CN102409020A - 一种无纺布/聚酯类纤维培养细胞用载体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无纺布/聚酯类纤维培养细胞用载体及其使用方法。具体包括：1)无纺布/聚酯类纤维细胞培养载体；2)无纺布/聚酯类纤维细胞培养载体加工制作方法；3)在细胞培养系统中，使用无纺布/聚酯类纤维细胞培养载体，进行细胞培养的工艺和方法。本发明使用了一种价格低廉且适合细胞贴壁生长的材料，制作细胞载体，培养细胞，大大降低了细胞载体及细胞培养的成本；用该材料预先制作成的各种几何形状的载体可以提供更大的表面积，以生长更多量的细胞；同时，根据具体细胞培养工艺的不同需要，该材料可以加工成不同形状和大小的载体，为工艺调节和优化提供了更大的空间。

Description

一种无纺布/聚酯类纤维培养细胞用载体及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种无纺布/聚酯类纤维培养细胞用载体及使用其进行细胞培养的工艺和方法。

背景技术

细胞载体培养是一种可以大规模培养贴壁细胞的技术和方法，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。通过对细胞没有毒副作用的载体介质，细胞贴附于载体表面或内部，可以大大提高细胞培养面积和效率，比如微载体培养技术，具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势，培养条件(温度、pH值、二氧化碳浓度等)容易控制，并且培养过程系统化、自动化，不易被污染。但是，目前市面上的细胞载体(例如cytodex系列微载体)大多价格昂贵，不适于工业化大规模培养细胞。

经对现有技术文献的检索发现，M.Pohl scheidt等人在《Vaccine》Volume26，Issue 12，17March 2008，Pages 1552-1565上发表的“Development andoptimisation of a procedure for the production of Parapoxvirus ovisby large-scale microcarrier cell culture in a non-animal，non-humanand non-plant-derived medium”(“非动物/人/植物源培养液大规模微载体细胞培养生产Parapoxvirus ovis的过程发展和优化”)中，报道了使用Cytodex-

微载体进行了50L牛肾细胞BK KL3A株反应器悬浮培养，并且对工业大规模工程放大做了基础研究，而这种大规模的细胞培养和重复性的生产活动需耗费大量的微载体，目前常用的商品化微载体有cytodex系列、biosilon系列、solo微载体等，这些微载体对用于细胞培养来说，价格往往过于昂贵，用于大规模生产成本大，不适合进行工业化生产；同时，作为成型商品，这些细胞载体的形状和大小已经固定，不易加以改动，影响了相应工艺的设计、改进和优化。

发明内容

为了克服上述现有常见细胞载体的缺陷，发明人经过研究开发，提供了利用一种价格低、易于切割加工的无纺布/聚酯类纤维作为细胞培养载体，在细胞培养系统中实施贴壁细胞载体培养，有利于降低工业化大规模贴壁细胞载体培养的成本。

本发明使用的细胞贴壁生长载体，是一种无纺布/聚酯类纤维。无纺布(英文名：Non Woven)又称不织布。是由定向的或随机的纤维而构成，它是一种不需要纺纱织布而形成的织物，只是将纺织短纤维或者长丝进行定向或随机撑列，形成纤网结构，然后采用机械、热粘或化学等方法加固而成。因具有布的外观和某些性能而称其为布。无纺布是新一代环保材料，具有防潮、透气、柔韧、质轻、不助燃、容易分解、无毒无刺激性、色彩丰富、价格低廉、可循环再用等特点。制作无纺布的纤维材料主要有聚丙烯或者聚酯纤维等。其中，聚酯纤维由有机二元酸和二元醇缩聚而成的聚酯经纺丝所得的合成纤维。它是以精对苯二甲酸(PTA)或对苯二甲酸二甲酯(DMT)和乙二醇(EG)为原料经酯化或酯交换和缩聚反应而制得的成纤高聚物--聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，经纺丝和后处理制成的纤维。

本发明即是使用无纺布/聚酯类纤维为材料制作成的各种形状和大小的细胞载体，进行细胞培养制备病毒或生产疫苗的工艺和方法。

本发明包括以下步骤：

1)将无纺布/聚酯类纤维材料用物理或者化学方式进行适当处理(包括进行各种表面处理)，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；同时，剪切加工制作成不同形状和大小的、具有一定强度的、用于细胞培养的各种细胞生长载体。

2)在细胞培养系统(包括各种细胞培养瓶、袋、生物反应器等)中，以上述无纺布/聚酯类纤维的加工品(包括切片、碎片、颗粒等)作为载体，用合适的细胞培养液(基)，进行细胞培养。

3)获取细胞生长或代谢数据；或者，收获细胞或细胞产生物。

本发明以无纺布/聚酯类纤维为材料制作成细胞培养载体，进行细胞培养，具有以下优点：

1、拥有较高的细胞培养比表面积，从而可以增加细胞培养体系内的细胞总量。例如，应用于细胞培养滚瓶内部，通过增大单个滚瓶的细胞培养面积，减少滚瓶数量，从而降低劳动强度，并减小细胞感染机率。

2、细胞所承受的剪切力较小，并可保证较高的营养利用率和氧传递率。例如在应用于固定床技术培养细胞工艺中，细胞可以牢固贴附于无纺布/聚酯类纤维材料表面和内部，培养液可以通过在载体间流动，提高营养成分的利用率；同时，细胞嵌于载体内部纤维中，降低了外部剪切力对细胞的损伤，从而可以通过加大搅拌速率或流体流经速率而提高氧传递效率。

3、降低成本：无纺布/聚酯类纤维用作载体，与传统常见的商品化细胞载体相比，价格低廉，从而可以降低细胞培养成本，更适合于产业化大规模贴壁细胞载体培养。

4、价格低廉，可以一次性使用，减少了生产批次间的交叉污染。

5、无纺布/聚酯类纤维材料易于被切割成各种形状和大小，比如圆形、三角形、四方形、菱形等等，大大增加了使用的范围，提高了工艺优化的空间。

附图说明

图1为本发明细胞载体的一种形状--圆片形；

图2为本发明细胞载体的一种形状--长片形；

图3为本发明细胞载体的一种形状--折叠菱形；

图4为本发明细胞载体的一种形状--碎纤维碎屑形。

具体实施方式

具体实施例1

本实施例子中采用连续灌注固定床培养的方法，在生物反应器中培养扩增vero细胞，然后接种、制备狂犬病毒，生产狂犬病毒疫苗。将无纺布/聚酯类纤维制作成直径为6mm的圆形小片体，作为细胞生长载体。

1、采用美国BBA Fiberweb的Reemay公司(Old Hickory，TN，USA)生产的无纺布聚酯类纤维(Non Woven Polyester Fabric)，style no.2214作为无纺布/聚酯类纤维材料，经表面处理并切割成直径为6mm的圆形小片体。

2、从种子细胞库中复苏1支vero细胞(由非洲绿猴肾细胞培育出的可传代的广谱宿主细胞，购买自中国药品生物制品鉴定所)，48小时传代，用方瓶扩增。

3、细胞生物反应器选择的是购买自美国NBS公司的5L生物反应器CelligenPlus，工作体积3.5L，采用固定床篮式搅拌系统。在生物反应器中加入上述处理切割好的直径为6mm的圆形聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，121摄氏度消毒30分钟。消毒后，排空磷酸缓冲液，加入vero细胞生长培养基，并开始细胞生物反应器条件控制。

4、将方瓶扩增好的vero细胞，作为细胞生物反应器的种子细胞，以2-5×10⁵/mL的密度接种到生物反应器中的无纺布/聚酯纤维圆形小片载体上，用细胞增殖培养液进行扩增培养。其中聚酯纤维圆形小片载体的使用量为每升罐体积35g，所使用的细胞增殖培养液为DMEM-F12培养基加10％新生牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度(pH)值7.2，温度37℃，溶氧浓度(DO)空气饱和的50％，搅拌速度120rpm。

5、在vero细胞生长至一定密度时，一般在接种后7-13天，换用细胞维持培养基，以0.005-0.125MOI(用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)感染复数接种狂犬病毒7aG株，使细胞感染；细胞所用的细胞维持培养液使用DMEM-F12培养基加上1％的小牛血清配制而成；设定生物反应器培养的条件为pH值7.6，温度36℃，溶氧浓度(DO)空气饱和的50％，搅拌速度为100rpm。连续灌注收获20天，病毒滴度保持在81gLD50/mL以上。

6、收获的病毒液用1∶4000β-丙内酯灭活。

7、以sepharose 4 fast flow为填料进行层析纯化，收集抗原峰。

8、纯化除菌后病毒原液加入1％人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂。

9、病毒滴定，效力测定，蛋白含量测定，牛血清蛋白残留量测定，残余DNA测定按照《中国药典》2005版相关要求进行。

具体实施例2

本实施例子中采用连续灌注悬浮培养的方法，在生物反应器中培养可胞外表达分泌一种基因重组人蛋白的基因重组CHO细胞，连续收获含有目标重组人蛋白的收获液。将无纺布/聚酯类纤维制作成碎屑碎纤维体，作为细胞生长载体。

1、无纺布材料采用国内某公司生产的聚酯纤维无纺布，将材料经过适当碎切，成为碎屑碎纤维状载体，作为细胞培养用载体。

2、生物反应器选择的是荷兰Applikon autoclavable bioreactor 15L反应器，工作体积11L。将碎屑碎纤维状无纺布细胞载体用PBS冲洗，膨胀过夜，漂洗几次后加入生物反应器，高压灭菌。加入无菌细胞生长液，浸泡载体。

3、从生产细胞库中复苏1支重组CHO细胞，用方瓶培养扩增。

4、将方瓶扩增扩增好的重组CHO细胞，以3-6×10⁵/mL的密度接种到装有碎屑碎纤维状无纺布/聚酯类纤维载体的生物反应器罐中，用细胞培养液进行载体悬浮培养，其中无纺布/聚酯类纤维载体的使用量为每升罐体积45g，所使用的细胞培养液为DMEM-F12培养基加10％新生牛血清。细胞培养条件为pH值7.0-7.2，温度37℃，溶氧浓度(DO)空气饱和的50％，搅拌速度15-35rpm。

5、接种后培养约8天，通过生物反应器的细胞/载体截流装置，连续抽取细胞培养收获液，同时连续等量等速加入新鲜细胞培养液，开始实施连续灌注培养。

6、根据反应器中的细胞活率及细胞密度、细胞/载体截流后的细胞流失量、细胞代谢数据、产品蛋白表达情况等信息调节灌注速率，实施过程优化。

7、对所得到的收获液进行超滤浓缩，去除一定量的水分。

8、对浓缩后的收获液进行蛋白纯化。

9、按照药物技术法规做成蛋白制剂。

以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用无纺布/聚酯类纤维培养细胞用载体及其使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将无纺布/聚酯类纤维材料用物理或者化学方式进行包括各种表面处理在内的处理，以更利于细胞贴壁或生长或改善材料强度；同时，剪切加工制作成不同形状和大小的、具有一定强度的、用于细胞培养的各种细胞生长载体；

2)在包括各种细胞培养瓶、袋、生物反应器在内的细胞培养系统中，以上述聚酯类纤维材料加工成包括切片、碎片、颗粒在内的加工品作为载体，用细胞培养液/基，进行细胞培养；

3)获取细胞生长或代谢数据；或者，收获细胞或细胞产生物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞可以是下列中之一个或多个组合：CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞/Chinese hamster ovary cell)、BHK21细胞(幼金仓鼠肾细胞/Baby hamster kidney cell)、Marc145细胞(克隆恒河猴肾细胞/Maacague kidney cell)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞/Kidney cells of Afrcan Green Monkey)、F81细胞(猫肾细胞/Kidney cellsof Cat，Felis catus)、猪肾传代细胞系(PK-15或IBRS-2)或其它敏感猪源细胞、ST细胞(胎猪睾丸细胞/Testis cells of swine)、牛睾丸细胞(Testiscells of fetus boyine)、牛羊犬等的肾细胞、鸡胚成纤维细胞、昆虫细胞(包括按蚕蛾(anteraea eucalypti)卵巢细胞、白纹伊蚊(Aedes albopictusSkuse)细胞Aa2-678、小菜蛾(Plutell xylostella L innaeus)细胞BCIRL-Px2-HNU3、草地贪叶蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞Sf21及其克隆株Sf9和粉纹夜蛾(Trichop lusiani)胚胎细胞BTI-Tn5-BI-4(商业上称之为High Five))；上述各种细胞应包含其各所属所有亚型细胞株及其各种驯化、基因工程改造型细胞株。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括：所述细胞培养包括动物组织培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，细胞培养系统包括搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、细胞悬浮或贴壁式生长生物反应器、间歇式或流加式或连续灌注式生物反应器、wave生物反应器在内的细胞培养生物反应器，以及包括各种细胞培养瓶、袋系统、一次性塑料袋系统在内的各种形式和基于各种原理的细胞培养系统或装置。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：细胞培养方式包括常见的贴壁固定床式细胞培养、载体悬浮式细胞培养，以及其各种衍变方式。

6.一种可用于培养细胞的聚酯类纤维细胞载体，其特征在于，包括：制作该载体的聚酯类纤维类材料包括聚丙烯类、聚酯类、粘胶类、丙烯酸纤维类、聚酰胺类以及其他纤维经过化学或物理进行包括表面处理在内处理后的裁体，所述载体包括经过剪切或加工而成具有不同形状和不同大小的、具一定强度的、可用于细胞培养的各种细胞生长载体。

7.如权利要求6所述的聚酯类纤维细胞载体，其特征在于：所述载体由无纺布/聚酯类纤维材料制作的切割方式和切割形状可随具体应用而任意变化；可以但不局限于制作成包括圆形、方形、三角形、碎屑、碎纤维等各种可以设想和制作出来的形状和任意大小，所述载体可以但不局限于是球状、棒状、条状、片状在内的任何规则和不规则形载体。

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