CN113832073B

CN113832073B - 一种耐镉粪肠球菌及其应用

Info

Publication number: CN113832073B
Application number: CN202111224334.3A
Authority: CN
Inventors: 高玉时; 陈大伟; 陆俊贤; 唐修君; 刘茵茵; 马丽娜; 蒲俊华; 葛庆联; 樊艳凤; 贾晓旭; 黄胜海
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2021-10-19
Filing date: 2021-10-19
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2041-10-19
Also published as: CN113832073A

Abstract

本发明提供了一种耐镉粪肠球菌及其应用，涉及镉吸附技术领域，本发明提供了一种耐镉粪肠球菌，其保藏编号为CGMCC NO.22993。从鸡肠道内容物中分离了一种新的耐镉粪肠球菌，其可以耐受最高1000mg/L的镉浓度，在pH为5的条件下，对5mg/L的镉溶液镉吸附率为98％以上，且对金黄色葡萄球菌有抑制作用。该耐镉粪肠球菌可用于去除基质中的镉金属元素，这种基质可以是土壤、饲料、培养基等需要去除镉的物质。

Description

一种耐镉粪肠球菌及其应用

技术领域

本发明涉及镉吸附技术领域，具体而言，涉及一种耐镉粪肠球菌及其应用。

背景技术

肠球菌属是乳酸菌的一种，在1984年被列为独立的新菌属。粪肠球菌是肠球菌内的代表种，为革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一。粪肠球菌在动物生产实践中的应用越来越广泛，能够改善肠道微环境，调节肠道菌群平衡，增强机体免疫力，提高饲料转化率等益生功能。农业部发布的《饲料添加剂品种目录(2013)》中微生物类别中包含粪肠球菌。作为一种肠道益生菌，在医学和食品工程领域应用广泛。此外，因为动物源的粪肠球菌是动物消化道正常存在的一类微生物，所以在肠道内有较强的耐受胃酸和胆盐作用的特点，是一种兼性厌氧的乳酸菌，比较适合在生产中应用。

镉是一种重要的有毒重金属元素，一旦进入动物机体极难排出体外，因此，饲料卫生标准中规定镉在鱼粉、石粉、鸡配合饲料中含量分别不得超过2.0、0.75和0.5mg/kg。但由于饲料原料污染，主要由于工业生产过程中排放的镉废物直接污染土壤以及含镉农药、磷肥的使用等都有可能导致农作物镉蓄积。饲料加工环节也可能引起二次污染。尽管饲料镉污染现象依然存在，但饲料中的镉在一般情况下难以达到极高的中毒量。因此，污染更为隐蔽。为防范和降低镉对动物和人的危害和风险，有必要寻找到降低饲料镉对动物危害的方法。但目前针对饲料中非中毒剂量镉污染防控方法仍是空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐镉粪肠球菌，该粪肠球菌可以在高浓度的镉环境生存，并对镉具有较强的吸附效果，可用于吸附去除动物饲料中的镉元素。

本发明的另一目的在于提供上述耐镉粪肠球菌的应用。

本发明的另一目的在于提供一种镉吸附剂。

本发明的另一目的在于提供镉的吸附方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种耐镉粪肠球菌，其保藏编号为CGMCC NO.22993。

菌株于2021年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)保藏号为CGMCC NO.22993。

优选的，其16S rRNA如SEQ ID NO.1所示。

优选的，其具有如下抑菌性质：具有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特性。其中对抑制金黄色葡萄球菌的效果最好，其次为抑制大肠杆菌和沙门氏菌。

优选的，所述耐镉粪肠球菌的耐受胆盐浓度为0.3％。

优选的，所述耐镉粪肠球菌在pH为6的条件下，对5mg/L的镉溶液具有超过98％的镉吸附率。

本发明从鸡肠道内容物中分离了一种新的耐镉粪肠球菌，其可以耐受最高1000mg/L的镉浓度，在pH为6的条件下，对5mg/L的镉溶液镉吸附率为98％以上，且对金黄色葡萄球菌有抑制作用。该耐镉粪肠球菌可用于去除基质中的镉金属元素，这种基质可以是土壤、饲料、培养基等需要去除镉的物质。

第二方面，本发明提供了上述耐镉乳酸菌在制备镉吸附剂中的应用。

第三方面，本发明提供了一种镉吸附剂，其包括上述的耐镉乳酸菌。

第四方面，本发明提供了一种镉的吸附方法，其包括：往需要去除镉的基质中加入上述的耐镉乳酸菌。

优选的，控制所述基质的pH为2.6-7。

优选的，控制所述基质的pH为5.8-6.2。

技术效果：

本发明从鸡肠道内容物中分离了一种新的耐镉粪肠球菌，其可以耐受最高1000mg/L的镉浓度，在pH为5的条件下，对5mg/L的镉溶液镉吸附率为98％以上，且对金黄色葡萄球菌有抑制作用。该耐镉粪肠球菌可用于去除基质中的镉金属元素，这种基质可以是土壤、饲料、培养基等需要去除镉的物质。

本发明在pH为2.6-7的条件下，上述耐镉粪肠球菌具有较好的镉吸附率，例如在pH为5的条件下，其镉吸附率超过98％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为粪肠球菌革兰氏染色结果；

图2为粪肠球菌扫描电镜观察结果；

图3为耐镉粪肠球菌在胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板菌落形态；

图4为根据CLE01的16S rRNA序列构建的进化树结果。

图5粪肠球菌最大镉耐受浓度。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1、耐镉粪肠球菌的分离和鉴定

样品来源于鸡肠道内容物。取肠道内容物1g，无菌生理盐水溶液逐级稀释至10^-8，分别取100μL各级稀释液滴在含Cd 50mg/L的MRS固体培养基上，37℃培养48h后，挑取单菌落，继续接种在含Cd 100mg/L的MRS固体培养基上，继续培养48h后，挑取单菌落，重复接种在含Cd 100mg/L的MRS固体培养基上，培养48h后获得的单菌落为耐镉100mg/L的菌株。命名为CLE01。

2粪肠球菌的鉴定

2.1革兰氏染色

挑一个粪肠球菌单菌落于10μL无菌生理盐水溶液中混匀，涂布在无菌载玻片上，快速在火焰上固定，冷却后，按照革兰氏染色步骤操作，在显微镜下用油镜观察，确定为革兰氏阳性球菌，如图1所示。

2.2扫描电镜观察

1、上述1中所获得的菌株经MRS液体培养基37℃振荡培养18h后，取20mL培养液，3000-4000rpm离心，去除上清液，加入适当PH的0.1M PBS清洗三遍；清洗时将菌体温柔吹打悬浮。

2、固定，0.25％戊二醛固定3h，用PBS清洗两遍，每次10min。再用纯水清洗两遍。

3、梯度脱水：用乙醇的水溶液按30％、50％、70％、80％、90％的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，然后在100％乙醇的水溶液中脱水15min*2次，再将样品置于乙醇和叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min*2次。

4、冷冻干燥：处理好的样品于5*5mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥剂中进行冷冻干燥，

5、电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

扫描电镜观察见图2，菌体呈球形或椭球形，表面平滑，散在或呈短串珠状。

2.3胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基鉴定

称取胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基61.6克,加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，倾入无菌平皿，备用。挑一个粪肠球菌单菌落于胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基平板上进行三区划线。36℃±1℃倒置培养24h±2h。培养结果图3所示。胆汁七叶苷叠氮钠琼脂平板上呈灰褐色至黑色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、直径约为1mm的菌落。对照乳酸杆菌不变色。

2.4 16S rRNA生物学鉴定

上述1中所获得的菌株经MRS液体培养基37℃振荡培养18h后，取1mL培养液，按照TIANGEN细菌DNA提取试剂盒(No：DP302)的要求，提取菌株DNA。利用细菌16S rRNA基因通用引物(表1)PCR扩增菌株16S rRNA基因。PCR扩增程序为：95℃:1min,95℃:30s,52℃:30s,72℃:2min,35循环,16℃。取5μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，剩余PCR产物送生物技术公司测序，测序结果与NCBI数据库比对，确定乳酸菌种属。

表1 16S rRNA基因扩增引物

测序结果如下(SEQ ID NO.1)：

GAGCCAAGCAGCTCTATAATGCAGTCGACGCTTCTTTCCTCCCGAGTGCTTGCACTCAATTGGAAAGAGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCCATCAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACAGTTTATGCCGCATGGCATAAGAGTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGACGTTAGTAACTGAACGTCCCCTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTCGCTAGACCGCGAGGTCATGCAAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAAAGTTCATAAGACA

根据16s rRNA序列构建的进化树结果图4所示，根据图4结果，可以看出，CLE01是一种不同于现有的新的粪肠球菌菌株。

2.5粪肠球菌最大镉耐受量

上述1中粪肠球菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别取100μL滴至含Cd 100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L的MRS固体培养基上，37℃培养72h观察结果，确定粪肠球菌耐受最大镉浓度，将最大耐镉浓度的粪肠球菌菌株接种在含镉100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L的MRS液体培养基中，37℃振荡培养48h。结果显示其可耐受最大镉浓度1000mg/L的生长，如图5所示。

2.6粪肠球菌对溶液中镉离子的吸附性

上述1中粪肠球菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基培养18h后，以10000r/min转速离心10分钟，去上清，超纯水清洗沉淀后，调吸光度为1(OD600)，取0.5mL溶液仍以10000r/min转速，离心10分钟，去上清加入0.5mL pH为5.0的5mg/L镉溶液悬浮沉淀，37℃，中速震荡2h后，10000r/min转速，离心10分钟，取上清液，经适当倍数稀释后，用石墨炉法测定溶液中的镉含量。利用公式(1)计算粪肠球菌镉吸附率。

吸附率(％)＝100％-(C₁/C₀)×100％ (1)

其中C₀为初始镉液浓度，C₁为最终上清液中镉液浓度。

结果显示，该粪肠球菌对5mg/L镉溶液(pH5)镉吸附率大于98％。

2.7粪肠球菌抑菌性质

上述1中粪肠球菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，取1mL MRS培养液于无菌管中，将6mm的无菌滤纸片分别浸入MRS培养液中。调节金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌吸光度为0.08-0.1(OD600)，分别取50μL金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌均匀涂满LB培养基，将滤纸片分别铺在细菌培养板上，金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌37℃培养24h，确定粪肠球菌的抑菌性质。结果显示，该粪肠球菌对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，其次是大肠杆菌和沙门氏菌，表3。

表3 CLE01抑菌能力测定

2.8粪肠球菌耐受胆盐

上述1中粪肠球菌按2％的接种量接种于MRS肉汤培养基培养18h，8000rpm离心10min，去上清，用含有0.3％、0.5％和1％浓度胆盐的MRS肉汤培养基重悬菌体，分别培养2h和4h后，取1mL菌液用无菌生理盐水倍比稀释至10^-5，取100μl稀释液均匀涂布在MRS琼脂培养基，37℃厌氧培养36h，数菌落数，计算存活率，确定乳酸菌耐受胆盐浓度。

结果显示，0.5％和1％胆盐处理存活率为0，该粪肠球菌可耐受0.3％的胆盐。

表4耐镉粪肠球菌对0.3％胆盐的耐受能力

综上，该粪肠球菌最大耐受镉浓度为1000mg/L，对5mg/L镉溶液(pH5)镉吸附率大于98％，且耐受0.3％的胆盐，可抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。

CLE01菌株于2021年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)保藏号为CGMCC NO.22993。

实施例2

粪肠球菌CLE01对溶液中镉离子的吸附

粪肠球菌CLE01按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基培养18h后，以10000r/min转速离心10分钟，去上清，超纯水清洗沉淀后，调吸光度为1(OD600)，取0.5mL溶液仍以10000r/min转速，离心10分钟，去上清分别加入0.5mL pH为2.6、4.0、6.0和7.0的5mg/L镉溶液悬浮沉淀，37℃，中速震荡2h后，10000r/min转速，离心10分钟，取上清液，经适当倍数稀释后，用石墨炉法测定溶液中的镉含量。利用公式(1)计算粪肠球菌镉吸附率。

吸附率(％)＝100％-(C₁/C₀)×100％

其中C₀为初始镉液浓度，C₁为最终上清液中镉液浓度。

结果表5显示，pH值对菌株吸附镉的影响较大。在pH值为2.5时，粪肠球菌对5mg/L镉溶液镉的吸附率低于20％，随着pH值的升高，镉的吸附率上升，pH为5.0时镉吸附率最高，高达98.5％，pH为7.0时，镉吸附率接近60％。

表5 CLE01对镉溶液的吸附率

以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种耐镉粪肠球菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1463

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

gagccaagca gctctataat gcagtcgacg cttctttcct cccgagtgct tgcactcaat 60

tggaaagagg agtggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctacccat cagaggggga 120

taacacttgg aaacaggtgc taataccgca taacagttta tgccgcatgg cataagagtg 180

aaaggcgctt tcgggtgtcg ctgatggatg gacccgcggt gcattagcta gttggtgagg 240

taacggctca ccaaggccac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg 300

actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcg gcaatggacg 360

aaagtctgac cgagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aaactctgtt 420

gttagagaag aacaaggacg ttagtaactg aacgtcccct gacggtatct aaccagaaag 480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540

ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600

aaccggggag ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660

atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct 720

ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780

tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 840

agcaaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960

cttaccaggt cttgacatcc tttgaccact ctagagatag agctttccct tcggggacaa 1020

agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080

caacgagcgc aacccttatt gttagttgcc atcatttagt tgggcactct agcgagactg 1140

ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200

ggctacacac gtgctacaat gggaagtaca acgagtcgct agaccgcgag gtcatgcaaa 1260

tctcttaaag cttctctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagccggaa 1320

tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380

gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttggagcca 1440

gccgcctaaa agttcataag aca 1463

Claims

1.一种耐镉粪肠球菌，其特征在于，该粪肠球菌(Enterococcus faecalis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22993。

2.如权利要求1所述的一种耐镉粪肠球菌，其特征在于，其16S rRNA基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1或2所述的耐镉粪肠球菌，其特征在于，其具有如下抑菌性质：具有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特性。

4.如权利要求1所述的一种耐镉粪肠球菌，其特征在于，所述耐镉粪肠球菌的耐受胆盐浓度为0.3％。

5.如权利要求1所述的一种耐镉粪肠球菌，其特征在于，所述耐镉粪肠球菌在pH为5的条件下，对5mg/L的镉溶液具有超过98％的镉吸附率。

6.如权利要求1或2所述的耐镉粪肠球菌在制备镉吸附剂中的应用。

7.一种镉吸附剂，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的耐镉粪肠球菌。

8.一种镉的吸附方法，其特征在于，其包括：往需要去除镉的基质中加入权利要求1-5任一项所述的耐镉粪肠球菌。

9.如权利要求8所述镉的吸附方法，其特征在于，控制所述基质的pH为2.6-7。

10.如权利要求9所述镉的吸附方法，其特征在于，控制所述基质的pH为5.8-6.2。