CN102686239A

CN102686239A - 稳定的抗-tnfr1多肽、抗体可变结构域和拮抗剂

Info

Publication number: CN102686239A
Application number: CN2010800596185A
Authority: CN
Inventors: I.德西尔瓦; A.塞普; A.A.施托普
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: PE20121564A1; ZA201203052B; EA201290172A1; ES2552177T3; CA2777312A1; UA107200C2; CR20120197A; KR20120101417A; PH12012500826A1; EA022898B1; SG10201500274TA; MX2012005024A; TW201125877A; BR112012010114A2; EP2493504A1; NZ599114A; MA33758B1; UY32969A; CL2012001055A1; AU2010311640A1

Abstract

本发明涉及贮存稳定的抗-TNFR1抗体单可变结构域(dAb)、拮抗剂和多特异性配体，以及这些的方法和用途。抗-TNFR1多肽、抗体单可变结构域(dAb)、拮抗剂和多特异性配体可用于治疗和/或预防炎性疾病，例如关节炎或COPD，也可用于肺部给药、口服给药、递送至肺和递送至患者的GI道。

Description

稳定的抗-TNFR1多肽、抗体可变结构域和拮抗剂

本发明涉及抗-肿瘤坏死因子1 (TNFRl、p55、CD120a、P60、TNF受体超家族成员1A、TNFRSF1A)多肽、免疫球蛋白(抗体)单可变结构域和包含这些的拮抗剂。本发明还涉及包含或使用这样的抗-TNFR1配体的方法、用途、制剂、组合物和装置。

发明背景

TNFR1

TNFR1是一种跨膜受体，其包含结合配体的胞外区和缺乏内在信号转导活性但可与信号转导分子相缔合的胞内结构域。TNFR1与结合的TNF的复合体包含3条TNFR1链和3条TNF链。(Banner 等, Cell, 73(3) 431-445 (1993).) TNF配体以三聚体存在，三聚体被3条TNFR1链结合。(同上) 3条TNFR1链在受体-配体复合体中紧密聚簇在一起，并且该聚簇是TNFR1介导的信号转导的前提。事实上，结合TNFR1的多价物质(例如抗-TNFR1抗体)在TNF不存在下可诱导TNFR1聚簇和信号转导，并一般被用作TNFR1激动剂。(参见，例如，Belka 等, EMBO, 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak 等, J. Immunol, 167: 1920-1928 (2001).) 因此，即使结合TNFR1的多价物质阻断TNFα与TNFR1的结合，它们通常也不是TNFR1的有效拮抗剂。

本段中的SEQ ID号指的是WO2006038027中使用的编号。TNFR1的胞外区包含：13个氨基酸的氨基端区段(SEQ ID NO: 603 (人)的氨基酸1-13、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸1-13)、结构域1 (SEQ ID NO: 603 (人)的氨基酸14-53、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸14-53)、结构域2 (SEQ ID NO: 603 (人)的氨基酸54-97、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸54-97)、结构域3 (SEQ ID NO: 603 (人)的氨基酸98-138、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸98-138)和结构域4 (SEQ ID NO: 603 (人)的氨基酸139-167、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸139-167)，其后是膜近侧区(SEQ ID NO: 603_(人)的氨基酸168-182、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸168-183)。(参见，Banner 等, Cell 73(3) 431-445 (1993) 和 Loetscher 等, Cell 61(2) 351-359 (1990).) 结构域2和3与结合的配体(TNFβ，TNFα)接触。(Banner 等, Cell, 73(3) 431-445 (1993).) TNFR1的胞外区也包含被称为前-配体结合装配结构域或PLAD结构域的区(SEQ ID NO: 603_(人)的氨基酸1-53、SEQ ID NO: 604 (小鼠)的氨基酸1-53)) (USA政府, WO 01/58953; Deng 等, Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005))。

TNFR1体内通过包括在结构域4或膜近侧区(SEQ ID NO: 603的氨基酸168-182、SEQ ID NO: 604的氨基酸168-183)中蛋白酶解TNFR1的过程从细胞表面脱落，来产生可溶形式的TNFR1。可溶性TNFR1保留结合TNFα的能力，并藉此作为TNFα活性的内源性抑制剂起作用。

WO2006038027、WO2008149144和WO2008149148公开了抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域和包含这些结构域的拮抗剂。这些文献还公开了这样的结构域和拮抗剂用于治疗和/或预防由TNFα介导的病况的用途。提供具有改进贮存稳定性的抗-人TNFR1免疫球蛋白单可变结构域、包含这些结构域的拮抗剂、配体和产品将是合乎需要的。它们的目的将是提供改进的诊断试剂用于检测样品中的人TNFR1，以及或者备选地，提供改进的治疗剂用于治疗和/或预防人和其他哺乳动物中的TNFR1介导的病况和疾病。提供强效中和TNFR1(尤其是人TNFR1)的抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域、包含这些结构域的拮抗剂、配体和产品将特别合乎需要。

本发明的各个方面满足这些所需特性。

发明概述

在一个方面，本发明提供一种抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列具有至少95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的氨基酸序列，其中该单可变结构域在PBS中40℃孵育40小时后具有<1.0、<0.9、<0.8、<0.7、<0.6、<0.5或<0.4的OD₃₂₀。在一个实施方案中，单可变结构域具有通过以下测试测定的<1.0、<0.9、<0.8、<0.7、<0.6、<0.5或<0.4的OD₃₂₀：

a) 将100μl在PBS(磷酸缓冲盐水)中的1mg/ml单可变结构域分配在PCR板上；

b) 将该板在40℃孵育40小时；和

c) 移除50μl的等分试样并例如在微量培养板读数器(例如，来自Molecular Devices的一种)中测量OD₃₂₀。

在一个方面，本发明提供一种抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列具有至少95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供一种抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与选自DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213和DOM1h-574-214的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者相比于所述选择的氨基酸序列具有1或2个氨基酸改变的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供一种包含编码抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列的核酸，其中该可变结构域包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列具有至少95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的氨基酸序列。

在一个方面，本发明提供一种包含编码抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列的核酸，其中该核苷酸序列与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的核苷酸序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)。

在一个方面，本发明涉及一种多特异性配体，其包含本发明的免疫球蛋白单可变结构域，并任选包含至少一种特异性结合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白单可变结构域。在一个实施方案中，多特异性配体是，或者包含，选自本文公开的标记有“DMS”的任何构建体的氨基酸序列的氨基酸序列，例如，DMS5535、5541、5542和5544的任何一种。在一个实施方案中，多特异性配体是，或者包含，由本文公开的任何DMS的核苷酸序列编码的氨基酸序列，例如，DMS5535、5541、5542和5544的核苷酸序列的任何一种。在一个实施方案中，本发明提供编码包含抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域和抗-SA单可变结构域的多特异性配体的核酸，其中该核酸包含本文公开的任何DMS的核苷酸序列，例如，DMS5535、5541、5542和5544的核苷酸序列的任何一种。本发明提供包含这样的核酸的载体，以及包含这样的载体的宿主细胞。

在一个方面，本发明提供一种多特异性配体，所述多特异性配包含：(i)抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列具有至少95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的氨基酸序列，(ii)至少一种特异性结合SA的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单可变结构域，其中该抗-SA单可变结构域包含与DOM7h-11-3的序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和(iii)任选其中在抗-TNFR1单可变结构域和抗-SA单可变结构域之间提供接头。

在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列AST，任选是ASTSGPS。备选地，接头是AS(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G₄S)₃。

在一个方面，本发明提供一种TNFR1拮抗剂，其包含本发明的任何在先方面的单可变结构域、多肽或多特异性配体。

在一个方面，本发明提供本发明的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，用于口服递送、递送至患者的GI道、肺部递送、递送至患者的肺或全身递送。

在一个方面，本发明提供本发明的TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防炎性病况。

在一个方面，本发明提供本发明的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防炎性病况的药物中的用途。

本发明的另一方面提供包含或由DMS5535、DMS5541、DMS5542或DMS5544组成的多特异性配体。本发明的一个方面提供编码任一多特异性配体的核酸。本发明的另一方面提供包含与DMS5535、DMS5541、DMS5542或DMS5544的核苷酸序列具有至少80%同一性的核苷酸序列的核酸。本发明进一步提供包含核酸的载体，以及包含该载体的宿主(任选是非-人胚细胞)。

附图简述

图1. 来自稳定性选择并纯化用于表征的dAb的氨基酸序列比对。相对于DOM1h-574-156比对序列，DOM1h-574-156是稳定性选择用作起始dAb的那些的代表性dAb。在特定位置上的“.”表明在那个位置在DOM1h-574-156中发现相同氨基。通过下划线和加粗文本表示CDR (第一个下划线序列是CDR1，第二个下划线序列是CDR2和第三个下划线序列是CDR3)。

发明详述

在本说明书内参照实施方案以使所写的说明书能够清楚和简明的方式描述本发明。旨在并应该认识到，只要不背离本发明，可将实施方案不同地组合或分开。

除非另有规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)的普通技术人员一般理解相同的含义。标准技术被用于分子、遗传和生化方法(通常参见，Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 和 Ausubel 等, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第四版, John Wiley & Sons, Inc.，其通过引用结合到本文中)和化学方法。

本文所述的免疫球蛋白单可变结构域(dAb)包含互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。CDR和框架(FR)区的位置和编号系统由Kabat等规定(Kabat, E.A. 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991))。基于众所周知的Kabat氨基酸编号系统和CDR的定义，本领域的技术人员将容易明白本文公开的V_H和V_L(V_κ) dAb的CDR (CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列。根据Kabat编号系统，重链CDR-H3具有不同的长度，在残基H100和H101之间插入编号一直到字母K(即H100，H100A ... H100K，H101)。可备选地使用Chothia系统(Chothia 等, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, 第877-883页)、根据AbM或根据如下的Contact法确定CDR。关于确定CDR的合适方法参见http://www.bioinf.org.uk/abs/。

一旦已将各残基编号，然后可应用下述CDR定义(“–”意指如对Kabat所示的相同残基编号)：

Kabat – 最通常使用的基于序列变异性的方法

(使用Kabat编号)：

CDR H1：31-35/35A/35B

CDR H2：50-65

CDR H3：95-102

CDR L1：24-34

CDR L2：50-56

CDR L3：89-97

Chothia – 基于结构环区的位置

(使用Chothia编号)：

CDR H1：26-32

CDR H2：52-56

CDR H3：95-102

CDR L1：24-34

CDR L2：50-56

CDR L3：89-97

AbM – Kabat和Chothia之间的折衷

(使用Kabat编号)： (使用Chothia编号)：

CDR H1：26-35/35A/35B 26-35

CDR H2：50-58 –

CDR H3：95-102 –

CDR L1：24-34 –

CDR L2：50-56 –

CDR L3：89-97 –

Contact – 基于晶体结构和与抗原接触残基的预测

(使用Kabat编号)： (使用Chothia编号)：

CDR H1：30-35/35A/35B 30-35

CDR H2：47-58 –

CDR H3：93-101 –

CDR L1：30-36 –

CDR L2：46-55 –

CDR L3：89-96 –

本文所用的术语“肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1)的拮抗剂”或“抗-TNFR1拮抗剂”等指的是结合TNFR1并可抑制TNFR1的(即，一种或多种)功能的物质(例如，分子、化合物)。例如，TNFR1的拮抗剂可抑制TNFα与TNFR1结合，和/或抑制通过TNFR1介导的信号转导。因此，可用TNFR1的拮抗剂抑制TNFR1介导的过程和细胞反应(例如，在标准L929细胞毒性测定中TNFα诱导的细胞死亡)。

本文所用的“肽”指的是通过肽键连接在一起的约2 - 约50个氨基酸。

本文所用的“多肽”指的是通过肽键连接在一起的至少约50个氨基酸。多肽一般包含三级结构并折叠成功能结构域。

本文所用的肽或多肽(例如，结构域抗体(dAb))“耐受蛋白酶降解”是，当在适合于蛋白酶活性的条件下与蛋白酶孵育时不被蛋白酶实质性降解。在适合蛋白酶活性的温度下(例如在37或50摄氏度下)与蛋白酶孵育约1小时后，当不超过约25%、不超过约20%、不超过约15%、不超过约14%、不超过约13%、不超过约12%、不超过约11%、不超过约10%、不超过约9%、不超过约8%、不超过约7%、不超过约6%、不超过约5%、不超过约4%、不超过约3%、不超过约2%、不超过约1%的蛋白或实质上没有蛋白被蛋白酶降解时，多肽(例如dAb)不被实质性降解。可使用任何合适方法(例如，通过SDS-PAGE或通过本文所述的功能测定(例如，配体结合))评估蛋白降解。

本文所用的“展示系统”指的是基于所需特性(例如物理、化学或功能特性)而便于选择一批多肽或肽的系统。展示系统可为多肽或肽的合适的库(例如，在溶液中，固定在合适支持物上)。展示系统亦可为使用细胞表达系统(例如，在例如转化的、感染的、转染的或转导的细胞中表达核酸文库并在细胞表面上展示所编码的多肽)或非细胞表达系统(例如，乳液区室化(emulsion compartmentalization)并展示)的系统。例示性展示系统连接核酸的编码功能和由该核酸编码的多肽或肽的物理、化学和/或功能特性。当使用这样的展示系统时，可选择具有所需物理、化学和/或功能特性的多肽或肽，并可容易分离或回收编码所选择的多肽或肽的核酸。连接核酸的编码功能和多肽或肽的物理、化学和/或功能特性的许多展示系统在本领域是已知的，例如噬菌体展示(噬菌体展示，例如噬菌粒展示)、核糖体展示、乳液区室化并展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、质粒上展示、共价展示等。(参见，例如EP 0436597 (Dyax), U.S.专利号6,172,197 (McCafferty 等), U.S.专利号6,489,103 (Griffiths 等))。

本文所用的“库”指的是由氨基酸序列多样性表征的一批多肽或肽。库的个体成员可具有共同的特征，例如共同的结构特征(例如，共同的核心结构)和/或共同的功能特征(例如，能够结合共同的配体(例如，通用配体或靶配体，TNFR1))。

本文所用的“功能”描述具有生物学活性(例如特异性结合活性)的多肽或肽。例如，术语“功能多肽”包括通过其抗原结合位点结合靶抗原的抗体或其抗原结合片段。

本文所用的“通用配体”指的是结合给定库的(例如，实质上所有)功能成员的实质部分的配体。通用配体(例如，共同通用配体)可结合给定库的许多成员，即使这些成员可能对共同靶配体不具有结合特异性。一般来说，多肽上存在功能通用配体结合位点(如由结合通用配体的能力所示)表明，该多肽正确折叠并具备功能。通用配体的合适实例包括超抗原、结合在库的功能成员的实质部分上表达的表位的抗体等。

“超抗原”是本领域的术语，指的是与免疫球蛋白超家族的成员在不同于这些蛋白的靶配体结合位点的位点上相互作用的通用配体。葡萄球菌肠毒素是与T细胞受体相互作用的超抗原的实例。结合抗体的超抗原包括结合IgG恒定区的蛋白G (Bjorck 和Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984))、结合IgG恒定区和V_H结构域的蛋白A (Forsgren 和 Sjoquist, J. Immunol, 97:822 (1966))和结合V_L结构域的蛋白L (Bjorck, J. Immunol, 140: 1194 (1988))。

本文所用的“靶配体”指的是由多肽或肽特异性或选择性结合的配体。例如，当多肽是抗体或其抗原结合片段时，靶配体可为任何所需抗原或表位。与靶抗原结合取决于具有功能的多肽或肽。

本文所用的抗体指的是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或者片段(例如Fab、F(ab')₂、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭式构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双抗体)，不管其来源于天然产生抗体的任何物种还是通过重组DNA技术产生，不管其分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌。

本文所用的“抗体形式”、“形式化”或类似指的是，可在其中掺入一个或多个抗体可变结构域以便在该结构上赋予抗原结合特异性的任何合适的多肽结构。许多合适抗体形式在本领域是已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异二聚体、任何上述的抗原结合片段(例如Fv片段(例如，单链Fv (scFv)、二硫键键合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段)、单抗体可变结构域(例如dAb、V_H、V_HH、V_L)和任何上述的修饰形式(例如通过聚乙二醇或其他合适聚合物的共价连接而修饰，或者人源化V_HH)。

短语“免疫球蛋白单可变结构域”指的是与其他V区或结构域地特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(V_H、V_HH、V_L)。免疫球蛋白单可变结构域可以以与其他可变区或可变结构域一起的形式(例如，同型多聚体或异多聚体)存在，其中其他区或结构域不为单免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所需(即，其中免疫球蛋白单可变结构域与另外可变结构域无关地结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”相同。“单免疫球蛋白可变结构域”与本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”相同。“单抗体可变结构域”或“抗体单可变结构域”与本文使用的术语“免疫球蛋白单可变结构域”相同。免疫球蛋白单可变结构域在一个实施方案中是人抗体可变结构域，还可以包括来自其他物种(例如啮齿类动物(例如，如在WO 00/29004中所公开，其内容通过引用以其整体结合到本文中))、护士鲨的单抗体可变结构域和骆驼科动物(Camelid)的V_HH dAb。骆驼科动物的V_HH是来源于产生天然缺乏轻链的重链抗体的物种(包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼)的免疫球蛋白单可变结构域多肽。V_HH可被人源化。

“结构域”是具有与蛋白其余部分无关的三级结构的折叠蛋白结构。一般地，结构域导致蛋白的离散功能性质，并在许多情况下可被添加、移除或转移至其他蛋白中而不丧失蛋白剩余部分和/或结构域的功能。“单抗体可变结构域”是包含抗体可变结构域的序列特征的折叠多肽结构域。它因此包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已被非抗体可变结构域特征的序列代替的结构域，或者被截短或包含N末端或C末端延伸的抗体可变结构域，以及保留至少全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域折叠片段。

术语“文库”指的是异质多肽或核酸的混合物。文库由各自具有单多肽或核酸序列的成员组成。在这个意义上，“文库”与“库”同义。文库成员间的序列差异导致文库中存在多样性。文库可呈多肽或核酸的简单混合物形式，或可为用核酸的文库转化的生物体或细胞(例如细菌、病毒、动物或植物细胞等)的形式。在一个实施方案中，各单独生物体或细胞仅包含一个或有限数量的文库成员。在一个实施方案中，核酸被整合到表达载体中，以便能够使核酸编码的多肽表达。在一个方面，因此，文库可呈宿主生物体群的形式，各生物体包含一个或多个拷贝的表达载体，表达载体包含可被表达以产生其相对应的多肽成员的核酸形式的单个文库成员。因此，宿主生物体群有潜力编码大的多样化多肽库。

“通用框架”是对应于如Kabat("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)所定义的序列中的保守抗体区或对应于如Chothia和Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917所定义的人种系免疫球蛋白库或结构的单抗体框架序列。文库和库可使用单框架或一系列这样的框架，尽管仅在高变区变化，但已发现其允许几乎任何结合特异性的衍生。

本文所用的术语“剂量”指的是一次全部(单剂量)，或跨越定义的时间间隔两次或更多次给予受试者的配体的量。例如，剂量可指，在一天(24小时)(每日剂量)、两天、一周、两周、三周或者一个或多个月期间给予(例如，通过单次给予，或通过两次以上给予)受试者的配体(例如，包含结合靶抗原的免疫球蛋白单可变结构域的配体)的量。剂量间的时间间隔可为任何所需的时间量。

本文所用的“流体尺寸(hydrodynamic size)”指的是，基于分子通过水溶液扩散的分子(例如，蛋白分子、配体)表观尺寸。可处理蛋白通过溶液的扩散或运动以获得蛋白的表观尺寸，其中该尺寸由蛋白粒子的“斯托克斯半径”或“流体半径”给定。蛋白的“流体尺寸”取决于质量和形状(构象)两者，使得具有相同分子量的两个蛋白基于蛋白的整体构象可具有不同的流体尺寸。

本文所涉及的术语“竞争”意指，在对关联靶标特异的第二结合结构域存在下，抑制第一靶标与其关联靶结合结构域的结合。例如，可空间上抑制结合，例如通过物理阻断结合结构域，或通过改变结合结构域的结构或环境以便降低其对靶标的亲合力或亲和力。关于如何进行竞争ELISA和竞争BiaCore实验来确定第一和第二结合结构域之间的竞争的细节，参见WO2006038027。

如下进行两条序列间“同源性”或“同一性”或“相似性”(本文可交换使用所述术语)的计算。为最优比较的目的比对序列(例如，可在第一条和第二条氨基酸或核酸序列中的一条或两条中引入空位用于最优比对，并为了比较的目的可忽视非同源序列)。在一个实施方案中，用于比较目的比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%、80%、90%、100%。然后比较相对应的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的一个位置被第二条序列中相对应的位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，那么在那个位置上分子具有同一性(本文使用的氨基酸或核苷酸“同源性”等于氨基酸或核酸“同一性”)。考虑到为了最优比对两条序列所需引入的空位的数量和各空位的长度，两条序列间百分比同一性是序列所共有的同一性位置的数量的函数。如本文所定义的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性可使用算法BLAST 2 Sequences (使用默认参数)准备和测定(Tatusova, T. A. 等, FEMS Microbiol Lett, 774: 187-188 (1999))。

在本发明任何方面的一个实施方案中，抗-TNFR1单可变、拮抗剂、配体或多肽在标准MRC5测定中，以(或约)5、4、3、2或1nM或更低的ND50中和TNFR1(例如，人TNFR1)，如通过抑制TNFα诱导的IL-8分泌而测定。

在本发明任何方面的一个实施方案中，抗-TNFR1单可变、拮抗剂、配体或多肽在标准L929测定中，以150、100、50、40、30或20nM或更低，或者(约)150-10nM，或者(约)150-20nM，或者(约)110-10nM，或者(约)110-20nM的ND50中和TNFR1(例如，鼠TNFR1)，如通过抑制TNFα诱导的细胞毒性而测定。

在本发明任何方面的一个实施方案中，抗-TNFR1单可变、拮抗剂、配体或多肽在标准食蟹猴(Cynomologus) KI测定中，以5、4、3、2或1nM或更低，或者(约)5-(约)1nM的ND50中和TNFR1(例如，食蟹猴TNFR1)，如通过抑制TNFα诱导的IL-8分泌而测定。

在本发明任何方面的一个实施方案中，单可变结构域包含末端(任选C末端)半胱氨酸残基。例如，半胱氨酸残基可用于将PEG连接到可变结构域，例如使用马来酰亚胺键(参见，例如WO04081026)。在本发明任何方面的一个实施方案中，单可变结构域与聚亚烷基二醇部分(任选是聚乙二醇部分)连接。关于合适PEG部分和缀合方法以及测试，参见例如WO04081026。将这些公开结合到本文中，以便提供例如下文权利要求所包括的具体PEG的公开。

在一个方面，本发明涉及包含本发明免疫球蛋白单可变结构域和效应基团或抗体恒定结构域(任选是抗体Fc区，任选其中Fc的N末端与可变结构域的C末端连接(任选直接连接))的多肽。如在WO04058820中所述的任何“效应基团”可用于本发明的这个方面，并通过引用将WO04058820中效应基团的描述和将它们与在该篇公布中公开的可变结构域连接的方法明确结合到本文中，以提供本文 (例如在本文权利要求)中可使用的描述。

在一个方面，本发明涉及多特异性配体，其包含本发明的免疫球蛋白单可变结构域并任选包含至少一种特异性结合血清白蛋白(SA)的免疫球蛋白单可变结构域。在一个实施方案中，多特异性配体以至多为TNFR1单体的KD的1/2的KD结合TNFR1 (例如，人TNFR1)。另外或备选地，在一个实施方案中，多特异性配体具有单体半寿期的至少5、10、20、30、40、50或100倍的半寿期。另外或备选地，在一个实施方案中，多特异性配体在人中具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天的终末半寿期(例如如在人类志愿者中根据经验测定，或者如使用技术人员熟悉的常规技术通过配体在动物系统(例如小鼠、狗和/或非-人灵长类(例如食蟹猴、狒狒、猕猴))中的半寿期推断而计算)，例如其中抗-SA结构域在人SA和来自动物的SA之间交叉反应。

在本发明多特异性配体的一个实施方案中，配体是TNFR1 (例如人TNFR1)的拮抗剂，任选是TNFR1介导的信号转导的拮抗剂。

在一个实施方案中，本发明提供根据本发明具有在(或约)2.5小时以上范围内的tβ半寿期的可变结构域、多特异性配体或拮抗剂。在一个实施方案中，该范围的下端为(或约)3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外，或备选地，tβ半寿期为(或约) 21或25天。在一个实施方案中，该范围的上端为(或约)12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天、19天、20天、21天或22天。例如，根据本发明的可变结构域或拮抗剂将具有在12-60小时(或约12-60小时)范围内的tβ半寿期。在另一个实施方案中，它将是在12-48小时(或约12-48小时)的范围内。在又一个实施方案中，它将是在12-26小时(或约12-26小时)的范围内。

作为使用双-区室模型的备选，技术人员将熟练使用非-区室模型，其可用于确定终末半寿期(在这一点上，本文使用的术语“终末半寿期”意指使用非-双区室模型确定的终末半寿期)。可使用WinNonlin分析包(例如版本5.1 (从Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA可得))，例如来这样做模型曲线。在这种情况下，在一个实施方案中，单可变结构域、多特异性配体或拮抗剂具有至少(或至少约)8小时、10小时、12小时、15小时、28小时、20小时、1天、2天、3天、7天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天的终末半寿期。在一个实施方案中，该范围的上端是(或约)24小时、48小时、60小时或72小时或120小时。例如，终末半寿期例如在人类中是(或约)8小时至60小时，或8小时至48小时，或12-120小时。

除上文标准外或作为其备选，本发明的可变结构域或拮抗剂具有在(或约)1mg.min/ml以上范围内的AUC值(曲线下面积)。在一个实施方案中，该范围的下端是(或约)5、10、15、20、30、100、200或300 mg.min/ml。另外或备选地，本发明的可变结构域、多特异性配体或拮抗剂具有在多达(或约)600 mg.min/ml范围内的AUC。在一个实施方案中，该范围的上端是(或约) 500、400、300、200、150、100、75或50 mg.min/ml。有利地，可变结构域或拮抗剂可具有在(或约在)选自如下的范围内的AUC：15-150 mg.min/ml、15-100 mg.min/ml、15-75 mg.min/ml和15-50 mg.min/ml。

通过提供与PEG或特异性结合血清白蛋白(例如小鼠和/或人血清白蛋白(SA))的单可变结构域(或结合部分)连接的一个或多个抗-TNFR1单可变结构域(或本文所定义的其他结合部分)，可在人和/或动物(例如小鼠或非-人灵长类(例如狒狒、猕猴、食蟹猴))中获得本文提及的一个或多个tα、tβ和终末半寿期以及AUC。PEG大小可为(或约)至少20 kDa，例如30、40、50、60、70或80kDa。在一个实施方案中，PEG是40kDa，例如2x20kDa PEG。在一个实施方案中，为了获得本文提及的tα、tβ和终末半寿期或AUC，提供包含与抗-SA免疫球蛋白单可变结构域连接的抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域的拮抗剂。在一个实施方案中，PEG是40kDa，例如2x20kDa PEG。例如，该拮抗剂包含仅一个这样的抗-TNFR1可变结构域，例如与仅一个抗-SA可变结构域连接的一个这样的结构域。在一个实施方案中，为了获得本文提及的tα、tβ和终末半寿期或AUC，提供包含与PEG(例如40-80kDa PEG，例如40kDa PEG)连接的抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域的拮抗剂。例如，拮抗剂包含仅一个这样的抗-TNFR1可变结构域，例如一个与40kDa PEG连接的这样的结构域。

在本发明的多特异性配体的一个实施方案中，配体包含抗-SA (例如HSA)单可变结构域，其包含与DOM7h-11、DOM7h-11-3

、DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-14、DOM7h-14-10、DOM7h-14-18或DOM7m-16的序列(参见WO04003019、WO2008096158和2009年3月27日提交的共同待审的专利申请USSN 61/163,987和61/163,990，其公开内容结合到本文中，尤其包括抗-血清白蛋白dAb序列)相同，或具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。备选地或另外地，在一个实施方案中，多特异性配体包含抗-TNFR1单可变结构域和抗-SA单可变结构域之间提供的接头，该接头包含氨基酸序列AST，任选是ASTSGPS。备选地，接头是AS(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G₄S)₃。例如，配体包含(N-C末端) DOM1h-574-16-AST-DOM7h-11或DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7m-16或DOM1h-574-72-ASTSGPS-DOM7h-11-12。

在一个方面，本发明提供一种多特异性配体，所述多特异性配体包含：(i)抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列相同，或具有至少93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列，(ii)至少一种特异性结合SA的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单可变结构域，其中该抗-SA单可变结构域包含与DOM7h-11-3的序列相同，或具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列，并(iii)任选其中在抗-TNFR1单可变结构域和抗-SA单可变结构域之间提供接头，该接头包含氨基酸序列AST，任选ASTSGPS。备选地，接头是AS(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G₄S)₃。例如，配体包含任选由AST或ASTSGPS连接的DOM1h-574-156和DOM7h-11-3。备选地，接头是AS(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G₄S)₃。在本实例或方面中，配体任选适合通过血管内、皮下、肌内、腹膜内或通过吸入给予患者。在一个实例中，以干粉或冻干组合物(任选在给药前与稀释剂混合)提供配体。

在一个方面，本发明提供一种多特异性配体，所述多特异性配体包含：(i)抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列相同，或具有至少93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列，(ii)至少一种特异性结合SA的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单可变结构域，其中该抗-SA单可变结构域包含与DOM7h-14-10的序列相同，或具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列，和(iii)任选其中在抗-TNFR1单可变结构域和抗-SA单可变结构域之间提供接头，该接头包含氨基酸序列AST，任选ASTSGPS。备选地，接头是AS(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G₄S)₃。在本实例或方面中，配体任选适合通过血管内、皮下、肌内、腹膜内或通过吸入给予患者。在一个实例中，以干粉或冻干组合物(任选在给药前与稀释剂混合)提供配体。

本发明提供包含本发明任何方面或实施方案的单可变结构域、多肽和多特异性配体的TNFR1拮抗剂。例如，本发明的拮抗剂或可变结构域对于TNFR1结合是单价的。例如，本发明的拮抗剂或可变结构域是单价的或实质上单价的，如通过标准SEC-MALLS测定。以通过标准SEC-MALLS测定的非单价形式存在的可变结构域或拮抗剂不超过5、4、3、2或1%表示实质上单价。

在一个实施方案中，本发明的拮抗剂包含第一和第二抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域，其中各可变结构域依据本发明的任何方面或实施方案。第一和第二免疫球蛋白单可变结构域在一个实例中是相同的。在另一个实例中它们是不同的。

在一个实例中，本发明拮抗剂中的或各个抗-TNFR1单可变结构域的拮抗剂氨基酸序列与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的氨基酸序列相同。

在一个方面，本发明提供包含本发明的任何方面的抗-TNFR1可变结构域的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，用于口服递送、递送至患者的GI道、肺部递送、递送至患者的肺或全身递送。在另一方面中，本发明提供本发明任何方面的TNFR1拮抗剂在制备用于口服递送的药物中的用途。在另一方面中，本发明提供本发明任何方面的TNFR1拮抗剂在制备用于递送至患者GI道的药物中的用途。在一个实例中，拮抗剂或可变结构域耐受胰蛋白酶、弹性蛋白酶和/或胰酶制剂(参见WO2008149143)。

在一个方面，本发明提供本发明的任何方面的TNFR1拮抗剂在制备用于肺部递送的药物中的用途。在另一方面，本发明提供本发明的任何方面的TNFR1拮抗剂在制备用于递送至患者的肺的药物中的用途。在一个实例中，拮抗剂或可变结构域耐受leucozyme。

在一个方面，本发明提供一种口服递送，或递送药物至患者的GI道，或至患者的肺或肺组织的方法，其中该方法包括将药学上有效量的本发明的TNFR1拮抗剂给予患者。

在一个方面，本发明提供用于结合人、鼠、食蟹猴TNFR1的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，该拮抗剂具有与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的CDR1序列相同，或有至少50、60、70、80、90、95或98%同一性的CDR1序列。任选地，该拮抗剂还具有与所选择的序列的CDR2序列相同，或有至少50、60、70、80、90、95或98%同一性的CDR2序列。任选地，另外或备选地，该拮抗剂还具有与所选择的序列的CDR3序列相同，或有至少50、60、70、80、90、95或98%同一性的CDR3序列。

在一个方面，本发明提供用于结合人、鼠、食蟹猴TNFR1的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，该拮抗剂具有与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的CDR2序列相同，或有至少50、60、70、80、90、95或98%同一性的CDR2序列。任选地，该拮抗剂还具有与所选择的序列的CDR3序列相同，或有至少50、60、70、80、90、95或98%同一性的CDR3序列。

在一个方面，本发明提供用于结合人、鼠、食蟹猴TNFR1的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，该拮抗剂具有与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的CDR3序列相同，或有至少50、60、70、80、90、95或98%同一性的CDR3序列。

在一个方面，本发明提供用于结合人、鼠、食蟹猴TNFR1的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，该拮抗剂包含免疫球蛋白单可变结构域，其包含选自以下的单可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的序列：DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214。

本发明提供任何方面的TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防炎性病况。本发明提供任何方面的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防炎性病况的药物中的用途。在拮抗剂或用途的一个实施方案中，病况选自：关节炎、多发性硬化、炎性肠病和慢性阻塞性肺病。在一个实例中，关节炎是类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎。在一个实例中，炎性肠病选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。在一个实例中，慢性阻塞性肺病选自慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎和肺气肿。在一个实例中，肺炎是细菌性肺炎。在一个实例中，细菌性肺炎是葡萄球菌肺炎。

本发明提供任何方面的TNFR1拮抗剂用于治疗和/或预防呼吸疾病。本发明提供任何方面的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防呼吸疾病的药物中的用途。在一个实例中，呼吸疾病选自：肺部炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺炎、过敏性肺炎、肺嗜酸性细胞增多性浸润、环境性肺病、肺炎、支气管扩张、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺动脉血栓栓塞、胸膜疾病、纵隔疾病、隔膜疾病、通气不足、通气过度、睡眠呼吸暂停、急性呼吸窘迫综合征、间皮瘤、肉瘤、移植排斥、移植物抗宿主病、肺癌、过敏性鼻炎、过敏反应、石棉沉着病、曲霉肿、曲霉病、支气管扩张、慢性支气管炎、肺气肿、嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化、侵袭性肺炎球菌疾病、流行性感冒、非结核分枝杆菌、胸膜腔积液、尘肺、肺囊虫病、肺炎、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺水肿、肺栓子、肺部炎症、肺组织细胞增多症X、肺动脉高压、肺部奴卡氏菌病(nocardiosis)、肺结核、肺静脉闭塞病、类风湿性肺病、结节病和韦格纳肉芽肿病。

多肽、dAb和拮抗剂

多肽、配体、dAb、配体或拮抗剂可在大肠杆菌(E. coli)或毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(P. pastoris))中表达。在一个实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母)中表达时，配体或dAb单体以至少约0.5mg/L的量分泌。尽管当在大肠杆菌或毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述的配体和dAb单体是可分泌的，但是它们还可以使用任何合适方法而产生，例如合成化学法或不使用大肠杆菌或毕赤酵母属的生物学产生方法。

在一些实施方案中，多肽、配体、dAb、配体或拮抗剂不包含骆驼科动物的免疫球蛋白可变结构域，或一个或多个是由骆驼科动物种系抗体基因片段编码的免疫球蛋白可变结构域所特有的框架氨基酸，例如在位置108、37、44、45和/或47上。在一个实施方案中，本发明的抗-TNFR1可变结构域根据Kabat在位置44上包含G残基，并任选在其他位置(例如，在位置37或103)上包含一个或多个骆驼科动物特异性氨基酸。

本发明的TNFR1的拮抗剂可以是单价或多价的。在一些实施方案中，拮抗剂是单价的并包含一个与TNFR1相互作用的结合位点，该结合位点由本发明的多肽或dAb提供。单价拮抗剂结合一个TNFR1，并可能不能在细胞表面上诱导可导致受体激活和信号转导的TNFR1的交联或聚簇。本发明的单价拮抗剂可结合TNFR1的结构域1、结构域2、结构域3或结构域4。在一个实施方案中，单价拮抗剂结合TNFR1的结构域4。在其他实施方案中，单价拮抗剂与跨越TNFR1的多于一个结构域的表位结合。因此，在一个实施方案中，单价拮抗剂可与TNFR1的结构域1和2、结构域1和3、结构域1和4、结构域2和3、结构域2和4、结构域3和4、结构域1,2和3、结构域1、2和4或结构域1、3和4结合。

在其他实施方案中，TNFR1的拮抗剂是多价的。TNFR1的多价拮抗剂可包含两个以上TNFR1的特定结合位点的拷贝，或包含两个以上结合TNFR1的不同结合位点(至少一个结合位点由本发明的多肽或dAb提供)。例如，如本文所述的TNFR1的拮抗剂可为二聚体、三聚体或多聚体，其包含，结合TNFR1的两个以上本发明的特定多肽或dAb的拷贝，或结合TNFR1的两个以上本发明的不同多肽或dAb。在一个实施方案中，TNFR1的多价拮抗剂在标准细胞测定中不实质上激动TNFR1(作为TNFR1的激动剂起作用) (即在该测定中，当以1nM、10nM、100nM、1μΜ、10μΜ、100μΜ、1000μΜ或5000μΜ的浓度存在时，导致不超过约5%的TNFR1介导的活性由TNFα (100pg/ml)诱导)。

在某些实施方案中，TNFR1的多价拮抗剂包含两个以上TNFR1所需表位或结构域的结合位点。例如，TNFR1的多价拮抗剂可包含，结合TNFR1结构域1中的相同表位或结合TNFR1结构域4中的相同表位的两个以上结合位点。

在其他实施方案中，TNFR1的多价拮抗剂包含，两个以上与TNFR1的不同表位或结构域结合的由本发明的多肽或dAb提供的结合位点。例如，TNFR1的多价拮抗剂可包含TNFR1的结构域1和2、结构域1和3、结构域1和4、结构域2和3、结构域2和4、结构域3和4、结构域1、2和3、结构域1、2和4或结构域1、3和4的结合位点。在一个实施方案中，当以约1nM，或约10nM，或约100nM，或约1μΜ，或约10μΜ的浓度存在时，这样的多价拮抗剂在如WO2006038027中所述的标准L929细胞毒性测定或标准Hela IL-8测定中不激动TNFR1。

TNFR1的其他拮抗剂不抑制TNFα与TNFR1的结合。这样的配体(和拮抗剂)可具有作为诊断剂的效用，因为它们可用于结合和检测、定量或测量样品中的TNFR1，并将不与样品中的TNF竞争结合TNFR1。因此，样品中是否有TNFR1或有多少TNFR1可精确测定。

在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂结合TNFR1，并在标准细胞测定中以ND50≤ 100 nM拮抗TNFR1的活性，并在该测定中，在≤ 10μΜ的浓度下，dAb激动的TNFR1的活性≤ 5%。

在特定实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在标准细胞测定中不实质上激动TNFR1(作为TNFR1的激动剂起作用) (即，在该测定中，当以1nM、10nM、100nM、1μΜ、10μΜ、100μΜ、1000μΜ或5000μΜ的浓度存在时，导致不超过约5%的TNFR1介导的活性由TNFα (100pg/ml)诱导)。

在某些实施方案中，当给予有效量时，本发明的多肽、配体、dAb或拮抗剂在慢性炎性疾病的模型中有效。通常有效量是约1mg/kg – 约10mg/kg (例如，约1 mg/kg、约2 mg/kg、约3 mg/kg、约4 mg/kg、约5 mg/kg、约6 mg/kg、约7 mg/kg、约8 mg/kg、约9 mg/kg或约10 mg/kg)。本领域普通技术人员接受慢性炎性疾病的模型(参见WO2006038027中所述的那些)预测在人类中的治疗效果。

在特定实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中有效(关于该模型的细节，参见WO2006038027)。例如，在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可降低四肢总和的平均关节炎分值约1 - 约16、约3 – 约16、约6 – 约16、约9 – 约16或约12 – 约16。在另一实例中，在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可延缓关节炎症状的发生约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在标准小鼠胶原诱导的关节炎模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，可导致0 – 约3、约3 – 约5、约5 – 约7、约7 – 约15、约9 – 约15、约10 – 约15、约12 – 约15或约14 – 约15的四肢总和的平均关节炎分值。

在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在关节炎的小鼠△ARE模型中有效(关于该模型的细节，参见WO2006038027)。例如，在关节炎的小鼠△ARE模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可降低平均关节炎分值约0.1 – 约2.5、约0.5 – 约2.5、约1 – 约2.5、约1.5 – 约2.5或约2 – 约2.5。在另一实例中，在关节炎的小鼠△ARE模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可延缓关节炎症状的发生约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在关节炎的小鼠△ARE模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，可导致0 – 约0.5、约0.5 – 约1、约1 – 约1.5、约1.5 – 约2或约2 – 约2.5的平均关节炎分值。

在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在炎性肠病(IBD)的小鼠△ARE模型中有效(关于该模型的细节，参见WO2006038027)。例如，在IBD的小鼠△ARE模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可降低平均急性和/或慢性炎症分值约0.1 – 约2.5、约0.5 – 约2.5、约1 – 约2.5、约1.5 – 约2.5或约2 – 约2.5。在另一实例中，在IBD的小鼠△ARE模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可延缓IBD症状的发生约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在IBD的小鼠△ARE模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，可导致0 – 约0.5、约0.5 – 约1、约1 – 约1.5、约1.5 – 约2或约2 – 约2.5的平均急性和/或慢性炎症分值。

在其他实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的IBD模型中有效(关于该模型的细节，参见WO2006038027)。例如，在IBD的小鼠DSS模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可降低平均严重性分值约0.1 – 约2.5、约0.5 – 约2.5、约1 – 约2.5、约1.5 – 约2.5或约2 – 约2.5。在另一实例中，在IBD的小鼠DSS模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，相比于合适对照，例如可延缓IBD症状的发生约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约14天、约21天或约28天。在另一实例中，在IBD的小鼠DSS模型中给予有效量的多肽、配体、dAb或拮抗剂，可导致0 – 约0.5、约0.5 – 约1、约1 – 约1.5、约1.5 – 约2或约2 – 约2.5的平均严重性分值。

在特定实施方案中，多肽、配体、dAb或拮抗剂在慢性阻塞性肺病(COPD)的小鼠烟草烟雾模型中有效(关于该模型的细节，参见WO2006038027和WO2007049017)。例如，给予有效量的配体，相比于合适对照，可降低或延缓COPD症状的发生。

可用于筛查TNFR1的拮抗剂(例如配体、抗体或其结合蛋白)在保护免受疾病或治疗疾病中的有效性的动物模型系统是可得的。用于在易感小鼠中测试系统性红斑狼疮(SLE)的方法在本领域是已知的(Knight 等 (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten 等 (1978) New Eng. J. Med., 299: 515)。通过用来自另一物种的可溶性AchR蛋白诱导疾病，在SJL/J雌性小鼠中测试重症肌无力(MG) ((Lindstrom 等(1988) Adv. Immunol., 42: 233))。通过注射II型胶原，在易感品系的小鼠中诱导关节炎(Stuart 等 (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233)。通过注射分支杆菌热休克蛋白在易感大鼠中诱导佐剂性关节炎的模型已被描述(Van Eden 等 (1988) Nature, 331 : 171)。如(Maron 等 (1980) J. Exp. Med., 152: 1 115)所述，通过给予甲状腺球蛋白在小鼠中诱导甲状腺炎。在特定品系的小鼠(例如，由Kanasawa 等 (1984) Diabetologia, 27: 113描述的那些小鼠)中，天然产生或可诱导胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。小鼠和大鼠EAE起人的MS模型的作用。在该模型中，通过给予髓鞘碱性蛋白诱导脱髓鞘疾病(参见，Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer 等, 主编, Grune和Stratton, New York, 第179-213页; McFarlin 等 (1973) Science, 179: 478: 和 Satoh 等 (1987) J. Immunol., 138: 179)。

通常，本发明的配体(例如，拮抗剂)以纯的形式与药学上合适的载体一起使用。典型地，这些载体包括，水性或酒精/水溶液、乳剂或混悬液、任何包含盐水的载体和/或缓冲媒介。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格式葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠和乳酸林格式液。如果需要保持混悬液中的多肽复合物，可从增稠剂(例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐)中选择合适的生理上可接受佐剂。

静脉内溶媒包括，液体和营养补充液以及电解质补充液，例如基于林格式葡萄糖液的那些溶媒。还可存在防腐剂和其他添加剂(例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体) (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版)。可使用各种合适的制剂，包括延迟释放制剂。

本发明的配体(例如，拮抗剂)可被用作单独给予的组合物或与其他物质一起给予。这些物质可包括各种免疫治疗药物(例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂)和免疫毒素。不管注射前是否合并，药物组合物还可包含各种细胞毒性或其他物质的“混合物”与本发明的配体的组合，或者甚至是与本发明具有不同特异性的配体(例如使用不同靶抗原或表位所选择的配体)的组合。

本发明的药物组合物的给药途径可为本领域的普通技术人员通常所知晓的任何途径。对于治疗，包括但不限于免疫治疗，所选择的本发明的配体可依据标准技术给予任何患者。

可通过任何合适的方式给药，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、经由肺途径、或者，还可用导管合适地直接输注。给药剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和病况、同时给予的其他药物、禁忌征和由临床医生考虑的其他参数。如文，可局部(通过肺部给药局部递送至肺，例如鼻内给药)或全身给药。

本发明的配体可冻干贮存并在使用前在合适载体中复溶。该技术已显示对常规免疫球蛋白有效，并可使用本领域已知的冻干和复溶技术。本领域的技术人员将认识到，冻干和复溶可导致不同程度的抗体活性丢失(例如，用常规免疫球蛋白时，IgM抗体比IgG抗体倾向具有更大的活性丢失)，并可能必须向上调整使用水平以补偿。

可给予包含本发明的配体(例如，拮抗剂)或其混合物的组合物用于预防和/或治疗处理。在某些治疗应用中，实现至少部分抑制、阻抑、调节、杀死所选择的细胞群或一些其他测量参数的足够的量被定义为“治疗上有效剂量”。需要达到该剂量的量将取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的一般状况，但通常每千克体重的配体(例如dAb或拮抗剂)在0.005 – 10.0mg的范围内，更通常使用的剂量是0.05 – 2.0 mg/kg/剂量。对于预防应用，亦可以类似或稍低剂量给予包含本发明的配体或其混合物的组合物来预防、抑制或延缓疾病的发生(例如，来保持、减轻或静止，或预防急性发作)。熟练的临床医生将能确定适合的给药间隔来治疗、阻抑或预防疾病。当给予TNFR1的配体(例如，拮抗剂)来治疗、阻抑或预防慢性炎性疾病时，可以例如约10μg/kg – 约80mg/kg、约100μg/kg – 约80mg/kg、约1mg/kg – 约80mg/kg、约1mg/kg – 约70mg/kg、约1mg/kg – 约60mg/kg、约1mg/kg – 约50mg/kg、约1mg/kg – 约40mg/kg、约1mg/kg – 约30mg/kg、约1mg/kg – 约20mg/kg、约1mg/kg – 约10mg/kg、约10μg/kg – 约10mg/kg、约10μg/kg – 约5mg/kg、约10μg/kg – 约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg的剂量多达每天四次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次给予。在特定实施方案中，以约10μg/kg – 约10mg/kg (例如，约10μg/kg、约100μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)的剂量每两周一次或每月一次给予TNFR1的配体(例如，拮抗剂)来治疗、阻抑或预防慢性炎性疾病。

如果相比于治疗前存在的这样的症状，或者相比于不用这种组合物治疗的个体(人或模型动物)或其他合适对照中的这样的症状，一种或多种症状减轻(例如，至少10%或减轻临床评定量表上至少一个点)，那么使用本文所述的组合物进行的处理或治疗被认为是“有效的”。取决于所靶向的疾病或障碍，症状将明显不同，但可由普通熟练临床医生或技师测量。例如，通过监测疾病或障碍的一种或多种生化指示物的水平(例如与疾病相关的酶或代谢物水平、受影响的细胞数等)，通过监测物理表现(例如炎症、肿瘤大小等)或通过可接受的临床评定量表(例如，Expanded Disability Status Scale(用于多发性硬化)、Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnaire(评价关于肠功能、全身症状、社会功能和情感状况的生活质量的32点评定 – 分值范围从32 – 224，具有较高分值表示更好的生活质量)、Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale或本领域所知的其他接受的临床评定量表)，可测量这样的症状。疾病或障碍症状持续(例如，一天或多天，或更长)减轻至少10%或减轻给定临床量表的一个或多个点是“有效”治疗的象征。类似地，如果相比于未用该组合物治疗的类似个体(人或动物模型)中的这样的症状，一种或多种症状的发生或严重性被延缓、减轻或消除，那么使用本文所述的组合物进行的预防是“有效的”。

本发明的包含配体(例如，拮抗剂)或其混合物的组合物可在预防和治疗环境中使用，以在哺乳动物中帮助改变、灭活、杀死或移除所选择的靶细胞群。另外，可体外选择性使用本文所述的多肽的所选择的库，来杀死、耗尽靶细胞群，或从异质细胞群中有效移除靶细胞群。可体外将哺乳动物的血与配体混合，藉此杀死不需要的细胞，或者根据标准技术，从用于返回哺乳动物的血中移除不需要的细胞。

本发明的包含配体(例如，拮抗剂)的组合物可在预防和治疗环境中使用，以在哺乳动物中帮助改变、灭活、杀死或移除所选择的靶细胞群。

可给予配体(例如，抗-TNFR1拮抗剂、dAb单体)和/或与一种或多种另外的治疗或活性物质一起配制。当配体(例如dAb)和另外的治疗物质一起给予时，可在给予另外的物质前、同时或随后给予配体。通常，以提供治疗效果的重叠的方式给予配体和另外的物质。

在一个实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防慢性炎性疾病的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在一个实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防关节炎(例如，类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎)的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在另一实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防银屑病的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在另一实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在另一实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防慢性阻塞性肺病(例如，慢性支气管炎、慢性阻塞性支气管炎、肺气肿)的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在另一实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防肺炎(例如，细菌性肺炎(例如，葡萄球菌肺炎))的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

本发明提供一种用于治疗、阻抑或预防除了慢性阻塞性肺病和肺炎外的其他肺病的方法。根据本发明，可被治疗、阻抑或预防的其他肺病例如包括囊性纤维化和哮喘(例如，类固醇抵抗型哮喘)。因此，在另一实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防肺病(例如，囊性纤维化、哮喘)的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在特定实施方案中，经由肺部递送(例如通过吸入，(例如，支气管内、鼻内或口服吸入、鼻内滴入))，或通过全身递送(例如，胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下)给予TNFR1的拮抗剂。

在另一实施方案中，本发明是一种用于治疗、阻抑或预防脓毒性休克的方法，其包括向有需要的哺乳动物给予治疗上有效剂量或量的本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂。

在本发明的又一方面，提供一种包含本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。

此外，本发明提供一种使用本发明的多肽、配体、dAb或TNFR1的拮抗剂的组合物用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该疾病是癌症或炎性疾病(例如类风湿性关节炎、哮喘或克罗恩病)。

在本发明的又一方面，提供一种包含本发明的多肽、单可变结构域、配体或拮抗剂以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。

在特定实施方案中，经由肺部递送(例如，通过吸入(支气管内、鼻内或口服吸入、鼻内滴入))或通过全身递送(例如，胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、皮下)给予多肽、配体、单可变结构域、拮抗剂或组合物。

本发明的一个方面提供包含本发明多肽、单可变结构域、配体、组合物或拮抗剂的肺部递送装置。该装置可以是吸入器或鼻内给药装置。

在其他实施方案中，本文所述的任何配体(例如拮抗剂或单可变结构域)进一步包含半寿期延长部分(例如，聚亚烷基乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分，或包含增强体内半寿期的多肽的结合位点的部分)。在一些实施方案中，半寿期延长部分是包含增强体内半寿期的多肽的结合位点的部分，其选自：亲合体(affibody)、SpA结构域、LDL受体A类结构域、EGF结构域和亲合多聚体(avimer)。

在其他实施方案中，半寿期延长部分是聚乙二醇部分。在一个实施方案中，拮抗剂包含与聚乙二醇部分(任选地，其中该部分具有约20 – 约50kDa的大小，任选是约40kDa线性或分枝PEG)连接的本发明的单可变结构域(任选由之组成)。关于dAb的PEG化和结合部分的更多细节，参考WO04081026。在一个实施方案中，拮抗剂由与PEG连接的dAb单体组成，其中dAb单体是本发明的单可变结构域。可提供该拮抗剂用于治疗炎性疾病、肺部病况(例如，哮喘、流行性感冒或COPD)或癌症，或者任选用于静脉内给药。

在其他实施方案中，半寿期延长部分是包含血清白蛋白或新生儿Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段(例如，免疫球蛋白单可变结构域)。

本发明还涉及包含本发明的配体(例如拮抗剂或单可变结构域)和生理上可接受的载体的组合物，例如药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含用于静脉内、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内、皮下给药、肺道、鼻内、阴道或直肠给药的溶媒。

本发明还涉及包含本发明组合物(例如，药物组合物)的药物递送装置。在一些实施方案中，药物递送装置包含多个治疗上有效剂量的配体。在其他实施方案中，药物递送装置选自：胃肠外递送装置、静脉内递送装置、肌内递送装置、腹膜内递送装置、经皮递送装置、肺道递送装置、动脉内递送装置、鞘内递送装置、关节内递送装置、皮下递送装置、鼻内递送装置、阴道递送装置、直肠递送装置、注射器、经皮递送装置、胶囊、片、雾化器、吸入器、喷雾器、烟雾器、弥雾器(mister)、干粉吸入器、计量剂量吸入器、计量剂量喷雾器、计量剂量弥雾器、计量剂量喷雾器和导管。

本发明的配体(例如，单可变结构域、拮抗剂或多特异性配体)可按本文所述形式化。例如，本发明的配体可被形式化以调整体内血清半寿期。若需要，配体可另外包含本文所述的毒素或毒素部分。在一些实施方案中，配体包含表面活性毒素，例如自由基发生器(例如，含硒的毒素)或放射性核素。在其他实施方案中，毒素或毒素部分是具有细胞内靶标结合特异性的结合位点的多肽结构域(例如，dAb)。在特定实施方案中，配体是具有TNFR1 (例如，人TNFR1)结合特异性的IgG样形式。

在一个方面，本发明提供包含本发明单可变结构域的融合蛋白。可变结构域可例如与肽、多肽或蛋白融合。在一个实施方案中，可变结构域与抗体或抗体片段(例如，单克隆抗体)融合。通常，通过表达来自单核酸序列的融合产物实现融合，或者通过表达包含单可变结构域的多肽，并接着使用常规技术将该多肽装配到较大的蛋白或抗体形式中实现融合。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域、拮抗剂或融合蛋白包含抗体恒定结构域。在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域、拮抗剂或融合蛋白包含抗体Fc，任选其中Fc的N末端与可变结构域的C末端连接(任选直接连接)。在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域、拮抗剂或融合蛋白包含半寿期延长部分。半寿期延长部分可为聚乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含增强体内半寿期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。半寿期延长部分可为包含血清白蛋白或新生儿Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。半寿期延长部分可为dAb、抗体或抗体片段。在一个实施方案中，提供免疫球蛋白单可变结构域或拮抗剂或融合蛋白，使得可变结构域(或由拮抗剂或融合蛋白所包含的可变结构域)进一步包含聚亚烷基二醇部分。聚亚烷基二醇部分可为聚乙二醇部分。进一步的讨论在下文提供。

参考WO2006038027，其公开了抗-TNFR1免疫球蛋白单可变结构域。该文献的公开内容以其整体结合到本文中，特别提供抗-TNFR1单可变结构域、配体、拮抗剂等的用途、形式、选择方法、产生方法、配制方法和测定，以便这些公开内容可具体和明确地在本发明的上下文中应用，包括对将权利要求结合到本说明书中提供明确描述。

本发明的抗-TNFR1是免疫球蛋白单可变结构域，其任选是人可变结构域，或者包含或来源于人框架区(例如，DP47或DPK9框架区)的可变结构域。在某些实施方案中，可变结构域基于本文所述的通用框架。

在某些实施方案中，有TNFR1结合特异性结合位点的多肽结构域(例如，免疫球蛋白单可变结构域)抵抗聚集、可逆展开(参见WO04101790，其教导通过引用结合到本文中)。

核酸分子、载体和宿主细胞

本发明还提供编码本文所述的配体(单可变结构域、融合蛋白、多肽、双特异性配体和多特异性配体)的分离和/或重组核酸分子。

在一个方面，本发明提供编码包含本发明的免疫球蛋白单可变结构域的多肽的分离或重组核酸。在一个实施方案中，核酸包含DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的核苷酸序列。在一个方面，本发明提供一种分离或重组核酸，其中该核酸包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的核苷酸序列具有至少80、85、90、95、98或99%同一性的核苷酸序列，并且其中该核酸编码包含与TNFR1特异性结合的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供一种分离或重组核酸，其中该核酸包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的核苷酸序列具有至少80、85、90、95、98或99%同一性的核苷酸序列，并且其中该核酸编码包含与TNFR1特异性结合的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供一种分离或重组核酸，其中该核酸包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的核苷酸序列具有至少80、85、90、95、98或99%同一性的核苷酸序列，并且其中该核酸编码包含与TNFR1特异性结合的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。在一个方面，本发明提供一种分离或重组核酸，其中该核酸包含与DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214的核苷酸序列具有至少80、85、90、95、98或99%同一性的核苷酸序列，并且其中该核酸编码包含与TNFR1特异性结合的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。

在一个方面，本发明提供包含本发明的核酸的载体。在一个方面，本发明提供包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。提供一种产生包含免疫球蛋白单可变结构域的多肽的方法，该方法包括将宿主细胞维持在适合于核酸或载体表达的条件下，藉此产生包含免疫球蛋白单可变结构域的多肽。任选地，该方法还包括分离多肽并任选产生变体(例如突变变体)的步骤，所述变体在标准MRC5、L929或食蟹猴KI测定中相比于分离多肽，对TNFR1中和有改进的亲和力(KD)、ND50。

本文称为“分离的”核酸是已从其原始来源的基因组DNA或细胞RNA的核酸中分离的核酸(例如，如它在细胞或核酸的混合物(例如文库)中存在)，并包括通过本文所述的方法或其他合适方法获得的核酸，包括基本上纯的核酸、通过化学合成、通过生物学和化学方法的组合产生的核酸和分离的重组核酸(参见，例如, Daugherty, B.L. 等, Nucleic Acids Res., 19(9) : 2471-2476 (1991); Lewis, AP. 和 J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991))。

本文称为“重组的”核酸是已通过重组DNA方法学产生的核酸，包括通过依赖于人工重组的方法的步骤(例如聚合酶链式反应(PCR)和/或使用限制酶克隆到载体中)产生的那些核酸。

在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含编码本文所述的配体的核苷酸序列，其中该配体包含与本文公开的结合TNFR1的dAb的氨基酸序列(例如，DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214)有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。核苷酸序列同一性可在编码所选择的抗-TNFR1 dAb的全长核苷酸序列上确定。

本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，载体是包含一种或多种与本发明的重组核酸有效连接的表达控制元件或序列的表达载体。本发明还提供包含本发明的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如，质粒、噬菌粒)、表达控制元件、宿主细胞和产生本发明的重组宿主细胞的方法在本领域是公知的，并且本文另外描述实例。

合适的表达载体可包含许多组分，例如，复制起点、选择性标记基因、一种或多种表达控制元件(例如，转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子)和/或一种或多种翻译信号) 、信号序列或前导序列等。表达控制元件和信号序列，如果存在，可通过载体或其他来源提供。例如，编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于直接表达。

可在所需的宿主细胞中提供启动子用于表达。启动子可为组成型或诱导型。例如，启动子可有效连接于编码抗体、抗体链或其部分的核酸，使得其指导转录核酸。用于原核(例如大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和真核(例如，猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)宿主的各种合适启动子是可得的。

另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择性标记物，并在可复制表达载体的情况下，通常包含复制起点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因是常见的选择性标记物，并可用于原核细胞(例如，内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如，新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许用甲氨蝶呤在各种宿主中选择。编码宿主的营养缺陷型标记物的基因产物的基因(例如，LEU2 、URA3 、HIS3)在酵母中经常用作选择性标记物。还预期使用病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体载体，和能够整合到宿主细胞的基因组中的载体(例如，反转录病毒载体)。用于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇(Drosophila) Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇型毕赤酵母(P. methanolica)、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母(S. cerevisiae))中表达的合适表达载体在本领域是公知的。

合适的宿主细胞可为原核细胞(包括细菌细胞(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和/或其他合适细菌))、真核细胞(例如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母、曲霉属(Aspergillus sp.)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)))或其他低等真核细胞，和高地真核生物细胞(例如来自于昆虫(例如，果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087 (O'Connor)))和哺乳动物(例如，COS细胞(例如COS-1 (ATCC保藏号CRL-1650)和COS-7 (ATCC保藏号CRL-1651))、CHO (例如ATCC保藏号CRL-9096、CHO DG44 (Urlaub, G. 和 Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)))、293(ATCC保藏号CRL-1573)、Hela (ATCC保藏号CCL-2)、CV1 (ATCC保藏号CCL-70)、WOP (Dailey, L., 等, J. Virol, 54:739-749 (1985)、3T3、293T (Pear, W. S., 等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)) NSO细胞、SP2/0、HuT78细胞等)，或植物(例如，烟草)的那些细胞) (参见，例如Ausubel, F.M. 等,主编. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993))。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的宿主细胞，并且不是多细胞生物体(例如，植物或动物)的一部分。在某些实施方案中，宿主细胞是非人宿主细胞。

本发明还提供一种用于产生本发明的配体(例如，双特异性配体、多特异性配体)的方法，该方法包括将包含本发明的重组核酸的重组宿主细胞维持在适合于重组核酸表达的条件下，藉此表达重组核酸并产生配体。在一些实施方案中，该方法进一步包括分离配体。

关于适用于本发明的实施方案的公开内容的细节，参考WO2006038027。例如，相关公开内容涉及：基于免疫球蛋白单可变结构域的配体的制备、文库载体系统、文库构建、组合单可变结构域、配体的表征、配体的结构、骨架、蛋白质支架、规范序列的多样化、测定和治疗和诊断组合物和用途以及“有效连接”、“幼稚”、“预防”、“阻抑”、“治疗”和“治疗上有效剂量”的定义。

形式

延长的半寿期在免疫球蛋白(特别是抗体，最特别是小尺寸的抗体片段)的体内应用中有用。这样的片段(Fv、二硫键键合的Fv、Fab、scFv、dAb)遭受来自身体的迅速清除；因此，尽管它们能够迅速到达身体的大多数部位，并迅速产生和较容易操作，但其体内应用还是被其体内仅短暂的持续时间限制。本发明的一个实施方案通过提供体内延长半寿期的配体，并因此提供功能活性的配体在体内的较长持续时间，来解决该问题。本领域的技术人员将熟悉用于药代动力学分析和配体半寿期测定的方法。细节可发现于：Kenneth, A 等: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists和Peters 等, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)。还参考了描述药代动力学参数(例如tα和tβ半寿期，曲线下面积(AUC))的"Pharmacokinetics", M Gibaldi 和 D Perron, Marcel Dekker出版, 2^nd Rev. ex editon (1982)。上文提供了半寿期和AUC定义。

在一个实施方案中，本发明提供具有在15分钟以上范围内的tα半寿期的配体(例如，多肽、可变结构域、拮抗剂、多特异性配体)或包含本发明配体的组合物。在一个实施方案中，该范围的下端是30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外，或备选地，本发明的配体或组合物将具有在多达12小时范围内的tα半寿期。在一个实施方案中，该范围的上端是11、10、9、8、7、6或5小时。合适的范围的实例是1 - 6小时、2 – 5小时或3 – 4小时。

在一个实施方案中，本发明提供具有在约2.5小时以上范围内的tβ半寿期的配体(例如，多肽、可变结构域、拮抗剂、多特异性配体)或包含本发明配体的组合物。在一个实施方案中，该范围的下端是约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约10小时、约11小时或约12小时。另外，或备选地，本发明的配体或组合物具有在多达21天范围内的tβ半寿期。在一个实施方案中，该范围的上端是约12小时、约24小时、约2天、约3天、约5天、约10天、约15天或约20天。在一个实施方案中，本发明的配体或组合物将具有在约12 – 约60小时范围内的tβ半寿期。在另一实施方案中，它将是在约12 – 约48小时范围内。在又一实施方案中，它将是约12 – 约26小时范围内。

除上文标准之外或作为其备选，本发明提供具有在约1 mg·min/ml以上范围内的AUC值(曲线下面积)的配体或包含本发明配体的组合物。在一个实施方案中，该范围的下端是约5、约10、约15、约20、约30、约100、约200或约300 mg·min/ml。另外，或备选地，本发明的配体或组合物具有在多达约600 mg·min/ml范围内的AUC。在一个实施方案中，该范围的上端是约500、约400、约300、约200、约150、约100、约75或约50 mg·min/ml。在一个实施方案中，本发明的配体将具有在选自如下的范围内的AUC：约15 – 约150 mg·min/ml、约15 – 约100 mg·min/ml、约15 – 约75 mg·min/ml和约15 – 约50 mg·min/ml。

本发明的多肽和dAb以及包含它们的拮抗剂可被形式化为具有较大的流体尺寸，例如，通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区，或通过与抗体结构域缀合。例如，将多肽、dAb和拮抗剂形式化为较大抗原-抗体的结合片段或形式化为抗体(例如，形式化为Fab、Fab’、F(ab)₂、F(ab’)₂、IgG、scFv)。

可使用本领域公知的方法确定本发明的配体(例如，dAb单体和多聚体)的流体尺寸。例如，凝胶过滤层析可用于测定配体的流体尺寸。用于测定配体的流体尺寸的合适凝胶过滤基质(例如交联琼脂糖基质)是公知的并容易获得。

视所需的应用，配体形式的尺寸(例如，与dAb单体连接的PEG部分的尺寸)可不同。例如，当配体旨在离开循环并进入外周组织时，保持配体的流体尺寸低以促进从血流中外渗是所需的。备选地，当需要使配体在全身循环中保持较长时间段时，可增加配体的尺寸，例如通过形式化为Ig样蛋白。

通过靶向增加体内半寿期的抗原或表位延长半寿期

也可通过将本发明的TNFR1结合多肽、dAb或拮抗剂，与增加如本文所述的体内半寿期的抗原或表位结合的结合结构域(例如抗体或抗体片段)缀合或缔合，增加配体的流体尺寸及其血清半寿期。例如，可将TNFR1结合剂(例如多肽)与抗-血清白蛋白或抗-新生儿Fc受体抗体或抗体片段(例如，抗-SA或抗-新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)，或者与抗-SA 亲合体或抗-新生儿Fc受体亲合体或抗-SA 亲合多聚体或包含支架的抗-SA结合结构域(选自，但不限于CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲合体、亲合多聚体、GroEI和纤连蛋白(关于这些结合结构域的公开内容，参见WO2008096158，这些结构域及其序列通过引用结合到本文中，并形成本发明文本的公开内容的一部分)缀合或连接。缀合指的是，包含本发明多肽、dAb或拮抗剂的组合物与结合血清白蛋白的结合结构域键合(共价或非共价)。

增加体内血清半寿期的合适多肽包括，例如转铁蛋白受体特异性配体-神经药物融合蛋白(参见，美国专利号5,977,307，该专利的教导通过引用结合到本文中)、脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如，可溶性转铁蛋白受体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1 (IGF1)受体、胰岛素样生长因子2 (IGF2)受体、胰岛素受体、凝血因子X、α1-抗胰蛋白酶和HNF 1α。增加血清半寿期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类黏蛋白；AAG)、α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋白HC；AIM)、抗凝血酶III (AT III)、载脂蛋白A-1 (Apo A-1)、载脂蛋白B (Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3 (C3)、补体成分C4 (C4)、CI酯酶抑制剂(CI INH)、C反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血液结合素(HPX)、脂蛋白(a) (Lp(a))、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白；PAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。

来自胞外基质的合适蛋白包括，例如胶原、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原是胞外基质的主要蛋白。约15种胶原分子是目前已知的，在身体的不同部位中发现，例如在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原(占身体胶原的90%)或在软骨、椎间盘、脊索和眼睛的玻璃体液中发现的II型胶原。

来自血液的合适蛋白包括，例如血浆蛋白质(例如，血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原(例如，血纤蛋白原A、血纤蛋白原B)、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、抑制蛋白、泛素、子宫珠蛋白和β-2-微球蛋白)、酶和酶抑制剂(例如，纤溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)、免疫系统的蛋白质(例如免疫球蛋白蛋白质(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免疫球蛋白轻链(κ/λ))、转运蛋白(例如，视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)、防卫素(例如，β-防卫素1、中性粒细胞防卫素1、中性粒细胞防卫素2和中性粒细胞防卫素3)等)。

在血脑屏障或在神经组织中发现的合适蛋白包括，例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转动蛋白等。

增加体内血清半寿期的合适多肽还包括位于肾的蛋白(例如，多囊蛋白、IV型胶原、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann抗原)、位于肝的蛋白(例如，醇脱氢酶、G250)、位于肺的蛋白(例如，结合IgA的分泌成分)、位于心脏的蛋白(例如，与扩张型心肌病相关的HSP27)、位于皮肤的蛋白(例如，角蛋白)、骨特异性蛋白(例如，形态发生蛋白(BMP)，其为显示生骨活性的蛋白的转化生长因子β超家族的子集(例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8))、肿瘤特异性蛋白(例如，滋养层抗原、赫赛汀受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如，可在肝和脾中发现的组织蛋白酶B))。

合适的疾病特异性蛋白包括，例如，仅在激活的T细胞上表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞激活基因)、骨保护素配体(OPGL，参见Nature 402, 304-309 (1999))、OX40 (TNF受体家族的成员，在激活的T细胞上表达并在产生人T细胞白血病I型病毒(HTLV-I)的细胞中特异性上调；参见Immunol. 165 (l):263-70 (2000))。合适的疾病特异性蛋白还包括，例如包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白(paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH在内的金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)、血管生成生长因子(包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF))、转化生长因子-α (TGFα)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、血管生成素、白细胞介素-3 (IL-3)、白细胞介素-8 (IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子血小板衍生生长因子-BB (PDGF)和CXXXC趋化分子)。

增加体内血清半寿期的合适多肽还包括应激蛋白，例如热休克蛋白(HSP)。HSP通常发现于胞内。当在胞外发现它们时，表明细胞已死亡并溢出其内容物。当由于创伤、疾病或损伤时，胞外HSP引发来自免疫系统的反应，该非程序化细胞死亡(坏死)发生。与胞外HSP的结合可导致本发明的组合物定位于疾病位点。

涉及Fc转运的合适蛋白包括，例如Brambell受体(也称为FcRB)。该Fc受体具有两种功能，两者对递送潜在有用。功能是(1) 将来自母亲的IgG穿过胎盘转运至婴儿 (2)保护IgG免受降解，藉此延长其血清半寿期。据认为，该受体再循环来自内体的IgG。(参见，Holliger 等, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)。

结合血清白蛋白的dAb

本发明在一个实施方案中提供与TNFR1结合的配体、多肽或拮抗剂(例如，包含抗-TNFR1 dAb (第一dAb)的双特异性配体)并提供结合血清白蛋白(SA)的第二dAb，由表面等离振子共振测定的第二dAb与SA结合的KD是约1nM - 约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约100、约200、约300、约400或约500μM (即，x 10^-9 – 5 x 10^-4M)，或约100nM – 约10μM，或约1 – 约5μM，或约3 – 约70nM，或约10nM – 约1、约2、约3、约4或约5μM。例如由表面等离振子共振测定为约30 – 约70nM。在一个实施方案中，第一dAb (或dAb单体)与SA (例如，HSA)结合的KD由表面等离振子共振测定为近似约1、约50、约70、约100、约150、约200、约300nM，或约1、约2或约3μM。在一个实施方案中，对于包含TNFR1的第一抗-SA dAb和第二dAb的双特异性配体，第二dAb对其靶标的亲和力(例如，由表面等离振子共振(例如，使用BiaCore)测定的KD和/或K_off)是第一dAb对SA的亲和力的约1 – 约100000倍(例如，约100 - 约100000，或约1000 – 约100000，或约10000 – 约100000倍)。在一个实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。例如，第一dAb与SA结合的亲和力近似为约10μΜ，而第二dAb与其靶标结合的亲和力约100pM。在一个实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一个实施方案中，第一dAb与SA (例如，HSA)结合的KD近似为约50，例如约70、约100、约150或约200nM。双特异性配体的细节在WO03002609、WO04003019、WO2008096158和WO04058821中找到。

本发明的配体在一个实施方案中可包含dAb，其与血清白蛋白(SA)结合的KD由表面等离振子共振测定为约1nM - 约1、约2、约3、约4、约5、约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约100、约200、约300、约400或约500μM (即，x 10^-9 – 5 x 10^-4M)，或约100nM – 约10μM，或约1 – 约5μM，或约3 – 约70nM，或约10nM – 约1、约2、约3、约4或约5μM。例如由表面等离振子共振测定为约30 – 约70nM。在一个实施方案中，第一dAb (或dAb单体)与SA (例如，HSA)结合的KD由表面等离振子共振测定为近似约1、约50、约70、约100、约150、约200、约300nM，或约1、约2或约3μM。在一个实施方案中，第一和第二dAb由接头相连接，例如，1 – 4个氨基酸或1 – 3个氨基酸、或超过3个氨基酸、或超过4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸的接头。在一个实施方案中，较长的接头(超过3个氨基酸)用于增强效能(拮抗剂中一个或两个dAb的KD)。

在配体和拮抗剂的特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并与选自如下的dAb竞争结合白蛋白：DOM7h-11、DOM7h-11-3、DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-14、DOM7h-14-10、DOM7h-14-18和DOM7m-16。

在配体和拮抗剂的特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并与选自如下的dAb竞争结合白蛋白：

MSA-16、MSA-26 (关于这些序列的揭露，参见WO04003019，这些序列及其对应的核酸通过引用结合到本文中，并形成本发明文本的公开内容的一部分)，

DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473)、DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l (SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-l (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501)、DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510)、DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (关于这些序列的揭露，参见WO2007080392，这些序列及其对应的核酸通过引用结合到本文中，并形成本发明文本的公开内容的一部分；在本段中的SEQ ID No是WO2007080392中出现的那些)，

dAb8 (dAb10)、dAb10、dAb36、dAb7r20 (DOM7r20)、dAb7r21 (DOM7r21)、dAb7r22 (DOM7r22)、dAb7r23 (DOM7r23)、dAb7r24 (DOM7r24)、dAb7r25 (DOM7r25)、dAb7r26 (DOM7r26)、dAb7r27 (DOM7r27)、dAb7r28 (DOM7r28)、dAb7r29 (DOM7r29)、dAb7r29 (DOM7r29)、dAb7r31 (DOM7r31)、dAb7r32 (DOM7r32)、dAb7r33 (DOM7r33)、dAb7r33 (DOM7r33)、dAb7h22 (DOM7h22)、dAb7h23 (DOM7h23)、dAb7h24 (DOM7h24)、dAb7h25 (DOM7h25)、dAb7h26 (DOM7h26)、dAb7h27 (DOM7h27)、dAb7h30 (DOM7h30)、dAb7h31 (DOM7h31)、dAb2 (dAb4、7、41)、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12 (dAb7m12)、dAb13 (dAb15)、dAb15、dAb16 (dAb21, dAb7m16)、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25 (dAb26、dAb7m26)、dAb27、dAb30 (dAb35)、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38 (dAb54)、dAb41、dAb46 (dAbs 47、52和56)、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1 (DOM 7r1)、dAb7r3 (DOM7r3)、dAb7r4 (DOM7r4)、dAb7r5 (DOM7r5)、dAb7r7 (DOM7r7)、dAb7r8 (DOM7r8)、dAb7r13 (DOM7rl3)、dAb7r14 (DOM7r14)、dAb7r15 (DOM7r15)、dAb7r16 (DOM7r16)、dAb7r17 (DOM7r17)、dAb7r18 (DOM7r18)、dAb7r19 (DOM7r19)、dAb7h1 (DOM7h1)、dAb7h2 (DOM7h2)、dAb7h6 (DOM7h6)、dAb7h7 (DOM7h7)、dAb7h8 (DOM7h8)、dAb7h9 (DOM7h9)、dAb7h10 (DOM7h10)、dAb7h11 (DOM7h11)、dAb7h12 (DOM7h12)、dAb7h13 (DOM7h13)、dAb7h14 (DOM7h14)、dAb7p1 (DOM7p1)和dAb7p2 (DOM7p2) (关于这些序列的揭露，参见WO2008096158，这些序列及其对应的核酸通过引用结合到本文中，并形成本发明文本的公开内容的一部分)。备选的名称在dAb后的括号中示出，例如dAb8具有的备选的名称是dAb10，即dAb8 (dAb10)。

在特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并包含与选自DOM7h-11、DOM7h-11-3、DOM7h-11-12、DOM7h-11-15、DOM7h-14、DOM7h-14-10、DOM7h-14-18和DOM7m-16的dAb的氨基酸序列有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在特定实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并包含与选自如下的dAb的氨基酸序列有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：

MSA-16、MSA-26，

DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473)、DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474)、DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475)、DOM7r-l (SEQ ID NO: 476)、DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477)、DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478)、DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479)、DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480)、DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481)、DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499)、DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500)、DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501)、DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502)、DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503)、DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504)、DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505)、DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506)、DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507)、DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508)、DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509)、DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510)、DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511)、DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512)、DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513)、DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514)、DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515)、DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516)、DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (在本段中的SEQ ID No是WO2007080392中出现的那些)，

dAb8、dAb10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7m12、dAb7m16、dAb7m26、dAb7r1、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7r13、dAb7r14、dAb7r15、dAb7r16、dAb7r17、dAb7r18、dAb7r19、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13、dAb7h14、dAb7pl和 dAb7p2。

例如，结合人血清白蛋白的dAb可包含与DOM7h-11-3或DOM7h-14-10有至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

例如，结合人血清白蛋白的dAb可包含与如下的序列有至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：

DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483)、DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、D0M7h-1 (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497)、DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO:490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)或DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495) (在本段中的SEQ ID No是WO2007080392中出现的那些)，或

dAb8、dAb10、dAb36、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb11、dAb12、dAb13、dAb15、dAb16、dAb17、dAb18、dAb19、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13或dAb7h14。

DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496)、DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489)、DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490)、DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491)、DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492)、DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493)、DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494)、DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495) (在本段中的SEQ ID No是WO2007080392中出现的那些)，

dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb7h1、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、dAb7h12、dAb7h13和dAb7h14。

在更特定的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白的V_κdAb并具有选自如下的氨基酸序列：

DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482)、DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485)、DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486)、DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487)、DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496) (在本段中的SEQ ID No是WO2007080392中出现的那些)，

dAb2、dAb4、dAb7、dAb38、dAb41、dAb54、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、 dAb7h9、dAb7h10、dAb7h11、 dAb7h12、dAb7h13和dAb7h14。

在更特定的实施方案中，dAb是结合人血清白蛋白的V_HdAb并具有选自dAb7h30和dAb7h31的氨基酸序列。

在更特定的实施方案中，dAb是dAb7h11或dAb7h14。在一个实例中，dAb是DOM7h-11-3。在另一实例中，dAb是DOM7h-14-10。

在其他实施方案中，dAb、配体或拮抗剂结合人血清白蛋白并包含任何前述氨基酸序列的一个、二个或三个CDR，例如DOM7h-11-3、DOM7h-14-10、dAb7h11或dAb7h14的一个、二个或三个CDR。

结合血清白蛋白的合适骆驼科动物V_HH包括在WO2004/041862 (Ablynx N.V.)和WO2007080392中公开的那些(这些V_HH序列及其对应的核酸通过引用结合到本文中并形成本发明文本的公开内容的一部分)，例如序列A (SEQ ID NO: 518)、序列B (SEQ ID NO: 519)、序列C (SEQ ID NO: 520)、序列D (SEQ ID NO: 521)、序列E (SEQ ID NO: 522)、序列F (SEQ ID NO: 523)、序列G (SEQ ID NO: 524)、序列H (SEQ ID NO: 525)、序列I (SEQ ID NO: 526)、序列J (SEQ ID NO: 527)、序列K (SEQ ID NO: 528)、序列L (SEQ ID NO: 529)、序列M (SEQ ID NO: 530)、序列N (SEQ ID NO: 531)、序列O (SEQ ID NO: 532)、序列P (SEQ ID NO: 533)、序列Q (SEQ ID NO:534)，这些序列编号对应于WO2007080392或WO 2004/041862 (Ablynx N.V.)中引用的那些编号。在特定实施方案中，骆驼科动物V_HH结合人血清白蛋白并包含与公开于WO2007080392中的ALB1或SEQ ID NO: 518-534 (这些序列编号对应于WO2007080392或WO 2004/041862中引用的那些编号)的任何一条序列有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，配体或拮抗剂包含抗-血清白蛋白dAb，其与本文公开的任何抗-血清白蛋白dAb竞争结合血清白蛋白(例如，人血清白蛋白)。

在一个备选的实施方案中，拮抗剂或配体包含对SA (例如，人SA)特异的结合部分，其中该部分包含如WO2008096158中所述的非-免疫球蛋白序列，这些结合部分、其产生和选择(例如，从不同文库中)方法及其序列的公开内容作为本发明文本公开内容的一部分通过引用结合到本文中。

与半寿期延长部分( 例如，白蛋白) 缀合

在一个实施方案中，(一个或多个)半寿期延长部分(例如，白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)与本发明的TNFR1结合多肽、dAb或拮抗剂缀合或缔合。用于在TNFR1结合形式中使用的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例描述于WO 2005077042，其公开内容通过引用结合到本文中并形成本发明文本的公开内容的一部分。特别地，下述白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体可在本发明中使用：

● SEQ ID NO: 1 (如WO 2005077042中所公开，该序列通过引用明确结合到本说明书中)；

● 包含或由WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸1-387组成的白蛋白片段或变体；

● 包含选自如下的氨基酸序列的白蛋白或其片段或变体：(a) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸54-61；(b) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸76-89；(c) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸92-100；(d) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸170-176；(e) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸247-252；(f) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸266-277；(g) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸280-288；(h) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸362-368；(i) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸439-447；(j) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸462-475；(k) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸478-486；和(l) WO 2005077042中SEQ ID NO: 1的氨基酸560-566。

用于在TNFR1结合形式中使用的合适白蛋白、片段和类似物的进一步的实例描述于WO 03076567，其公开内容通过引用结合到本文中并形成本发明文本的公开内容的一部分。特别地，下述白蛋白、片段或变体可在本发明中使用：

● 如在WO 03076567中(例如，在图3中)所述的人血清白蛋白(该序列信息通过引用明确结合到本说明书中)；

● 由585个氨基酸的单一非-糖基化多肽链组成的人血清白蛋白(HA)，其具有66,500的分子式分子量(参见，Meloun, 等, FEBS Letters 55: 136 (1975); Behrens, 等, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, 等, Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981); Minghetti, 等 , J. Biol. Chem. 261:6141 (1986))；

● 如在Weitkamp, 等, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)中所述的白蛋白的多态变体或类似物或片段；

● 如在EP 322094中所述的白蛋白片段或变体，例如HA(l-373.、HA(l-388)、HA(l-389)、HA(l-369)和HA(1-419)以及1-369和1-419之间的片段；

● 如在EP 399666中所述的白蛋白片段或变体，例如HA(1-177)和HA(1-200)以及HA(1-X)之间的片段，其中X是178-199的任何数字。

当一个或多个半寿期延长部分(例如，白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于形式化本发明的TNFR1结合多肽、dAb和拮抗剂时，可使用任何合适的方法缀合，例如，通过与TNFR1结合部分(例如，抗-TNFR1dAb)直接融合，例如通过使用编码融合蛋白的单核苷酸构建体，其中该融合蛋白被编码为具有定位于TNFR1结合部分的N或C末端的半寿期延长部分的单一多肽链。备选地，通过使用部分之间的肽接头实现缀合，例如，如WO 03076567或WO 2004003019中所述的肽接头(这些接头公开内容通过引用结合到本说明书中，来提供用于在本发明中使用的实例)。通常，增加体内血清半寿期的多肽是体内天然产生并通过从生物体(例如，人)中移除不需要的物质的内源机制抵抗降解或移除的多肽。例如，增加体内血清半寿期的多肽可选自：来自胞外基质的蛋白、在血液中发现的蛋白、在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白、位于肾、肝、肺、心脏、皮肤或骨的蛋白、应激蛋白、疾病特异性蛋白或涉及Fc转运的蛋白。

在贯穿本说明书所述的本发明的实施方案中，在本发明的拮抗剂或配体中代替使用抗-TNFR1单可变结构域(“dAb”)，预期熟练的收信人(addressee)可使用包含与TNFR1结合的本发明dAb的一个或多个或所有3个CDR的多肽或结构域(例如，移植到合适蛋白支架或骨架，例如亲合体、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域上的CDR)。因此作为整体的说明书应视为提供了使用这样的结构域代替dAb的拮抗剂的公开内容。在这方面，关于如何产生基于蛋白支架的不同文库和来自这样的文库的结构域的选择和表征的细节，参见WO2008096158，其公开内容通过引用结合。

在一个实施方案中，因此，本发明的拮抗剂包含具有TNFR1结合特异性的免疫球蛋白单可变结构域或结构域抗体(dAb)，或者合适形式的这种dAb的互补决定区。拮抗剂可为，由这种dAb组成、或基本上由这种dAb组成的多肽。拮抗剂可为，包含合适形式(例如抗体形式，例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)₂)的dAb (或dAb的CDR)，或包含结合TNFR1的dAb和结合另一靶蛋白、抗原或表位(例如，血清白蛋白)的第二dAb的双特异性配体。

本发明的多肽、dAb和拮抗剂可被形式化为本领域已知的各种合适抗体形式，例如IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异二聚体、任何前述的抗原结合片段(例如，Fv片段(例如，单链Fv (scFv)、二硫键键合的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段)、单可变结构域(例如V_H、V_L)、dAb和任何前述的修饰形式(例如，通过聚亚烷基二醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其他合适聚合物的共价连接而修饰)。

在一些实施方案中，本发明提供IgG样形式的配体(例如，抗-TNFR1拮抗剂)。这种形式具有IgG分子的常规四条链结构(两条重链和两条轻链)，其中一个或多个可变区(V_H和或V_L)已用本发明的dAb替换。在一个实施方案中，各可变区(2个V_H区和2个V_L区)均用dAb或单可变结构域替换，至少一个dAb或单可变结构域是本发明的抗-TNFR1 dAb。包含在IgG样形式内的dAb或单可变结构域可具有相同的特异性或不同的特异性。在一些实施方案中，IgG样形式是四价的并可具有一种(仅抗-TNFR1)、两种(例如，抗-TNFR1和抗-SA)、三种或四种特异性。例如，IgG样形式可为，单特异性的，并包含4个具有相同特异性的dAb；双特异性的，并包含3个具有相同特异性的dAb和具有不同特异性的另一dAb；双特异性的，并包含2个具有相同特异性的dAb和两个具有共同但不同特异性的dAb；三特异性的，并包含具有相同特异性的第一和第二dAb、具有不同特异性的第三dAb和与第一、第二和第三dAb不同特异性的第四dAb；或四特异性的，并包含四个各具有不同特异性的dAb。可制备IgG样形式的抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv、scFv)。在一个实施方案中，IgG样形式或抗原结合片段可为对于TNFR1是单价的。如果补体激活和/或依赖抗体的细胞毒性(ADCC)是所需的，那么配体可为IgG1样形式。若需要，IgG样形式可包含突变的恒定区(变体IgG重链恒定区)来最小化结合Fc受体和/或固定补体的能力(例如，参见Winter 等, GB 2,209,757 B; Morrison 等, WO 89/07142; Morgan 等, WO 94/29351, 1994年12月22日)。

本发明的配体(例如，多肽、dAb和拮抗剂)可被形式化为融合蛋白，其包含与第二免疫球蛋白单可变结构域直接融合的第一免疫球蛋白单可变结构域。若需要，这种形式还可另外包含半寿期延长部分。例如，配体可包含与第二免疫球蛋白单可变结构域直接融合的第一免疫球蛋白单可变结构域，该第二免疫球蛋白单可变结构域与结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域直接融合。

具有靶标结合特异性结合位点的多肽结构域的取向和配体是否包含接头，通常是设计选择的问题。然而，一些取向(有或没有接头)可提供比其他取向更好的结合特性。本发明所包含的所有取向(例如，dAb1-接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)是，包含提供所需结合特性可通过筛选容易鉴定的取向的配体。

本发明的多肽和dAb (包括dAb单体、二聚体和三聚体)，可与抗体Fc区(包含C_H2和C_H3结构域的一个或两者，并任选包含铰链区)连接。例如，编码作为单核苷酸序列与Fc区连接的配体的载体可用于制备这样的多肽。

本发明此外提供上述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。

实施例

抗体片段的生物物理性质在确定抗体片段是否可开发作为治疗剂中起着关键的作用。这些生物物理性质之一是，抗体片段在贮存时沉淀的稳定性。加速稳定性测试是，用于通过在高温下孵育蛋白很长时间，并接着测定沉淀水平，更加迅速地评价稳定性的技术。因此，我们表征7个抗-TNFR1 dAb的加速稳定性。由于所研究的单个dAb的非常不同的性质(特别是不同的Tm)，这些dAb的加速稳定性研究都在40℃下进行。

用于测试加速稳定性的方案如下：将所有蛋白缓冲液更换为PBS并调整为1mg/ml的浓度。在0.5ml eppendorf中制备四份250μl的等分试样(对应于4个时间点，0h、2h、23h和47h)。将第一份样品(47h时间点)放在40℃的烘箱中；24小时后将第二个250μl的等分试样(23h时间点)放在烘箱中；又过20小时后，将第三个250μl的等分试样(2h时间点)放在烘箱中；在本研究期间，将0h等分试样保持在4℃下。所有的等分试样在4℃放置直至它们被放入40℃烘箱中。在总计为47h后，将所有等分试样移出烘箱并以16,100 x g离心10分钟。测量各样品的A280，使用96孔UV板读数器来监测仍在溶液中的蛋白量。该数据用于计算各蛋白在各时间点的蛋白浓度，并进而对其绘制针对时间的图来监测蛋白随时间推移的损失。

实施例1 ：测试抗- TNFRl dAb 的加速稳定性

对于抗-TNFR1 dAb，评价6个相关的抗-TNFR1 dAb (即DOM1h-574-72、DOM1h-574-109、DOM1h-574-133、DOM1h-574-138、DOM1h-574-156和DOM1h-574-180)和不相关的抗-TNFR1 dAb DOM1h-131-206。将所有这些Sa1I/NotI克隆在pDOM13(一种pBR322衍生的表达载体)中的dAb的遗传构建体转化到大肠杆菌HB2151中后，在上清液中表达蛋白。在单步纯化中在Protein-A Streamline (GE Healthcare商品目录号17-1281-03)上纯化来自上清液的dAb，之后用100mM甘氨酸pH2.0洗脱并用200mM Tris pH8中和。浓缩后，通过透析将dAb缓冲液更换为PBS并以1mg/ml测试加速稳定性。加速稳定性的结果示于表1中，其提供在各时间点溶液中的dAb量占t=0h时存在的dAb的量的百分比。

表1：当以1mg/ml在PBS中40℃孵育时，抗-TNFR1 dAb的加速稳定性。值代表：在各时间点溶液中的dAb量占t=0h时存在的dAb的量的百分比。

DOM1h-574系除了DOM1h-574-133外的抗-TNFR1 dAb在第一个47h内倾向于沉淀，导致在该时间点溶液中蛋白的量实质性降低。与此相反，对于这段时间，抗-TNFR1 dAb DOM1h-131-206的确在溶液中保留。因此，稳定dAb使得它在加速稳定性研究中更加抗沉淀是有益的。

实施例2 ：为了改进的生物物理性质，选择和筛查抗-TNFR1 dAb 系DOM1h-574

为了鉴定在高温孵育后具有改进的抗沉淀性的新dAb，基于5个抗-TNFR1 dAb：DOM1h-574-156、DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162和DOM1h-574-180，构建倾向容错PCR文库。使用在pDOM13载体中的这些克隆制备倾向容错文库(作为模板)，并接着使用GeneMorph II (Stratagene, 商品目录号 200550)进行两轮倾向容错PCR。在第一轮中，在50μl体积中使用寡核苷酸AS9和AS339以及下列扩增参数扩增50ng的载体30个循环：95℃ 2分钟，并接着30个循环是：95℃ 15秒、50℃ 30秒、72℃ 1分钟，和最后72℃ 10分钟。

在第二轮中，0.4μl的第一轮倾向容错PCR反应产物在第二轮的用GeneMorph II (Strategene) (200μl体积)的诱变中用作模板，使用嵌套引物AS639和AS65，和扩增参数：95℃ 2分钟，并接着35个循环是：95℃ 15秒、50℃ 30秒、72℃ 1分钟，和最后72℃ 10分钟。

使用Qiagen Gel Extraction试剂盒在2% E-Gel上纯化PCR产物，并用Sal I和Not I限制酶(NEB)切割。在2% E-Gel上运行消化反应产物，并使用Qiagen Gel Extraction试剂盒从E-Gel中纯化编码dAb的DNA插入片段。使用T4 DNA连接酶试剂盒(NEB)将纯化的插入片段连接到pDOM33噬菌体展示载体中：

40μl的30nM 0.7μg/μl Sal I/Not I-切割pDOM33载体

30μl的300nM插入片段

400μl的H₂0

50μl的10 x 缓冲液

15μl的400U/μl T4 DNA连接酶

在16℃孵育反应18小时。苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀反应产物并溶解在50μl的H₂0中，加入到400μl的电感受态TB1大肠杆菌细胞中，在100μl体积中使用Bio-Rad Gene Pulser II电穿孔，然后接种在四环素-2xTY琼脂糖平板上。对于5个文库的每个文库，平均获得约2.4x10⁸单个转化体。每个基因平均约有3个氨基酸突变。

在开始选择改进的生物物理性质之前，在可溶性人TNFR1 (R&D Systems)上预选择5个倾向容错噬菌体文库，该TNFR1已使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce Protein Research Products, Rockford Illinois, 商品目录号 21327)生物素化来富集有TNFR1结合性质的功能噬菌体。使用下列方案进行预选择：

1. 在室温下，用2% Marvel在PBS中封闭1ml的M280 Streptavidin Dynabeads (Invitrogen)1小时。

2. 在室温下，对于各文库，用2% Marvel在0.5ml PBS中封闭约10¹¹转化单位(Tu)噬菌体1小时。

3. 向0.5ml封闭的噬菌体中加入0.53μl的47μM生物素化人可溶性TNFR1。在室温下孵育1小时。

4. 向噬菌体溶液中加入200μl的封闭的Dynabeads。在室温下孵育10分钟。

5. 用PBST (含0.1% Tween20的PBS)洗涤5次。

6. 用500μl的0.1M甘氨酸pH=2洗脱结合噬菌体。

7. 用100μl的1M Tris pH8中和洗脱的噬菌体。

对于每个文库，在预选择轮结束时，约回收2%的投入Tu噬菌体。在预选择后，合并DOM1h-574-109、DOM1h-574-138、DOM1h-574-162和DOMlh-574-180前导克隆的文库，形成文库A。DOM1h-574-156的文库B单独保存。

在该阶段，采取四种噬菌体展示选择策略以从这些倾向容错PCR文库中富集具有改进生物物理性质的DOM1h-574变体：

1) 高温下(65℃)动力学稳定性

2) 热变性的可逆性(80℃)

3) 抗蛋白酶消化

4) 低pH诱导的变性的可逆性

噬菌体展示文库选择第1 轮

在第一轮噬菌体展示选择中，在PBS中将文库A和B稀释至5x10¹¹Tu/ml并接着使100μl等分试样经受热、蛋白酶或低pH预处理。对于热选择(样品1-4，表2)，使用50℃-80℃的温度，孵育时间是2h或10min，如在表2中所示。在37℃下，在PBS中以10-100μg/ml的胰蛋白酶进行胰蛋白酶(Promega, V511)选择(样品5-7) 2小时，并在室温下，在PBS中进行对照孵育2小时(样品8和9)。孵育后，向样品5-9中各加入50μl的2xComplete蛋白酶抑制剂(Roche 04 693 116 001)。对于酸选择，将样品10-13噬菌体从噬菌体原液稀释10倍至420μl的HNC缓冲液(5mM HEPES、5mM NaCl、100mM柠檬酸盐，pH=3.2)。在孵育(各样品酸孵育的时间长短在表2中示出)结束时，用80μl的的Tris缓冲液中和样品。

在这些应激条件下孵育后，通过与生物素化的人可溶性TNFR1一起孵育，针对功能活性dAb选择噬菌体文库，如在上文预选择步骤中所述。所使用的方案仅改变的是使用Kingfisher进行10次洗涤步骤。对于用文库A和B的所有选择，测定回收的噬菌体的数量并在表2中示出。随后扩增噬菌体用于下一轮选择。

表2：用于改进性质的第1轮选择。示出的是所使用的选择条件和选择后分别从两个文库中回收的Tu噬菌体。所有选择的投入是5x10¹⁰Tu噬菌体

。

基于回收水平，将来自两种文库的选择3、4、5和12 (和来自文库A的选择6)的产出用于第二轮的选择。将噬菌体产出通过一轮大肠杆菌的感染扩增，并随后纯化并浓缩至2x10¹⁴Tu/ml。

噬菌体展示文库选择第2 轮

将来自第一轮的来自文库A和B的选择的产出在PBS中稀释至5x10¹¹Tu/ml，并将各100μl等分试样用于第二轮的选择。尽管使用的是相同的方案，但是将选择条件修改为如表3中概述的。

表3：第2轮选择投入、条件和回收。投入指的是第1轮使用的选择条件参考。对于文库A，合并第1轮中条件5和6的选择产出，并在用“*”表示的地方使用该合并物。选择条件包括不存在配体时本底结合的阴性对照。对于所有选择，投入为5x10¹⁰Tu噬菌体

。

纯化噬菌体产出并浓缩至1x10¹³Tu/ml。来自两者文库的选择1、4、9和12的产出用于下一轮选择。将噬菌体产出通过一轮大肠杆菌感染扩增，并随后纯化并浓缩至2x10¹⁴Tu/ml。

噬菌体展示文库选择第3 轮

将来自第二轮的来自文库A和B的选择的产出在PBS中稀释至5x10¹¹Tu/ml，并将各100μl等分试样用于第三轮的选择。尽管使用相同的方案，但是将选择条件修改为如表4中概述的。

表4：第3轮选择投入、条件和回收。投入指的是第2轮使用的选择条件参考。选择条件包括不存在配体时本底结合的阴性对照。对于所有选择，投入为5x10¹⁰Tu噬菌体，在0.5ml的体积中回收并以Tu/ml表示结果

。

扩增来自第2轮和第3轮的噬菌体产出并随后纯化并浓缩至1x10¹³Tu/ml。培养用来自选择产出的噬菌体感染的细菌培养物(100 ml)并使用Qiagen Midi DNA纯化柱(Qiagen)用于回收双链噬菌体DNA。

使用Taq聚合酶以及引物CE2和CE3，从各自的噬菌体制备物等分试样扩增来自第2轮文库A和B的选择1、以及第3轮文库A选择2、5、9、12、13和文库B选择1、2、5、8、9、12和13的dAb插入序列。用凝胶纯化扩增产物，用Sa1 I和Not I限制酶切割，然后克隆至pDOM13载体中用于测序和表达。

选择结果分析：

对使用上述噬菌体在第3轮后从文库B选择的的DOM1h-574变体的DNA序列合并物的分析揭示，不同的选择压力优先富集不同组的突变，如在表5中概述。所观察的某些突变也在用作选择起始点的dAb中存在，即30V和62A在DOM1h-574-180中存在，30V在DOM1h-574-109中存在和100A在DOM1h-574-138中存在。

表5：概述表明，对于各选择条件所发现的最频繁的位置和变化。“+”的数量是该氨基酸残基相对频率的指示。根据Kabat编号

。

实施例3 ：所选择的dAb 的表征

使用来自DNA序列分析的信息，选择抗-TNFR1 dAb亚群，在表6中概述，其组合了如在图1中所示的不同的突变。对于进一步的表征，在大肠杆菌中表达这些dAb，使用分批结合Protein-A Streamline从上清液中纯化并将缓冲液更换为PBS。为了促进筛查过程，加速稳定性测试相比较早所述的方法稍做修改。

对于加速稳定性测试，在热循环仪中孵育的PCR板中进行反应所需的时间：

d) 将100μl 的1mg/ml PBS中的dAb分配至PCR板的孔中。

e) 在40℃或50℃孵育蛋白40小时。

f) 移除50μl的等分试样，并在微量培养板读数器(Molecular Devices)中测量OD₃₂₀，并在测量后返还至反应器中。较高的读数表示聚集形成。使用OD₃₂₀的测量，因为其最适合于确定沉淀和聚集，而OD₂₈₀最好用于确定溶液中蛋白浓度。

该筛查的结果在表6中概述。该分析强调，当在40℃测量时许多dAb在加速稳定性方面相比于DOM1h-574-156具有显著增加。尽管起始克隆(DOM1h-574-156)在40℃ 40小时后320nm处提供1.08的吸光度(表明显著量的蛋白已沉淀)，但是许多新dAb具有低的读数(<0.5)，表明大部分蛋白还在溶液中。在40℃ 40小时后，对DOM1h-574-188、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206和DOM1h-574-208观察到最显著的加速稳定性增加。

表6：针对加速稳定性测试的新dAb。对于各dAb，用其所来自的文库和用于鉴定该dAb的选择条件表示。通过在40℃或50℃，在PCR板中孵育40小时，测试纯化的dAb (1mg/ml)的加速稳定性。孵育后，对于各dAb，测定OD₃₂₀，确定各孔中沉淀水平。数值越低，dAb越稳定

。

在Tris-甘氨酸缓冲液中测试DOM1h-574-207，并且它比DOM1h-574-156更稳定。

实施例4 ：稳定抗-TNFR1 dAb 是功能活性的

为了证实加速稳定性的增加，根据实施例1中所述的更广泛的方案，还表征了四种新dAb。在本方案中，在40℃孵育dAb多达48小时，离心并使用OD₂₈₀定量溶液中剩余的dAb。所测试的dAb是DOM1h-574-188、DOM1h-574-196、DOM1h-574-208和DOM1h-574-214，并且结果在表7中概述。明显地，这些dAb相比于起始dAb DOM1h-574-156(历史数据)，明显更稳定，因为在40℃，在第一个48小时期间，没有观察到蛋白损失。为了证实稳定性的增加不是以dAb的功能性抗-TNFR1活性为代价，使用俘获在BIAcore SA芯片上的生物素化TNFR1，通过BIAcore测定dAb与TNFR1的结合亲和力。虽然这些新dAb对人TNFR1的亲和力比之前所述的DOM1h-574-156 dAb的亲和力(150pM)稍低，但是它仍在原始dAb的4倍内。因此，这些dAb同时具有加速稳定性的增加，而不对dAb对TNFR1的亲和力损害太多。

表7：新抗-TNFR1 dAb的加速稳定性和对人sTNFR1的亲和力。在PBS中，在40℃，以1mg/ml孵育纯化的dAb所示的时间量。在那个时间后，通过OD280测定确定溶液中剩余蛋白的百分比。对sTNFR1的亲和力是使用包被的sTNFR1并注射所述的dAb，由BIAcore所测定。

实施例5 ：构建稳定抗-TNFR1 dAb 和AlbudAb 的遗传融合

为了延长抗-TNFR1 dAb的血清半寿期，将它们与白蛋白结合dAb DOM7h-11-3融合。所选择的四种稳定抗-TNFR1 dAb是DOM1h-574-188、DOM1h-574-196、DoM1h-574-208和DOM1h-574-214，并使用Ala-Ser-Thr接头序列与DOM7h-11-3融合。这些融合分子的构建分两步完成。首先，使用引物AS9和OA154通过PCR扩增抗-TNFR1 dAb，然后用Sa1I/NheI消化纯化的反应产物，凝胶纯化并连接到包含接头和DOM7h-11-3的Sa1I/NheI消化的pDOM13载体中。连接后，将DNA转化到XL10-Gold (Stratagene)细胞中并挑选集落用于序列分析。在确定该构建体的序列后，通过使用寡核苷酸JAL102和AS65，扩增抗-TNFR1/抗-白蛋白盒，进行第二步的构建。用限制酶Nde I/Not I消化反应产物，并在琼脂糖凝胶上运行，并通过凝胶提取纯化。接着将包含融合产物的纯化DNA片段克隆到Nde I/Not I切割的PET30a载体(Merck)中。在该载体中进行的克隆能使在发酵罐中使用IPTG诱导蛋白表达，并将导致被加工的dAb不具有任何前导氨基酸残基。这与pDOM13载体(其将在该载体中表达的所有dAb的N末端上添加Ser-Thr)形成对比。下述抗-TNFR1 dAb/DOM7h-11-3融合在pET30a中构建：

克隆名称	抗-TNFR1 dAb	接头	抗-白蛋白dAb
				DMS5535	DOM1h-574-196	Ala-Ser-Thr	DOM7h-11-3
DMS5541	DOM1h-574-208	Ala-Ser-Thr	DOM7h-11-3
				DMS5542	DOM1h-574-214	Ala-Ser-Thr	DOM7h-11-3
DMS5544	DOM1h-574-188	Ala-Ser-Thr	DOM7h-11-3

将构建体转化到带pECO-1pg1的大肠杆菌株BL21(DE3) (如Aon等2008所述)中用于表达。然后将所有四种构建体使用23℃诱导后培养在发酵罐中表达，并用0.01mM IPTG诱导表达。以5L规模，所有发酵在基本培养基中至高细胞密度。

以下述方法制备周质提取物。解冻冷冻的细胞糊(cell paste)，与0.5M GuHcl、200mM Tris pH8、10mM EDTA在37℃混合过夜，然后以4500g离心1小时并丢弃沉淀。通过分批结合蛋白A，随后用100mM甘氨酸pH2洗脱和用200mM Tris pH8中和，从周质中纯化。将洗脱的蛋白缓冲液更换为PBS并在功能表征前浓缩。

实施例6 ：抗-TNFR1/ 抗- 白蛋白融合的表征

接着在一系列测试中表征DMS5535、DMS5541、DMS5542和DMS5544的纯化蛋白，以证明这些分子是稳定的并有好的抗-TNFR1活性。

加速稳定性表征

为了评价分子的生物物理性质，测试了融合蛋白的加速稳定性。因为预期分子是明显更稳定的，所以以1mg/ml在PBS中40℃进行加速稳定性测试28天，而不是2天。结果在表8中概述。从结果可推断出，所有的构建体是非常稳定的并且没有蛋白损失，如28天后通过OD280所确定。所观察到的蛋白的轻微增加最可能由于该检测方法内的误差并且该轻微增加是不显著的。

表8：遗传抗-TNFR1/抗-白蛋白融合的加速稳定性和功能表征的总结。加速稳定性量化为40℃ 28天后在溶液中融合蛋白的百分比，如通过OD280所确定。通过注射至少六种不同浓度的抗-TNFR1/AlbudAb^TM(AlbudAb是抗-血清白蛋白dAb)，测定BIAcore^TM亲和力(KD)。在两个独立的实验中进行该方法，平均这些实验的数值，产生提出的标准偏差(SD)。在HUVEC细胞测定中测定抗-TNFR1/Albudab融合的效能。从总计为7组关于抗-TNFR1/Albudab融合的实验计算平均EC50值。S.E=平均标准误差

。

抗-TNFR1/ 抗- 白蛋白蛋白的功能表征

为了保证分子的功能性抗-TNFR1活性不受损害，在功能性测定中测试四种抗-TNFR1/抗-白蛋白的遗传融合，以确定其对TNFR1的亲和力及其在抑制TNFα诱导的信号转导中的效能。

TNFR1 亲和力-BIAcore

通过BIAcore测定抗-TNFR1/AlbudAb融合对人TNFR1的亲和力。简言之，将抗-TNFR1分子注射到已固定生物素化人TNFR1的链霉亲和素Biocore芯片上。在不同浓度的注射抗-TNFR1下，测定缔合和解离。该表征的结果在图8中概述，并且表明，分子是人TNFR1的高亲和力结合剂(KD<280pM)。通过抗-TNFR1/AlbudAb融合的BIAcore所确定的对人TNFR1的亲和力比在各组合构建体中使用的单个抗-TNFR1 dAb所确定的对人TNFR1的亲和力稍高。

在HUVEC 细胞测定中的效能

确定dAb的抗-TNFR1活性的第二功能测定是HUVEC测定。简言之，在该测定中，将HUVEC和dAb预孵育1小时后，用1ng/ml的TNFα刺激。该刺激导致细胞上可被测定的VCAM表达增加。通过绘制dAb浓度针对VCAM表达的图，确定由dAb提供的TNFα诱导的VCAM表达的抑制水平。

结果在表8中概述，并且显示，抗-TNFR1/AlbudAb融合在该HUVEC测定中具有单数位nM效能。

总之，通过在苛刻的选择条件下进行突变体文库的噬菌体展示选择，我们已经能够鉴定新的抗-TNFR1 dAb。这些dAb将结合对TNFR1的高亲和力(通过BIAcore测定)和增加的加速稳定性。此外，当这些dAb与另一蛋白或肽融合时，维持结合性质，如通过DOM7h-11-3AlbudAb所例示，并进一步增加稳定性。这些dAb表现显著的改进，并且dAb的新性质应该改善这些dAb作为治疗剂的可开发性。

BIAcore 方案

通过BIAcore™分析评估与重组人TNFR1结合的结合亲和力。使用链霉亲和素(SA)包被的芯片(BIAcore，商品目录号BR-1000-32)进行分析。使用生物素化hTNFR1以低密度包被SA芯片。在其表面上按七种浓度(即32、16(两次)、8、4、2、1和0.5nM)以随机的次序，使用50μl/min的流速注射检测的分子。在各次注射之间，使用10mM 甘氨酸pH2.0将表面再生来返回至基线。使用二次参考，纠正数据的仪器假象。在BIAcore™ 3000机器上进行实验并使用BIAevaluation软件版本4.1分析数据，使用1:1 Langmuir结合模型，同时拟合K_on 和K_off 。对于拟合目的，浓度范围1-32nM用于单体，而0.5-16nM用于AlbudAb融合分子。对于所有测试的分子，结合数据与1:1模型拟合佳。从K_on 和K_off 速率计算所有的K_D值。在25℃进行BIAcore™运行。

HUVEC 细胞测定方案

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通过上调VCAM-1表达响应TNF-α处理。抗-TNFR1 dAb抑制TNF-α的作用，因此存在抗-TNFR1 dAb时可通过HUVE细胞观察到VCAM-1表达的减少。为了评估该抑制，简言之，将正常混合HUVEC细胞(Promocell # C- 12203)铺板出到明胶包被的96孔微量滴定板(VWR # 734-0403) (4x10⁴细胞/孔)的内皮细胞生长培养基(Promocell # C-22110)中。留下细胞贴壁过夜(37℃/5%CO₂)，然后将dAb剂量范围或仅培养基加入到细胞中，静置板在37℃/5%CO₂一小时。接着将固定浓度的TNF-α (1ng/ml, Peprotech # 300-01A)加入到已另外孵育23小时(37℃/5%CO₂)的细胞中。作为阴性对照，仅用培养基孵育细胞，而对于阳性对照，仅用TNF-α孵育细胞。

孵育后，吸出细胞培养上清液并将细胞在冰冷PBS中洗涤三遍。通过加入75μl/孔冰冷Tris-甘油裂解缓冲液(40mM Tris，274mM NaCl，2% Triton-X-100，20%甘油，50mM NaF，1mM Na₃VO₄，1x蛋白酶抑制剂片/10ml (Roche # 11-836-170-001))裂解细胞并在冰上孵育15分钟。然后将细胞裂解物转移到VCAM-1夹心ELISA。

对于VCAM-1夹心ELISA，用PBS中的抗-VCAM-1 mAb (R&D systems # MAB809，2μg/ml)以100ul/孔在4℃包被F96 Maxisorp免疫板(Nunc # 439454)过夜。第二天，洗涤各板并用1% BSA/PBS (200ul/孔)封闭1小时，然后加入HUVE细胞裂解物(50ul/孔)。板与裂解物孵育2小时并再次洗涤，然后以100ul/孔加入0.1% BSA/PBS、0.05% Tween-20中的0.4ug/ml生物素化抗-VCAM-1多克隆Ab (R&D systems # BAF809)，然后孵育又一个小时。再次洗涤板，然后以100ul/孔加入链霉亲和素-HRP (根据制造商的说明，在0.1% BSA/PBS，0.05% Tween-20中稀释)，。通过加入Sureblue TMB-1过氧化物酶底物(KPL-# 52-00-00)显现结合的链霉亲和素-HRP，并通过加入1M HCl终止反应。立即在SpectraMax M5^e板读数器(Molecular Devices)上读取450nm的吸光度。

将原始OD值导出到Microsoft Excel中并从所有数据点中减去背景OD值(仅用培养基孵育的细胞)。为了计算由细胞抑制的TNF-α诱导的VCAM-1上调，使用如下公式计算在各dAb的浓度下最大VCAM-1表达(如阳性对照所示)的百分比抑制：

最大VCAM-1上调的%抑制 = 100 – (特定dAb稀释下的OD值/阳性对照的OD值) *100。

然后在GraphPad Prism中绘制dAb浓度值针对百分比抑制的图，并使用具有可变斜率的S型剂量反应曲线确定浓度效应曲线和效能(EC₅₀)值。

用于刺激细胞的TNF-α的浓度大约为细胞对TNF-α的最大反应的70% (EC70)。

参考文献：

Aon JC, Caimi RJ, Taylor AH, Lu Q, Oluboyede F, Dally J, Kessler MD, Kerrigan JJ, Lewis TS, Wysocki LA, Patel PS. Suppressing posttranslational gluconoylation of heterologous proteins by metabolic engineering of Escherichia coli(通过大肠杆菌的代谢工程阻抑异源蛋白的翻译后gluconoylation). Appl Environ Microbiol. 2008年2月;74(4):950-8. Epub 2007年12月14日。

序列表

所有核苷酸序列以5’-3’书写，并且所有氨基酸序列以N-C末端书写。

DOM1h-131-206公开于WO2008149148 (在该PCT申请中公开的其氨基酸序列和核苷酸序列通过引用清楚地结合到本文中，好像明确地在本文书写并用于本发明，并预期这种公开的任何部分可结合到本文的一项或多项权利要求中)。

使用的寡核苷酸：

核苷酸序列：

氨基酸序列：

。

Claims

1. 一种抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，其包含与以下的氨基酸序列具有至少95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的氨基酸序列：DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214，其中所述单可变结构域在PBS中40℃孵育40小时后具有<1.0、<0.9、<0.8、<0.7、<0.6、<0.5或<0.4的OD₃₂₀。

2. 一种多特异性配体，其包含权利要求1的免疫球蛋白单可变结构域，并任选包含至少一种与血清白蛋白(SA)特异性结合的免疫球蛋白单可变结构域。

3. 权利要求2的多特异性配体，其中所述配体包含：(i)权利要求1的抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域，(ii)至少一种与SA特异性结合的抗-血清白蛋白(SA)免疫球蛋白单可变结构域，其中所述抗-SA单可变结构域包含与DOM7h-11-3的序列具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的氨基酸序列，和(iii)任选其中在抗-TNFR1单可变结构域和抗-SA单可变结构域之间提供接头。

4. 权利要求3的配体，其中所述接头包含氨基酸序列AST(任选是ASTSGPS)，或者其中所述接头是AS(G₄S)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8，例如AS(G₄S)₃。

5. 一种TNFR1拮抗剂，其包含任何前述权利要求的单可变结构域或多特异性配体。

6. 权利要求5的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于口服递送、递送至患者的GI道、肺部递送、递送至患者的肺或全身递送。

7. 权利要求5或6的TNFα 1型受体(TNFR1；p55)拮抗剂，其用于治疗和/或预防炎性病况。

8. 权利要求5或6的TNFR1拮抗剂在制备用于治疗和/或预防炎性病况的药物中的用途。

9. 一种治疗和/或预防患者的炎性病况的方法，所述方法包括将权利要求5或6的拮抗剂给予患者。

10. 一种多特异性配体，其包含或由DMS5535、DMS5541、DMS5542或DMS5544组成。

11. 一种核酸，其包含与DMS5535、DMS5541、DMS5542或DMS5544的核苷酸序列具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)的核苷酸序列。

12. 一种核酸，其包含编码权利要求1的抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列。

13. 一种包含编码权利要求1的抗-TNFα 1型受体(TNFR1；p55)免疫球蛋白单可变结构域的核苷酸序列的核酸，其中所述核苷酸序列与以下的核苷酸序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性(或100%同一性)：DOM1h-574-188、DOM1h-574-189、DOM1h-574-190、DOM1h-574-191、DOM1h-574-192、DOM1h-574-193、DOM1h-574-194、DOM1h-574-195、DOM1h-574-196、DOM1h-574-201、DOM1h-574-202、DOM1h-574-203、DOM1h-574-204、DOM1h-574-205、DOM1h-574-206、DOM1h-574-207、DOM1h-574-208、DOM1h-574-209、DOM1h-574-211、DOM1h-574-212、DOM1h-574-213或DOM1h-574-214。

14. 一种载体，其包含权利要求11、12或13的核酸。

15. 一种宿主细胞(任选是非-人胚细胞)，其包含权利要求14的载体。