液，用0.22μm滤膜过滤。以40μg/kg(降钙素当量)的剂量施用降钙素和缀合物。将以相同量存在于缀合物中的HA作为对照品施用。通过尾静脉施用后，在预定时间(0、0.5、1、2、3、4、5、6、24小时)采血样，保存在冷藏箱内，直到应用为止。以1,000x g离心20分钟后，收集血浆，通过比色测定法(比色钙测定试剂盒，Vinci-Biochem)评价血浆中存在的钙。

将获得的结果概括在图12中，其中用时间表示血浆中钙的百分比变化。sCT在施用后具有其最大的效应，6小时后，钙水平相对于基础值再次升高。相反，缀合物显示更延长的降钙化作用和更显著的效果。HA和盐水溶液不会导致血液中钙的任何变化。

实施例12：HA-IL1-ra缀合物的合成

在60℃温度将10mg的HA-乙缩醛以10mg/ml浓度溶于10mM、pH2.1的磷酸1小时。在用0.1N的NaOH将pH调节至6.0和保持该溶液冷却至室温后，向水解产物中加入2.46x 10^-4毫摩尔的IL-1-ra，30分钟后，加入1，16x10^-2毫摩尔的氰基硼氢化钠。在48h反应后，通过使用具有50kDa截止值的膜对磷酸盐缓冲液0.1M、pH 6.5(2L)透析24小时纯化加合物。透析后，通过比色测定法测定蛋白质浓度(BCA assay；SigmaAldrich)。在4℃将缀合物维持在溶液中。通过凝胶过滤色谱法(GPC)验证纯度，相应的色谱图如图13中所示。

实施例13：HA-润滑素缀合物的合成

在60℃温度将10mg的HA-乙缩醛以10mg/ml浓度溶于10mM、pH2.1的磷酸1小时。在用0.1N的NaOH将pH调节至6.0和保持该溶液冷却至室温后，向水解产物中加入2.50x 10^-4毫摩尔的润滑素，30分钟后，加入1，16x 10^-2毫摩尔氰基硼氢化钠。在48h反应后，通过使用具有50kDa截止值的膜对磷酸盐缓冲液0.1M、pH 6.5(2L)透析24小时纯化加合物。透析后，通过比色测定法测定蛋白质浓度(BCA assay；Sigma Aldrich)。在4℃将缀合物维持在溶液中。通过凝胶过滤色谱法(GPC)验证纯度。

实施例14：通过合成缀合物的GPC的表征

为了测定合成缀合物中存在的游离蛋白质，使实施例3、8、9和10的制备进行高压尺寸分离色谱。就实施例3的缀合物HA-IFN和实施例10的HA-胰岛素而言，色谱图(图5和图8)记录于Agilent GF-250柱上，使用磷酸盐缓冲液0.2M pH＝7.0+NaCl 10^-1M 80％+乙腈20％组成的洗脱液，流速为0.3ml/min。

使用Superose 12柱记录相对于其他缀合物的色谱图(图6、图7)，在280nm进行UV检测，使用磷酸盐缓冲液10^-1M pH＝7.2+NaCl 0.2M 80％+乙腈20％组成的洗脱液，流速为0.8ml/min。

实施例15：作为活化中间体的硫酸软骨素的醛衍生物的合成

将5.00g提取来源的硫酸软骨素(具有通常位于N-乙酰半乳糖胺单元4位的硫酸盐基)溶于250ml水，通过预装填四丁铵形式的100cm³Dowex树脂的玻璃柱渗滤得到的溶液。收集洗脱的硫酸软骨素的TBA盐溶液，冷冻干燥。得到7.75g产物，将其溶于400ml的N-甲基-吡咯烷酮(NMP)。

在完全溶解后，加入345mg的羰基-二咪唑(CDI)、460μl的甲磺酸和396mg的4-氨基丁醛二乙缩醛，将该混合物在45℃、在适度搅拌下反应过夜。

通过添加0.1体积的饱和NaCl水溶液终止衍生过程。将该反应混合物对0.9％NaCl盐水溶液、然后对纯水透析，冷冻干燥。得到4.13g淡棕色颗粒固体。

Claims (23)

1.糖胺聚糖类(GAG)与生物活性分子的缀合物的合成方法，包含下列步骤：

a)通过GAG与间隔分子(SP)反应用至少一个醛基(CHO)衍生GAG，其中所述间隔分子包含：一个或多个醛基(SP-CHO)作为第一种官能团，所述醛基(SP-CHO)被保护；和适合于缀合GAG的亲核基团作为第二种官能团；

a1)所述一个或多个醛基被保护，用酸水水解活化的中间体；

b)使步骤a1)中得到的加合物与至少一种生物活性分子(TA)反应，所述生物活性分子的特征在于它包含能够与醛基反应的官能团，所述生物活性分子选自多肽类和蛋白质、核酸和含有至少一个并非生物功能基础的胺基的治疗剂，

其中所述间隔分子SP-(CHO)是氨基醛，氨基醛是被保护的乙缩醛，

其中所述能够与醛类反应的生物活性分子的官能团是可以天然存在或通过合成引入的胺基，

其中当所述生物活性分子是包含并非生物功能基础的胺基的治疗剂时，其选自：抗肿瘤药；抗病毒药和抗生素；蛋白酶和聚合酶抑制剂；抗炎药、止痛药、麻醉药、止痛药；麻醉品；类固醇；米诺地尔。

2.根据权利要求1的方法，其中所述用酸水水解活化中间体以释放醛基的步骤a1)在1.5-3.0的pH、在25-65℃温度下进行至少30分钟。

3.根据权利要求1-2的任一项的方法，其中所述步骤a)的亲核基团是游离或盐化形式的胺基或醇基。

4.根据权利要求1-2的任一项的方法，其中所述GAG选自透明质酸(HA)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸类肝素或其衍生物，其选自与碱金属和碱土金属的盐，所述碱金属和碱土金属选自钠、钾、镁、钙；季铵盐；羧酸酯类、O-酯类；酰胺类、过羧酸化衍生物；O-硫酸化衍生物；N-脱乙酰化衍生物；N-硫酸化衍生物。

5.根据权利要求1-2的任一项的方法，其中当所述生物活性分子是多肽或蛋白质时，其选自：

-免疫调节剂；

-生长因子；

-细胞因子；

-糖蛋白；

-酶；

-抗体；

-激素。

6.根据权利要求5的方法，其中免疫调节剂为I型干扰素、II型干扰素、III型干扰素；生长因子为红细胞生成素和一般鉴定为ESA的分子、红细胞生长刺激因子、用于骨和软骨的生长因子；细胞因子为IL2、TNF及其具有其可溶性受体的受体拮抗剂、IL1-ra和促炎细胞因子的可溶性受体；糖蛋白为润滑素；酶为超氧化物歧化酶、核糖核酸酶和葡糖脑苷脂酶；激素为降钙素、胰岛素及其类似物和生长激素。

7.根据权利要求6的方法，其中红细胞生长刺激因子为GM-CSF和G-CSF因子。

8.根据权利要求1-2的任一项的方法，其中当所述生物活性分子是核酸时，其选自：小干扰RNA、微小RNA、反义RNA。

9.根据权利要求1-2的任一项的方法，用于合成透明质酸或其衍生物与生物活性分子的缀合物，其包含下列步骤：

a)用至少一个醛基(CHO)通过HA与被保护的氨基-醛类在EDC+NHS的水性介质或在无质子溶剂中进行的反应衍生HA或可溶于无质子有机极性溶剂的HA盐，以形成酰胺；

a1)水解步骤a)的中间体，以便在磷酸、在pH1.5-3.0、在25-65℃温度下进行至少30分钟中释放醛基；

b)使步骤a)或a1)中得到的中间体与生物活性分子(TA)反应，该生物活性分子的特征在于它包含能够与醛基反应的官能团。

10.根据权利要求9的方法，其中所述透明质酸或其衍生物选自用有机和/或无机碱盐化的透明质酸；透明质酸与脂族、芳基脂族、脂环族、芳香、环状和杂环系列的醇类的具有酯化百分比20-80％的酯类；HA与脂族、芳基脂族、脂环族、芳香、环状和杂环系列的胺类的具有酰胺化百分比0.1-50％的酰胺类；至多第四硫酸化度的透明质酸的O-硫酸化衍生物；具有低于20％酯化百分比的透明质酸的内酯类；具有0.1-30％脱乙酰化百分比的透明质酸脱乙酰化化合物；具有0.1-100％过羧酸化度的透明质酸过羧酸化衍生物。

11.根据权利要求9的方法，其中所述生物活性分子是蛋白质或多肽且所述官能团是胺基。

12.根据权利要求11的方法，其中在使用氰基硼氢化钠或氢化铝锂或硼氢化钠的还原条件下将所述蛋白质或多肽加入步骤a1)中得到的中间体中。

13.根据权利要求9的方法，其中所述多肽或蛋白质选自干扰素、红细胞生成素、血细胞生成刺激因子、骨/软骨生长因子、生长激素、润滑素、胰岛素、降钙素、IL1-ra。

14.根据权利要求9的方法，其中所述HA的盐是HATBA。

15.可通过根据权利要求1-14任意一项的合成方法得到的糖胺聚糖类(GAG)与生物活性分子的缀合物。

16.根据权利要求15的缀合物，其选自HA-IFN、HA-EPO、HA-GCSF、HA-骨/软骨生长因子、HA-hGH、HA-润滑素HA-胰岛素、HA-sCT、HA-IL1-ra。

17.根据权利要求15-16的任一项的缀合物，其用于医学领域。

18.根据权利要求17的缀合物用于制备具有抗病毒或抗肿瘤作用的药物的用途。

19.根据权利要求18的用途，其中所述缀合物是HA-IFN。

20.药物组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求15-17任一项所定义的缀合物与一种或多种药理学可接受的赋形剂。

21.根据权利要求20的药物组合物，用于口服、直肠、阴道内、舌下、眼内应用；或作为通过皮内、静脉内、肌内、皮下、动脉内、鞘内、心内、滑膜内、关节内、腹膜内、膀胱内注射的可注射溶液；或将它们配制成凝胶、霜剂、软膏剂、泡沫、干粉、喷雾剂、皮肤或透皮硬膏剂用于局部应用。

22.根据权利要求21的药物组合物，配制成用于肝和/或肺定位的可注射静脉内溶液或具有用于皮下和/或皮内和/或关节内施用的控释的系统。

23.生物材料，其特征在于包含根据权利要求15-16的任一项所定义的缀合物的基质。