CN102296046B - 可用于预防慢性重金属中毒的重组食品级乳酸菌、其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组食品级乳酸菌，及其制备方法，特别是涉及利用谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白进行融合表达的方法。本发明将编码上述融合蛋白的基因克隆到乳酸菌组成型食品级表达载体pMG36m中，然后转化至乳酸乳球菌MG1363，并利用蜜二糖作为碳源进行重组子筛选。重组乳酸工程菌在发酵过程中能持续表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白，且该蛋白具有结合生活环境中重金属Pb、Cd以及Hg的能力。本发明还涉及所述重组食品级乳酸菌在制备用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组食品级乳酸菌，及其制备方法及所述重组食品级乳酸菌在制备用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品中的应用。
背景技术
随着中国各产业工业化的发展，重金属污染已成为社会十分关注的问题。大量的有毒重金属离子通过水、空气、土壤以及生物链污染到人类赖于生存的动植物产品及水源上，给人们的健康带来潜在的危害。一般来说，重金属污染是指铅、汞、镉、砷等重金属离子的污染，常以慢性中毒的方式危害于人类，而这种危害又往往容易被人们所忽视。重金属污染的主要来源一方面是未经处理的工业废水、废气、废渣的随意排放。另一方面则是农业上滥用的农药和化肥。
有毒重金属可以随着各种食物和水进入人体并造成极大危害[Rusyniak DE，et al.，2010，EXS，100：365-396；Johri N，et al.，2010，Biometals，23(5)：783-792]。1)铅对人体各系统均有毒害作用，尤其是神经系统和造血系统。在神经系统方面，铅中毒早期可出现高级神经机能障碍，而晚期则可造成器质性脑病及神经麻痹；在造血系统方面，铅可以干扰血红素的合成而造成贫血。此外，铅对儿童的生长发育影响极大，过量的铅可以严重妨碍儿童智力正常发育。2)砷在环境中大都以无机砷和烷基砷的形态存在，其中三价砷化合物，如三氧化二砷，具有很大的毒性。人体如果长期接触砷，会引起细胞中毒，甚至会诱发恶性肿瘤。此外，砷还能透过胎盘损害胎儿的正常发育。3)汞离子早已成为大众健康的公害，可以在动物体内蓄积，其对人体的神经系统、肾、肝脏等器官均可产生不可逆的损害。4)镉进入体内可损害血管，导致组织缺血，引起多系统损伤；还可干扰铜、钴、锌等微量元素的代谢，阻碍肠道吸收铁，并能抑制血红蛋白的合成和肺泡巨噬细胞的氧化磷酰化的代谢过程，进而引起肺、肾、肝损害，同时也具有致癌、致畸和致突变作用。
从上述资料可知，重金属污染的问题实际也是食品安全的重大问题。受到重金属污染的蔬菜、水果、粮食、鱼肉等并不能通过多浸泡、多清洗或多煮来去除。相反，在食物链的生物放大作用下，其能成千上万倍地富集，最后进入人体。随着蓄积量的增加，机体便出现各种病态反应。目前，防治重金属污染主要还是预防为主，临床上治疗重金属中毒首选药物是依地酸二钠钙，其次是二已烯二胺五乙醇三钠钙和二硫醇钠，但这些学药物只能静脉给药，不能口服，而且不能长期使用。另外，这些药物对几乎所有金属都具有络合作用，为非特异性吸附，故对人体有益的金属也因此丧失，如锌、铁等[Flora SJ和Pachauri V，2010，Int.J.Environ.Res.PublicHealth，7(7)：2745-2788]。
金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类广泛存在于动物、植物以及微生物中富含半胱氨酸的蛋白质，具有非常保守的一级结构和相似的空间结构。由于具有结合重金属离子、清除自由基、抗辐射以及调节微量元素平衡等重要生理功能，且与动物机体的生长发育及部分疾病的发病机理有着密切的关系，因此，MT一直是生物学与医学领域中基础研究和应用研究的热点之一(Liu et al.，1998，Toxicol.Sci.，46：197-203；Zeng et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9984-9988；Zangger et al.，2001，FASEB J，15：1303-1305；Li et al.，1998，Nucleic Acids Res.，26：5182-5189)。
MT富含巯基及其重金属结合能力决定了它在重金属解毒方面起着重要的作用。MT的巯基基团(-SH)能强烈螯合有毒金属Hg、Pb、Cd、As等，其螯合Pb的强度比Zn大200倍，而螯合Cd的强度又比Pb大10倍。实验证明，MT的解毒机理主要是螯合进入细胞内的重金属离子，形成无活性的重金属-MT复合物，随后将之排出体外。在临床应用上，MT已被医疗科研人员视为最理想的生物整合解毒剂[Flora SJ和Pachauri V，2010，Int.J.Environ.Res.Public Health，7(7)：2745-2788]。
利用哺乳动物、酵母以及大肠杆菌表达MT的生产方法已有许多报道(CN101144093B；ZL96100897.0；CN1803840A；CN1348010A；CN1376719A)。然而，利用动物生产以及重金属诱导获得的可溶性MT，产量极低且提纯步骤繁复。而在利用基因工程技术生产MT方面，则主要以大肠杆菌作为优选宿主细胞(Hong et al.，2001，Protein Expression andPurification，21：243-250)。尽管大肠杆菌表达系统具有表达量高、易于培养和操作以及生产成本低等优点，然而，大肠杆菌所具有细菌内毒素以及具有致病性，又大大限制了重组蛋白，例如MT，在医药、食品以及化妆品等方面的广泛应用。为此，寻找一种理想的食品级表达载体表达MT就具有十分重要的研究意义和应用价值。
乳酸菌(lactis acid bacteria，LAB)是一类能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌，其包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属，在食品工业各个领域中的长期应用已证明其无致病性，被公认为安全级(generally recognized as safe，GRAS)微生物。在人和大多数动物体内，乳酸菌广泛分布于消化系统、呼吸系统、泌尿系统、口腔系统、皮肤系统和粪便当中。研究发现，乳酸菌具有提供人体必需的营养物质、维持泌尿生殖系统健康、增强机体免疫作用、降低胆固醇含量、改善胃肠道功能以及抗肿瘤作用等多种重要的生理功能。而在这些功能中，后两种研究得最多，也最有应用价值。乳酸菌在人体消化道和生殖道中大量存在，其它部位比较少。一般情况下，从口腔、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠到直肠，其数量会逐渐增加(103--1012/每克细菌)。其改善胃肠道功能的机理在于：一方面，其通过自身及其代谢产物和其它细菌之间的相互作用，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定，抑制有害菌的增殖，降低了有害菌毒素的产生；另一方面，通过产酸、表达酶类和细菌素、合成维生素以及分解胆盐维持内环境的稳定。而在抗肿瘤活性方面，乳酸菌可以通过降解或者吸附致癌物、阻止肠内致癌物的形成、增强宿主免疫系统、产生抗突变的物质、改变肠道的生理生化环境以及通过增加NADPH还原酶的活性等方面来显著改善人体的生理机能，抑制肿瘤细胞的增殖[贾士芳郭兴华，1996，生物工程进展，16(2)：16-20]。
有鉴于其具有极其重要应用价值，从20世纪80年代开始，人们就开始致力于对各种乳酸菌，尤其是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的生物学特性和分子机制研究。乳球菌作为表达外源蛋白的理想菌株有其独特的优势：首先，该菌已经进行全基因组测序，其所有的功能基因以及生化途径一清二楚；其次，乳球菌抗原性弱，不会产生内毒素，宿主本身不会引起强烈的免疫应答；再次，乳球菌本身分泌蛋白较少，Usp45(一种分子量为45kDa的未知蛋白)是迄今唯一可检测由乳酸乳球菌分泌的蛋白。这一特点减少了载体自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰；最后，乳球菌不在胃肠道内定殖，这一特点可以避免因其长期定殖而导致的免疫耐受。目前，乳球菌已作为一种食品级表达宿主用于表达各种抗原、生长因子以及功能蛋白。
乳球菌属中的质粒是研究最多的乳酸菌质粒，作为理想的表达载体，现时已经广泛应用于基因工程领域。然而，传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素等)抗性的基因，如果将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于抗性因子的转移，将会对生物安全性产生严重后果。为了构建一个食品级的表达载体，最有效的办法就是用安全的食品级标记替代抗生素抗性标记。现时，用于乳球菌表达系统的食品级选择性标记主要有三类：糖类利用标记、营养缺陷型标记和编码细菌素抗性。1)糖类作为选择标记，主要是利用某种糖(如蜜二糖、乳糖、D-木糖等)作为发酵底物，将能发酵这种物质的酶基因(例如，α-半乳糖苷酶)克隆并与表达载体连接，然后转化到不能利用这种物质的乳球菌中进行表达，这样就可通过该物质作为底物来筛选；2)营养缺陷型标记。这是一类为以细菌管家基因缺陷株为受体菌，在质粒上克隆入同源或异源的受体菌缺陷基因(如胸苷酸合成酶、氨基酸消旋酶、赭石突变抑制基因等)作为外源基因稳定表达的选择标记；3)细菌素抗性或免疫性标记。某些细菌通过核糖体机制可以产生具有抑菌活性的蛋白质，而其本身对所产这类细菌素具有免疫性。对于一些不能产生这类物质的乳酸菌，细菌素(如nisin)就可以作为筛选标记。
本发明的主要目的就是实现MT融合蛋白在乳酸菌中持续表达，由于重金属离子可以自由通过乳酸菌的细胞膜，因此，乳酸菌内的MT可以将人体胃肠道内所含的有毒重金属离子结合，形成无毒的复合物。最后，该工程菌从人体内排出，从而有效预防人体慢性重金属中毒。
发明内容
针对上述研究背景，本发明涉及一种含人IA型金属硫蛋白(Humanmetallothionein-I，hMT-IA)融合蛋白的重组食品级乳酸菌，及其制备方法，特别是涉及利用谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)、小分子泛素相关修饰因子成熟肽(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)和hMT-IA进行融合表达的方法。本发明将编码上述融合蛋白的基因克隆到乳酸菌组成型食品级表达载体pMG36m中，然后转化至乳酸乳球菌MG1363，并利用蜜二糖作为碳源进行重组子筛选。重组乳酸工程菌在发酵过程中能持续表达含IA型金属硫蛋白的融合蛋白，且该蛋白具有结合生活环境中重金属Pb、Cd以及Hg的能力。本发明还涉及所述重组食品级乳酸菌在制备用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品中的应用。
因此，本发明涉及以下各项：
1.一种表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌，其通过下述方法制备：构建一种以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组表达载体，并转化到乳酸菌宿主细胞中。
2.上述1中所述的重组食品级乳酸菌，其中所述的融合蛋白由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成，且三种蛋白是按所述顺序从融合蛋白的N端到C端依次编码(图2)。
3.上述2中所述的重组食品级乳酸菌，其中所述谷胱甘肽S-转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；所述小分子泛素相关修饰因子成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；人IA型金属硫蛋白相关修饰蛋因子蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
4.上述1中所述的重组食品级乳酸菌，其中所述抗性筛选标记为α-半乳糖苷酶(SEQ ID No：4)。
5.上述1-4中任何一项的重组食品级乳酸菌，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：5所示。
6上述1-4中任何一项的重组食品级乳酸菌，其中所述重组表达载体衍生于pMG36e(图1，SEQ ID No：6)。
7.上述1中的重组食品级乳酸菌，其中所述的乳酸菌宿主细胞选自：乳球菌(例如，乳球菌MG1363、LM0230、MG1614)，粪肠球菌(例如，粪肠球菌OGIX、FA2-2)，或植物乳杆菌(例如，ATCC 8014)，优选乳酸乳球菌MG1363。
8.一种制备表达含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法，该方法包括以下步骤：
1)构建以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组表达载体；
2)将1)中构建的重组表达载体转化乳酸菌宿主细胞中，并且用含蜜二糖的乳酸菌培养基(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠，0.5％蜜二糖和1.5％琼脂粉)筛选转化成功的重组乳酸菌。
9.上述8中所述的方法，其还包括下述步骤：
3)在适于以可溶形式表达融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的重组乳酸菌；和
4)在3)的重组乳酸菌内表达出所述含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白。
10.根据上述8所述的方法，其中所述的乳酸菌宿主细胞选自：乳球菌(例如，乳球菌MG1363、LM0230、MG1614)，粪肠球菌(例如，粪肠球菌OGIX、FA2-2)，或植物乳杆菌(例如，ATCC 8014)，优选乳酸乳球菌MG1363。
11.根据上述9的方法，其中所述适于以可溶形式表达融合蛋白的条件是指在含有0.5％蜜二糖的乳酸菌培养基(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠和0.5％蜜二糖)中，37℃厌氧静置培养24小时。
12.上述1中表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌在制备用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品中的应用。
13.上述12中所述的应用，其中所述的重金属是指铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)或它们的任意组合。
14.一种用于预防人慢性重金属中毒的药物，其包含药效学有效量的上述1-7中任一项所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
15.一种用于预防人慢性重金属中毒的食品，其包含有效量的上述1-7中任一项所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
16.一种用于预防人慢性重金属中毒的化妆品，其包含有效量的上述1-7中任一项所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
更具体地，在本发明的重组表达载体中，其中所述融合蛋白中的谷胱甘肽S-转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No：7)、小分子泛素相关修饰因子成熟肽的核苷酸序列(SEQ ID No：8)、人IA型金属硫蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No：9)以及α-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ ID No：10)可以是天然来源中筛选的野生序列或人工化学合成的序列。
在本发明的一个方面中，其中所述小分子泛素相关修饰因子成熟肽是指酿酒酵母泛素相关修饰因子(Smt3 or yeast Small Ubiquitin-relatedModifier)成熟肽。
在本发明的一个方面中，其中所述的谷胱甘肽S-转移酶是指日本血吸虫(Schistosoma japonicum)谷胱甘肽S-转移酶。
在本发明的一个方面中，其中所述的α-半乳糖苷酶是指植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)α-半乳糖苷酶。
得到编码谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽以及人IA型金属硫蛋白融合蛋白基因的优选方法是人工合成方法，因为这样可以避免氨基酸密码子偏好性的影响，从而增加目的蛋白的表达量。可以按照Itatura等人所述的技术(Science，1977，198：1056-1063)来合成基因，也可以利用本领域已知的技术从宿主基因组中获得和鉴定基因。而本领域已知的技术包括进行基因的合成、克隆和表达载体的构建、DNA序列分析及鉴定、宿主细胞的转化和培养以及表达产物的分离鉴定等操作(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
可以使用任何一种适于在其中以高效表达所需蛋白质(由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽以及人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白)的乳酸菌作为宿主，这样的菌株包括乳球菌(例如，MG1363、LM0230、MG1614)、粪肠球菌(例如，OGIX、FA2-2)以及植物乳杆菌(例如，ATCC 8014)等。本发明优选的宿主是乳酸乳球菌MG1363(购自NIZO Co.Ltd.，Netherlands)。
本发明涉及一种制备表达含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法，该方法包括以下步骤：
1)构建以α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)为抗性筛选标记的表达含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组表达载体；
2)将1)中构建的重组表达载体转化乳酸菌宿主细胞中，并且用含蜜二糖的乳酸菌培养基(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠，0.5％蜜二糖和1.5％琼脂粉)筛选转化成功的重组乳酸菌。
优选地，上述方法还可以包括下述步骤：
3)在适于以可溶形式表达融合蛋白的条件下培养步骤2)中被转化的重组乳酸菌；
4)在3)的重组乳酸菌内表达出由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白。
优选地，其中所述的乳酸菌宿主细胞选自：乳球菌(例如，MG1363、LM0230、MG1614)，粪肠球菌(例如，OGIX、FA2-2)，或植物乳杆菌(例如，ATCC 8014)，优选乳酸乳球菌MG1363。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明涉及一种制备含人IA型金属硫蛋白(Human metallothionein-IA，hMT-IA)融合蛋白的重组食品级乳酸菌的方法，该方法包括以下步骤：
1)人工合成编码由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽、人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No：11)；
2)提供编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ ID No：10)；
3)从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中获得编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列，然后用限制性内切酶EcoR I和Nsi I对编码α-半乳糖苷酶的核苷酸序列进行酶切反应；
4)将步骤(3)中核苷酸序列连接到用限制性内切酶EcoR I和Nsi I处理过的乳酸菌组成型表达载体pMG36e上，获得重组表达质粒pMG36m；
5)用步骤(4)的重组表达载体转化适当的乳酸菌宿主细胞MG1363中，蜜二糖作为碳源筛选重组子；
6)从阳性重组子中抽提重组表达质粒pMG36m，然后利用限制性内切酶Sac I以及Sph I对该重组质粒进行酶切，然后与经相同限制性内切酶处理的步骤(1)中核苷酸序列相连，获得重组表达质粒pMG36m-GSMT；
7)用步骤(6)的重组表达载体转化乳酸菌宿主细胞MG1363中，蜜二糖作为碳源筛选重组子；
8)在适于以可溶形式表达融合蛋白的条件下培养步骤7)中被转化的乳酸菌宿主细胞；
9)通过分子生物学技术，例如链式聚合酶反应(Polymerase chainreaction，PCR)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及蛋白质杂交技术(Western blot，WB)，筛选和分析高效表达目的融合蛋白的重组乳酸菌表达菌株。
根据本发明的方法，其中所述适于以可溶形式表达融合蛋白的条件是指在含有0.5％蜜二糖的乳酸菌培养基(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠和0.5％蜜二糖)中，37℃厌氧静置培养24小时。
毋庸置疑地，本发明所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌可以用于制备食品，所述食品包括可以含有食品级乳酸菌的所有种类的食品，例如，酸奶，诸如：纯酸奶、调味酸奶或果肉酸奶等。并且，包含本发明所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌的食品还具备预防人慢性重金属中毒的功效。因此，本发明提供一种预防人慢性重金属中毒的食品，其包含有效量的本发明所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。本发明还提供本发明所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌用于制备用于预防人慢性重金属中毒的食品的应用。
本发明还提供所述表达由谷胱甘肽S-转移酶的核苷酸序列、小分子泛素相关修饰因子成熟肽、人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白的重组食品级乳酸菌可以在药品及化妆品制剂方面应用：包括将上述的重组食品级乳酸菌加入本领域技术人员熟知的药物载体或赋形剂，按照化妆品领域的常规方法制成适于外用的霜剂、乳化剂或者水剂等剂型；也可以将上述的重组食品级乳酸菌加入药品领域技术人员熟知的载体或赋形剂并按照药品领域的常规方法制成适于口服的固态或者液态药品。本发明优选药品方面的应用。
本发明的重组食品级乳酸菌可以单独或组合物的形式用作预防人类重金属中毒的药品，其中所述的组合物形式，包括片剂、包衣片剂、糖锭剂、硬和软明胶胶囊、溶液、乳剂或混悬剂。
上述药物组合物可以通过用药用惰性的无机或有机载体加工本发明的重组乳酸菌来获得。例如可以将乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等用作这些用于片剂、包衣片剂、糖锭剂、和硬明胶胶囊的载体。软明胶胶囊的适当载体有，例如，植物油，蜡，脂肪，半固体和液体多元醇等。然而，取决于活性物质的性质，在软明胶胶囊的情形中通常不需要载体。生产溶液和糖浆的适当载体有，例如，水，多元醇，甘油，植物油等。栓剂的适当载体有，例如，天然或硬化油，蜡，脂肪，半液体或液体多元醇等。
此外，药物组合物可以含有防腐剂，增溶剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，甜味剂，着色剂，调味剂，改变渗透压的盐，缓冲液，掩蔽剂或抗氧化剂。它们也可以还含有其它的在重金属中毒治疗上有价值的药用物质，例如二己烯二胺五乙醇三钠钙和二硫醇钠。
因此，本发明提供本发明所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌在制备用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品中的应用，其中所述的重金属是指铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)或它们的任意组合。
本发明还提供一种用于预防人慢性重金属中毒的药物或化妆品，其包含药效学有效量的本发明所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
本领域技术人员应该注意，上述“药学有效量”或“有效量”意指治疗有效量，本领域技术人员根据现有技术、经过简单的、有限次的实验即可确定其具体的数值。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1.乳酸菌表达质粒pMG36e图谱；
图2.融合蛋白结构图；
图3.融合蛋白Western Blot检测(1.表示空白对照；2-3.融合蛋白与谷胱甘肽S-转移酶抗体反应；4-6.融合蛋白与小鼠MT抗体反应)；
图4.不同剂量的重组乳酸菌对染镉大鼠肝组织影响的病理切片分析，图中数字说明：1、2为对照组(生理盐水组)；3、4为模型组(氯化镉溶液处理组，0.65mg/ml/d)；5、6为含空载体乳酸菌组(0.65mg/ml/d氯化镉溶液+1x108个细胞/ml/d含pGM36m空载体的乳酸菌)；7、8为高剂量乳酸菌组(0.65mg/ml/d氯化镉溶液+1x108个细胞/ml/d重组乳酸菌)；9、10为中剂量乳酸菌组(0.65mg/ml/d氯化镉溶液+1x107个细胞/ml/d重组乳酸菌)；11、12为低剂量乳酸菌组(0.65mg/ml/d氯化镉溶液+1x106个细胞/ml/d重组乳酸菌)。
序列表说明
为了清楚起见，以下对后附序列表中各个序列作简要说明：
SEQ ID NO.1：日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶的氨基酸序列(参见AAC00518；N端-C端，共211个氨基酸)；
SEQ ID NO.2：酿酒酵母泛素相关修饰因子成熟肽的氨基酸序列(参见AAB01675以及Johnson，E.S.2004，Annu.Rev.Biochem.，73，355-382；N端-C端，共98个氨基酸)；
SEQ ID NO.3：人IA型金属硫蛋白的氨基酸序列(参见NP_005937；N端-C端，共61个氨基酸)；
SEQ ID NO.4：植物乳杆菌α-半乳糖苷酶的氨基酸序列(参见CAI60220，N端-C端，共738个氨基酸)；
SEQ ID NO.5：谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白的氨基酸序列(N端-C端，共370个氨基酸)；
SEQ ID NO.6：乳酸乳球菌表达质粒pMG36e的核苷酸序列(5’-3’，共3611个碱基)
SEQ ID NO.7：编码日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶的核苷酸序列(参见AF044411，5’-3’，共636个碱基)；
SEQ ID NO.8：编码酿酒酵母小分子泛素相关修饰因子成熟肽的核苷酸序列(参见Schwartz D.C.et al.，2003，Trends Biochem.Sci.，28：321-328；5’-3’，共294个碱基)；
SEQ ID NO.9：编码人IA型金属硫蛋白的核苷酸序列(参见NM_005946，5’-3’，共186个碱基)；
SEQ ID NO.10：含有EcoR I和Nsi I限制性内切酶酶切位点的编码植物乳杆菌α-半乳糖苷酶(Mel A)的核苷酸序列(参见AJ888516，5’-3’，共2235个碱基)；
SEQ ID NO.11：编码由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白的核苷酸序列(5’-3’，共1113个碱基)；
SEQ ID NO.12：mel AF(5’-3’，共32个碱基)；
SEQ ID NO.13：mel AR(5’-3’，共29个碱基)；
SEQ ID NO.14：GSMT-F(5’-3’，共35个碱基)；
SEQ ID NO.15：GSMT-R(5’-3’，共36个碱基)；
SEQ ID NO.16：经EcoR I和Nsi I双酶切表达质粒pMG36e后得到的载体DNA大片段(5’-3’，共2589个碱基)
SEQ ID NO.17：含Sac I和Sph I限制性内切酶酶切位点的编码由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成的融合蛋白的核苷酸序列，GSMT(5’-3’，共1131个碱基)
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。
实施例1：植物乳杆菌中编码α-半乳糖苷酶基因的获得
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum(Orla-Jehsen)Holland，ATCC11095，广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.191)菌株在GM17平板[成分：3.725％M17肉汤(M17Broth，购自Biokar Diagnostics，France)，0.5％葡萄糖，1.5％琼脂粉]上进行菌种活化，37℃厌氧培养48h。然后，挑取单克隆转接至GM17液体培养基[成分：3.725％M17肉汤，0.5％葡萄糖]，37℃厌氧静置培养直至OD600＝0.6，离心收集菌体并利用细菌基因组提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction KitVer.2.0，购自大连宝生物工程有限公司，大连，中国)抽提基因组DNA。以该基因组DNA为模板，加入mel AF(SEQ ID NO.12)和mel AR(SEQID NO.13)(均由中国上海生工生物工程技术服务有限公司合成)作为上下游引物，再加入dNTP(各2.5μmol·L-1)10μl，10x PCR pfu缓冲液10μl以及pfu Taq DNA聚合酶1μl(5U/μl)，加水至总体积为100μl，按照标准的PCR反应条件(94℃变性4分钟后进入循环，循环参数为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸180秒，共30个循环)进行目的片段的扩增。电泳检测并回收目的DNA片段(Agarose Gel DNAFragment RecoveryKit Ver.2.0，购自大连宝生物工程有限公司，大连，中国)并命名为Mel A(SEQ ID NO.10)。该片段包含植物乳杆菌的α-半乳糖苷酶基因，两端分别含有EcoR I(GAATTC)和Nsi I(ATGCAT)限制性内切酶酶切位点。
实施例2：重组食品级乳酸菌表达载体pMG36m的构建
将含有pMG36e质粒的野生型乳酸乳球菌MG1363(购自NIZO Co.Ltd.，Catalog：ELS09000-01，Netherlands)在含红霉素抗生素的EGM17固体培养平板(成分：3.725％M17肉汤，0.5％葡萄糖，1.5％琼脂粉，终浓度为10μg/ml的红霉素)上划线培养。37℃厌氧培养36小时后，从平板培养基上挑单菌落接种至含红霉素抗生素的EGM17液体培养基(成分：3.725％M17肉汤，0.5％葡萄糖，终浓度为10μg/ml的红霉素)中，37℃厌氧静置培养至OD600＝0.6。离心收集菌体并利用质粒抽提试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0，购自大连宝生物工程有限公司，大连，中国)获得质粒pMG36e。按照已有的方法建立标准的限制性内切酶消化体系，然后利用EcoR I(购自New England Biolabs，Inc.，Catalog：R0101L，USA)和Nsi I(购自New England Biolabs，Inc.，Catalog：R0127L，USA)处理pMG36e(具体操作参考Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)，回收分子量约2.6kb的大片段(SEQ ID NO.16)。利用相同的限制性内切酶处理并回收实施例1中得到的Mel A，然后与上述约2.6kb的载体大片段相连，构建出重组乳酸菌组成型表达质粒pMG36m。将该重组质粒利用电转方法转化宿主菌NZ9000(购自NIZO Co.Ltd.，Catalog：ELS09000，Netherlands)中，蜜二糖为碳源的培养平板(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠，1.5％琼脂粉和0.5％蜜二糖)筛选重组子。培养增殖后从转化株中抽提重组质粒pMG36m，按本领域工作人员熟知的方法测序确定片段插入的方向以及编码的氨基酸都是正确的(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。抽取测序正确的重组载体质粒备用。
实施例3：重组表达质粒pMG36m-GSMT的构建
将编码由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成融合蛋白的DNA片段送到广州杰特伟生物科技有限公司(Guangzhou Jetway Biotech Co.Ltd.，China)进行全基因合成。以此DNA片段为模板，GSMT-F(SEQ ID NO.14)和GSMT-R(SEQ ID NO.15)为上下游引物，再加入dNTP(各2.5μmol·L-1)10μl，10x PCR pfu缓冲液10μl以及pfu Taq DNA聚合酶1μl(5U/μl)，加水至总体积为100μl，按照标准的PCR反应条件(94℃变性4min后进入循环，循环参数为94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸180秒，共25个循环)进行目的片段的扩增。电泳检测并回收目的DNA片段并命名为GSMT(SEQ ID NO.17)。该片段两端分别含有Sac I(GAGCTC)和Sph I(GCATGC)的限制性内切酶酶切位点。建立标准的限制性内切酶消化体系，然后利用Sac I(购自New England Biolabs，Inc.，Catalog：R0156L，USA)和Sph I(购自New England Biolabs，Inc.，Catalog：R0182L，USA)处理GSMT。回收片段后，与利用相同限制性内切酶处理并回收的实施例2中得到的pMG36m相连，构建重组食品级乳酸菌表达质粒pMG36m-GSMT。
实施例4：重组食品级乳酸菌的制备及融合蛋白的表达
将乳酸乳球菌MG1363在GM17固体培养平板(成分：3.725％M17肉汤，0.5％葡萄糖，1.5％琼脂粉)上划线培养。37℃厌氧培养36h后，从平板培养基上挑单菌落接种至GSGM17B肉汤液体培养基(成分：3.725％M17，0.5％葡萄糖，17％蔗糖，2％甘氨酸)中，37℃厌氧静置培养至OD600＝0.3。4℃，6000rpm离心20分钟，弃上清。然后用预冷的GSGM17B洗涤2次后置于冰上，制备成乳酸菌感受态细胞。取出5μg重组乳酸菌表达质粒pMG36m-GSMT，加入到上述制备好的乳酸菌感受态细胞中。在电压为2000V，脉冲时间为4ms的条件下进行电转化。电转后，取100～200μl菌液涂布于筛选培养平板(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠，1.5％琼脂粉和0.5％蜜二糖)上，37℃、厌氧静置培养1～2天。利用PCR技术鉴定阳性重组子。挑取阳性重组子接种到表达培养基(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠和0.5％蜜二糖)中，37℃、厌氧静置培养1天。发酵结束后，12000rpm离心收集菌体，按1∶10的比例(v/w)加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬菌体。然后，利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心30分钟，收集上清。SDS-PAGE以及Western-blot检测和分析融合蛋白的表达(具体操作参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。通过薄层凝胶扫描以及灰度分析结果表明，重组融合蛋白在乳酸菌中得到表达(融合蛋白结构如图2)，其分子量约为41kDa，表达量约为20mg/L。此外，融合蛋白可以与谷胱甘肽S-转移酶抗体以及小鼠MT抗体产生阳性反应(图3)。
实施例5：重组食品级乳酸菌以及含hMT-1A融合蛋白的金属耐受能力
在表达培养平板中(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠，1.5％琼脂粉和0.5％蜜二糖)添加不同浓度的Cd2+(200μM、300μM、400μM、500μM)和Zn2+(4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM)，然后在平板上接种表达MT融合蛋白的重组乳酸菌，以含空载体的乳酸菌作为对照，37℃厌氧静置培养1天。实验结果表明，重组乳酸菌对Cd2+和Zn2+的最高耐受浓度分别为400μM和5.0mM。收集菌体并利用原子吸收光谱法分析MT融合蛋白具有结合重金属离子的能力，结果表明，其对Cd2+和Zn2+的结合能力分别高于对照菌的4.7倍和4.3倍。
实施例6：重组食品级乳酸菌制剂对预防大鼠亚慢性镉中毒的应用
在5ml的表达培养基接种上述能表达重组融合蛋白的乳酸工程菌，然后，37℃、厌氧静置培养2天。将所有的培养液全部接入到50ml新鲜表达培养基中，37℃、厌氧静置培养1天。取200μl菌液接种到固体培养基(成分：2％蛋白胨、0.5％酵母粉、0.4％氯化钠，0.15％乙酸钠，1.5％琼脂粉和0.5％蜜二糖)中进行菌落计数，其余部分通过5℃，12000rpm离心30分钟后，收集菌体并利用常规的方法冻干，置于5℃保存[周华伟等，2005，生命科学研究，9(2)：72.]。通过平板计数的方式得到原来菌液中乳酸菌的含量后，用生理盐水稀释冻干的乳酸菌，分别调整为1x106、1x107以及1x108个细胞/ml的不同剂量。
从广东省实验动物中心购买SPF级雄性Wistar大鼠(8周龄，体重130±10g)，适应性喂饲7天后，每周一至周五上午通过灌胃方式服用氯化镉溶液(配制0.65mg/ml的工作溶液，服用剂量为5mg/kg/d，每天一次，每次1ml)，周末2天正常饲养，连续饲养8周。对于实验组，在服用氯化镉溶液同时，分别服用不同剂量的重组乳酸菌制剂(分别含重组乳酸菌低剂量1x106个细胞/ml/d，中剂量1x107个细胞/ml/d，高剂量1x108个细胞/ml/d，每天1次，每次1ml)。以含空载体的乳酸工程菌溶液(1x108个细胞/ml/d，每天1次，每次1ml)作为对照。
实验结束后，采集各组动物的肝脏、肾脏、脑、睾丸以及血液进行分析。结果显示，重组乳酸菌可以显著降低镉在体内各脏器中的蓄积，且呈剂量依赖性。在肝脏组织中，模型组大鼠肝脏外观颜色变暗，肝细胞呈现疏松肿胀，部分变性，有部分肝小梁拥挤，排列受破坏，肝窦受压变窄，中央静脉充血。乳酸菌中低剂量组可见肝细胞的病变有所改善，但仍有明显的疏松肿胀及中央静脉充血。乳酸菌高剂量组则显著改善镉对肝细胞的毒害作用，与空白对照组相比，肝损伤没有明显的差异(图4)。
实施例7：香蕉酸牛奶的制备工艺及食用方法
首先制备复原乳溶液：称取10g脱脂奶粉(市售)并置于1L三角瓶中，加入190mL蒸馏水溶解后，95℃处理15min，然后冷却至4℃保存。将本发明能高效表达重组融合蛋白的食品级乳酸工程菌单克隆接种到5ml复原乳溶液中，37℃厌氧培养24hr后，按5％(v/v)的比例加入到新鲜复原乳溶液中备用。
其次制备香蕉果肉泥：根据已有文献资料[郑亚琴，2010，食品科学，31(24)：498]，将香蕉(市售)去皮称重后，用微波(800瓦，普通市售家用微波炉即可)处理30秒，然后按香蕉果肉的质量加入0.5％的柠檬酸(w/w)和0.25％的维生素C(w/w)，室温下8000rpm匀浆搅拌2分钟成香蕉果肉泥。
取10g香蕉果肉泥与90ml上述含重组乳酸工程菌的复原乳混合均质，再加入6％的蔗糖(w/v)、0.1％明胶(w/v)和0.1％的羧甲基纤维素钠(w/v)搅拌混匀，95℃水浴条件下处理5分钟后，接种到小烧杯中，覆盖保鲜膜，37℃发酵8小时，然后置4℃保存。按照本领域技术人员熟知的方法检测可知，这种酸奶每100ml中含有活乳酸工程菌达到1x1010个以上，且能在4℃条件下稳定储存1周[陈廷续，2011，农业技术与装备，208：36]。
食用方法：餐后0.5-2小时内服用100ml，每2-3天服用1次。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
等同实施方案：本发明可以体现为其他具体的但不偏离其精神或基本特征的形式，因此认为前述实施方案是在所有方面说明而不是限制本文所描述的发明。因此，本发明的范围包括在权利说明书等同目的和范围内的所有修改和组合。
Claims (8)
1.一种表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌，其通过下述方法制备：构建一种以α-半乳糖苷酶为抗性筛选标记的表达含人IA型金属硫蛋白融合蛋白的重组表达载体，并转化到乳酸菌宿主细胞中，其中所述融合蛋白由谷胱甘肽S-转移酶、小分子泛素相关修饰因子成熟肽和人IA型金属硫蛋白组成，其氨基酸序列如SEQ ID No：5所示。
2.根据权利要求1所述的重组食品级乳酸菌，其中所用的重组表达载体衍生于pMG36e。
3.根据权利要求1所述的重组食品级乳酸菌，其中所述的乳酸菌宿主细胞选自：乳球菌、粪肠球菌或植物乳杆菌。
4.根据权利要求3所述的重组食品级乳酸菌，其中所述乳球菌选自乳球菌MG1363、LM0230或MG1614；所述粪肠球菌选自粪肠球菌OGIX或FA2-2。
5.根据权利要求4所述的重组食品级乳酸菌，其中所述乳酸菌宿主细胞为乳酸乳球菌MG1363。
6.权利要求1-5中任一项的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白重组的食品级乳酸菌在制备用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品中的应用。
7.权利要求6中所述的应用，其中所述的重金属是指铅、镉、汞或它们的任意组合。
8.一种用于预防人慢性重金属中毒的药物、食品或化妆品，其包含有效量的权利要求1-5中任一项所述的表达含人IA型金属硫蛋白的融合蛋白的重组食品级乳酸菌。
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| 张金宝等,1.乳酸菌食品级高效表达载体系统的研究进展.《畜牧兽医杂志》.2008,(第06期), |
| 林琳等,1.BALB/c小鼠金属硫蛋白-1 cDNA基因在乳酸菌质粒表达载体pNZ2103上的克隆.《中国微生态学杂志》.2006,(第01期), |
| 郝凤奇等,1."食品级"乳酸菌表达载体系统的研究进展.《中国预防兽医学报》.2008,(第10期), |
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| CN102296046A (zh) | 2011-12-28 |
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