MX2012005024A

MX2012005024A - Polipeptidos anti-tnfr1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas.

Info

Publication number: MX2012005024A
Application number: MX2012005024A
Authority: MX
Inventors: Armin Sepp; Adriaan Allart Stoop; Inusha De Silva
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2012-09-07
Also published as: ES2552177T3; CL2012001055A1; WO2011051217A1; ZA201203052B; JP2013507978A; AU2010311640A1; AU2010311640B2; CR20120197A; PE20121564A1; TW201125877A; UY32969A; IL218860A0; AR078763A1; CO6612254A2; EP2493504B1; EA201290172A1; US20150210767A1; EP2493504A1; NZ599114A; PH12012500826A1

Abstract

La invención se refiere a dominios variables sencillos de anticuerpo anti-TNFR1 (dAb) estables en almacenamiento, antagonistas y ligandos multiespecíficos, así como a procedimientos y usos de los mismos. Los polipéptidos, dominios variables sencillos de anticuerpo (dAb), antagonistas y ligandos multiespecíficos antiTNFR1 son útiles para tratar y/o prevenir una enfermedad inflamatoria, tal como artritis o EPOC, así como para administración pulmonar, administración oral, liberación en los pulmones y liberación en el tracto GI de un paciente.

Description

POLIPÉPTIDOS ANTI-TNFR1 ESTABLES, DOMINIOS VARIABLES DE ANTICUERPOS Y ANTAGONISTAS La presente invención se refiere a polipéptidos anti-tactor de necrosis tumoral 1 (TNFR1, p55, CD120a, P60, miembro 1A de la superfamilia de los receptores del TNF, TNFRSF1A), dominios variables sencillos de inmunoglobulina (anticuerpo) y antagonistas que los comprenden. La invención se refiere además a procedimientos, usos, formulaciones, composiciones y dispositivos que comprenden o usan dichos ligandos anti-TNFR1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN TNFR1 El TNFR1 es un receptor transmembrana que contiene una región extracelular que se une al ligando y un dominio intracelular que carece de la actividad de transduccion de señal intrínseca, pero que se puede asociar con las moléculas de transduccion de señal. El complejo del TNFR1 con TNF unido contiene tres cadenas de TNFR1 y tres cadenas de TNF. (Banner y colaboradores, Cell, 73(3) 431-445 (1993).) El ligando TNF está presente como un fragmento, que está unido por tres cadenas de TNFR1. (Id.) Las tres cadenas de TNFR1 están agrupadas próximas en el complejo receptor-ligando y este agrupamiento es un requisito previo para la transduccion de señal mediada por el TNFR1. De hecho, los agentes multivalentes que se unen al TNFR1, tales como los anticuerpos anti-TNFR1, pueden inducir agrupación de TNFR1 y transduccion de la señal en ausencia de TNF y normalmente se usan como agonistas del TNFR1. (Véase, por ejemplo, Belka y colaboradores, EMBO, 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak y colaboradores, J. Immunol, 767:1920-1928 (2001).) De acuerdo lo anterior, los agentes multivalentes que se unen al TNFR1 no suelen, en general, ser antagonistas eficaces del TNFR1 incluso si bloquean la unión de TNFa a TNFR1.

Los números de SEQ ID en este párrafo se refieren a la numeración usada en el documento WO2006038027. La región extracelular del TNFR1 comprende un segmento amino-terminal de trece aminoácidos (aminoácidos 1-13 de la SEQ ID NO: 603 (humana); aminoácidos 1-13 de la SEQ ID NO: 604 (de ratón)), el dominio 1 (aminoácidos 14-53 de la SEQ ID NO: 603 (humana); aminoácidos 14-53 de la SEQ ID NO: 604 (de ratón), el dominio 2 (aminoácidos 54-97 de la SEQ ID NO: 603 (humana); aminoácidos 54-97 de la SEQ ID NO: 604 (de ratón)), el dominio 3 (aminoácidos 98-138 de la SEQ ID NO: 603 (humana); aminoácidos 98-138 de la SEQ ID NO: 604 (de ratón)), y el dominio 4 (aminoácidos 139-167 de la SEQ ID NO: 603 (humana); aminoácidos 139-167 de la SEQ ID NO: 604 (de ratón)), seguido de una región proximal a la membrana (aminoácidos 168-182 de la SEQ ID NO: 603 (humana); aminoácidos 168-183 de la SEQ ID NO: 604 (ratón)). (Véase, Banner y colaboradores, Cell 73(3) 431-445 (1993) y Loetscher y colaboradores, Cell 61(2) 351-359 (1990).) Los dominios 2 y 3 entran en contacto con el ligando unido (TNFB, TNFa). (Banner y colaboradores, Cell, 73(3) 431-445 (1993).) La región extracelular del TNFR1 también contiene una región denominada dominio de ensamblaje de unión pre-ligando o dominio PLAD (aminoácidos 1-53 de la SEC IND N° 603 (humana); aminoácidos 1-53 de la SEQ ID NO: 604 (de ratón)) (Gobierno de EE.UU., documento WO 01/58953; Deng y colaboradores, Nature Medicine, doi: 10.1038/nm 1304 (2005)).

El TNFR1 se desprende de la superficie de las células in vivo a través de un proceso que incluye la proteólisis del TNFR1 en el dominio 4 o en la región proximal en la membrana (aminoácidos 168-182 de la SEQ ID NO: 603; aminoácidos 168-183 de la SEQ ID NO: 604) para producir una forma soluble del TNFR1. El TNFR1 soluble conserva la capacidad para unir TNFa y, de este modo, funciona como inhibidor endógeno de la actividad del TNFa.

El documento WO2006038027, el documento WO2008149144 y el documento WO2008149148 divulgan dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-TNFR1 y antagonistas que los comprenden. Estos documentos también divulgan el uso de dichos dominios y antagonistas para el tratamiento y/o prevención de afecciones mediadas por el TNFa. Sería deseable proporcionar dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-TNFR1 humano con mejor estabilidad al almacenamiento, antagonistas, ligandos y productos que los comprenden. El objetivo de estos sería proporcionar mejores reactivos diagnósticos para detectar TNFR1 humano en las muestras, así como, o como alternativa, proporcionar mejores terapéuticas para el tratamiento y/o la profilaxis de afecciones y enfermedades mediadas por TNFR1 en seres humanos u otros mamíferos. Sería particularmente deseable proporcionar dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-TNFR1, antagonistas, ligandos y productos que los comprenden que sean potentes neutralizantes del TNFR1, especialmente del TNFR1 humano.

Los diversos aspectos de la presente invención cumplen estas deseables características.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% (o 100%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM 1 h-574- 190, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM 1 h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM1h-574-205, DOM 1 h-574-206, DOM 1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM1 h-574-2 1 , DOM1h-574-212, DOM1 h-574-213 o DOM1 h-574-214, en los que el dominio variable sencillo tiene una DO320 <1,0, <0,9, <0,8, <0,7, <0,6, <0,5, o <0,4 tras la incubación en PBS a 40°C durante 40 horas. En una forma de realización, el dominio variable sencillo tiene una D032o <1,0, <0,9, <0,8, <0,7, <0,6, <0,5, o <0,4 determinada mediante la prueba siguiente a) 100 microlitros del dominio variable sencillo de 1 miligramo/mililitro en PBS (solución salina tamponada con fosfato) se dispensan sobre una placa para PCR; b) La placa se incuba durante 40 horas a 40°C; y c) Se extrae una alícuota de 50 microlitros y se mide la DO320 en, por ejemplo, un lector de microplacas (por ejemplo, uno de Molecular Devices).

En un aspecto, la invención proporciona un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1 ; p55) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% (o 100%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM1 h-574-188, DOM 1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM 1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM 1 h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 0 DOM1 h-574-214.

En un aspecto, la invención proporciona un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1 ; p55) que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM 1 h-574- 191 , DOM1h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM 1 h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1h-574-201 , DOM1 h-574-202, DOM 1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM 1 h-574-206, DOM1h-574- 207, DOM1 h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM1 h-574-213 y DO 1 h-574-214 o tiene 1 o 2 cambios de aminoácidos en comparación con dicha secuencia de aminoácidos seleccionada.

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55), en el que el dominio variable comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, un 95, 96, 97, 98 o 99% (o 100%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM1 h-574-188, DOM1h-574-189, DOM 1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM 1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM1 h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM 1 h-574-205 , DOM 1 h-574-206, DOM 1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-2095 DOM 1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214.

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55), en el que la secuencia de nucleotidos es, al menos, un 70, 75 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99%(o 100%) idéntica a la secuencia de nucleotidos de DOM1 h-574-188, DOM 1 h-574- 189 , DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM 1 h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM 1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201, DOM 1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM 1 h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM 1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM1 h-574-213 o DOM1 h-574-214.

En un aspecto, la invención se refiere a un ligando multiespecífico que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención y, opcionalmente, al menos un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une de forma específica a la seroalbúmina (SA). En una forma de realización, el ligando multiespecífico es, o comprende, una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia de aminoácidos de cualquier constructo denominado "DMS" divulgado en la presente memoria descriptiva, por ejemplo uno cualquiera de DMS5535, 5541, 5542 y 5544. En una forma de realización, el ligando multiespecífico es, o comprende, una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de cualquier DMS divulgado en la presente memoria descriptiva, por ejemplo una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de DMS5535, 5541, 5542 y 5544. . En una forma de realización, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica un ligando multiespecífico que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-TNFR1 y un dominio variable sencillo anti-SA, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de cualquier DMS divulgado en la presente memoria descriptiva, por ejemplo una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de DMS5535, 5541, 5542 y 5544. Se proporciona un vector que comprende dicho ácido nucleico, así como una célula huésped que comprende dicho vector.

En un aspecto, la invención proporciona un ligando multipespecífico que comprende (i) un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55), que comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, un 95, 96, 97, 98 o 99% (o 100%) idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM1h-574-188, DOM 1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1 h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202 , DOM1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-209, DOM1 h-574-211, DOM1h-574-212, DOM1 h-574-213 O DOM1 h-574-214., (ii) al menos un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-seroalbúmina (SA) que específicamente se une a la SA, en el que el dominio variable sencillo anti-SA comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, un 80 % idéntica a la secuencia de DOM7h-11-3, y (iii) opcionalmente, en el que se proporciona un ligador entre el dominio variable sencillo anti-TNFR1 y el dominio variable sencillo anti-SA.

En una forma de realización, el ligador comprende la secuencia de aminoácidos AST, opcionalmente ASTSGPS. Como alternativa, el ligador es AS(G4S)n, en el que n es 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8, por ejemplo AS(G4S)3 En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del TNFR1 que comprende un dominio variable sencillo, polipéptido o Mgandos multiespecíficos de cualquier aspecto precedente de la invención.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de tipo 1 de TNFa (TNFR1; p55) de la invención, para administración oral, liberación en el tracto Gl de un paciente, liberación pulmonar, liberación en los pulmones de un paciente o liberación sistémica.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista de TNFR1 de la invención, para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección inflamatoria.

En un aspecto, la invención proporciona el uso del antagonista de TNFR1 de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección inflamatoria.

Otro aspecto de la invención proporciona ligando multiespecífico que comprende o consta de DMS5535, DMS5541, DMS5542 o DMS5544. Un aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que codifica un ligando multiespecífico. Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es, al menos, un 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de DMS5535, DMS5541, DMS5542 o DMS5544. La invención además proporciona un vector que comprende el ácido nucleico, así como un huésped, opcionalmente una célula embrionaria no humana, que comprende el vector.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA Figura 1. Alineación de la secuencia de aminoácidos para dAb de selecciones de estabilidad y purificada para su caracterización. Las secuencias se alinean contra DOM1 h-574-156, un dAb representativo para las usadas como dAb de partida para las selecciones de estabilidad. Un "." en una posición concreta indica el mismo amino encontrado en DOM1 h-574-156 en dicha posición. Las CDR se indican mediante subrayado y texto en negrita (la primera secuencia subrayada es CDR1, la segunda secuencia subrayada es CDR2 y la tercera secuencia subrayada es CDR3).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta especificación la invención se ha descrito con referencia a las formas de realización, de un modo que permite redactar una especificación clara y concisa. Se pretende y debe apreciarse que las formas de realización pueden combinarse o separarse de forma variada sin desviarse de la invención.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que un experto en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácido nucleico, técnicas de hibridación y bioquímica) entiende habitualmente. Para los procedimientos moleculares, genéticos y bioquímicos se usan técnicas convencionales (véase, en general, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a Ed, John Wiley & Sons, Inc. - que se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia) y procedimientos químicos.

Los dominios variables sencillos de inmunoglobulína (dAb) descritos en la presente memoria descriptiva contienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3). Las localizaciones de las CDR son regiones estructurales (FR) y Kabat y col. han definido un sistema de numeración. (Kabat, E.A. y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)). Las secuencias de aminoácidos de las CDR (CDR 1 , CDR2, CDR3) de las VH Y VL (VK) de los dAb divulgados en la presente memoria descriptiva serán evidentes para el experto en la técnica sobre la base del bien conocido sistema de numeración de Kabat y la definición de las CDR. De acuerdo con el sistema de numeración de Kabat las CDR-H3 de la cadena pesada tienen longitudes variables, las inserciones se numeran entre el resto H100 y H101 con letras hasta la K (es decir, H100, H100A ... H100K, H101). Como alternativa, las CDR se pueden determinar usando el sistema de Chothia (Chothia y colaboradores, (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883), de acuerdo con AbM o de acuerdo con el procedimiento de Contacto siguiente. Véase http://www.bioinf.orq.uk/abs/ para procedimientos adecuados para determinar las CDR.

Una vez que se ha numerado cada resto, se pueden aplicar las definiciones de CDR siguientes ("-" significa los mismos números de restos que se muestran para Kabat).

Kabat - procedimiento más utilizado sobre la base de la variabilidad de la secuencia (usando la numeración de Kabat): CDR H1: 31-35/35A/35B CDR H2: 50-65 CDR H3: 95-102 CDR L1 : 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 Chothia - sobre la base de la localización de las regiones bucle estructurales (usando la numeración de Chothia): CDR H1: 26-32 CDR H2: 52-56 CDR H3: 95-102 CDR L1 : 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 AbM - compromiso entre Kabat y Chothia (usando la numeración de Kabat): (usando la numeración de Chothia): CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35 CDR H2: 50-58 CDR H3: 95-102 CDR L1 : 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 Contacto— basado en estructuras de cristal y predicción de residuos de contacto con antígeno (usando la numeración de Kabat): (usando la numeración de Chothia): CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35 CDR H2: 47-58 CDR H3: 93-101 CDR L1 : 30-36 CDR L2: 46-55 CDR L3: 89-96 Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión "antagonista del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1)" o "antagonista anti-TNFR1" o similar se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que se une al TNFR1 y puede inhibir una (es decir, una o más) función del TNFR1. Por ejemplo, un antagonista del TNFR1 puede inhibir la unión de TNFa a y/o TNFR1 inhibir la transducción de señal mediada por el TNFR1. De acuerdo con esto, los procesos mediados por el TNFR1 y las respuestas celulares (por ejemplo, la muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicldad L929 estándar) se pueden inhibir con un antagonista del TNFR1.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "péptido" se refiere a aproximadamente dos a aproximadamente 50 aminoácidos que se unen a través de enlaces peptídicos.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "polipéptido" se refiere a al menos aproximadamente 50 aminoácidos que se unen a través de enlaces peptídicos. En general, los polipéptidos comprenden estructura terciara y se pliegan en dominios funcionales.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, un péptido o polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo de dominio (dAb)) que es "resistente a la degradación por proteasas" no es considerablemente degradado por una proteasa cuando se incuba con la proteasa en condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa. Un polipéptido (por ejemplo,, un dAb) no es considerablemente degradado cuando no más de aproximadamente el 25%, no más de aproximadamente el 20%, no más de aproximadamente el 15%, no más de aproximadamente el 14%, no más de aproximadamente el 13%, no más de aproximadamente el 12%, no más de aproximadamente el 11%, no más de aproximadamente el 10%, no más de aproximadamente el 9%, no más de aproximadamente el 8%, no más de aproximadamente el 7%, no más de aproximadamente el 6%, no más de aproximadamente el 5%, no más de aproximadamente el 4%, no más de aproximadamente el 3%, no más de aproximadamente el 2%, no más de aproximadamente el 1%, o sustancialmente nada de la proteína es degradada por la proteasa tras la incubación con la proteasa durante aproximadamente una hora a una temperatura adecuada para la actividad de la proteasa, por ejemplo a 37 o 50 grados C. La degradación de la proteína se puede evaluar usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo mediante SDS-PAGE o mediante un ensayo funcional (por ejemplo,, unión a ligando) como se describe en la presente memoria descriptiva.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "sistema de expresión" se refiere a un sistema en el que un grupo de polipéptidos o péptidos son accesibles para selección sobre la base de una característica deseada, tal como una característica física, química o funcional. El sistema de expresión puede ser un repertorio adecuado de polipéptidos o péptidos (por ejemplo,, en una solución, inmovilizados en un soporte adecuado) El sistema de expresión también puede ser un sistema que emplea un sistema de expresión celular (por ejemplo,, la expresión de una biblioteca de ácidos nucleicos en, por ejemplo,, células transformadas, infectadas, transfeccionadas o transducidas y la expresión de los polipéptidos codificados sobre la superficie de las células) o un sistema de expresión acelular (por ejemplo,, compartimentalización de la emulsión y expresión). Ejemplos de sistemas de expresión vinculan la función de codificación de un ácidos nucleico y las características físicas, químicas y/o funcionales de un polipéptido o péptido codificado por el ácido nucleico. Cuando se emplea dicho sistema de expresión, se pueden seleccionar los polipéptidos o péptidos que tienen una característica física, química y/o funcional deseada y un ácido nucleico que codifica el polipéptido o péptido seleccionado puede aislarse o recuperarse con facilidad. En la técnica se conocen una serie de sistemas de expresión que vinculan la función de codificación de un ácido nucleico y las características físicas, químicas y/o funcionales de un polipéptido o péptido, por ejemplo expresión en bacteriófago (expresión en fago, por ejemplo expresión en fagémido), expresión en ribosoma, compartimentalización y expresión en emulsión, expresión en levaduras, expresión de puromicina, expresión bacteriana, expresión en plásmidos, expresión covalente y similares. (Véase, por ejemplo,, el documento EP 0436597 (Dyax). la patente de EE.UU. n° 6.172.197 (McCafferty y colaboradores), la patente de EE.UU. n° 6.489.103 (Griffiths y colaboradores).) Como se usa en la presente memoria descriptiva, "repertorio" se refiere a un conjunto de polipéptidos o péptidos que se caracterizan por una diversidad de secuencia de aminoácidos. Los miembros individuales de un repertorio pueden tener características comunes, tales como características estructurales comunes (por ejemplo,, una estructura central común) y/o características funcionales comunes (por ejemplo,, capacidad de unirse a un ligando común (por ejemplo,, un ligando genérico o un ligando diana, TNFR1)).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "funcional" describe un polipéptido o péptido que tiene actividad biológico, tal como la actividad de unión específica. Por ejemplo, el término "polipéptido funcional" incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un antígeno diana a través de su sitio de unión a antígeno.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ligando genérico" se refiere a un ligando que se une a una porción sustancial (por ejemplo,, sustancialmente todo) de los miembros funcionales de un repertorio dado. Un ligando genérico (por ejemplo,, un ligando genérico común) puede unirse a muchos miembros de un repertorio dado aunque los miembros puedan no tener la especificidad para un ligando diana común. En general, la presencia de un sitio de unión a ligando genérico funcional en un polipéptido (como indica la capacidad de unirse a un ligando genérico) indica que el polipéptido está correctamente plegado y es funcional. Ejemplos adecuados de ligandos genéricos incluyen superantígenos, anticuerpos que se unen a un epítopo expresado sobre una porción sustancial de miembros funcionales de un repertorio y similares.

"Superantígeno" es un término de la técnica que se refiere a ligandos genéricos que interaccionan con miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas en un punto que es distinto de los sitios de unión al ligando de estas proteínas. Las enterotoxinas estafilocócicas son ejemplos de superantígenos que interaccionan con los receptores de las células T. Los superantígenos que se unen a anticuerpos incluyen la proteína G, que se une a la región constante de la IgG (Bjorck y Kronvall, J. Immunol., 133:969 (1984)); la proteína A que se une a la región constante de la IgG y a los dominios VH (Forsgren y Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)); y la proteína L que se une a los dominios VL (Bjorck, J. Immunol., 740:1194 (1988)).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "ligando diana" se refiere a un ligando que se une de forma específica o selectiva a un polipéptido o péptido. Por ejemplo, cuando un polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo de unión al antígeno, el ligando diana puede ser cualquier antígeno o epítopo deseado. La unión al antígeno diana depende del polipéptido o péptido que es funcional.

Como se usa en la presente memoria descriptiva un anticuerpo se refiere a IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o un fragmento (tales como Fab, F(ab')2, Fv, Fv unida por disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv unida por disulfuro, diacuerpo) derivado de cualquier especie natural que produce un anticuerpo o creado por tecnología de ADN recombinante; aislado de suero, de células B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "formato de anticuerpo", "formateado" o similar se refiere a cualquier estructura polipeptídica en la que se pueden incorporar uno o más dominios variables del anticuerpo de modo que se confiere especificidad de unión para el antígeno sobre la estructura. En la técnica se conocen varios formatos de anticuerpos adecuados, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de las cadenas pesadas y/o las cadenas ligeras del anticuerpo de cualquiera de los anteriores (por ejemplo,, un fragmento Fv (por ejemplo,, Fv de cadena sencilla(scFv) , un Fv unido por disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 , un dominio variable de anticuerpo sencillo (por ejemplo,, un dAb, VH, VHH, VL), y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo,, modificados por la unió covalente de polieti lenglicol u otro polímero adecuado o una VHH humanizada.

La frase "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" se refiere a un dominio variable del anticuerpo (VH, VHH, VL) que se une específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios V. Un dominio variable sencillo de la inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo o heteromultímero) con otras regiones variables o dominios variables en los que las otras regiones o dominios no son necesarias para la unión al antígeno a través del dominio variable sencillo de la inmunoglobulina (es decir, en el que el dominio variable sencillo de la inmunoglobulina se une al antígeno de forma independiente de los dominios variables adicionales). Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es lo mismo que un "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" tal como el término se usa en la presente memoria descriptiva. Un "dominio variable sencillo la inmunoglobulina " es lo mismo que un "dominio variable sencillo de inmunoglobulina" tal como el término se usa en la presente memoria descriptiva. Un "dominio variable de anticuerpo sencillo" o un "dominio variable sencillo de anticuerpo" es lo mismo que un "dominio variable sencillo de anticuerpo" tal como el término se usa en la presente memoria descriptiva. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina es, en una forma de realización, un dominio variable de anticuerpo humano, pero también incluye dominios variables sencillos de anticuerpo de otras especies, como de dAc VHH de roedores (por ejemplo, tal como se divulga en el documento WO 00/29004), cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad), dAb VHH de tiburón nodriza y de camélidos. El VHM de camélidos son polipéptidos en el dominio variable sencillo de inmunoglobulina que derivan de especies, entre las que se incluyen camellos, llamas, alpacas, dromedarios y guanacos, que producen anticuerpos de cadena pesada desprovistos de forma natural de las cadenas ligeras. La VHH puede ser humanizada.

Un "dominio" es una estructura proteica plegada que tiene una estructura terciaria independiente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las discretas propiedades funcionales de las proteínas y, en muchos casos, se pueden añadir, eliminar o transferir a otras proteínas sin que se pierda la función del resto de la proteína y/o del dominio. Un "dominio variable sencillo de anticuerpo" es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de los dominios variables del anticuerpo. Por tanto, incluye dominios variables completos del anticuerpo y dominios variables modificados en los que, por ejemplo, uno o más bucles han sido reemplazados por secuencias que no son características de los dominios variables del anticuerpo, o dominios variables del anticuerpo que se han truncado o que comprenden extensiones en los extremos N o C, así como fragmentos plegados de los dominios variables que retienen al menos la actividad de unión y la especificidad del dominio de longitud completa.

El término "biblioteca" se refiere a una mezcla de polipéptidos o ácidos nucleicos heterogéneos. La biblioteca está compuesta por miembros, cada uno de los cuales tiene una secuencia única de polipéptido o de ácido nucleico. Hasta este punto, "biblioteca" es sinónimo de "repertorio". Las diferencias de secuencia entre los miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La biblioteca puede tomar la forma de una mezcla sencilla de polipéptidos o ácidos nucleicos o puede estar en forma de organismos o células, por ejemplo bacterias, virus, células animales o vegetales y similares, transformados con una biblioteca de ácidos nucleicos. En una forma de realización, cada organismo o célula individual sólo contiene uno o una serie limitada de miembros de la biblioteca. En una forma de realización, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión con el fin de permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. Por tanto, en un aspecto, una biblioteca puede tomar la forma de una población de organismos huésped, en la que cada organismo contiene una o más copias de un vector de expresión que contiene un único miembro de la biblioteca en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su miembro polipeptídico correspondiente. Por tanto, la población de organismos huésped tiene el potencial de codificar un gran repertorio de diversos polipéptidos.

Una "estructura universal" es una única secuencia estructural de anticuerpo correspondiente a las regiones de un anticuerpo de secuencia conservada tal como define Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services) o correspondiente al repertorio o estructura de inmunoglobulinas de la línea germinal humana definida por Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917. Las bibliotecas y repertorios pueden usar una estructura única, o un grupo de dichas estructuras, lo cual se ha encontrado que permite la obtención prácticamente de cualquier especificidad de unión mediante la variación en las regiones hipervariables solas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "dosis" se refiere a la cantidad de ligando administrada a un sujeto de une ve (monodosis) o en dos o más administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, dosis se puede referir a la cantidad de ligando (por ejemplo,, ligando que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une al antígeno diana) administrada a un sujeto durante el transcurso de un día (24 horas) (dosis diaria), dos días, una semana, dos semanas, tres semanas o uno o más meses (por ejemplo,, mediante una única administración o mediando dos o más administraciones). El intervalo entre dosis puede ser cualquier cantidad de tiempo deseada.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "tamaño hidrodinámico" se refiere al tamaño evidente de una molécula (por ejemplo,, una molécula proteica, un ligando) sobre la base de la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión o movimiento de una proteína a través de la solución se puede procesar para deducir un tamaño evidente de la proteína, en el que el tamaño viene dado por el "radio de Stokes" o el "radio hidrodinámico" de la partícula proteica. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende de la masa y de la forma (conformación) de modo que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden temer diferentes tamaños hidrodinámicos sobre la base de la conformación global de la proteína.

Como se hace referencia en la presente memoria descriptiva, el término "compite" significa que la unión de una primera diana a su dominio de unión a la diana conocida se inhibe en presencia de un segundo dominio de unión que es específico de la diana conocida. Por ejemplo, la unión puede inhibirse estéricamente, por ejemplo mediante bloqueo físico de un dominio de unión o mediante alteración de la estructura o ambiente de un dominio de unión de modo que se reduce su afinidad o avidez por una diana. Véase el documento WO2006038027 para los detalles de cómo realizar un ELISA competitivo y experimentos de competición BiaCore para determinar la competición entre los dominios de unión primero y segundo.

Los cálculos de "homología" o "identidad" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se usan de forma intercambiable en la presente memoria descriptiva) se realizan del siguiente modo. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos primero y segundo para la alineación óptima y las secuencias no homologas se pueden descartar para fines comparativos). En una forma de realización, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines comparativos es de al menos 30%, o de al menos 40%, o de al menos 50%, o de al menos 60%, o de al menos 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Después se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en dicha posición (como se usa en la presente memoria descriptiva, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se han de introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. Alineaciones de la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos, y la homología, similitud o identidad, tal como se define en la presente memoria descriptiva se pueden preparar y determinar en una forma de realización usando el algoritmo BLAST 2 Sequences, con parámetros por defecto (Tatusova, T. A. y col., FEMS Microbiol Lett, 774:187-188 (1999)).

En una forma de realización de cualquier aspecto de la invención, la variable sencilla anti-TNFR1, antagonista, ligando o polipéptido neutraliza el TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 humano) con una ND50 de (o de aproximadamente) 5, 4, 3, 2 o 1 nM o menor en un ensayo MRC5 estándar, determinado mediante la inhibición de la secreción de IL-8 inducida por TNF alfa.

En una forma de realización de cualquier aspecto de la invención, la variable sencilla anti-TNFR1, antagonista, ligando o polipéptido neutraliza el TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 murino) con una ND50 de 150, 100, 50, 40, 30 o 20 nM o menor; o de (aproximadamente) 150 a 10 nM; o de (aproximadamente) 150 a 20 nM; o de (aproximadamente) 110 a 10 mM; o de (aproximadamente) 110 a 20 mM en un ensayo L929 estándar, determinado mediante la inhibición de la citotoxicidad inducida por TNF alfa.

En una forma de realización de cualquier aspecto de la invención, la variable sencilla anti-TNFR1, antagonista, ligando o polipéptido neutraliza el TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 de mono Cynomologus) con una ND50 de 5, 4, 3, 2 o 1 nM o menor; o de (aproximadamente) nM en un ensayo Cynomologus Kl MRC5 estándar, determinado mediante la inhibición de la secreción de IL-8 inducida por TNF alfa.

En una forma de realización de cualquier aspecto de la invención, el dominio variable sencillo comprende un resto terminal de cisteína, opcionalmente C-terminal. Por ejemplo, el resto de cisterna se puede usar para unir PEG al dominio variable, por ejemplo, usando un enlace maleimida (véase, por ejemplo, el documento WO04081026). En una forma de realización de cualquier aspecto de la invención, el dominio variable sencillo está unido a un resto de polialquilenglicol, opcionalmente un resto de polietilenglicol. Véase, por ejemplo, el documento WO04081026, para restos de PEG adecuados y procedimientos y pruebas de conjugación. Estas divulgaciones se incorporan en la presente memoria descriptiva para proporcionar divulgación de, por ejemplo, PEG específicos para incluir en las reivindicaciones más adelante.

En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención y a un grupo efector o un dominio constante de anticuerpo, opcionalmente una región Fe de anticuerpo, en la que, opcionalmente, el extremo N de la Fe está unido (opcionalmente directamente unido) al extremo C del dominio variable. Cualquier "grupo efector", tal como se describe en el documento in WO04058820, se puede usar en este aspecto de la presente invención y la descripción de los grupos efectores en el documento in WO04058820 y procedimientos de unirlos a dominios variables divulgados en dicha publicación se incorporan explícitamente en la presente memoria descriptiva por referencia para proporcionar descripción en la presente memoria descriptiva que se pueda usar en, por ejemplo, las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva.

En un aspecto, la invención se refiere a un ligando multiespecíf ico que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la presente invención y, opcionalmente, al menos un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une de forma específica a la seroalbúmina (SA). En una forma de realización, el ligando multiespecífico se une a TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 humano) con una KD que es al menos dos veces menor que la KD del monómero del TNFR1. Adicional o alternativamente, en una forma de realización, el ligando multiespecífico tiene una semivida que es al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50 ó 100 veces la del monómero. Adicional o alternativamente, en una forma de realización, el ligando multiespecífico tiene una semivida terminal de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 días en el hombre (por ejemplo, tal como se determina empíricamente en voluntarios sanos o como se calcula usando técnicas convencionales familiares para el experto mediante extrapolación de la semivida del ligando en un sistema animal tal como ratón, perro y/o primate no humano (por ejemplo, mono Cynomolgus, babuino , mono rhesus)), por ejemplo cuando el dominio anti-SA tiene reacción cruzada entre la SA humana y la SA del animal.

En una forma de realización de los ligandos multiespecíficos de la invención, el ligando es un antagonista de TNFR1 (POR EJEMPLO, TNFR1), opcionalmente de la señalización mediada por TNFR1.

En una forma de realización, la presente invención proporciona el dominio variable, el ligando multiespecífico o antagonista de acuerdo con la invención tiene una semivida tB en el intervalo de (o de aproximadamente) 2,5 horas o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es (o es de aproximadamente) 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas , 11 horas o 12 horas. Además o como alternativa, la semivida tB es (o es de aproximadamente) hasta 21 o 25 días, y ambos incluidos. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es (o es de aproximadamente) 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 19 días 20 días, 21 días o 22 días. Por ejemplo, el dominio variable o antagonista de acuerdo con la invención tendrá una semivida tB en el intervalo de 12 a 60 horas (o de aproximadamente 12 a 60 horas). En otra forma de realización, estará en el intervalo de 12 a 48 horas (o de aproximadamente 12 a 48 horas). En otra forma de realización más, estará en el intervalo de 12 a 26 horas (o de aproximadamente 12 a 26 horas).

Como alternativa al uso de modelización de dos compartimentos, el experto estará familiarizado con el uso de modelización no compartimental, que se puede usar para determinar las semividas terminales (a este respecto, el término "semivida terminal" como se usa en la presente memoria descriptiva significa una semivida terminal determinada mediante el uso de modelización no compartimental). Se puede usar el paquete de análisis WinNonlin, por ejemplo, versión 5.1 (disponible Pharsight Corp., ountain View, CA94040, USA) por ejemplo, para modelar la curva de este modo.

En este caso, en una forma de realización, el dominio variable sencillo, ligando multiespecífico o antagonista tiene una semivida terminal de al menos (o de al menos aproximadamente) 8 horas, 10 horas, 12 horas, 15 horas, 28 horas, 20 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días, 22 días, 23 días, 24 días o 25 días. En una forma de realización, el extremo superior de este intervalo es (o es de aproximadamente) 24 horas, 48 horas, 60 horas o 72 horas o 120 horas. Por ejemplo, la semivida terminal es (o es de aproximadamente) 8 horas a 60 horas, o de 8 horas a 48 horas o de 12 a 120 horas, por ejemplo, en el hombre.

Además de, o como alternativa a, los criterios anteriores, el dominio variable o antagonista de acuerdo con la invención tiene un valor de la AUC (área bajo la curva) en el intervalo de (o de aproximadamente) 1 mg.min/ml o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es (o es de aproximadamente) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg.min/ml. Además, o como alternativa a, el dominio variable, ligando multiespecífico o antagonista de acuerdo con la invención tiene un valor de la AUC en el intervalo de (o de aproximadamente) hasta 600 mg.min/ml. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es (o es de aproximadamente) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. De forma ventajosa, el dominio variable o antagonista tendrá una AUC en el intervalo de (o aproximadamente) seleccionado del grupo constituido por los siguientes: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml, y 15 a 50mg.min/ml.

Una o más de las semividas t alfa, t beta y terminales, así como las AUC citadas en la presente memoria descriptiva se pueden obtener en un ser humano y/o animal (por ejemplo, un ratón o un primate no humano, por ejemplo, un babuino, mono rhesus, mono Cynomolgus) proporcionando uno o más dominios variables sencillos anti-TNFR1 (u otros restos de unión definidos en la presente memoria descriptiva) unidos a un PEG o a un dominio variable sencillo (o resto de unión) que se une de forma específica a la seroalbúmina, por ejemplo seroalbúmina de ratón y/o humana. El tamaño de PEG puede ser (o ser aproximadamente) de al menos 20 kDa, por ejemplo 30, 40, 50, 60, 70 u 80 kDa. En una forma de realización, el PEG es 40 kDa, por ejemplo, 2x20kDa PEG En una forma de realización, para obtener semividas t alfa, t beta y terminales, o una AUC citadas en la presente memoria descriptiva, se proporciona un antagonista que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-TNFR1 unido a un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-SA. En una forma de realización, el PEG es 40 kDa, por ejemplo, 2x20kDa PEG Por ejemplo, el antagonista comprende sólo uno de estos dominios variables anti-TNFE1, por ejemplo uno de esos dominios unidos a sólo un dominio variable anti-SA. En una forma de realización, para obtener semividas t alfa, t beta y terminales, o una AUC citadas en la presente memoria descriptiva, se proporciona un antagonista que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti- TNFR1 unido a PEG, por ejemplo, 40-80 kDa PEG, por ejemplo, 40 kDa PEG. Por ejemplo, el antagonista comprende sólo uno de estos dominios variables anti-TNFE1, por ejemplo uno de esos dominios unidos a PEG de 40 kDa.

En una forma de realización del ligando multiespecífico de la invención, el ligando comprende un dominio variable sencillo anti-SA (por ejemplo, HSA) que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a, o al menos idéntica a, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99, la secuencia de DOM7h-11 , DOM7h-11 -3, DOM7h-11-12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 o DOM7m-16 (véanse los documentos WO04003019, WO2008096158 y las solicitudes de patente pendientes de tramitación USSN 61/163,987 y 61/163,990 presentadas el 27 de marzo de 2009, cuyas divulgaciones se incorporan en la presente memoria descriptiva, incluidas específicamente las secuencias de dAb anti-seroalbúmina) . Además, o como alternativa a, en una forma de realización, el ligando multiespecífico comprende un ligador proporcionado entre el dominio variables sencillo anti-TNFFM y el dominio variable sencillo anti-SA, en el que el ligador comprende la secuencia de aminoácidos AST, opcionalmente ASTSGPS. Como alternativa, el ligador es AS(G4S)n, en el que n es 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8, por ejemplo AS(G4S)3. Por ejemplo, el ligando comprende (de N-a C- terminal) DO 1h-574-16-AST-DOM7h-11 ; o DOM1 h-574-72-ASTSGPS-DOM7m-16; o DOM 1 h-574-72-ASTSGPS-DOM7h-11 -12.

En un aspecto, la invención proporciona un ligando multipespecífico que comprende (i) un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55), que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a, o al menos a, un 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% a la secuencia de aminoácidos de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1 h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM 1 h-574-201 , DOM1 h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM 1 h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1 h-574-211 , DOM 1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM1 h-574-214., (ii) al menos un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-seroalbúmina (SA) que específicamente se une a la SA, en el que el dominio variable sencillo anti-SA comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia de DOM7h-11-3, y (iii) opcionalmente, en el que se proporciona un ligador entre el dominio variable sencillo anti-TNFR1 y el dominio variable sencillo anti-SA, en el que el ligador comprende la secuencia de aminoácidos AST, opcionalmente ASTSGPS. Como alternativa, el ligador es AS(G4S)n, en el que n es 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8, por ejemplo AS(G4S)3. Por ejemplo, el ligando comprende DOM1 h-574-156 y DOM7h-11-3 opcionalmente unidos por AST o ASTSGPS. Como alternativa, el ligador es AS(G4S)n, en el que n es 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8, por ejemplo AS(G4S)3. En este ejemplo o aspecto, el ligando está opcionalmente adaptado para administrar a un paciente por vía ¡ntravascular, subcutánea, intramuscular, peritoneal o mediante inhalación. En un ejemplo, el ligando se proporciona en forma de un polvo seco o composición liofilizada (que opcionalmente se mezcla con un diluyente antes de administrar).

En un aspecto, la invención proporciona un ligando multipespecífico que comprende (i) un dominio variable sencillo de mmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55), que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a, o al menos a, un 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% a la secuencia de aminoácidos de DOM1 h-574-188, DOM 1 h-574-189, DOM 1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM 1 h-574- 193, DOM 1 h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM1 h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM 1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM1h-574-209 DOM1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM1 h-574-213 O DOM1 h-574-214., (ii) al menos un dominio variable sencillo de mmunoglobulina anti-seroalbúmina (SA) que específicamente se une a la SA, en el que el dominio variable sencillo anti-SA comprende una secuencia de aminoácidos que es, al menos, un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a la secuencia de DOM7h-14-10, y (iii) opcionalmente, en el que se proporciona un ligador entre el dominio variable sencillo anti-TNFR1 y el dominio variable sencillo anti-SA, en el que el ligador comprende la secuencia de aminoácidos AST, opcionalmente ASTSGPS. Como alternativa, el ligador es AS(G4S)n, en el que n es 1 , 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8, por ejemplo AS(G4S)3. En este ejemplo o aspecto, el ligando está opcionalmente adaptado para administrar a un paciente por vía intravascular, subcutánea, intramuscular, peritoneal o mediante inhalación. En un ejemplo, el ligando se proporciona en forma de un polvo seco o composición liofilizada (que opcionalmente se mezcla con un diluyente antes de administrar).

La invención proporciona un antagonista del TNFR1 que comprende un dominio variable sencillo, polipéptido o ligandos multiespecíficos de cualquier aspecto o forma de realización de la invención. Por ejemplo, el antagonista o dominio variable de la invención es monovalente para la unión a TNFR1. Por ejemplo, el antagonista o dominio variable de la invención es monovalente o sustancialmente monovalente tal como se determina mediante SEC-MALLS. Monovalencia sustancial está indicada por no más de 5, 4, 3, 2 o 1% del dominio variable o antagonista presente en forma no monovalente tal como se determina mediante SEC-MALLS.

En una forma de realización, el antagonista de la invención comprende los dominios primero y segundo variable sencillo de inmunoglobulina anti-TNFR1, en el que cada dominio variable es de acuerdo a cualquier aspecto o forma de realización de la invención. Los dominios primero y segundo variables sencillos de inmunoglobulina son, en un ejemplo, idénticos. En otro ejemplo son diferentes.

En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos del antagonista o cada dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-TNFR1 en un antagonista de la invención es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DO 1 h-574-193, DOM1h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM 1 h-574- 196 , DOM 1 h-574-201 , DOM1h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM 1 h-574-208, DOM1h-574-209, DOM1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de tipo 1 de TNFa (TNFR1; p55) que comprende un dominio variable anti-TNFR1 de acuerdo con cualquier aspecto de la invención, para administración oral, liberación en el tracto Gl de un paciente, liberación pulmonar, liberación en los pulmones de un paciente o liberación sistémica. En otro aspecto, la invención proporciona el uso del antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para administración oral. En otro aspecto, la invención proporciona el uso del antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para administración en el tracto Gl de un paciente. En un ejemplo, el antagonista o el dominio variable es resistente a tripsina, elastasa y/o pancreatina (véase el documento WO2008149143).

En un aspecto, la invención proporciona el uso de un antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para administración pulmonar. . En otro aspecto, la invención proporciona el uso del antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto de la invención en la fabricación de un medicamento para administración en los pulmones de un paciente. En un ejemplo del antagonista o el dominio variable es resistente a leucozima.

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para administración oral o administración de un medicamento en el tracto Gl de un paciente o en los pulmones o el tejido pulmonar de un paciente, en el que el procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de un antagonista del TNFR1 de la invención.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de tipo 1 del TNFa (TNFR1; p55) para la unión al TNFR1 humano, murino o mono Cynomologus, en el que el antagonista tiene una secuencia de CDR1 que es idéntica, o al menos idéntica, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%, a la secuencia de CDR1 de DOM1 h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-19 , DOM1h-574-192, DO 1 h-574-193, DOM 1 h-574- 194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1h-574-201 , DOM1 h-574-202, DOM 1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM 1 h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-2095 DOM 1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM1h-574-213 o DOM1 h-574-214. Opcionalmente, el antagonista también tiene una secuencia de CDR2 que es idéntica, o al menos idéntica, en un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%, a la secuencia de CRD2 de la secuencia seleccionada. Opcionalmente, adicionalmente o como alternativa, el antagonista también tiene una secuencia de CDR3 que es idéntica a, o al menos idéntica a, en un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%, a la secuencia de CRD3 de la secuencia seleccionada.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de tipo 1 del TNFa (TNFR1; p55) para la unión al TNFR1 humano, murino o mono Cynomologus, en el que el antagonista tiene una secuencia de CDR2 que es idéntica, o al menos idéntica, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%, a la secuencia de CDR2 de DOM 1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM 1 h-574-195, DOM 1 h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM 1 h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-2094 DOM1 h-574-211 , DOM 1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214. Opcionalmente, el antagonista también tiene una secuencia de CDR3 que es idéntica, o al menos idéntica, en un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%, a la secuencia de CRD3 de la secuencia seleccionada.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de tipo 1 del TNFa (TNFR1; p55) para la unión al TNFR1 humano, murino o mono Cynomologus, en el que el antagonista tiene una secuencia de CDR3 que es idéntica, o al menos idéntica, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 98%, a la secuencia de CDR3 de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM 1 h-574-194, DOM 1 h-574- 195, DOM 1 h- 574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 -574-205, DOM 1 h-574-206, DOM1h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM 1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214.

En un aspecto, la invención proporciona un antagonista del receptor de tipo 1 del TNFa (TNFR1; p55) para la unión al TNFR1 humano, murino o mono Cynomologus, en el que el antagonista comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que comprende la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de un dominio variable sencillo seleccionado de DOM 1 h-574-188, DOM 1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1 h-574- 94, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM 1 h-574-201, DOM1 h-574-202, DOM 1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM 1 h-574-207, DOM1h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM 1 h-574-211 , DOM 1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM1h-574-214.

La invención proporciona el antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto, para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección inflamatoria. La invención proporciona el uso del antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección inflamatoria. En una forma de realización del antagonista o uso, la afección se selecciona del grupo constituido por artritis, esclerosis múltiple, enfermedad intestinal inflamatoria y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En un ejemplo, la artritis es artritis reumatoide o artritis reumatoide juvenil. En un ejemplo, la enfermedad intestinal inflamatoria se selecciona del grupo constituido por enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. En un ejemplo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica se selecciona del grupo constituido por bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica y enfisema. En un ejemplo, la neumonía es neumonía bacteriana. En un ejemplo, la neumonía bacteriana es neumonía producida por estafilococos.

La invención proporciona un antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto, para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. La invención proporciona el uso del antagonista de TNFR1 de cualquier aspecto en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En un ejemplo, la enfermedad respiratoria se selecciona del grupo constituido por inflamación pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, neumonía, neumonitis por ipersensibilidad, infiltrado pulmonar con eosinofilia, enfermedad pulmonar ambiental, neumonía, bronquiectasia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar intersticial, hipertensión pulmonar primaria, tromboembolia pulmonar, trastornos de la pleura, trastornos del mediastino, trastornos del diafragma, hipoventilación, hiperventilación, apnea del sueño, síndrome de dificultad respiratoria agua, mesotelioma, sarcoma, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, cáncer de pulmón, rinitis alérgica, alergia, asbestosis, aspergiloma, aspergilosis, bronquiectasia, bronquitis crónica, enfisema, neumonía eosinof ílica, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad neumocócica invasiva, gripe, micobacteria no tuberculosa, derrame pleural, neumoconiosis, neumocitosis, neumonía, actinomicosis pulmonar, proteinosis alveolar pulmonar, ántrax pulmonar, edema pulmonar, embolia pulmonar, inflamación pulmonar, histiocitosis pulmonar X, hipertensión pulmonar, nocardiosis pulmonar, tuberculosis pulmonar, enfermedad veno-oclusiva pulmonar, enfermedad reumatoide pulmonar, sarcoidosis y granulomatosis de Wegener.

POLIPÉPTIDOS, dAb y ANTAGONISTAS El polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista se puede expresar en E. coli o en especies de Pichia (por ejemplo,, P. pastoris). En una forma de realización, el ligando o monómero de dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0,5 mg/l cuando se expresa en E. coli o en especies de Pichia (por ejemplo,, P. pastoris). Aunque los ligandos y monómeros de dAb descritos en la presente memoria descriptiva se pueden secretar cuando se expresan en E. coli o en especies de Pichia (por ejemplo,, P. pastoris), se pueden producir usando cualquier procedimiento adecuado, tal como procedimientos químicos sintéticos o procedimientos de producción biológica que no emplean E. coli o especies de Pichia.

En algunas formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista no comprende un dominio variable de inmunoglobulina de camélidos o uno o más aminoácidos estructurales que son únicos de los dominios variables de ¡nmunoglobulina codificados por segmentos génicos de anticuerpos de la línea germinal de camélidos, por ejemplo en la posición 108, 37, 44, 45 y/o 47. En una forma de realización, el dominio variable anti-TNFR1 de la invención comprende un resto G en la posición 44 de acuerdo con Rabat y opcionalmente comprende uno o más aminoácidos específicos de camélidos en otras posiciones, por ejemplo en la posición 37 o 103.

Los antagonistas del TNFR1 de acuerdo con la invención pueden ser monovalentes o multivalentes. En algunas formas de realización, el antagonista es monovalente y contiene un sitio de unión que interacciona con TNFR1, el sitio de unión proporcionado por un polipéptido o dAb de la invención. Los antagonistas monovalentes se unen a un TNFR1 y pueden no inducir reticulación ni agrupación de TNFR1 sobre la superficie de las células que puede conducir a la activación del receptor y la transducción de la señal. Los antagonistas monovalentes de acuerdo con la invención se pueden unir al Dominio 1, Dominio 2, Dominio 3 o Dominio 4 del TNFR1. En una forma de realización, el antagonista monovalente se une al dominio 4 del TNFR1. En otras formas de realización, el antagonista monovalente se une a un epítopo que abarca más de un Dominio de TNFR1. Por tanto, en una forma de realización, el antagonista monovalente se puede unir a los Dominios 1 y 2, los Dominios 1 y 3, los Dominios 1 y 4, los Dominios 2 y 3, los Dominios 2 y 4, los Dominios 3 y 4, los Dominios 1, 2 y 3, los Dominios 1, 2 y 4 o los Dominios 1 , 3 y 4, de TNFR1.

En otras formas de realización, el antagonista de TNFR1 es multivalente. Los antagonistas multivalentes de TNFR1 pueden contener dos o más copias de un sitio de unión concreto para TNFR1 o contener dos o más sitios de unión diferentes que se unen a TNFR1, proporcionándose al menos uno de los sitios de unión por un polipéptido o dAb de la invención. Por ejemplo, como se ha descrito en la presente memoria descriptiva, el antagonista de TNFR1 puede ser un dímero, trímero o multímero, que comprende dos o más copias de un polipéptido o dAb concreto de la invención que se une a TNFR1, o dos o más polipéptidos o dAb diferentes de la invención que se unen a TNFR1. En una forma de realización, un antagonista multivalente de TNFR1 no tiene agonismo sustancial con TNFR1 (actúa como agonista de TNFR1) en un ensayo celular estándar (es decir, cuando está presente a una concentración de 1 nM, 10 nfvl, 100 nM, 1 µ?, 10 µ?, 100 µ?, 1000 µ? o 5,000 µ?, tiene como resultado en no más de aproximadamente 55 de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa (100 pg/ml) en el ensayo).

En ciertas formas de realización, el antagonista multivalente de TNFR1 contiene dos o más sitios de unión para un epítopo o dominio deseado de TNFR1. Por ejemplo, el antagonista multivalente de TNFR1 puede comprender dos o más sitios de unión que se unen al mismo epítopo en el Dominio 1 de TNFR1 o se unen al mismo epítopo en el Dominio 4 de TNFR1.

En otras formas de realización, el antagonista multivalente de TNFR1 contiene dos o más sitios de unión proporcionados por poiipéptidos o dAb de la invención que se unen a diferentes epítopos o dominios de TNFR1. Por ejemplo, los antagonistas multivalentes de TNFR1 pueden comprender sitios de unión para los Dominios 1 y 2, los Dominios 1 y 3, los Dominios 1 y 4, los Dominios 2 y 3, los Dominios 2 y 4, los Dominios 3 y 4, los Dominios 1, 2 y 3, los Dominios 1 , 2 y 4 o los Dominios 1 , 3 y 4 de TNFR1. En una forma de realización, dichos antagonistas multivalentes de TNFR1 no tienen agonismo con TNFR1 cuando están presentes a una concentración de aproximadamente 1 nM, o de aproximadamente 10 nM, o de aproximadamente 100 nM, o de aproximadamente 1 µ?, o de aproximadamente 10 µ?, en un ensayo estándar de citotoxicidad en L929 o un ensayo estándar con IL-8 en HeLa como se describe en el documento WO2006038027.

Otros antagonistas de TNFR1 no inhiben la unión de TNFa a TNFR1. Dichos ligandos (y antagonistas) pueden tener utilidad como agentes diagnósticos porque pueden usarse para unirse y detectar, cuantificar o medir TNFR1 en una mezcla y no competirán con el TNF en la muestra por la unión a TNFR1. De acuerdo con lo anterior se puede realizar una determinación precisa de si, o cuánto, TNFR1 hay en la muestra.

En otras formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista se une a TNFR1 y antagoniza la actividad de TNFR1 en un ensayo celular estándar con una ND50 de < 100 nM, y a una concentración de < 10µ?, el dAb agoniza la actividad del TNFFR1 en= 5% en el ensayo.

En formas de realización concretas, el polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista no tiene agonismo sustancial con TNFR1 (actúa como agonista de TNFR1) en un ensayo celular estándar (es decir, cuando está presente a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µ?, 10 µ?, 100 µ?, 1000 µ? o 5,000 µ?, tiene como resultado en no más de aproximadamente 5% de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa (100 pg/ml) en el ensayo).

En ciertas formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb o antagonista de la invención son eficaces en modelos de enfermedades inflamatorias crónicas cuando se administra una cantidad eficaz. En general, una cantidad eficaz es de aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo (por ejemplo,, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo, o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo) Los expertos en la técnica reconocen los modelos de enfermedad inflamatoria crónica (véase los descritos en el documento WO2006038027) como predictores de la eficacia terapéutica en seres humanos.

En ciertas formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb o antagonista es eficaz en el modelo estándar de artritis inducida por colágeno en ratones (véase el documento WO2006038027 para los detalles del modelo). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede reducir la puntuación media de artritis de la suma de las cuatro extremidades en el modelo estándar de artritis inducida por colágeno en ratones, por ejemplo en aproximadamente 1 a aproximadamente 16, aproximadamente 3 a aproximadamente 16, aproximadamente 6 a aproximadamente 16, aproximadamente 9 a aproximadamente 16, o aproximadamente 12 a aproximadamente 16, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede retrasar el inicio de los síntomas de artritis en el modelo estándar de artritis inducida por colágeno en ratones, por ejemplo en aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede resultar en una puntuación media de artritis de la suma de las cuatro extremidades en el modelo estándar de artritis inducida por colágeno en ratones de 0 a aproximadamente 3, aproximadamente 3 a aproximadamente 5, aproximadamente 5 a aproximadamente 7, aproximadamente 7 a aproximadamente 15, aproximadamente 9 a aproximadamente 15, aproximadamente 10 a aproximadamente 15, aproximadamente 12 a aproximadamente 15, o aproximadamente 14 a aproximadamente 15.

En otras formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb o antagonista es eficaz en el modelo AARE de artritis en ratones (véase el documento WO2006038027 para los detalles del modelo). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede reducir la puntuación media de artritis en el modelo AARE de artritis en ratones, por ejemplo en aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5, aproximadamente a aproximadamente 2,5, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede retrasar el inicio de los síntomas de artritis en el en el modelo AARE de artritis en ratones, por ejemplo, en aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede tener como resultado una puntuación media de artritis en el modelo AARE de artritis en ratones de 0 a aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1, aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5.

En otras formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb o antagonista es eficaz en el modelo AARE de enfermedad intestinal inflamatoria (EN) en ratones (véase el documento WO2006038027 para los detalles del modelo). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede reducir la puntuación media de inflamación crónica y/o aguda en el modelo ???.? de EN en ratones, por ejemplo en aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5, aproximadamente a aproximadamente 2,5, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede retrasar el inicio de los síntomas de Eli en el en el modelo AARE de Eli en ratones, por ejemplo, en aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede tener como resultado una puntuación media de de inflamación crónica y/o aguda en el modelo ???.? de EN en ratones de O a aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 , aproximadamente 1 a aproximadamente 1 ,5, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5.

En otras formas de realización, el polipéptido, ligando, dAb o antagonista es eficaz en el modelo de EN inducida por dextrano sulfato sódico (DSS) en ratones (véase el documento WO2006038027 para los detalles del modelo). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede reducir la puntuación media de gravedad en el modelo DSS de Ell en ratones, por ejemplo en aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5, aproximadamente a aproximadamente 2,5, aproximadamente 1 ,5 a aproximadamente 2,5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede retrasar el inicio de los síntomas de Ell en el en el modelo DSS de Ell en ratones, por ejemplo, en aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del polipéptido, ligando, dAb o antagonista puede tener como resultado una puntuación media de gravedad en el modelo DSS de Ell en ratones de 0 a aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1, aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2,5.

En formas de realización concretas, el polipéptido, ligando, dAb o antagonista es eficaz en el modelo de enfermedad obstructiva crónica (EPOC) por humo de tabaco en ratones (véase el documento WO2006038027 y el documento WO2007049017 para los detalles del modelo). Por ejemplo, la administración de una cantidad eficaz del ligando puede reducir o retrasar el inicio de los síntomas de EPOC, comparación con un control adecuado.

Se dispone de sistemas de modelos animales que se pueden usar para detectar la eficacia de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, anticuerpos o proteínas de unión de los mismos) en la protección contra, o el tratamiento de, la enfermedad. En la técnica se conocen procedimientos para analizar el lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones susceptibles (Knight y col. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten y col. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). La miastenia gravis (MG) se analiza en ratones SJL/J hembras mediante la inducción de la enfermedad con proteína AchR soluble de otra especie (Lindstrom y col. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). La artritis se induce en una cepa susceptible de ratones mediante inyección de colágeno de tipo II (Stuart y col. (1984) Ann. Rev. Immunol., 42: 233). Se ha descrito un modelo mediante el cual se induce artritis adyuvante en ratas susceptibles mediante inyección de proteína del shock térmico micobacteriana (Van Edén y col. (1988) Nature, 331: 171). Se induce tiroiditis en ratones mediante la administración de tiroglobulina, tal como se ha descrito (Marón y col. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). La diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI) se produce de forma natural o se puede inducir en ciertas cepas de ratones, tales como las descritas por Kanasawa y col. (1984) Diabetologia, 27: 113. EAE en ratas y ratones sirve como modelo para la EM en seres humanos. En este modelo se induce enfermedad desmielinizante mediante la administración de proteína básica de mielina (véase Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer y colaboradores, eds., Gruñe y Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin y col. (1973) Science, 179: 478: y Satoh y col. (1987) J. Immunol., 138: 179).

En general, los presentes ligandos (por ejemplo, antagonistas) se utilizarán en forma purificada junto con transportadores farmacológicamente adecuados. Normalmente, estos transportadores incluyen soluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, todas incluyendo medios salinos y/o tamponados. Vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de ringer, dextrosa y cloruro sódico y solución de Ringer lactato. Los adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si son necesarios para mantener un complejo polipeptídico en suspensión, se pueden escoger de espesantes tales como carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina y alginatos.

Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y de nutrientes y reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de ringer. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a Edición). Se puede usar una variedad de formulaciones adecuadas, incluidas formulaciones de liberación extendida.

Los ligandos (por ejemplo, antagonistas) de la presente invención se pueden usar en forma de composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Éstos pueden incluir varios fármacos inmunoterapéuticos, tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, e inmunotoxinas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de varios agentes citotóxicos o de otro tipo junto con los ligandos de la presente invención, o incluso combinaciones de ligandos de acuerdo con la presente invención que tienen diferentes especificidades, tales como ligandos seleccionados usando diferentes antígenos o epítopos diana, se hayan combinado o no antes de la administración.

La vía de administración de ias composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención puede ser cualquiera de las conocidas habitualmente por los expertos en la técnica. Para terapia, incluida la inmunoterapia sin limitaciones, sus ligandos seleccionados de la invención se pueden administrar a cualquier paciente de acuerdo con técnicas estándar.

La administración se puede realizar de cualquier modo, incluidas las vías parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, mediante la vía pulmonar o, también, adecuadamente, mediante infusión directa con un catéter. La dosificación y la frecuencia de administración dependerá de la edad, el sexo y la afección del paciente, la administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros que el médico ha de tener en cuenta. La administración puede ser local (por ejemplo, liberación local en los pulmones mediante administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal) o sistémica, según lo indicado.

Los ligandos de la presente invención se pueden liofilizar para su almacenamiento y reconstituirse en un transportador adecuado antes de usar. Se ha mostrado que esta técnica es eficaz con las inmunoglobulinas convencionales y se pueden emplear las técnicas de liofilizacion y reconstitución conocidas en la materia. Los expertos en la técnica pueden apreciar que la liofilizacion y reconstitución pueden conducir a varios grados de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG), y que los niveles de uso pueden tener que ajustarse de forma creciente para compensar.

Las composiciones que contienen los presentes ligandos (por ejemplo, antagonistas) o un cóctel de las mismas se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada pata conseguir al menos una inhibición, supresión, modulación, muerte parciales, o algún otro parámetro mensurable, de una población de células seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades necesarias para alcanzar esta dosificación dependerán de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunitario del paciente pero, en general, varían de 0,005 a 10,0 mg de ligando, por ejemplo dAb o antagonista por kilogramo de peso corporal, siendo las dosis de 0,05 a 2,0 miligramos/kilogramo las más habituales. Para aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los presentes ligandos o cócteles de los mismos también se pueden administrar a dosis similares o ligeramente menores, para prevenir, inhibir o retrasar el inicio de la enfermedad (por ejemplo, para mantener la remisión o quiescencia, o prevenir la fase aguda). El clínico experto podrá determinar el intervalo de dosificación adecuado para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad. Cuando un ligando de TNFR1 (por ejemplo, antagonista) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, se puede administrar hasta cuatro veces al día, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes o una vez cada dos meses, a una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 80 miligramos/kilogramo, aproximadamente 100 microgramos/kilogramo a aproximadamente 80 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 80 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 70 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 60 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 50 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 40 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 30 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 20 miligramos/kilogramo , aproximadamente 1 miligramo/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 2.5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo. En formas de realización concretas, el ligando de TNFR1 (por ejemplo,, antagonista) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica una vez cada dos semanas o una vez al mes a una dosis de aproximadamente 10 microgramos/kilogramo a aproximadamente 10 miligramos/kilogramo (por ejemplo,, aproximadamente 10 microgramos/kilogramo, aproximadamente 100 microgramos/ kilogramo, aproximadamente 1 miligramo/kilogramo, aproximadamente 2 miligramos/kilogramo, aproximadamente 3 miligramos/kilogramo, aproximadamente 4 miligramos/kilogramo, aproximadamente 5 miligramos/kilogramo, aproximadamente 6 miligramos/kilogramo, aproximadamente 7 miligramos/kilogramo, aproximadamente 8 miligramos/kilogramo, aproximadamente 9 miligramos/kilogramo o aproximadamente 10 miligramos/kilogramo.) El tratamiento o terapia realizado usando las composiciones descritas en la presente memoria descriptiva se considera "eficaz" si se redicen uno o más síntomas (por ejemplo, en al menos 10% o al menos un punto en una escala de evaluación clínica) respecto a dichos síntomas presentes antes del tratamiento, o respecto a dichos síntomas en un individuo (humano o animal) no tratado con dicha composición u otro control adecuado. Obviamente, los síntomas varían en función de la enfermedad o trastorno diana, pero un clínico o técnico experto los puede medir. Dichos síntomas se pueden medir mediante, por ejemplo, monitorización del nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, niveles de una enzima o metabolito correlacionados con la enfermedad, números de células afectadas etc.), mediante monitorización de las manifestaciones físicas (por ejemplo, inflamación, tamaño del tumor etc.) o mediante una escala de evaluación clínica aceptada, por ejemplo la escala Expanded Disability Status Scale (para la esclerosis múltiple), el cuestionario Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnaire (evaluación de 32 puntos de la calidad de vida con respecto a la función intestinal, síntomas sistémicos, función social y estado emocional, la puntuación varía de 32 a 224, en el que las puntuaciones más altas indican una mejor calidad de vida), la escala Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale u otras escalas de evaluación clínica aceptadas conocidas en el campo. Una reducción sostenida (por ejemplo, un día o más, o más prolongada) en los síntomas de la enfermedad o trastorno e al menos un 10% o en uno o más puntos en una escala clínica dada es indicativa de tratamiento "eficaz". De igual forma, la profilaxis realizada usando una composición como se ha descrito en la presente memoria descriptiva es "eficaz" si el inicio o gravedad de uno o más síntomas se retrasa, reduce o anula con respecto a dichos síntomas en un individuo simular (humano o animal) no tratado con la composición.

Una composición que contiene un ligando (por ejemplo, antagonista) o un cóctel de las mismas de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en contextos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, muerte o eliminación de una población celular diana seleccionada en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar de forma extracorpórea o in vitro de forma selectiva para matar, depencionar o, de otro modo, eliminar de forma eficaz una población celular diana de un grupo heterogéneo de células. La sangre de un mamífero se puede combinar de forma extracorpórea con los ligandos, de modo que mata las células no deseadas o, de otro modo, son eliminadas de la sangre para devolverla al mamífero de acuerdo con técnicas estándar.

Una composición que contiene un ligando (por ejemplo, antagonista) o de acuerdo con la presente invención se puede utilizar en contextos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, muerte o eliminación de una población celular diana seleccionada en un mamífero.

Los ligandos (por ejemplo, antagonistas anti-TNFR1, monómeros dAb) se pueden administrar y/o formular juntos con uno o más agentes activos o terapéuticos adicionales. Cuando un ligando (por ejemplo, un dAb) se administra con un agente terapéutico adicional, el ligando se puede administrar antes, de forma simultánea o después de la administración del agente adicional. En general, el ligando y el agente adicional se administrar de un modo que se produce un solapamiento del efecto terapéutico.

En una forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En una forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir la artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica) que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir la psoriasis, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica y enfisema), que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En otra forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir la neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como la neumonía producida por estafilococos), que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

La invención proporciona un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir otras enfermedades pulmonares además de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la neumonía. Otras enfermedades pulmonares que se pueden tratar, suprimir o prevenir de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, fibrosis quística y asma (por ejemplo, asma resistente a esteroides). Por tanto, en otra forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad pulmonar (por ejemplo, fibrosis quística, asma), que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En formas de realización concretas, un antagonista de TNFR1 se administra vía liberación pulmonar, tal como mediante inhalación (por ejemplo, intrabronquial, intranasal o inhalación oral, gotas intranasales) o mediante administración sistémica (por ejemplo, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea).

En otra forma de realización, la invención es un procedimiento para tratar, suprimir o prevenir el shock séptico, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, ligando, dAb, ligando o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención.

En otro aspecto de la invención se proporciona una composición que comprende un polipéptido, ligando, dAb o antagonista de TNFR1 de acuerdo con la invención y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad usando un polipéptido, ligando, dAb o antagonista de TNFR1 o una composición de acuerdo con la presente invención. En una forma de realización, la enfermedad es cáncer o una enfermedad inflamatoria (por ejemplo, artritis reumatoide, asma o enfermedad de Crohn), En otro aspecto de la invención se proporciona una composición que comprende un polipéptido, dominio variable sencillo, ligando o antagonista de acuerdo con la invención y un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En formas de realización concretas, el polipéptido, dominio variable sencillo, antagonista o composición se administra vía liberación pulmonar, tal como mediante inhalación (por ejemplo, intrabronquial, intranasal o inhalación oral, gotas intranasales) o mediante administración sistémica (por ejemplo, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea).

Un aspecto de la invención se proporciona un dispositivo para liberación pulmonar que contiene un polipéptido, dominio variable sencillo, ligando, composición o antagonista de acuerdo con la invención. El dispositivo puede ser un inhalador o un dispositivo de administración intranasal.

En otras formas de realización, cualquiera de los ligandos descritos en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, antagonista o dominio variable sencillo) comprende además un resto extensor de la semivida, tales como un resto de polialquilenglicol, seroalbúmina o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porción del mismo de unión a transferrina, o un resto que comprende, un sitio de unión para un polipéptido que potencia la semivida in vivo. En algunas formas de realización, el resto extensor de la semivida es un resto que comprende un sitio de unión para un polipéptido que potencia la semivida in vivo seleccionado del grupo compuesto por un affibody, un dominio SpA, un dominio de clase A del receptor de LDL, un dominio de EGF y un avímero.

En otras formas de realización, el resto extensor de la semivida es un resto de polietilenglicol. En una forma de realización, el antagonista comprende (opcionalmente consta de) un dominio variable sencillo de la invención ligado a un resto de polietilenglicol (opcionalmente, en el que el resto tiene el tamaño de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 kDA, opcionalmente de aproximadamente 40 kDa de PEG lineal o modificado). Se hace referencia al documento WO04081026 para una información más detallada sobre la PEGilación de dAb y restos de unión. En una forma de realización, el antagonista consta de un monómero de dAb unido a un PEG, en el que el monómero de dAb es un dominio variable sencillo de acuerdo con la invención. Este antagonista se puede proporcionar para el tratamiento de enfermedad inflamatoria, una afección pulmonar (por ejemplo, asma, gripe o EPOC) o cáncer u, opcionalmente es para administración intravenosa.

En otras formas de realización, el resto extensor de la semivida es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina) que comprende un sitio de unión para seroalbúmina o receptor Fe neonatal.

La invención también se refiere a una composición (por ejemplo, composición farmacéutica), que comprende un ligando de la invención (p. e., antagonistas o dominio variable sencillo) y un transportador farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, la composición comprende un vehículo para administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, ¡ntratecal, intraarticular, subcutánea, administración pulmonar, intranasal, vaginal o rectal.

La invención también se refiere a un dispositivo de liberación de fármaco, que comprende la composición ( por ejemplo, composición farmacéutica) de la invención. En algunas formas de realización, el dispositivo de liberación de fármaco comprende una pluralidad de dosis terapéuticamente eficaces de ligando.

En otras formas de realización, el dispositivo de liberación de fármaco se selecciona del grupo constituido por dispositivo de liberación parenteral, dispositivo de liberación intravenosa, dispositivo de liberación intramuscular, dispositivo de liberación intraperitoneal, dispositivo de liberación transdérmica, dispositivo de liberación pulmonar, dispositivo de liberación intraarterial, dispositivo de liberación intratecal, dispositivo de liberación intraarticular, dispositivo de liberación subcutánea, dispositivo de liberación intranasal, dispositivo de liberación vaginal, dispositivo de liberación rectal, jeringuilla, un dispositivo de liberación transdérmica, una cápsula, un comprimido, un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un aerosol, un dispensador de neblina, un inhalador de polvo seco, un inhalador de dosis medida, un pulverizador de dosis medida, un dispensador de neblina en dosis medida, un atomizador de dosis medida y un catéter.

El ligando (por ejemplo, dominio variable sencillo, antagonista o ligando multiespecífico) de la invención se puede formatear como se ha descrito en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, el ligando de la invención puede formatear para ajusfar la semivida sérica in vivo. Si se desea, el ligando puede comprender además una toxina o resto de toxina como se ha descrito en la presente memoria descriptiva. En algunas formas de realización, el ligando comprende una toxina de superficie activa, tal como un generador de radicales libres (por ejemplo, toxina que contiene selenio) o un radionúclido. En otras formas de realización, la toxina o resto de toxina es un dominio polipeptídico (por ejemplo, un dAb) que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para una diana intracelular. En formas de realización concretas, el ligando es un formato de tipo IgG que tiene especificidad de unión por el TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 humano).

En un aspecto, la Invención proporciona una proteína de fusión que comprende el dominio variable sencillo de la invención. El dominio variable se puede fusionar con, por ejemplo, un péptido o polipéptido o proteína. En una forma de realización, el dominio variable se fusiona con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo monoclonal. En general, la fusión se puede conseguir expresando el producto de fusión de una secuencia de ácido nucleico sencilla o expresando un polipéptido que comprende el dominio variable sencillo y, después, ensamblando este polipéptido en un formato de proteína o anticuerpo más grande usando técnicas convencionales.

En una forma de realización, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina, antagonista o proteína de fusión comprende un dominio constante de anticuerpo. En una forma de realización, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina, antagonista o proteína de fusión comprende un anticuerpo Fe, en el que, opcionalmente, el extremo N de Fe está unido (opcionalmente directamente unido) a extremo C del dominio variable. En una forma de realización, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina, antagonista o proteína de fusión comprende un resto extensor de la semivida. El resto extensor de la semivida puede ser un resto de pol i et i I en g licol , seroalbúmina o un fragmento de la misma, receptor de transferrina o una porción del mismo de unión a transferrina, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de unión para un polipéptido que potencia la semivida in vivo. El resto extensor de la semivida puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un sitio de unión para seroalbúmina o receptor Fe neonatal. El resto extensor de la semivida puede ser un dAb, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una forma de realización, el dominio variable sencillo de inmunoglobulina, o el antagonista o la proteína de fusión se proporciona de modo que el dominio variable (o el dominio variable constituido por el antagonista o la proteína de fusión) comprende además un resto de polialquilenglicol. El resto de polialquilenglicol puede ser un resto de polietilengli col . Más adelante se proporciona discusión adicional.

Se hace referencia al documento WO2006038027, que divulga dominios variables sencillos de inmunoglobulina anti-TNFR1. La divulgación de este documento se incorpora en el presente en su totalidad, en particular para proporcionar usos, formatos, procedimientos de selección, procedimientos de producción, procedimientos de formulación y ensayos para dominios variables sencillos anti-TNFR1, ligandos, antagonistas y similares, de modo que estas divulgaciones se pueden aplicar de forma específica y explícita en el contexto de la presente invención, incluido proporcionar descripción explícita para su importación a las reivindicaciones de la presente divulgación.

El anti-TNFR1 de la invención es un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que opcionalmente es un dominio variable humano o un dominio variable que comprende o deriva de regiones estructurales humanas (por ejemplo, regiones estructurales DP47 o DPK9). En ciertas formas de realización, el dominio variable se basa en una estructura universal, como se ha descrito en la memoria descriptiva.

En ciertas formas de realización, un dominio polipeptídico (por ejemplo, dominio variable sencillo de inmunoglobulina) que tiene un sitio de unión con especificidad de unión para TNFR1 resiste agregaciones, se despliega de forma reversible (véase el documento WO04101790, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia).

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO, VECTORES Y CÉLULAS HUÉSPED La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas y/o recombinantes que codifican ligandos (dominios variables sencillos, proteínas de fusión, polipéptidos, ligandos de especificidad doble y ligandos multiespecíficos) como se ha descrito en la memoria descriptiva.

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado y/o recombinante que codifica un polipéptido que comprende un dominio variables sencillo de inmunoglobulina de acuerdo con la invención. En una forma de realización, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DO 1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM1h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM 1 h-574-196, DOM1 h-574-201, DOM1h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1h-574- 208, DOM1 h-574-209, DOM1 h-574-211 , DOM1 h-574-212, DOM1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% idéntica a la secuencia de nucleotidos de DOM1h-574-188, DOM1h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 -574- 91 , DOM1 h-574-192, DO 1 h-574-193, DOM 1 h-574-194, DOM1h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM 1 h-574-205, DOM 1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DO 1 h-574-208, DOM 1 h-574-209, DOM1h-574-211, DOM1 h-574-2 2, DOM 1 h-574-213 o DOM1 h-574-214, y en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina que se une específicamente a TNFR1. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% idéntica a la secuencia de nucleotidos de DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM 1 h-574- 196, DOM 1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202 , DOM1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM 1 h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-209, DOMIh-574-211, DOM1h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214, y en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de ¡nmunoglobulina que se une específicamente a TNFR1. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de DOM1h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191, DO 1 h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202, DO 1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-209, DOM 1 h-574-211, DOM1h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM1 h-574-214, y en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une específicamente a TNFR1. En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado o recombinante, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de DO 1h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1 h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM1 h-574-194, DOM1 h-574-195, DOM1h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202, DOM1h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-2094 DOM 1 h-574-211, DOM1h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM1 h-574-214, y en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une específicamente a TNFR1.

En un aspecto, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico de la invención o el vector. Se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, en el que el procedimiento comprende mantener la célula huésped en las condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico o vector, de modo que se produce un polipéptido que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina. Opcionalmente, el procedimiento comprende además la etapa de aislar el polipéptido y, opcionalmente, producir una variante, por ejemplo una variante mutada, que tiene una afinidad mejorada (KD); la ND50 para la neutralización de TNFR1 en un ensayo Kl con MRC5, L929 o Cynomologus con respecto al polipéptido aislado.

Los ácidos nucleicos a los que en la presente memoria descriptiva se hace referencia como "aislados" son ácidos nucleicos que se han separado de los ácidos nucleico del ADN genómico o el ARN celular o su fuente de origen (por ejemplo, como existen en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos tal como una biblioteca) e incluyen ácidos nucleicos obtenidos mediante los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva u otros procedimientos adecuados, incluidos ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos mediante síntesis química, mediante combinación de procedimientos biológicos y químicos, y ácidos nucleicos recombinantes que se aislan (véase, por ejemplo, Daugherty, B.L. y colaboradores, Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)).

Los ácidos nucleicos a los que en la presente memoria descriptiva se hace referencia como "recombinantes" son ácidos nucleicos que se han producido mediante metodología de ADN recombinante, incluidos los ácidos generados mediante procedimientos que dependen de un procedimiento de recombinación artificial, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o clonación en un vector usando enzimas de restricción.

En ciertas formas de realización, el ácido nucleico aislado y/o recombinante comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un ligando, tal como se ha descrito en la memoria descriptiva, en el que el ligando comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un dAb que se une al TNFR1 descrito en la presente memoria descriptiva, por ejemplo DO 1 h-574-188, DOM 1 h-574-189, DOM 1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM 1 h-574- 193, DOM1h-574-194, DOM1 h-574-195, DO 1 h-574-196, DOM1h-574-201, DOM1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM 1 h-574-211 , DOM h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM1 h-574-214. La identidad de la secuencia de nucleótidos se puede determinar a lo largo de toda la longitud de la secuencia de nucleótidos que codifica el dAb anti-TNFFM seleccionado.

La invención también proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. En ciertas formas de realización, el vector es un vector de expresión que comprende uno o más elementos de control de la expresión o secuencias operablemente unidas al ácido nucleico recombinante de la invención. La invención también proporciona una célula huésped recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector de la invención. Vectores adecuados (por ejemplo, plásmidos, fagémidos), elementos de control de la expresión, células huésped y procedimientos para producir células huésped recombinantes de la invención son bien conocidos en la técnica y ejemplos se describen más adelante en la presente memoria descriptiva.

Los vectores de expresión adecuados pueden contener una serie de componentes, por ejemplo un origen de replicación, un gen marcador seleccionable, uno o más elementos de control de la expresión, tal como un elemento de control de la transcripción (por ejemplo, promotor, potenciador, terminador) y/o una o más señales de traducción, una secuencia señal o secuencia líder, y similares.

Los elementos de control de la expresión y una secuencia señal, si están presentes, pueden ser proporcionados por el vector u otra fuente. Por ejemplo, las secuencias de control de la transcripción y/o la traducción de un ácido nucleico clonado que codifica una cadena de anticuerpo se pueden usar para dirigir la expresión.

Se puede proporcionar un promotor para la expresión en una célula huésped deseada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor puede estar operablemente unido a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, una cadena de anticuerpo o una porción del mismo, de modo que dirige la transcripción del ácido nucleico. Se dispone de diversos promotores adecuados para huéspedes procariotas (por ejemplo, los promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucariotas (por ejemplo, el promotor temprano o tardío del virus 40 de simios, el promotor de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, el promotor del citomegalovirus, el promotor tardío del adenovirus).

Además, los vectores de expresión normalmente comprenden un marcador seleccionable para la selección de células huésped que portan el vector y, en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de replicación. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibióticos o fármacos son marcadores seleccionables comunes y pueden usarse en células procariotas (por ejemplo, gen de la ß-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y eucariotas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G148 o geneticina), gpt (ácido micofenólico), ampicilina o higromicina). Los genes marcadores de la dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en diversos huéspedes. Los genes que codifican el producto génico de marcadores auxótrofos del huésped (por ejemplo, LEU2, URA3, HIS3) a menudo se usan como marcadores seleccionares en levaduras. También se contempla el uso de vectores víricos (por ejemplo, baculovirus) o fagos y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, tales como vectores retrovirales. En la técnica se conocen bien vectores de expresión adecuados para expresión en células de mamífero y procariotas (E. coli), células de insectos (células S2 de Drosophila Schnieder. Sf9) y levaduras (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) .

Las células huésped adecuadas pueden ser procariotas, incluidas células bacterianas tales como E. coli, B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas; células eucarlóticas, tales como células fúngicas o de levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), u otras células eucariotas menores y células de eucariotas superiores tales como las de Insectos (células S2 de Drosophila Schnieder, células de insectos Sf9 (documento WO 94/26087 (0'Connor)),de mamíferos (por ejemplo, células COS, tales como COS-1 (n° de registro en la ATCC CRL-1650) y COS-7 (n° de registro en la ATCC CRL-1651), CHO (por ejemplo,, n° de registro en la ATCC CRL-9096, CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, LA., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293 (n° de registro en la ATCC CRL-1573), HeLa (n° de registro en la ATCC CCL-2), CV1 (n° de registro en la ATCC CCL-70), WOP (Dailey, L., y colaboradores, J. Virol., 54:739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 90:8392-8396 (1993)) células NSO, SP2/0, células HuT 78 y similares, o plantas (por ejemplo,, tabaco). (Véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. y colaboradores, eds. Current Protocols ¡n Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993).) En algunas formas de realización, la célula huésped es una célula huésped aislada y no es parte de un organismo multicelular (por ejemplo, planta o animal). En ciertas formas de realización, la célula huésped es una célula huésped no humana.

La invención también proporciona un procedimiento para producir un ligando(por ejemplo, ligandos de especificidad doble y ligandos multiespecíficos) de la invención, que comprende mantener una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante, de modo que se expresa el nucleico recombinante y se produce un ligando. En algunas formas de realización, el procedimiento además comprende aislar el ligando.

Se hace referencia al documento WO2006038027, para detalles de la divulgación que es aplicable a formas de realización de la presente invención. Por ejemplo, una divulgación relevante se refiere a la preparación de ligandos basados el dominios variables sencillos de inmunoglobulina, sistemas de vectores en bibliotecas, construcción de biblioteca, combinación de dominios variables sencillos, caracterización de ligandos, estructura de ligandos, esqueletos, armazones proteicos, diversificación de la secuencia canónica, ensayos y composiciones y USIS terapéuticos y diagnósticos, así como definiciones de "unido operablemente", "naive", "prevención", "supresión", "tratamiento" y "dosis terapéuticamente eficaz".

FORMATOS El incremento de la semivida es útil en las aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y, más especialmente, fragmentos de anticuerpos de tamaño pequeño. Dichos fragmentos (Fvs, Fvs unidos por disulfuro, Fabs, scFvs, dAbs) sufren un rápido aclaramiento del cuerpo; por tanto, aunque pueden alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo con rapidez y son rápidos de producir y fáciles de manejar, sus aplicaciones in vivo han sido limitadas por su breve persistencia in vivo. Una forma de realización de la invención resuelve este problema proporcionando un incremento de la semivida de los ligandos in vivo y, en consecuencia, tiempos de persistencia más prolongada en el cuerpo de la actividad funcional del ligando.

Los expertos en la técnica estarán familiarizados con los procedimientos de análisis farmacocinético y la determinación de la semivida de los ligandos. Los detalles pueden encontrarse en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters y colaboradores, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Rev. ex edición (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como las semividas de t alfa y de t beta y el área bajo la curva (AUC). Las definiciones de semivida y de AUC se proporcionan en lo que antecede.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un ligando (por ejemplo, polipéptido, dominio variable, antagonista, ligando multiespecífico) o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida ta en el intervalo de 15 minutos o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas.. Además, o como alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tendrá una semivida ta en el intervalo de hasta 12 horas, incluidas. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es de 1 a 6 horas, de 2 a 5 horas o de 3 a 4 horas.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un ligando (por ejemplo, polipéptido, dominio variable, antagonista, ligando multiespecífico) o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida tB en el intervalo de 2,5 horas o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es de aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 10 horas , aproximadamente 11 horas, o aproximadamente 12 horas. Además, o como alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tendrá una semivida tB en el intervalo de hasta e incluidos 21 días. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es de aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 15 días o aproximadamente 20 días. En una forma de realización, un ligando o composición de acuerdo con la invención tendrá una semivida tB en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 60 horas. En otra forma de realización, estará en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas. En otra forma de realización más, estará en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 26 horas.

Además, o como alternativa a, de los criterios anteriores, la presente invención proporciona un ligando o una composición que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene un valor de la AUC (área bajo la curva) en el intervalo de aproximadamente 1 mg.min/ml o más. En una forma de realización, el extremo inferior del intervalo es de aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 100, aproximadamente 200 o aproximadamente 300 mg-min/ml. Además, o como alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tiene una AUC en el intervalo de hasta aproximadamente 600 mg-min/ml. En una forma de realización, el extremo superior del intervalo es de aproximadamente 500, aproximadamente 400, aproximadamente 300, aproximadamente 200, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 75 o aproximadamente 50 mg-min/ml. En una forma de realización, un ligando de acuerdo con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado del grupo constituido por los siguientes: aproximadamente 15 a aproximadamente 150 mg-min/ml, aproximadamente 15 a aproximadamente 100 mg-min/ml, aproximadamente 15 a aproximadamente 75 mg-min/ml, y aproximadamente 15 a aproximadamente 50mg-min/ml.

Los polipéptidos y dAb de la invención y antagonistas que comprenden éstos pueden formatearse de modo que tengan un tamaño hidrodinámico más grande mediante, por ejemplo, unión de un grupo PEG, seroalbúmina, transferrina , receptor de transferrina o al menos la porción del mismo de unión a transferrina, una región Fe del anticuerpo, o mediante conjugación a un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, polipéptidos dAb y antagonistas formateados como un fragmento de unión a antígeno más grandes de un anticuerpo o como un anticuerpo (por ejemplo, formateado como Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv).

El tamaño hidrodinámico de los ligandos (por ejemplo, monómeros y multímeros de dAb) de la invención puede determinarse usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de filtración en gel para determinar el tamaño hidrodinámico de un ligando. Matrices de filtración en gel adecuadas para determinar los tamaños hidrodinámicos de los ligandos, tales como matrices de agarosa reticulada, son bien conocidas y fácilmente disponibles.

El tamaño de un formato de ligando (por ejemplo, el tamaño de un resto PEG unido a un monómero de dAb) se puede variar en función de la aplicación deseada. Por ejemplo, cuando se pretende que el ligando salga de la circulación y entre en tejidos periféricos, es deseable mantener el tamaño hidrodinámico del ligando bajo para facilitar la extravasación desde la corriente sanguínea. Como alternativa, cuando se desee que el ligando permanezca en la circulación sistémica durante un periodo de tiempo más prolongado, el tamaño del ligando se puede incrementar mediante, por ejemplo, formateo en forma de una proteína similar a Ig.

Extensión de la semivida apuntando a un antíqeno o epítopo que incrementa la semivida in vivo El tamaño hidrodinámico de un ligando y su semivida en suero también puede incrementarse mediante conjugación o asociación de un polipéptido de unión a TNFR1, dAb o antagonista de la invención con un dominio de unión (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un antígeno o epítopo que aumenta la semivida in vivo, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, el agente de unión a TNFR1 (por ejemplo, polipéptido) se puede conjugar o unir a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-receptor de FC neonatal anti-seroalbúmina, por ejemplo dAb receptor de Fe anti-SA o anti-neonatal, Fab, Fab' orscFv, o a un affibody anti-SA o affibody del receptor de Fe anti-neonatal o un avímero anti-SA o un dominio de unión anti-SA que comprende un armazón seleccionado de , entre otros, el grupo constituido por CTLA-4, lipocalina, SpA, un affibody, un avímer, GroEl y fibronectina (véase el documento WO2008096158 para una divulgación de estos dominios de unión, en la que los dominios y sus secuencias se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia y forman parte de la divulgación del presente texto). Conjugación se refiere a una composición que comprende polipéptido, dAb o antagonista de la invención que está unido (de forma covalente o no covalente) a un dominio de unión que se une a seroalbúmina.

Los polipéptidos adecuados que potencian la semivida sérica in vivo incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión del agente neurofarmacéutico-ligando específico del receptor de transferrina (véase la patente de EE.UU. n° 5,977,307, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia), receptor de células endoteliales capilares del cerebro, transferrina, receptor de transferrina (por ejemplo, receptor de transferrina soluble), insulina, receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina (IGF 1), receptor del factor de crecimiento 2 similar a la insulina (IGF 2), receptor de la insulina, factor de coagulación sanguíneo X, antitripsina al y HNF 1a Entre los polipéptidos adecuados que potencian la semivida también se incluyen glicoproteína alfa- 1 (orosomucoide; AAG), anti-quimiotripsina alfa-1 (ACT), microglobulina alfa-1 (proteína HC, AIM), , anti-trombinaA III (AT III), apolipoproteína A-1 (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente del complemento C3 (C3), componente del complementa C4 (C4), inhibidor de la esterasa C1 (C1 INH), roteína C-reactiva (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína(a) (Lp(a)), proteína de unión a mañosa (MBP), mioglobina (Myo), pre-albúmina (transtiretina; PAL), proteína de unión a retinol (RBP) y factor reumatoide (RF).

Las proteínas adecuadas del matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágenos, laminitas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las proteínas principales de la matriz extracelular. Actualmente se conocen aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno, que se encuentran en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, colágeno de tipo I (que representa el 90% del colágeno corporal) que se encuentran en huesos, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos , o colágeno de tipo II que se encuentra en cartílago, discos vertebrales, notocorda y humor vitreo del ojo.

Las proteínas adecuadas de la sangre incluyen, por ejemplo, proteínas plasmáticas (por ejemplo, fibrina, a-2 macroglobulina, seroalbúmina, fibrinógeno (por ejemplo, fibrinógeno A, fibrinógeno B), proteína A amiloide sérica, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y ß-2-microglobulina) , enzimas e inhibidores enzimáticas (por ejemplo, plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa-1 -antitripsina e inhibidor de la tripsina pancreática , proteínas del sistema inmunitario, tal como proteínas inmunoglobulinas (por ejemplo, cadenas ligeras de inmunoglobulinas, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, (kappa/lambda)), proteínas transportadoras (por ejemplo, proteína de unión a retinol, a-1 microglobulina), defensinas (por ejemplo, beta-defensina 1, defensina de neutrófilos 1, defensina de neutrófilos 2 y defensina de neutrófilos 3) y similares.

Las proteínas adecuadas que se encuentran en la barrera hematoencefálica o en el tejido neural incluyen, por ejemplo, receptor de melanocortina, mielina, transportador de ascorbato y similares.

Entre los polipéptidos adecuados que potencian la semivida sérica in vivo también se incluyen las proteínas localizadas en el riñon (por ejemplo, policistina, colágeno de tipo IV, transportador aniónico orgánico Kl, antígeno de Heymann'), proteínas localizadas en el hígado (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa, G250), proteínas localizadas en el pulmón (por ejemplo, componente secretor, que se une a IgA), proteínas localizadas en el corazón (por ejemplo, HSP 27, que está asociado con miocardiopatía dilatada), proteínas localizadas en la piel (por ejemplo, queratina), proteínas específicas de hueso, tal como proteínas morfogénicas (BMP), que son un subconjunto del factor de crecimiento transformante B, superfamilia de proteínas que muestran actividad osteogénica (por ejemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas tumorales (por ejemplo, antígeno trofoblástico, receptor de herceptina, receptor de estrógenos, catepsinas (por ejemplo, catepsina B, que se puede unir en el hígado y el bazo)) Entre las proteínas específicas de enfermedad adecuadas se incluyen, por ejemplo, antígenos que sólo se expresan en células T activadas, incluidas LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL; véase Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (un miembro de la familia de los receptores de TNF, expresado sobre células T activasa y específicamente regulado por incremento en células productoras de virus de la leucemia de células T humana de tipo -I (HTLV-I); véase Immunol. 165 (1):263-70 (2000)). Entre las proteínas específicas de enfermedad adecuadas se incluyen, por ejemplo, metaloproteasas (asociadas con artritis/cáncer) incluidas CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH murino; y factores de crecimiento angiogénico, incluido el factor de crecimiento fibroblástico ácido (FGF-1), el factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular /factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor transformante de crecimiento a (TGF a), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), angiogenina, interleucina-3 ( I L-3) , interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placentario (P1GF), factor de crecimiento derivado de las plaquetas midcina BB (PDGF), y fractalcina.

Entre los polipéptidos que potencian la semivida sérica in vivo también incluye proteínas de tensión, tales como las proteínas del shock término (HSP). Las HSP normalmente se encuentran intracelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente es indicativo de que la célula ha muerto y sus componentes se han diseminado. Esta muerte celular no programada (necrosis) se produce como resultado de traumatismo, enfermedad o lesión, las HSP desencadenan una respuesta del sistema inmunitario. La unión a HSP extracelular pueda dar lugar a localizar las composiciones de la invención en un punto enfermo.

Las proteínas adecuadas implicadas en el transporte de Fe incluyen, por ejemplo, receptor de Brambell (también conocido como FcRB) Este receptor de Fe tiene dos funciones, ambas potencialmente útiles para liberar. Las funciones son (1) transporte de IgG de la madre al hijo a través de la placenta (2) protección de IgG de la degradación, de modo que se prolonga su semivida en suero. Se piensa que el receptor recicla IgG de los endosomas. (Véase, Holliger y colaboradores, Nat Biotechnoi 15(7):632-6 (1997).) dAb que se unen a la seroalbúmina La invención, en una forma de realización, proporciona un ligando, polipéptido o antagonista (por ejemplo, ligandos de especificidad doble y dAb anti-TNFFU (un primer dAb)) que se une al TNFR1 y un segundo dAb que se une a la seroalbúmina (SA), donde el segundo dAb se une a la SA con una KD determinada mediante resonancia en plasmón superficial de aproximadamente 1nM a aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400 o aproximadamente 500 µ? (es decir., x 10"9 a5 x 10"4M), O aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 µ? o aproximadamente 3 a aproximadamente 70 nM o aproximadamente 10nM a aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 5 µ?. Por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nM, determinado mediante resonancia en plasmón superficial. En una forma de realización, el primer dAb (o monómero de dAb) se une a la SA (por ejemplo, HSA) con una KD determinada mediante resonancia en plasmón superficial de aproximadamente 1, aproximadamente 50, aproximadamente 70, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 300 nM o aproximadamente 1, aproximadamente 2 o aproximadamente 3 µ?. En una forma de realización, para un ligando de especificidad doble que comprende un primer dAb anti-SA y un segundo dAb frente a TNFR1, la afinidad (por ejemplo,, KD y/o Koff medida mediante resonancia en plasmón superficial, por ejemplo,, usando BiaCore) del segundo dAb por su diana es de aproximadamente 1 a aproximadamente 100000 veces (por ejemplo,, aproximadamente 100 a aproximadamente 100000, o aproximadamente 1000 a aproximadamente 100000, o de aproximadamente 10000 a aproximadamente 100000 veces) la afinidad del primer dAb por SA. En una forma de realización, la seroalbumina es seroalbumina humana (HSA). Por ejemplo, el primer dAb se une a la SA con una afinidad de aproximadamente unos 10 µ?, mientras que el segundo dAb se une a su diana con una afinidad de aproximadamente 100 pM. En una forma de realización, la seroalbumina es seroalbúmina humana (HSA). En una forma de realización, el primer dAb se une a la SA (por ejemplo,, HSA) con una KD de aproximadamente unos 50, por ejemplo de aproximadamente 70, aproximadamente 100, aproximadamente 150 o aproximadamente 200 nM. Detalles sobre ligandos con especificidad doble se encuentran en los documentos WO03002609, WO04003019, WO2008096158 y WO04058821.

En una forma de realización, los ligandos de la invención pueden comprender un dAb que se une a la seroalbúmina (SA) con una KD determinada mediante resonancia en plasmón superficial de aproximadamente inM a aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400 o aproximadamente 500 µ? (i.e., x aproximadamente 10"9 a aproximadamente 5 x 10"4M), o aproximadamente 100 nM a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 µ? o aproximadamente 3 a aproximadamente 70 nM o aproximadamente 10nM a aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 5µ?. Por ejemplo de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 nM determinada mediante resonancia en plasmón superficial. En una forma de realización, el primer dAb (o un monómero de dAb) se une a la SA (por ejemplo,, HSA) con una KD determinada mediante resonancia en plasmón superficial de aproximadamente 1, aproximadamente 50, aproximadamente 70, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 300 nM o aproximadamente 1, aproximadamente 2 o aproximadamente 3 µ?. En una forma de realización, el primero y el segundo dAb están unidos por un ligador, por ejemplo un ligador de 1 a 4 aminoácidos o de 1 a 3 aminoácidos o de más de 3 aminoácidos o de más de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 aminoácidos. En una forma de realización, se usa un ligador más largo (mayor de 3 aminoácidos) para aumentar la potencia (KD de uno o ambos dAb en el antagonista).

En formas de realización concretas de los ligandos y antagonistas, el dAb se une a seroalbúmina humana y compite por la unión a albúmina con un dAb seleccionado del grupo constituido por DOM7h-11, DOM7h-11-3, DOM7h-11-12, DOM7h-11 -15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 y DOM7m-16.

En formas de realización concretas de los ligandos y antagonistas, el dAb se une a seroalbúmina humana y compite por la unión a albúmina con un dAb seleccionado del grupo constituido por: MSA-16, MSA-26 (véase el documento WO04003019 para la divulgación de estas secuencias, en el que las secuencias y sus homologas de ácido nucleico se incorporan en la presente memoria descriptiva por relerencia y forma parte de la divulgación del presente texto), DOM7m-16 (SEQ ID N°: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7m-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7m-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7m-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7m-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7m-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7m-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7m-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7m-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7m-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7m-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7m-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7m-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7m-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7m-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7m-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7m-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7m-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7m-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7m-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7m-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7m-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7m-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7m-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7m-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7m-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7m-33 (SEQ ID NO: 517) (véase el documento WO2007080392 para la divulgación de estas secuencias, en el que las secuencias y sus homólogos de ácido nucleico se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia y forman parte de la divulgación del presente texto; las SEQ ID NO: en este párrafo son las que aparecen en el documento WO2007080392), dAb8 (dAb10), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DOM7h23), dAb7h24 (DOM7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb11, dAb12 (dAb7m12), dAb13 (dAb 15), dAb15, dAb16 (dAb21, dAb7m16) , dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 ( dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41, dAb46 (dAbs 47, 52 y 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM 7?), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7r13 (DOM7r13), dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7r 6), dAb7r17 (DOM7M7), dAb7r18 (DOM7r18), dAb7r19 (DOM7r19), dAb7M (DOM7 ), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DOM7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 (DOM7h9), dAb7h10 (DOM7h10), dAb7h11 (DOM7h11), dAb7h12 (DOM7h12), dAb7h13 (DOM7h13), dAb7h14 (DOM7h14), dAb7p1 (DOM7p1), y dAb7p2 (DOM7p2) (véase el documento WO2008096158 para la divulgación de estas secuencias, en el que las secuencias y sus homologas de ácido nucleico se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia y forman parte de la divulgación del presente texto). Los nombres alternativos se muestran entre paréntesis después del dAb, por ejemplo dAb8 tiene un nombre alternativo que es dAblO, es decir dAb8 (dAblO).

En ciertas formas de realización, el dAb se une a seroalbúmina humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo constituido por DOM7h-11, DOM7h-11 -3, DO 7h-11 -12, DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 y DOM7m-16.

En ciertas formas de realización, el dAb se une a seroalbúmina humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo constituido por: SA-16, MSA-26, DOM7m-16 (SEQ ID N°: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7m-1 (SEQ ID NO: 476), DOM7m-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7m-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7m-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7m-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7m-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7m-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7m-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7m-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7m-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7m-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7m-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7m-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7m-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7m-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7m-22 (SEQ ID NO: 506), DO 7m-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7m-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7m-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7m-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7m-28 (SEQ ID NO: 512), DO 7m-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7m-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7m-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7m-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7m-33 (SEQ ID NO: 517) (las SEQ ID No en este párrafo son aquéllas que aparecen en el documento WO2007080392), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, y dAb7p2.

Por ejemplo, el dAb que se une a la seroalbúmina humana puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% con DOM7h-11-3 o DOM7h-14-10.

Por ejemplo, el dAb que se une a la seroalbúmina humana puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% con: DO 7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494) o DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495) (las SEQ ID NO: en este párrafo son aquéllas que aparecen en el documento WO2007080392), o dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 o dAb7h14.

En ciertas formas de realización, el dAb se une a seroalbúmina humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% con la secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo constituido por: DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7 -22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495) (las SEQ ID NOs en este párrafo son las que aparecen en el documento WO2007080392) , dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En formas de realización más concretas, el dAb es un VK dAb que se une a la seroalbúmina humana y tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DO 7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-1 (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496) ( WO2007080392), dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7 , dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 y dAb7h14.

En formas de realización más concretas, el dAb es un VM dAb que se une a la seroalbumina humana y tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de dAb7h30 y dAb7h31.

En formas de realización más concretas, el dAb es dAb7h11 o dAb7h14. En un ejemplo, el dAb es DOM7h-11 -3. En otro ejemplo, el dAb es DOM7h-14-10.

En otras formas de realización, el dAb, ligando o antagonista se une a la seroalbúmina humana y comprende una, dos o tres de las CDR de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, por ejemplo una, dos o tres de las CDR de DOM7h-11'-3, DOM7h-14-10, dAb7h11 o dAb7h14.

VHH de camélidos adecuadas que se unen a seroalbúmina incluyen las descritas en el documento WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) y en el documento WO2007080392 (en el que las secuencias V I— 11— I y sus homologas de ácido nucleico se incorporan en la presente memoria descriptiva y forman parte de la divulgación del presente texto), tales como la Secuencia A (SEQ ID NO: 518), la secuencia B (SEQ ID NO: 519), La secuencia C (SEQ ID NO: 520), La secuencia D (SEQ ID NO: 521), La secuencia E (SEQ ID NO: 522), La secuencia F (SEQ ID NO: 523), la secuencia G (SEQ ID NO: 524), la secuencia H (SEQ ID NO: 525), la secuencia I (SEQ ID NO: 526), La secuencia J (SEQ ID NO: 527), la secuencia K (SEQ ID NO: 528), la secuencia L (SEQ ID NO: 529), la secuencia M (SEQ ID NO: 530), la secuencia N (SEQ ID NO: 531), la secuencia O (SEQ ID NO: 532), la secuencia P (SEQ ID NO: 533), la secuencia Q (SEQ ID NO: 534), en las que estos números de secuencia corresponden a los citados en los documentos WO2007080392 o WO 2004/041862 (Ablynx N.V.) En ciertas formas de realización, la V(-JH de camélidos se une a seroalbúmina humana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 97%, o al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% con el ALB1 divulgado en el documento WO2007080392 o una cualquiera de las SEQ ID NO: 518-534, en las que estos números de secuencia corresponden a los citados en los documentos WO2007080392 o WO 2004/041862.

En algunas formas de realización, el ligando o antagonista comprende un dAb anti-seroalbúmina que compite con cualquier dAb anti-seroalbúmina divulgado en la presente memoria descriptiva por la unión a seroalbúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana).

En una forma de realización alternativa, el antagonista o ligando comprende un resto de unión específico de SA (por ejemplo, SA humana), en el que el resto comprende secuencias no inmunoglobulínicas como las descritas en el documento WO2008096158, cuya divulgación de estos restos de unión, sus procedimientos de producción y selección (por ejemplo, de diversas bibliotecas) y sus secuencias se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia y forman parte de la divulgación del presente texto).

Conjugación con un resto de extensión de la semivida (por ejemplo, albúmina) En una forma de realización, un (uno o más) esto de extensión de la semivida (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos) está conjugado o asociado con el polipéptido de unión a TNFR1, dAb o antagonista de la invención. Ejemplos de albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina adecuados apara usar en un formato de unión a TNFR1 se describen en el documento WO 2005077042, cuya divulgación se incorpora en la presente memoria descriptiva y forma parte de la divulgación del presente texto. En particular, en la presente invención se pueden usar las siguientes albúminas, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina: · SEQ ID NO: 1 (como se divulga en el documento WO 2005077042, estando esta secuencia explícitamente incorporada en la presente divulgación por referencia); • Fragmento o variante de albúmina que comprende o consta de los aminoácidos 1-387 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; • Albúmina o Fragmento o variante de la misma, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por: (a) los aminoácidos 54 a 61 de SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (b) los aminoácidos 76 a 89 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (c) los aminoácidos 92 a 100 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (d) los aminoácidos 170 a 176 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (e) los aminoácidos 247 a 252 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (f) los aminoácidos 266 a 277 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (g) los aminoácidos 280 a 288 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (h) los aminoácidos 362 a 368 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (i) los aminoácidos 439 a 447 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042 (j) los aminoácidos 462 a 475 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; (k) los aminoácidos 478 a 486 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042; y (I) los aminoácidos 560 a 566 de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005077042.

Otros ejemplos de albúmina, fragmentos de albúmina y análogos de albúmina adecuados apara usar en un formato de unión a TNFR1 se describen en el documento WO 03076567, cuya divulgación se incorpora en la presente memoria descriptiva y forma parte de la divulgación del presente texto. En particular, en la presente invención se pueden usar las albúminas, fragmentos o variantes de albúmina siguientes: • Seroalbúmina humana tal como se describe en el documento WO 03076567, por ejemplo, en la figura 3 (estando la información de esta secuencia explícitamente incorporada en la presente divulgación por referencia); . Seroalbúmina humana (HA) constituida por polipéptido no glicosilado de cadena sencilla de 585 aminoácidos con un peso molecular de 66,500 (véase Meloun, y colaboradores, FEBS Letters 5S:136 (1975); Behrens, y colaboradores, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, y colaboradores, Nucleic Acids Research 9: 6102-6114 (1981); Minghetti, y colaboradores, J. Biol. Chem.261:6747 (1986)); • Una variante o análogo o fragmento polimórfico de albúmina tal como se describe en Weitkamp, y colaboradores, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973); • Un fragmento o variante de albúmina tal como se describe en el documento EP 322094, por ejemplo, HA(1-373., HA(1- 388), HA(1-389), HA(1-369), y HA(1-419) y fragmentos entre 1-369 y 1 -419; • Un fragmento o variante de albúmina tal como se describe en el documento EP 399666, por ejemplo, HA(1-177) y HA(1-200) y fragmentos entre HA(1-X), donde X es cualquier número de 178 a 199.

Cuando (uno o más) restos de extensión de la semivida (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de las mismas) se usan para formatear los polipéptidos de unión a TNFR1, dAb y antagonistas de la invención, se pueden conjugar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como, mediante fusión directa con el resto de unión a TNFR1 (por ejemplo, dAb anti-TNFR1), por ejemplo usando un constructo de un único nucleótido que codifica una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión está codificada en forma de una cadena polipeptídica sencilla con el resto de extensión de la semivida localizada en los extremos N o C del resto de unión a TNFR1. Como alternativa, la conjugación se puede realizar usando un ligador peptídico entre los restos, por ejemplo un ligador peptídico como se describe en los documentos WO 03076567 o WO 2004003019 (estando las divulgaciones de estos ligadores incorporadas por referencia en la presente divulgación para proporcionar ejemplos para usar en la presente invención). Normalmente, un polipéptido que aumenta la semivida en suero in vivo es un polipéptido natural in vivo y que resiste la degradación o eliminación mediante mecanismos endógenos que eliminan el material no deseado del organismo (por ejemplo, ser humano). Por ejemplo, un polipéptido que aumenta la semivida en suero in vivo se puede seleccionar de proteínas de la matriz extracelular, proteínas encontradas en sangre, proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en tejido neural, proteínas localizadas en el riñon, el hígado, los pulmones, el corazón, la piel o los huesos, proteínas de estrés, proteínas específicas de enfermedad o proteínas implicadas en el transporte de Fe.

En formas de realización de la invención descritas a lo largo de esta divulgación, en lugar del uso de un dominio variable sencillo anti-TNFFM (("dAb") en un antagonista o ligando de la invención, se contempla que el destinatario experto pueda usar un polipéptido o dominio que comprenda una o más o todas 3 las CDR de un dAb de la invención que se une al TNFR1 (por ejemplo, CDR injertadas en un armazón o esqueleto proteico adecuado, por ejemplo, un affibody, un armazón SpA, un dominio de clase A del receptor de LDL o un dominio de EGF). La divulgación como un todo debe interpretarse de acuerdo con proporcionar divulgación de antagonistas que usan dichos dominios en lugar de un dAb. A este respecto, véase el documento WO2008096158 para los detalles de cómo producir diversas bibliotecas sobre la base de armazones proteicos y selección y caracterización de dominios de dichas bibliotecas, cuya divulgación se incorpora por referencia).

Por tanto, en una forma de realización un antagonista de la invención comprende un dominio de variable sencillo de inmunoglobulina o anticuerpo de dominio (dAb) que tiene especificidad de unión por TNFR1 o las regiones determinantes de complementariedad de dicho dAb en un formato adecuado. El antagonista puede ser un polipéptido que consta de dicho dAb, o consta esencialmente de dicho dAb. El antagonista puede ser un polipéptido que comprende un dAb (o las CDR de un dAb) en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo (por ejemplo, un formato de tipo IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2), o un ligando de especificidad doble que comprende un dAb que se une a TNFR1 y un segundo dAb que se une a otra proteína, antígeno o epítopo diana (por ejemplo, seroalbúmina).

Los polipéptidos, dAb y antagonistas de acuerdo con la invención se pueden formatear como varios formatos de anticuerpos adecuados que se conocen en la técnica, tales como formatos de tipo IgG, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de las cadenas pesadas y/o las cadenas ligeras del anticuerpo de cualquiera de los anteriores (por ejemplo,, un fragmento Fv (por ejemplo,, Fv de cadena sencilla(scFv), un Fv unido por disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 , un dominio variable de anticuerpo sencillo (por ejemplo,, un dAb, VH, VL>, un dAb y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo,, modificados por la unió covalente de polialquilenglicol (por ejemplo, polietile nglicol , polipropilenglicol, polibutilenglicol) u otro polímero adecuado).

En algunas formas de realización, la invención proporciona un ligando (por ejemplo, un antagonista anti-TNFFM) que es un formato de tipo IgG. Dichos formatos tienen la estructura convencional de cuatro cadenas de una molécula de IgG (2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras), en las que una o más de las regiones variables (VH y/o VL) se han sustituido con un dAb de la invención. En una forma de realización, cada una de las regiones variables (2 regiones VH y 2 regiones VL) está sustituida con un dAb o dominio variable sencillo, al menos uno de los cuales es un dAb anti-TNFFM de acuerdo con la invención. Los dAb o dominio variables sencillos que están incluidos en un formato de tipo IgG pueden tener la misma o diferentes especificidades. En algunas formas de realización, el formato de tipo IgG es tetravalente y puede tener uno (sólo anti-TNFFM), dos (por ejemplo, anti-TNFFM y anti-SA), tres o cuatro especificidades. Por ejemplo, el formato de tipo IgG puede ser monoespecífico y comprende 4 dAb que tienen la misma especificidad; biespecífico y comprende 4 dAb que tienen la misma especificidad y otro dAb que tiene una especificidad diferente; biespecífico y comprende 2 dAb que tienen la misma especificidad y dos dAb que tiene una especificidad común pero diferente; triespecíf Ico y comprende dAb primero y segundo que tienen la misma especificidad, un tercer dAb con una especificidad diferente y un cuarto dAb con una especificidad diferente del primero, segundo y tercero dAb; o tetraespecífico y comprende 4 dAb cada uno con una especificidad diferente. Se pueden preparar fragmentos de unión a antígeno de formatos de tipo IgG (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv). En una forma de realización, los formatos de tipo IgG o fragmentos de unión a antígeno pueden ser monovalentes para TNFR1. Si se desea activación complementaria y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA), el ligando puede ser de un formato de tipo lgG1. Si se desea, el formato de tipo IgG puede comprender una región constante mutada (región constante de la cadena pesada de la IgG variante) para minimizar la unión a receptores Fe y/o capacidad para fijar el complemento, (véase e.g, Winter y colaboradores, GB 2,209,757 B; Morrison y colaboradores, WO 89/07142; Morgan y colaboradores, WO 94/29351, Diciembre 22, 1994).

Los ligandos de la invención (por ejemplo, polipéptidos, dAb y antagonistas) pueden formatearse como una proteína de fusión que contiene un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que está fusionado directamente con un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina. Si se desea, dicho formato puede comprender además un resto de extensión de la semivida. Por ejemplo, el ligando puede comprender un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que está fusionado directamente con un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina que está fusionado directamente con un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une a seroalbúmina.

En general, la orientación de los dominios polipeptídicos que tienen un sitio de unión con especificidad de unión por una diana y si el ligando comprende un ligador es cuestión de elección del diseño. No obstante, algunas orientaciones, con o sin ligadores, pueden proporcionar mejores características de unión que otras orientaciones. Todas las orientaciones (por ejemplo, dAb1 -ligador-dAb2; dAb2-ligador-dAb1 ) están abarcados por la invención son ligandos que contienen una orientación que proporciona las deseadas características de unión y pueden identificarse fácilmente mediante cribado.

Los polipéptidos y dAb de acuerdo con la invención, incluidos los monómeros, dímeros y trímeros de dAb, pueden unirse a una región Fe de anticuerpo, que comprende uno o ambos dominios CH2 y CH3, y, opcionalmente una región bisagra. Por ejemplo, se pueden usar vectores que codifican ligandos como una secuencia de nucleótidos sencilla a una región Fe para preparar dichos polipéptidos.

La invención además proporciona dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros dAb mencionados en lo que antecede.

EJEMPLOS Las propiedades biofísicas de los fragmentos de anticuerpo desempeñan un papel fundamental en la determinación de si un fragmento de anticuerpo se puede desarrollar como terapéutica o no. Una de estas propiedades biofísicas es la estabilidad del fragmento de anticuerpo a la precipitación cuando se almacena. La prueba de estabilidad acelerada es una técnica usada para evaluar la estabilidad más rápidamente mediante incubación de la proteína a temperaturas elevadas durante periodos de tiempo prolongados y, después, determinación del nivel de precipitación. Por tanto, los autores han caracterizado siente dAb anti-TNFFM por su estabilidad acelerada. Debido a las propiedades muy diferentes (especialmente Tm diferentes) de los dAb individuales a estudiar, los estudios de estabilidad acelerada de estos dAb se llevaron a cabo todos a 40°C.

El protocolo usado para la estabilidad acelerada es el siguiente: Todas las proteínas se intercambiaron con tampón en PBS y se ajustaron a una concentración de 1 miligramo/mililitro. Se prepararon cuatro alícuotas (correspondientes a 4 puntos de tiempo; Oh, 2h, 23h y 47h) de 250 microlitros en tubos eppendorf de 0,5 mi. Las primeras muestras (punto de tiempo 47 h) se introdujeron en una estufa a 40°C; 24 horas después se introdujeron en la estufa los segundos alícuotas de 250 microlitros (punto de tiempo 23 h); otras 20 horas después se introdujeron en la estufa los terceros alícuotas de 250 microlitros (punto de tiempo 2 h); los alícuotas de Oh se mantuvieron a 4°C durante este estudio. Todos los alícuotas se mantuvieron a 4°C hasta que se introdujeron en la estufa a 40°C. Tras un total de 47 h, todos los alícuotas se sacaron de la estufa y se centrifugaron a 16,100xg durante 10 min. La A280 de cada muestra se midió usando un lector de UV de placas de 96 pocilios para monitorizar la cantidad de proteína todavía en solución. Este dato se usó para calcular la concentración proteica para cada proteína en cada punto de tiempo y, esto, a su vez, se representó frente al tiempo para monitorizar la pérdida de proteína en el tiempo. Ejemplo 1: Prueba de la estabilidad acelerada de dAb anti-TNFR1 Para los dAb anti-TNFFM, seis dAb anti-TNFR1 se evaluaron, es decir DOM 1 h-574-72, DOM1 h-574-109, DOM1 h-574-133, DOM 1 h-574-138, DOM 1 h-574- 156 y DOM1 h-574-180, así como los dAb DOM1 h-131 -206 anti-TNFR1 no relacionados. Constructos genéticos de todos estos dAb clonados Sall/Notl en pDOM13 (un vector de expresión derivado de pBR322) se transformaron en E. coli HB2151, seguido por expresión de proteínas en el sobrenadante. Los dAb se purificaron del sobrenadante en una purificación de una sola etapa sobre Protein-A Streamline (GE Healthcare cat no. 17-1281-03), seguido por elución con glicina 100 mM a pH2,0 y neutralización con 200 mM Tris pH8. Tras concentración, los dAb se intercambiaron con tampón en PBS mediante diálisis y se analizó la estabilidad acelerada a 1 miligramo/mililitro. Los resultados de la estabilidad acelerada se muestran en la Tabla 1, en la que se indica la cantidad de dAb en solución en cada punto de tiempo en forma de un porcentaje de la cantidad de dAb presente a t= 0 h.

Tabla 1: Estabilidad acelerada para dAb anti-TNFFM cuando se incubó a 1 miligramo/mililitro en PBS A 40°C. Los valores representan la cantidad de dAb en solución en cada punto de tiempo en forma de un porcentaje de la cantidad de dAb presentes a t= 0 h.

Los dAb anti-TNFFM de la línea DOM1h-574, con al excepción de DOM1 h-574-133, tienden a precipitar en las primeras 47 h, lo que tiene como resultado una cantidad sustancialmente reducida de proteína en la solución en ese punto de tiempo. En contraste con esto, el dAb anti-TNFFM DOM1 h-131 -206 sí permanece en solución durante este periodo de tiempo. Por tanto, la estabilización del dAb para hacerlo más resistente a la precipitación en el estudio de estabilidad acelerada es beneficiosa.

Ejemplo 2: Selecciones v detección selectiva de dAb anti-TNFR1 de linaje DOM 1 h-574 para mejorar las propiedades biofísicas Para identificar nuevos dAb con mejor resistencia a la precipitación tras incubación a temperaturas elevadas se construyeron bibliotecas de PCR propensa a error sobre la base de cinco dAb anti-TNFR1. DOM1 h-574-156, DOM1 h-574-109, DOM 1 h-574-138, DOM1 h-574-162 y DOM1 h-574-180. Las construyeron bibliotecas de PCR propensa a error se construyeron usando estos clones en el vector pDOM13 como molde y después se sometieron a dos ciclos de PCR propensa a error usando GeneMorph II (Stratagene, n° cat. 200550). En la primera ronda se amplificaron 50 ng del vector durante 30 ciclos en un volumen de 50 microlitros usando los oligonucleótidos AS9 y AS339 y el siguiente perfil de amplificación 2 min 95°C y, después, 30 ciclos de: 15 s a 95°C, 30 s a 50°C, 1 min a 72°C; y al final 10 min a 72°C En la segunda ronda, se usaron 0.4 microlitros del primer producto de reacción de la PCR propensa a error como molde para la segunda ronda de mutagénesis con GeneMorph II (Strategene) con un volumen de 200 microlitros usando los cebadores anidados AS639 y AS65 y un perfil de amplificación: 2 min 95°C y, después, 35 ciclos de: 15 s a 95°C, 30 s a 50°C, 1 min a 72°C; y al final 10 min a 72°C.

Los productos de la PCR se purificaron en geles E al 2% usando el kit de extracción Qiagen Gel Extraction y se cortaron con las endonucleasas de restricción Sal I y Not I (NEB). Los productos de la reacción de digestión se pasaron por geles E al 2% y los insertos del ADN codificador del dAb se purificaron de los geles E usando el kit Qiagen Gel Extraction. Los insertos purificados se ligaron en el vector de expresión en fago pDOM33 usando el kit de la T4 ADN ligasa (NEB): 40 microlitros de 30 nM 0,7 microgramos/microlitro de vector pDOM33 cortado con Sal l/Not I 30 microlitros de inserto 300 nM 400 microlitros de H20 50 microlitros de tampón 10x 15 microlitros de 400U/microlitros de 4 ADN ligasa Las reacciones se incubaron a 16°C durante 18 horas. Los productos de la reacción se extrajeron con fenol-cloroformo, se precipitaron en etanol y se disolvieron en 50 microlitros de H20, se añadieron a 400 microlitros de células E. coli TB1 electrocompetentes y se sometieron a electroporación usando Bio- Rad Gene Pulser II en un volumen de 100 µ?, antes de sembrar en placas de agarosa con tetraciclina 2xTY. De media se obtuvieron 2,4x108 transformantes individuales para cada una de las cinco bibliotecas. De media había aproximadamente tres mutaciones de aminoácidos por gen.

Antes de comenzar las selecciones según mejores propiedades biofísicas, las cinco bibliotecas de fagos propensas a error se pre-seleccionaron en TNFR1 humano soluble (R&D Systems), que había sido biotinilado usando EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce Protein Research Products, Rockford Illinois, cat no.21327), para enriquecer el fago funcional con las propiedades de unión del TNFR1. La pre-selección se realizó usando el protocolo siguiente: 1. Bloqueo con 1 mi de M280 Streptavidin Dynabeads (Invitrogen) con 2% Marvel en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. 2. Bloqueo de aproximadamente 1011 unidades transformantes (Tu) del fago para cada una de las bibliotecas en 0,5 mi de PBS con 2% de Marvel durante una hora a temperatura ambiente. 3. Adición de 0,53 microlitros de 47 µ? TNFR1 humano soluble biotinilado hasta 0,5 mi del fago bloqueado. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 4. Añadir a la solución del fago 200 microlitros de Dynabeads bloqueadas. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 5. Lavar cinco veces con PBST (PBS con 0,1% de Tween 20) 6. Eluir el fago unido con 500 microlitros de glicina 0,1M a pH=2. 7. Neutralizar el fago eluido con 100 microlitros de 1 M Tris pH8.

Al final de la ronda de pre-selección se recuperó aproximadamente un 2% del fago Tu de entrada para cada biblioteca. Después de la pre-selección, las bibliotecas para los clones principales DOM1 h-574-109, DOM1 h-574-138, DOM1 h-574-162 y DOM1 h-574-180 se combinaron, formando la biblioteca A. La biblioteca B para DOM1 h-574-156 se mantuvo por separado.

En esta etapa se adoptaron cuatro estrategias de selección de expresión en fagos para enriquecer para variantes DOM1h-574 con mejores propiedades biofísicas de estas bibliotecas de PCR propensa a error: 1) Estabilidad cinética a temperaturas elevadas (65 °C) 2) Reversibilidad de la desnaturalización térmica (80°C) 3) Resistencia a la digestión con proteasas 4) Reversibilidad de la desnaturalización inducida por pH bajo.

Selección de la biblioteca de expresión en fagos Ronda 1.

En la primera ronda de selección de expresión en fagos, las bibliotecas A y B se diluyeron hasta 5x1011 Tu/ml en PBS y alícuotas de 100 microlitros se sometieron a pretratamiento térmico, con proteasas o con pH bajo. Para las selecciones térmicas (muestras 1 a 4, Tabla 2) se usaron temperaturas de 50°C a 80°C y periodos de incubación de 2 horas o 10 minutos, como se indica en la Tabla 2. La selección con tripsina (Promega, V511) (muestras 5 a 7) se realizó a 10-100 µg/ml de tripsina durante 2 h a 37°C en PBS y las incubaciones control se efectuaron a temperatura ambiente durante 2 h en PBS (muestras 8 y 9). Tras incubación, a cada una de las muestras 5-9 se añadieron 50 mi de 2xComplete inhibidores de la proteasa (Roche 04 693 116 001). para las selecciones ácidas, las muestras de fago 10-13 se diluyeron 10 veces con respecto a la reserva del fago en 420 microlitros de tampón HNC (HEPES 5 mM, NaCI 5 mM, citrato 100 mM, pH= 3,2). Al final de la incubación (la longitud de la incubación ácida para cada muestra se indica en la Tabla 2), las muestras se neutralizaron con 80 microlitros de tampón Tris.

Tras la incubación en estas condiciones de tensión, las bibliotecas de fagos se seleccionaron según los dAb f uncionalmente activos mediante incubación con TNFR1 soluble humano biotinilado, como se ha descrito en lo que antecede en la etapa de pre-selección. El único cambio en el protocolo usado fue que se realizaron diez etapas de lavado usando un Kingfisher. Para todas las selecciones como las bibliotecas A y B se determinó el número de fagos recuperado y se muestra en la Tabla 2. Después, los fagos se amplificaron para una siguiente ronda de selección.

Tabla 2: Selecciones de la ronda 1 para mejores propiedades. Se indican las condiciones de selección usadas y el fago Tu recuperado de cada una de las dos bibliotecas tras la selección. El valor inicial todas las selecciones fue 5x1010 de fago Tu.

Según los niveles de recuperación, los resultados de las selecciones 3, 4, 5 y 12 para ambas bibliotecas (y selección 6 para la biblioteca A) se pasaron a una segunda ronda de selección. Los resultados de fagos se amplificaron mediante una ronda de infección de E. coli y se purificaron después y concentraron hasta 2x1014 Tu/ml.

Selección de la biblioteca de expresión en fagos Ronda 2.

Los resultados de la primera ronda de selecciones de las bibliotecas A y B se diluyeron hasta 5x1011 de Tu/ml en PBS a y se usaron alícuotas de 00 microlitros de cada una para la segunda ronda de selección. Aunque se usó el mismo protocolo, las condiciones de selección se modificaron como se resume en la Tabla 3.

Tabla 3: Entradas de selección en la ronda 2, condiciones y recuperación. Entrada se refiere a la referencia de la condición de selección usada en la ronda 1. Para la biblioteca A, los resultados de selección para las condiciones 5 y 6 en la ronda 1 se combinaron y la combinación se usó cuando se indica con un "*". Las condiciones de selección incluyeron controles negativos para la unión de fondo en ausencia de ligando. La entrada para todas las selecciones fue 5x1010 de fago Tu Los resultados de fagos se purificaron y concentraron hasta 1x1013 Tu/ml. Los resultados de las selecciones 1, 4, 9 y 12 para ambas bibliotecas se pasaron a la siguiente ronda de selección. Los resultados de fagos se amplificaron mediante una ronda de infección de E. coli y se purificaron después y concentraron hasta 2x1014 Tu/ml.

Selección de la biblioteca de expresión en fagos Ronda 3.

Los resultados de la primera ronda de selecciones de las bibliotecas A y B se diluyeron hasta 5x1011 de Tu/ml en PBS a y se usaron alícuotas de 100 microlitros de cada una para la tercera ronda de selección. Aunque se usó el mismo protocolo, las condiciones de selección se modificaron como se resume en la Tabla Tabla 4: Entradas de selección en la ronda 3, condiciones y recuperación. Entradas se refiere a la referencia de la condición de selección usada en la ronda 2. Las condiciones de selección incluyeron controles negativos para la unión de fondo en ausencia de ligando. La entrada para todas las selecciones fue 5x1010 de fago Tu, las recuperaciones se produjeron en un volumen de 0,5 mi y los resultados se expresaron en Tu/ml.

Los resultados de fagos de la ronda 2 y la ronda 3 se amplificaron y se purificaron después y concentraron hasta 1x1013 Tu/ml Cultivos bacterianos (100 mi), infectados con el fago de los resultados de selección, se cultivaron y se usaron para recuperar ADN bicatenario de fago usando columnas de purificación Qiagen Midi DNA (Qiagen).

Los insertos de dAb de las selecciones 1 y 4 de la ronda 2 de las bibliotecas A y B, así como de las selecciones 2, 5, 9, 12 , 13 de la ronda 3 de la biblioteca A y las selecciones 1, 2, 5, 8, 9, 12 y 13 de la biblioteca B se amplificaron mediante PCR respecto a las alícuotas para preparación de fagos usando la Taq polimerasa con los cebadores CE2 y CE3. Los productos de amplificación se purificaron en gel y se cortaron con las enzimas de restricción Sal I y Not I antes de clonarse en le vector pDOM13 para su secuenciación y expresión.

Análisis de los resultados de selección: El análisis de las combinaciones de las secuencias de ADN de las variantes de DOM1h-574 seleccionadas tras la ronda 3 de la biblioteca B usando las selecciones en fagos mencionadas en lo que antecede reveló que diferentes presiones de selección habían enriquecido de forma preferencial diferentes grupos de mutaciones, como se resume en la tabla 5. Ciertas mutaciones observadas también están presentes en los dAb usados como punto de partida para las selecciones, es decir 30V y 62A están presentes en DOM1h-574-180, 30V está presente en DOM1 h-574-109 y 100A está presente en DOM1 h-574-138.

Tabla 5: Resumen que indica las posiciones y los cambios más frecuentes para cada condición de selección. El número de '+' es indicativo de la frecuencia relativa de dicho resto de aminoácido. Numeración de acuerdo con Kabat.

Ejemplo 3 Caracterización de los dAb seleccionados Usando la información del análisis de la secuencia de ADN se seleccionó un subgrupo de dAb anti-TNFR1, se resumió en la tabla 6, que combinó con diferentes mutaciones como se muestra en la figura 1. Para su caracterización posterior, estos dAb se expresaron en E. col i , se purificaron del sobrenadante usando unión discontinua a Protein-A Streamline e intercambio de tampón a PBS. Para facilitar el procedimiento de detección selectiva, las pruebas de estabilidad acelerada se modificaron ligeramente para el procedimiento descrito en lo que antecede.

Para las pruebas de estabilidad acelerada, las reacciones se llevaron a cabo en placa de PCR, se incubaron en ciclador térmico durante el periodo de tiempo deseado. d) 100 mi del dAb 1 miligramo/mililitro en PBS se dispensan en los pocilios de una placa de PCR. e) La proteína se incuba durante 40 horas a 40°C o 50°C. f) Se extrae un alícuota de 50 microlitros y se mide la D032o en un lector de microplacas (Molecular Devices) y, tras la medición, se devolvió al vaso de reacción. Lecturas más elevadas indican formación de agregados. La determinación de la DO320 se usa porque es la que mejor está adaptada para la determinación de precipitación y agregación, mientras que la D02so se usa mejor para la determinación de la concentración de proteína en la solución.

Los resultados de esta prueba se resumen en la tabla 6. Este análisis destaca los numerosos dAb con significativos incrementos de la estabilidad acelerada con respecto a DOM1 h-574-156 cuando se mide a 40°C Mientras que el clon de partida DOM1 h-574-156 da una absorbancia de 1,07 a 320 nm tras 40 h a 40°C, lo que indica precipitación de una cantidad significativa de proteína, muchos de los sAb nuevos tienen lecturas bajas (<0,5), lo que indica que una gran porción de la proteína todavía está en solución. Los incrementos más pronunciados en la estabilidad acelerada a 40°C durante 40 h se observan para DOM1 h-574-188, DOM1 h-574-191 , DOM1 h-574-192, DOM1 h-574-196, DO 1 h-574-201 , DOM1h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM 1 h-574-206 y DOM1 h-574-208.

Tabla 6: Nuevos dAb en los que se ha analizado la estabilidad acelerada. Para cada dAb se indica de qué biblioteca procede, así como las condiciones de selección usadas para identificad este dAb. Los dAb purificados (1 mg/ml) se analizó la estabilidad acelerada mediante incubación a 40°C o 50°C durante 40 h en una placa de PCR. Tras la incubación se determinó la DO320 para cada dAb, estableciendo el nivel de precipitación en cada pocilio. Cuando menos es el número, más estable es el dAb.

DOM1 h-574-207 se analizó en un tampón de Tris-glicina y fue más estable que DOM1 h-574-156.

Ejemplo 4 Los dAb anti-TNFR1 estables son funcionalmente activos Para confirmar el incremento de la estabilidad acelerada también se caracterizaron cuatro dAb nuevos con el protocolo más extenso descrito en el ejemplo 1. En este protocolo, los dAb se incuban hasta 48 h a 40°C, se centrifugan y los dAb restantes en solución se cuantifican usando D02eo- Los dAb analizados fueron DOM1 h-574-188, D0M1 h-574-196, DOM 1 h-574-208 y DOM 1 h-574-214 y los resultados se resumen en la tabla 7. Claramente, estos dAb son significativamente más estables en comparación con el dAb de partida DOM1 h-574-156 (datos históricos), dado que no se observa pérdida de proteína durante las primeras 48 h a 40°C. Para verificar que el incremento de estabilidad no se produce a expensas de la actividad anti-TNFR1 funcional del dAb, la afinidad de unión al TNFR1 de los dAb se determinó mediante BIAcore, usando TNFR1 biotinilado capturado en un chip de BIAcore SA. Aunque la afinidad del TNFR1 de estos dAb nuevos es ligeramente menor que la descrita anteriormente para el dAb DOM1 h-574-156 (150 pM), permanece dentro de 4 veces la del dAb parental. Por tanto, estos dAb combinan un incremento de la estabilidad acelerada sin comprometer mucho la afinidad del dAb por TNFR1.

Tabla 7: Estabilidad acelerada y afinidad por TNFR1 humano para nuevos dAb ant¡-TNFR1. El dAb purificado se incubó a 1 miligramo/mililitro en PBS a 40°C para las cantidades indicadas de tiempo. Después de este tiempo, se determinó el porcentaje de proteína residual mediante DO280. La afinidad por sTNFRI se determinó mediante BIAcore usando sTNFRI e inyectando el dAb como se ha descrito.

Ejemplo 5: Construcción de fusiones genéticas de dAb anti-TNFR1 estables con AlbudAbs Para extender la semivida en suero de los dAb anti-TNFR1 se fusionaron con el dAb de unión a albúmina DOM7h-11-3. Los cuatro dAb anti-T FR 1 estables escogidos fueron DOM1 h-574-188, DOM 1 h-574-196, DOM1 h-574-208 y DOM 1 h-574-214 y la fusión con DOM7h-11-3 usó como ligador la secuencia Ala-Ser-Thr. La construcción de estas moléculas de fusión se realizó en dos etapas. En primer lugar, los dAb anti-TNFR1 se amplificaron mediante PCR usando los cebadores AS9 y OA154, el producto de la reacción purificado se digirió después con Sall/Nhel, se purificó en gel y se ligó en el vector pDOM13 digerido con Sall/Nhel que contenía el ligador y DOM7h-11-3. Después de la ligadura, el ADN se transformó en células XL10-Gold (Stratagene) y se escogieron colonas para el análisis de la secuencia. Después de confirmar la secuencia de este constructo, se realizó la segunda etapa de la construcción amplificando el cásete anti-TNFR1/anti-Albúmina usando los oligonucleótidos JAL102 y AS65. Los productos de la reacción se digirieron con las enzimas de restricción Nde l/Not I y se pasaron en un gel de agarosa y se purificaron mediante extracción en gel. El fragmento de ADN purificado que contenía el producto de fusión se clonó después en el vector pET30a cortado con Nde l/Not I (Merck). La clonación en este vector se efectuó para permitir la expresión de la proteína usando inducción con IPTG en un termentador y tendrá como resultado el procesamiento del dAb sin ningún resto de aminoácido principal. Esto contrasta con el vector pDOM13, que añadirá Ser-Thr en el extremo N de todos los dAb expresados en este vector. Las siguientes fusiones dAb anti-TNFFM /DOM7h-11 -3 se construyeron en pET30a: Para la expresión, los constructos se transformaron en la cepa de E. coli BL21 (DE3) con pECO-1pgl como se describe en Aon y col. 2008. Los cuatro constructos se expresaron después en un termentador usando crecimiento a 23°C tras la inducción y se indujo la expresión con IPTF 0,01 mM. Todas las fermentaciones se realizaron a una densidad celular alta en medio mínimo a la escala de 5L.

El extracto periplásmico se preparó del siguiente modo: Pasta celular congelada se descongeló y mezcló con 0,5 GuHcl, 200mM Tris pH8, 10mM de EDTA a 37°C durante la noche antes de centrifugar durante 1 hora a 4500 g y desechar el sedimento. La purificación del periplasma se realizó mediante unión discontinua a proteína A, seguida por la elución con 100mM Glicina pH2 y neutralización con 200 mM Tris pH8. La proteína eluida se intercambió con tampón a PBS Y se concentró antes de la caracterización funcional.

Ejemplo 6: Caracterización de las fusiones anti-TNFR 1/anti-albúmina La proteína purificada para DMS5535, DMS5541, DMS5542 y DMS5544 se caracterizó en una serie de pruebas para demostrar que estas moléculas son estables y tienen una buena actividad anti-TNFR1.

Caracterización de la estabilidad acelerada Para evaluar las propiedades físicas de la moléculas, se analizó la estabilidad acelerada de las proteínas de fusión. Dado que cabe esperar que las moléculas sean significativamente más estables, las pruebas de la estabilidad acelerada se realizaron a 1 miligramo/mililitro en PBS durante 28 días a 40°C, en lugar de 2 días. Los resultados se resumen en la tabla 8. A partir de los resultados se puede concluir que todos los constructos son muy estables sin pérdida de proteína, determinado por la DO280 tras 28 días. El ligero incremento de la proteína observado es más probable que se deba al error dentro de este procedimiento de detección y no es significativo.

Tabla 8: Resumen de la estabilidad acelerada y caracterización funcional de las fusiones genéticas anti-TNFFM/anti-albúmina. La estabilidad acelerada se cuantifico como el porcentaje de proteína-fusión en solución tras 28 días a 40°C determinado mediante la DO 280· Las afinidades con BIAcore™ affinities (KD) se determinaron inyectando al menos seis concentraciones diferentes de anti-TNFR1/AlbudAb™ (un AlbudAb es un dAb anti-seroalbúmina). Este procedimiento se realizó en dos experimentos independientes y se realizó la media de los valores de estos experimentos, engendrando la desviación estándar citada (SD). La potencia de las fusiones anti-TN FR 1 /Albudab se determinó en el ensayo con células HUVEC. Los valores medios de CE50 se calcularon a partir de un total de 7 experimentos para todas las fusiones anti-TNFR1 /Albudab SE= error estándar de la media Caracterización funcional de proteína anti-TNFR1/anti-albúmina Para garantizar que la actividad funcional anti-TNFR1 de la molécula no se ha alterado se analizaron las cuatro fusiones genéticas de anti-TNFR1/anti-albúmina en ensayos funcionales para determinar su afinidad por el TNFR1 y su potencia al inhibir la señalización inducida por TNFa Afinidad por TNFR1- Bl Acore La afinidad de las fusiones anti-TNFR1 /AlbudAb por el TNFR1 humano se determinó mediante BIAcore. BREVEMENTE, las moléculas anti-TNFR1 se inyectaron sobre un chip BIACore con estreptavidina sobre el que se había inmovilizado TNFR1 humano biotinilado. La asociación y disociación se determinaron a diferentes concentraciones del anti-TNFR1 inyectado. Los resultados de esta caracterización se resumen en la Tabla 8 e indican que las moléculas son aglutinantes de alta afinidad del TNFR1 humano (KD <280 pM). La afinidad por el TNFR1 humano determinada mediante BIAcore de la fusión anti-TNFR1/AlbudAb es ligeramente superior que la determinada para el dAb anti-TNFR1 sencillo usado en cada uno de los constructos de combinación.

Potencia en el ensayo celular HUVEC Un segundo ensayo funcional para determinar la actividad anti-TNFR1 de los dAb es el ensayo HUVEC. Brevemente, en este ensayo, las células HUVEC se pre-incuba durante 1 hora con el dAb, seguido por estimulación con 1 ng/ml de TNFa. Esta estimulación produce un incremento de la expresión de VCAM en la célula, que puede determinarse. El nivel de inhibición de la expresión de VCAM inducida por TNFa proporcionada por el dAb se determina representando la concentración de dAb frente a la expresión de VCAM.

Los resultados se resumen en la tabla 8 y demuestran que las fusiones anti-TNFR1/AlbudAb tienen una potencia de un dígito nM en este ensayo HUVEC.

En conclusión, realizando selecciones de expresión de fagos de bibliotecas mutantes en condiciones de selección duras, hemos podido identificar nuevos dAb anti-TNFR1. Estos dAb combinan la alta afinidad por TNFR1, determinada mediante BIACore, con incremento de la estabilidad acelerada. Además, las propiedades de unión se mantienen cuando estos dAb se fusionan con otra proteína o péptido, como se pone de ejemplo con DOM7h-11-3 AlbudAb, y la estabilidad se incrementa más. Estos dAb representan una mejora significativa y las nuevas propiedades de los dAb deberían mejorar la capacidad para desarrollar estos dAb como agentes terapéuticos. Protocolo de BIAcore Las afinidades de unión por la unión a TNFR1 humano recombinante se evaluaron mediante análisis BIAcore™ . El análisis se llevó a cabo usando chips recubiertos con estreptavidina (SA) (BIAcore, n° de cat. BR-1000-32). Un chip de SA se recubrió a una densidad baja usando hTNFR biotinilado. Las moléculas analizadas se inyectaron sobre esta superficie a siete concentraciones, es decir a 32, 16 (dos veces), 8, 4, 2, 1 y 0,5 nM, en orden aleatorio usando un caudal de 50 µ?/min. Entre las inyecciones individuales, la superficie se regeneró de nuevo al valor basal usando 10mM glicina pH 2,0. Los datos se corrigieron según los artefactos del instrumento usando referencia doble. Los experimentos se llevaron a cabo en una máquina BIAcore™ 3000 y los datos se analizaron usando el software BIAevaluation, versión 4,1, las kon y k0a se ajustaron de forma simultánea usando un modelo de unión de Langmuir 1:1. Para el fin de ajustar, el intervalo de concentración 1-32 nM se usó para los monómeros, mientras que para las moléculas de fusión AlbudAb se usó 0,5-16 nM. Los datos de unión se ajustaron bien al modelo 1:1 de todas las moléculas analizadas. Todos los valores de KD se calcularon a partir de las tasas kon y ko . Los ciclos de BIAcore™ se realizaron a 25°C.

Protocolo del ensayo con células HUVEC Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) responden al tratamiento con TNF-a mediante regulación por aumento de la expresión de VCAM-1. Los dAb anti-TNFR-1 inhiben la acción de TNF-a, por tanto, se puede observar una reducción de la expresión de VCAM-1 por las células HUVE en presencia de dAb anti-TNFR1. Para evaluar esta inhibición, brevemente, células HUVEC normales combinadas ((Promocell # C-12203) se siembran en placas de microtitulación de 96 pocilios revestidas con gelatina (VWR # 734-0403) (4x104 células/pocilio) en medio de crecimiento de células endoteliales (Promocell # C-22110). Las células se dejan adherir durante la noche (37°C/5% C02) antes de añadir un intervalo de dosis de dAb o sólo medio a las células y las placas se dejan a 37°C/5% C02 durante una hora. Una concentración fija de TNF-a (1ng/ml, Peprotech # 300-01A) se añade después a las células, que se incuban durante 23 horas más (37°C/5% C02). Como control negativo, las células se incuban con medio solo y para control positivo las células se incuban con TNF-a solo.

Tras la incubación, el sobrenadante del cultivo celular se aspira y las células se lavan tres veces en PBS helado. Las células se lisan mediante la adición de 75µ?/??????? de tampón de lisis glicerol-Tris helado (40mM Tris, 274mM NaCI, 2% Triton-X-100, 20% Glicerol, 50mM NaF, 1m Na3V0 , 1x comprimido de inhibidor de la proteasa por 10mls (Roche # 11-836-170-001)) y se incuban durante 15 min en hielo. Después, los Usados celulares se transfieren a un ELISA de tipo sándwich con VCAM-1.

Para el ELISA de tipo sándwich con VCAM-1, inmunoplacas F96 Maxisorp Nunc # 439454) se revisten durante la noche a 4°C con mAb anti-VCAM-1 (R&D systems # MAB809, 2 microgramos/mililitro), 100ul/pocillo en PBS. Al día siguiente, las placas se lavan y bloquean con 1% de BSA/PBS (200ul/pocillo) durante 1 hora antes de la adición de los Usados celulares de HUVE (50ul/pocillo) . Las placas se incuban con los Usados durante 2 horas y se lavan de nuevo antes de la adición del Ab policlonal ant¡-VC AM1 biotinilado (R&D systems # BAF809) 0,4 0.4 microgramos/mililitro en 0,1% BSA/PBS, 0.05% Tween-20, 10Oul/pocillo e incubación durante otra hora. Las placas se lavan de nuevo antes de la adición de estreptavidina-HRP (diluida de acuerdo con las instrucciones del fabricante en 0,1% BSA/PBS, 0,05% Tween), 100ul/pocillo. La estreptavidina-HRP unida se visualiza mediante la adición de sustrato de TMB-1 peroxidasa Sureblue (KPL-# 52-00-00) y la reacción se detiene mediante la adición de HCI 1M. La absorbancia se lee inmediatamente en un lector de placas SpectraMax M5e (Molecular Devices) a 450 nm.

Los valores brutos de la DO se exportan a Microsoft Excel y los valores de fondo de DO (células Incubadas solo con medio) se restan de todos los puntos de datos. Para calcular la inhibición de la regulación por incremento de VCAM-1 inducida por TNF-a por las células, se calcula el porcentaje de inhibición de la expresión máxima de VCAM-1 (como muestra el control positivo) a cada concentración de dAb usando la fórmula siguiente: % inhibición de regulación por incremento máxima de VCAM-1 = 100- (valor de DO en una dilución concreta de dAb/valor de DO del control positivo)*100 Después, los valores de la concentración de dAb se representan frente al porcentaje de inhibición en GraphPad Prism y las curvas del efecto de la concentración y los valores de la potencia (CE50) se determinan usando una curva de respuesta a la dosis sigmoidal con una pendiente variable.

La concentración de TNF-a usada para estimular las células es de aproximadamente 70% (CE70) de la respuesta máxima al TNF-a por las células.

Referencias: Aon JC, Caimi RJ, Taylor AH, Lu Q, Oluboyede F, Daily J, Kessler MD, Kerrigan JJ, Lewis TS, Wysocki LA, Patel PS. Suppressing posttranslational gluconoylation of heterologous proteins by metabolic engineering of Escherichia coli. Appl Environ Microbio!. 2008 Feb; 74(4):950-8. Epub 2007 Dic 14.

LISTADO DE SECUENCIAS Todas las secuencias de nucleótidos se escriben de 5' a 3' y todas las secuencias de aminoácidos se escriben del extremo N al extremo C.

DOM1 h-131 -206 se divulga en el documento WO2008149148 (cuya secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos, como se divulgan en dicha solicitud de PCT, se incorporan expresamente en la presente memoria descriptiva por referencia como se escribe explícitamente en la presente memoria descriptiva y para usar con la presente invención, y se contempla que cualquier parte de dicha divulgación se puede incorporar en una o más de las reivindicaciones del presente documento).

Oligonucleótidos usados: AS9: CAGGAAACAGCTATGACCATG AS339: TTCAGGCTGCGCAACTGTTG AS639: CGCC AAGCTTGC ATGC AAATTC AS65: TTGTAAAACG ACGGCC AGTG CE2: CTTAA AC AGCTTG ATACCG CE3: GACAGCCCTCATAGTTAG OA154: TTCTTTTGCTAGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTC JAL102: GGAATTCCATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCT GCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGA GGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGG Secuencias de nucleótidos: >DOM1h-574-188 G AGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAA GTATTCAATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAA CACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCG GTATATTACTGTGCGATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-189 G AGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGG ATTC ACCTTTTTCAA GTATTCG ATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAG A GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC 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GTATATTACTGTGCGATATACACTGGGCGTTGG GTGCCTTTTG AGTA CTGG GGTCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCTAGC ACCG A CATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG ACCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGGACGAC GTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGG AAAGCCCCTAAGCTCCTG ATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGG GGTCCCATCACGTTTCAG TGG CAGTGGATCTGGG ACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTG C AACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGC AGGCTGGGACGC ATCCTACGACGTTCG GCCAAGGGACCAAG GTGG AAATCAAACG G >DMS5544 G AG GTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGG G G GGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAA GTATTCAATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGTCTAGA GTG GGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC ACTCCGTGAAGG GCCGGTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA C ACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCTGAG GACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTGG GGTCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTC GAGCGCTAGC ACCGA C ATCC AGATG ACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC ATCTGTAGG AG ACCGTGTCACC ATC ACTTGCCGGGCAAGTCGTCCGATTGGG ACG AC GTTAAGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGG AAAGCCCCTAAGCTCCTG ATCCTTTGGAATTCCCGTTTGCAAAGTGG GGTCCCATCACGTTTCAG TG G CAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTG CAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCGCAGGCTGGGACGC ATCCTACGACGTTCG GCCAAGGGACCAAG GTGG AAATCAAACGG > DOM 1 h-574-72 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG GGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGC GTCTCTCCTGTGC AG CCTCCGG ATTC ACCTTTGTTA A GTATTCG ATGG GGTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAG A GTGGGTCTCACAGATTTCG AATACTGCTGATCGTAC ATACTACGCAC ACTCCGTG A AGG GCCG GTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA C ACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCTGAG GACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTG GGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-109 GAGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAA GTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAA C ACGCTGTATCTGC AAATG AACAGCCTGCGTGCTGAGG ACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-133 GAGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAA GTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGATC ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA C AC GCTGTATCTGC A AATG A ACAGCCTGCGTGCCGAGG ACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACGGGTCGTTGGGAGCCTTTTGTCTA CTGGGGTC AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-138 GAGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTCAA GTATTCG ATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC ACTCCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA C ACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACGGGTCGGTGGGCGCCTTTTGAGTA CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-156 G AGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGG AGGCTTGGTAC AGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGG ATTCACCTTTTTCAA GTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC ACTCCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA C ACGCTGTATCTGC AAATG AACAGCCTGCGTGCTG AGG ACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-180 G AGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAA GTATTCG ATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACGCAC ACGCGGTG AAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA C ACGCTGTATCTGC AAATG AACAGCCTGCGTGCTG AGG ACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC >DOM1h-574-162 G AGGTGCAGCTGTTGG AGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGG GGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGG ATTC ACCTTTTTCAA GTATTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGA GTGGGTCTCACAGATTTCGGATACTGCTGATCGTACATACTACTCAC ACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCG ACAATTCCAAGAA CACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACCGCG GTATATTACTGTGCG ATATATACTGGGCGTTGGGTGCCTTTTGAGTA CTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC DOM7h-11-3 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTA GGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCG TCCGATTGG G ACGACGTTAA GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTA AGCTCCT GATCCTTTGG AATTCCCGTT TGCAAAGTGG GGTCCCAT CA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CC ATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTGCG CAG GCTGGG ACGC ATCCTACGAC GTTCGGCCAA GGGACCAAGG TGG AAATCAA ACGG Secuencias de aminoácidos: >DOM1h-574-188 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAI YTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-189 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAVYTGRWEPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-190 E VQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMG WIRQAPGKGLEW VSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AVYTGRWAPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-191 EVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYSMG WVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAIYTGRWVPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-192 EVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYSMG WVRQAPGKGLE 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EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHS VKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAI YTG R WAPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1 -574-204 E VQLLESGGG LVQPGGSLR LSCAASGFTFFKYSMG WVRQAPGKG LE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR VEDTAVY YCAI YTGQWAPYE YWGQGTLVTVRA >DOM h-574-205 E VQLLESGGG LVQPGGSLR LSCAASGFTFDKYSMGWVRQAPGKDLE WVSQ!SDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAI YTGR WVPFENWGHGTLVTVSS >DOM1h-574-206 EVQLLDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYSPSVKGRFTISRDNSGNTLN LQMTPLR AEDTAV Y YC Al YTGR WEPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1 -574-207 E VQLLESGGG MVQPGG SLR LSCASSGFTFSKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADLTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAEY YCAIYTGRWAPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-208 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCAI YTG RWVPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-209 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRD SKNTLYLQMNSLR VEDTAVY YCAIYTGQWAPYE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-211 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAIYTGRWVPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-212 EVQLLESGGGLVQPGGSLR LSCAASGFTFSKYSMG WVRQAPGKG LE WVSQISDTADRTYYAHS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAIYTGRWVPFE YWGQGTLVTVSS >DO 1h-574-213 EVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFDKYSMG WVRQAPGKG LE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTITRDNSKNTLYLQMN SLR AEDTAVY YCAI YTG RWEPFE YWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-214 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYADS VKGRFTISRD SKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAIYTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS >DMS5535 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQM SLR AEDTAVY YCAI YTGR WEPFEYWGQGTLVTVSSASTDIQMTQSPSSLSASVGDR VT ITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLILWNSRLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTTFGQGTKVEIKR >DMS5541 EVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFDKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAH A VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAIYTGR WVPFEYWGQGTLVTVSSASTDIQMTQSPSSLSASVGDRVT 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YCAIYTGRWEPFVYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-138 EVQLLESGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMG WVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAI YTGRWAPFEYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-156 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHSVKGRFTISRD SKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YCAI YTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-180 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYAHAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YC A I YTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS >DOM1h-574-162 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFKYSMGWVRQAPGKGLE WVSQISDTADRTYYSHSV GRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVY YC Al YTGRWVPFEYWGQGTLVTVSS DOM7h-11-3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIGTTLSWYQQKPGKAPKLLIL WNSRLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQAGTHPTT FGQGTKVEIKR

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica (o 100% idéntica) a la secuencia de aminoácidos de DOM1h-574-188, DOM1 h-574-189, DOM1 h-574-190, DOM1 h-574-191 , DOM1h-574-192, DO 1 h-574-195, DOM 1 h-574- 196, DOM1h-574-201, DOM1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM 1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1 h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM 1 h-574-208, DOM1 h-574-209, DOM1 h-574-211 , DOM 1 h-574-212, DOM 1 h-574-213 o DOM1 h-574-214, en el que el dominio variable sencillo tiene una DO320 <1,0, <0,9, <0,8, <0,7, <0,6, <0,5, o <0,4 tras la incubación en PBS a 40°C durante 40 horas.

2. Un ligando multiespecífico que comprende un dominio variable sencillo de inmunoglobulina de la reivindicación 1 y, opcionalmente, al menos un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une específicamente a seroalbúmina (SA).

3. Un ligando multiespecífico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el ligando comprende (i) un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55) de acuerdo con la reivindicación 1, (ii) al menos un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-seroalbúmina (SA) que específicamente se une a la SA, en el que el dominio variable sencillo anti-SA comprende una secuencia de aminoácidos que es, en al menos, un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica (o 100% idéntica) a la secuencia de DOM7h-11 -3, y (iii) opcionalmente, en el que se proporciona un ligador entre el dominio variable sencillo anti-TNFR1 y el dominio variable sencillo anti-SA.

4. El ligando de la reivindicación 3, en el que el ligador comprende la secuencia de aminoácidos AST, (opcionalmente ASTSGPS), o en el que el ligador es AS(G4S)n, en el que n es 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 u 8, por ejemplo AS(G4S)3.

5. Un antagonista de TNFR1 que comprende un dominio variable sencillo o ligando multiespecífico de cualquier reivindicación precedente.

6. Un antagonista del receptor de tipo 1 de TNFa (TNFR1; p55) de acuerdo con la reivindicación 5, para administración oral, administración en el tracto Gl de un paciente, administración pulmonar, administración en los pulmones de un paciente o administración sistémica.

7. Un antagonista del receptor de tipo 1 de TNFa (TNFR1; p55) de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 para tratamiento y/o profilaxis de una afección inflamatoria.

8. El uso del antagonista de TNFR1 de de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una afección inflamatoria.

9. Un procedimiento de tratamiento y/o la profilaxis de una afección inflamatoria en un paciente, en el que el procedimiento comprende administrar el antagonista de la reivindicación 5 ó 6 al paciente.

10. Un ligando multiespecífico que comprende o consiste en DMS5535, DMS5541, DMS5542 o DMS5544.

11. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica (o 100% idéntica) a la secuencia de nucleótidos de DMS5535, DMS5541, DMS5542 o DMS5544.

12. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor de tipo 1 anti-TNFa (TNFR1; p55) de acuerdo con la reivindicación 1.

13. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable sencillo de inmunoglobulina del receptor anti-TNFa de tipo 1 (TNFR1; p55) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es, al menos, un 70, 75 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica (o es 100% idéntica) a la secuencia de nucleótidos de DOM h-574-188, DOM1 -574- 89, DOM1 h-574-190, DOM1h-574-191, DOM1h-574-192, DOM1 h-574-193, DOM 1 h-574- 194, DOM1 h-574-195, DOM1 h-574-196, DOM1 h-574-201 , DOM 1 h-574-202, DOM1 h-574-203, DOM1 h-574-204, DOM1 h-574-205, DOM1h-574-206, DOM1 h-574-207, DOM1 h-574-208, DOM 1 h-574-209, DOM 1 h-574-211, DOM1 h-574-212, DOM1 h-574-213 o DOM 1 h-574-214.

14. Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, 12 ó 13.

15. Una célula huésped (opcionalmente una célula embrionaria no humana) que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 14.