CN102220301A

CN102220301A - 一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13及基因

Info

Publication number: CN102220301A
Application number: CN 201110142558
Authority: CN
Inventors: 黄遵锡; 董岩岩; 周峻沛; 许波; 唐湘华; 李俊俊; 高雅洁; 潘璐
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: CN102220301B

Abstract

本发明涉及一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13及其基因。本发明提供了一种来源于鞘氨醇单胞菌（Sphingobiumsp.）的α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，且提供了编码上述α-半乳糖苷酶的编码基因agaAJB13，及包含α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组载体和包含α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组菌株。α-半乳糖苷酶具有以下性质：最适pH5.0；最适温度60℃，在10℃和20℃下分别具有10%和20%以上的酶活；经0.1MpH11.0缓冲液在37℃下处理1h，仍能保持~40%的活性；良好的热稳定性和蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

Description

一种耐碱性低温α - 半乳糖苷酶 AgaAJB13 及基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13及其基因。

背景技术

α-半乳糖苷酶即蜜二糖酶（1,6-α-d-galactoside galactohydrolase；α-galactosidase；melibiase；EC 3.2.1.22），可移除不同底物中α-连接的末端非还原性D-半乳糖，包括蜜二糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半乳甘露聚糖等多聚糖底物。这些多糖广泛存在于食品和饲料原料中，特别是豆类植物的种子中，如豆粕、棉粕和菜粕等（Karr-Lilienthal et al. Livest Prod Sci, 2005, 97: 1–12.）。

α-半乳糖苷酶可应用于饲料、食品、造纸和医疗行业中。在饲料业中，α-半乳糖苷酶制剂可以促进营养物质的消化并消除或减少饲料组成中的抗营养因子（棉子糖等低聚糖）对营养物质消化的副作用，从而改善了动物的生产性能，降低饲料成本；在食品业中，α-半乳糖苷酶制剂可以降低棉子糖等在豆奶中的含量，增加人类对豆类营养的吸收；α-半乳糖苷酶还可提高纸张的漂白效果及治疗Fabry疾病等（Cao et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83: 875–884.）。

α-半乳糖苷酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌和植物中。根据氨基酸序列相似性，α-半乳糖苷酶被划分到糖苷水解酶第4、27、36和57家族，绝大多数α-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶第27和36家族。真核生物来源的α-半乳糖苷酶多数属于27家族，而原核生物来源α-半乳糖苷酶基本都属于36家族（Finn et al. Nucleic Acids Res, 2008, 36: D281–D288.）。但是，目前所报导的α-半乳糖苷酶多为中温或高温酶及耐酸性或耐中性pH酶，同时具有耐碱性和低温活性的（0–20℃）α-半乳糖苷酶还未曾报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶。

本发明的再一目的是提供编码上述α-半乳糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13可得自鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.），如Sphingobium estrogenivorans ATCC BAA-1367。 AgaAJB13的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

该酶总共含738个氨基酸，其中N端23个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MVMRRWGAALAAATMLAAAPAHA”（SEQ ID NO. 2）。

因此，成熟的α-半乳糖苷酶AgaAJB13的理论分子量为80.0kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

本发明的α-半乳糖苷酶AgaAJB13的最适pH值为5.0，在pH4.5–6.0的范围内维持80%以上的酶活性；经pH4.0–11.0的缓冲液处理1h，酶活剩余35%以上；最适温度为60℃，在10℃和20℃分别具有10%和20%以上的酶活，具有低温酶的低温催化特性；在37℃和60℃下的半衰期>60min，具有良好的热稳定性；可水解豆粕、棉粕和棉籽糖；经胰蛋白酶和蛋白酶K处理1h后，AgaAJB13仍能分别保持102.1%和114.0%的酶活。

本发明提供了编码上述α-半乳糖苷酶的基因agaAJB13，该基因序列如 SEQ ID NO. 4所示。

DNA序列结构分析结果表明，α-半乳糖苷酶基因agaAJB13编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

α-半乳糖苷酶基因agaAJB13编码成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了α-半乳糖苷酶AgaAJB13的编码基因agaAJB13，其全长2217bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG。经BLAST比对，该α-半乳糖苷酶基因agaAJB13编码的氨基酸序列与GenBank中Acidobacterium sp. MP5ACTX8来源的潜在α-半乳糖苷酶（EFI56085）具有最高的一致性，为59.2%；与确证活性的Lichtheimia corymbifera IFO 8084来源α-半乳糖苷酶（AAF68953）的一致性为40.1%。说明α-半乳糖苷酶AgaAJB13是一种新的α-半乳糖苷酶。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组载体，优选为pET-agaAJB13。将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的α-半乳糖苷酶基因插入到质粒pET-28a（+）上的EcoRI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-agaAJB13。

本发明还提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/agaAJB13。

本发明的制备α-半乳糖苷酶AgaAJB13的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶表达；

3）回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶AgaAJB13。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/agaAJB13。

本发明提供了一个新的α-半乳糖苷酶基因，其编码的α-半乳糖苷酶最适pH5.0；在10℃和20℃下分别具有10%和20%以上的酶活；经0.1M pH11.0缓冲液37℃处理1h，仍能保持约40%的活性，作用温度范围较广，良好的热稳定性和蛋白酶抗性；较好的水解各种自然底物的能力，可广泛的应用于饲料和食品等行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组α-半乳糖苷酶。

图2：重组α-半乳糖苷酶的最适pH。

图3：重组α-半乳糖苷酶的pH稳定性。

图4：重组α-半乳糖苷酶的最适温度。

图5：重组α-半乳糖苷酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）同文献报道菌种性质，如Sphingobium estrogenivorans ATCC BAA-1367；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）和表达载体pET-28a（+）可购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；pNPG（p-nitrophenyl-α-d-galactopyranoside）购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的克隆

提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据糖苷水解酶第36家族的保守序列（[F/L/V]-[L/V]-[L/M/V]-D-D-G-W-F和E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E]）设计合成了简并引物GH36F和GH36R（表1）。

以鞘氨醇单胞菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，43℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。得到一约172bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，分别设计上游和下游TAIL-PCR特异性引物各二条：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般为20–30nt，退火温度在65–70℃。并将它们分别命名为usp1和usp2（上游特异性引物）及dsp1和dsp2（下游特异性引物；表1）。

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到α-半乳糖苷酶基因agaAJB13，该基因序列如 SEQ ID NO. 4所示。

实施例2：重组α-半乳糖苷酶的制备

将表达载体pET-28a（+）进行双酶切（EcoRI和HindIII），同时将编码α-半乳糖苷酶的基因agaAJB13进行双酶切（EcoRI和HindIII），将上述酶切的α-半乳糖苷酶agaAJB13与表达载体pET-28a（+）相连接，获得含有α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组质粒pET-agaAJB13并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/agaAJB13。

取含有重组质粒pET-agaAJB13的E. coli BL21（DE3）菌株和只含有pET-28a（+）空质粒的E. coli BL21（DE3）菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50µg/mL Kan）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50µg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组α-半乳糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：重组α-半乳糖苷酶的活性分析

酶活性测定方法采用pNPG法。将pNPG溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM。反应体系含50μL适量酶液，450μL的2mM底物。底物在反应温度下预热5min后，加入酶液再反应10min，然后加1.5mL 1M Na₂CO₃终止反应，冷却至室温后在405nm波长下测定释放出的pNP。1个酶活单位（U）定义为每分钟分解pNPG产生1μmolpNP所需的酶量。对底物棉籽糖、豆粕和棉粕的活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸（DNS）法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应120min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol半乳糖所需的酶量。

实施例4：重组α-半乳糖苷酶AgaAJB13的性质测定

1、重组α-半乳糖苷酶AgaAJB13的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

酶的最适pH测定：将实施例2纯化的α-半乳糖苷酶AgaAJB13在37℃和pH3.0–8.0的缓冲液下进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于pH2.0–12.0的0.1M缓冲液中，在37℃下处理1h以上，然后在pH5.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer（pH2.0–8.0）和0.1M glycine-NaOH（pH9.0–12.0）。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAJB13的酶学性质。结果表明：AgaAJB13的最适pH为5.0，在pH4.5–6.0的范围内维持80%以上的酶活性（图2）；经pH4.0–11.0的缓冲液处理1h，酶活剩余~40%或40%以上（图3）。

2、重组α-半乳糖苷酶AgaAJB13的最适温度及热稳定性测定方法如下：

酶的最适温度测定：在pH5.0的缓冲液中，于0–70℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（37℃，60℃或70℃）处理0–60min后，在pH5.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPG为底物，反应10min，测定纯化的AgaAJB13的酶学性质。结果表明：AgaAJB13的最适温度为60℃，在10℃和20℃分别具有10%和20%以上的酶活（图4）；60℃下AgaAJB13的半衰期>60min，70℃下很快失活（图5）。

3、重组α-半乳糖苷酶AgaAJB13的动力学参数测定方法如下：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH5.0及60℃下，以0.5mM pNPG为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05–0.5mM pNPG为底物，在pH5.0、60℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定Km、Vmax和kcat。经测定，在60℃ pH5.0条件下，AgaAJB13对pNPG的K _m、V _max和k _cat分别为2.75 mM⁻¹、1250.00µmol min⁻¹ mg⁻¹和1792.08 s⁻¹。

4、不同金属离子及化学试剂对AgaAJB13酶活的影响测定方法如下：

在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果（表2）表明，10mM的Ag⁺和Hg²⁺可完全抑制AgaAJB13；SDS对AgaAJB13的抑制较强（剩余酶活~7%）；Fe²⁺对AgaAJB13的抑制较弱（剩余酶活~70%）；Ca²⁺和Pb²⁺可使AgaAJB13的酶活分别提高约0.2倍和约0.3倍；其余金属离子和化学试剂对AgaAJB13的影响很小。

表2. 金属离子及化学试剂对重组α-半乳糖苷酶AgaAJB13活力的影响

5、α-半乳糖苷酶AgaAJB13的抗蛋白酶能力

酶的蛋白酶抗性：用相当于重组酶10倍（w/w）的胰蛋白酶（pH7.5）和蛋白酶K（pH7.5）在37℃对重组酶处理1h，然后在pH5.0及37℃下进行酶促反应，以在蛋白酶对应pH缓冲液中但未加蛋白酶的酶液作为对照。经胰蛋白酶和蛋白酶K处理1h后，AgaAJB13仍能分别保持102.1%和114.0%的酶活。

6、α-半乳糖苷酶AgaAJB13对自然底物的降解

在37℃ pH5.0条件下，AgaAJB13对1.0%（w/v）的豆粕和棉粕的比活分别为6.99 ± 0.21和2.80 ± 0.21 U mg⁻¹，对0.5%的棉籽糖的比活为1.67 ± 0.01 U mg⁻¹

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13及基因

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 738

<212> PRT

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 1

Met Val Met Arg Arg Trp Gly Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Met Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Pro Ala His Ala Ser Ala Gly Tyr Asp Ala Lys Thr Arg

20 25 30

Met Phe Arg Leu Asp Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Ala Phe Gly Val Thr

35 40 45

Asp Asp Gly Tyr Leu Gln Ala Ala Tyr Trp Gly Gly Arg Leu Gly Ala

50 55 60

Asp Asp Pro Ile Arg Leu Thr Lys Ala Gln Gly Leu Ser Gly Phe Asp

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ile Leu Pro Gln Glu Phe Pro Gly Gln Gly Ala Gly

85 90 95

Leu Tyr Thr Glu Pro Ala Leu Lys Val Ala Trp Pro Asp Gly Asn Arg

100 105 110

Asp Leu Val Leu Lys Tyr Val Ser His Lys Met Ser Arg Asp His Val

115 120 125

Glu Ile Val Leu Lys Asp Ile Glu Arg Pro Leu Phe Val Thr Leu Asp

130 135 140

Tyr Ser Ile Asp Pro Asp Thr Gly Val Val Gly Arg Ser Ala Arg Ile

145 150 155 160

Glu Asn Arg Ser Asp Thr Asp Val Arg Ile Asp Gln Ala Glu Ala Gly

165 170 175

Ala Leu Thr Leu Pro Val Ala His Asp Tyr Arg Leu His Tyr Leu Thr

180 185 190

Gly Arg Trp Ala Ala Glu Trp Thr Leu Gln Asp Arg Pro Leu Thr Pro

195 200 205

Gly Ala Thr Val Leu Glu Ser Arg Arg Gly Ser Thr Gly Ser Glu Asn

210 215 220

Asn Pro Trp Phe Ala Ile Thr Arg Asp His Asp Ala Gly Glu Glu Tyr

225 230 235 240

Gly Pro Val Trp Phe Gly Ala Leu Ala Trp Ser Gly Ser Trp Arg Ile

245 250 255

Thr Val Asp Gln Asp Pro Ala Gly Glu Val Arg Val Val Gly Gly Phe

260 265 270

Asn Pro Phe Asp Phe Ala Tyr Arg Leu Lys Pro Gly Glu Ser Leu Asp

275 280 285

Thr Pro Thr Phe Tyr Ala Gly Tyr Ser Asp His Gly Met Gly Gly Ala

290 295 300

Ser Arg Leu Leu His Arg Phe Glu Arg Asp Thr Ile Leu Pro His Asp

305 310 315 320

Ala Asp Gly Lys Leu Pro Leu Arg Pro Val Leu Tyr Asn Ser Trp Glu

325 330 335

Ala Thr Gly Phe Asp Val Asp Glu Ala Gly Gln Ile Ala Leu Ala Glu

340 345 350

Lys Ala Ala Lys Ile Gly Val Glu Arg Phe Val Met Asp Asp Gly Trp

355 360 365

Phe Gly Ala Arg Asn Asp Asp His Ala Gly Leu Gly Asp Trp Thr Val

370 375 380

Asn Arg Thr Lys Phe Pro Asn Gly Leu Lys Pro Leu Ile Asp Lys Val

385 390 395 400

His Gly Leu Gly Met Gln Phe Gly Leu Trp Val Glu Pro Glu Met Thr

405 410 415

Asn Pro Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Ala His Pro Asp Trp Val Met Asn

420 425 430

Tyr Thr Gly Arg Pro Arg Thr Glu Gly Arg Asn Gln Leu Val Leu Asn

435 440 445

Leu Ala Arg Thr Asp Val Arg Asp Tyr Ile Phe Lys Val Leu Asp Asp

450 455 460

Leu Leu Asp Glu Asn Asp Ile Gln Phe Leu Lys Trp Asp Tyr Asn Arg

465 470 475 480

Asn Trp Ser Glu Pro Gly Trp Pro Glu Ala Asp Val Ala Asp Gln Gln

485 490 495

Gln Ile Tyr Val Lys Tyr Val Arg Asn Leu Tyr Trp Ile Ile Asp Lys

500 505 510

Leu Arg Ala Arg His Pro Lys Leu Glu Ile Glu Ser Cys Ser Gly Gly

515 520 525

Gly Gly Arg Val Asp Leu Gly Ile Met Ser Arg Thr Asp Glu Val Trp

530 535 540

Pro Ser Asp Asn Thr Asp Pro Phe Asp Arg Leu Thr Ile Gln Asn Gly

545 550 555 560

Phe Thr Tyr Ala Tyr Pro Pro Ala Ala Met Met Ala Trp Val Thr Ala

565 570 575

Ser Pro Asn Trp Val Asn Asn Arg Ala Thr Ser Leu Asp Tyr Arg Phe

580 585 590

Leu Ser Ala Met Gln Gly Gly Leu Gly Ile Gly Ala Asp Leu Asn Lys

595 600 605

Trp Ser Asp Ala Glu Phe Ala Glu Ala Ser Arg Met Val Ala Ala Tyr

610 615 620

Lys Arg Val Arg Ala Thr Val Gln Gln Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Ile

625 630 635 640

Ile Pro Asn Gly Ile Asp Arg Asp Asp Arg Val Ala Asn Leu Ser Val

645 650 655

Ser Pro Asp Lys Gln Gln Ala Val Leu Phe Ala Phe Leu His Ser Ser

660 665 670

Gln Glu Leu Asp Arg Leu Ser Ala Ile Arg Leu Arg Gly Leu Ala Pro

675 680 685

Lys Lys Asn Tyr Arg Val Ala Arg Ile Asp Gly Arg Pro Leu Ala Asp

690 695 700

Asp Thr Pro Ala Lys Ala Ser Gly Ala Tyr Trp Met Ala Arg Gly Ile

705 710 715 720

Asp Val Pro Leu Ile Gly Asp Phe Asp Ala Ala Gly Tyr Ile Phe Gln

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Ala Ile

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 2

Met Val Met Arg Arg Trp Gly Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Met Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Pro Ala His Ala

20

<210> 3

<211> 715

<212> PRT

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 3

Ser Ala Gly Tyr Asp Ala Lys Thr Arg Met Phe Arg Leu Asp Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Tyr Ala Phe Gly Val Thr Asp Asp Gly Tyr Leu Gln Ala

20 25 30

Ala Tyr Trp Gly Gly Arg Leu Gly Ala Asp Asp Pro Ile Arg Leu Thr

35 40 45

Lys Ala Gln Gly Leu Ser Gly Phe Asp Leu Val Asn Ser Ile Leu Pro

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Val Ala Trp Pro Asp Gly Asn Arg Asp Leu Val Leu Lys Tyr Val

85 90 95

Ser His Lys Met Ser Arg Asp His Val Glu Ile Val Leu Lys Asp Ile

100 105 110

Glu Arg Pro Leu Phe Val Thr Leu Asp Tyr Ser Ile Asp Pro Asp Thr

115 120 125

Gly Val Val Gly Arg Ser Ala Arg Ile Glu Asn Arg Ser Asp Thr Asp

130 135 140

Val Arg Ile Asp Gln Ala Glu Ala Gly Ala Leu Thr Leu Pro Val Ala

145 150 155 160

His Asp Tyr Arg Leu His Tyr Leu Thr Gly Arg Trp Ala Ala Glu Trp

165 170 175

Thr Leu Gln Asp Arg Pro Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Leu Glu Ser

180 185 190

Arg Arg Gly Ser Thr Gly Ser Glu Asn Asn Pro Trp Phe Ala Ile Thr

195 200 205

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210 215 220

Leu Ala Trp Ser Gly Ser Trp Arg Ile Thr Val Asp Gln Asp Pro Ala

225 230 235 240

Gly Glu Val Arg Val Val Gly Gly Phe Asn Pro Phe Asp Phe Ala Tyr

245 250 255

Arg Leu Lys Pro Gly Glu Ser Leu Asp Thr Pro Thr Phe Tyr Ala Gly

260 265 270

Tyr Ser Asp His Gly Met Gly Gly Ala Ser Arg Leu Leu His Arg Phe

275 280 285

Glu Arg Asp Thr Ile Leu Pro His Asp Ala Asp Gly Lys Leu Pro Leu

290 295 300

Arg Pro Val Leu Tyr Asn Ser Trp Glu Ala Thr Gly Phe Asp Val Asp

305 310 315 320

Glu Ala Gly Gln Ile Ala Leu Ala Glu Lys Ala Ala Lys Ile Gly Val

325 330 335

Glu Arg Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Ala Arg Asn Asp Asp

340 345 350

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355 360 365

Gly Leu Lys Pro Leu Ile Asp Lys Val His Gly Leu Gly Met Gln Phe

370 375 380

Gly Leu Trp Val Glu Pro Glu Met Thr Asn Pro Asp Ser Asp Leu Tyr

385 390 395 400

Arg Ala His Pro Asp Trp Val Met Asn Tyr Thr Gly Arg Pro Arg Thr

405 410 415

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435 440 445

Gln Phe Leu Lys Trp Asp Tyr Asn Arg Asn Trp Ser Glu Pro Gly Trp

450 455 460

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465 470 475 480

Arg Asn Leu Tyr Trp Ile Ile Asp Lys Leu Arg Ala Arg His Pro Lys

485 490 495

Leu Glu Ile Glu Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Arg Val Asp Leu Gly

500 505 510

Ile Met Ser Arg Thr Asp Glu Val Trp Pro Ser Asp Asn Thr Asp Pro

515 520 525

Phe Asp Arg Leu Thr Ile Gln Asn Gly Phe Thr Tyr Ala Tyr Pro Pro

530 535 540

Ala Ala Met Met Ala Trp Val Thr Ala Ser Pro Asn Trp Val Asn Asn

545 550 555 560

Arg Ala Thr Ser Leu Asp Tyr Arg Phe Leu Ser Ala Met Gln Gly Gly

565 570 575

Leu Gly Ile Gly Ala Asp Leu Asn Lys Trp Ser Asp Ala Glu Phe Ala

580 585 590

Glu Ala Ser Arg Met Val Ala Ala Tyr Lys Arg Val Arg Ala Thr Val

595 600 605

Gln Gln Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Ile Pro Asn Gly Ile Asp Arg

610 615 620

Asp Asp Arg Val Ala Asn Leu Ser Val Ser Pro Asp Lys Gln Gln Ala

625 630 635 640

Val Leu Phe Ala Phe Leu His Ser Ser Gln Glu Leu Asp Arg Leu Ser

645 650 655

Ala Ile Arg Leu Arg Gly Leu Ala Pro Lys Lys Asn Tyr Arg Val Ala

660 665 670

Arg Ile Asp Gly Arg Pro Leu Ala Asp Asp Thr Pro Ala Lys Ala Ser

675 680 685

Gly Ala Tyr Trp Met Ala Arg Gly Ile Asp Val Pro Leu Ile Gly Asp

690 695 700

Phe Asp Ala Ala Gly Tyr Ile Phe Gln Ala Ile

705 710 715

<210> 4

<211> 2217

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 4

atggtgatga ggcgatgggg ggcagccctt gcggccgcga cgatgctggc ggcggcgccg 60

gcgcatgcgt cggcgggcta cgacgcgaag acccgcatgt tccggctcga cggcggcggc 120

accacctacg cgttcggggt gaccgacgac ggctatctcc aggccgccta ttggggcggg 180

cgactcggcg ccgacgaccc gatccggctg accaaggcgc aagggctgag cggcttcgat 240

ctggtcaact cgatcctgcc gcaggaattt cccgggcaag gcgccggcct ctataccgag 300

ccggcgctca aggtcgcctg gcccgacggc aaccgcgatc tcgtgctcaa atacgtctcg 360

cacaagatgt ccagggacca tgttgagatc gtgctcaagg atatcgagcg accgttgttc 420

gtcacgctcg actacagcat cgatcccgat accggcgtgg tcggccgctc ggcgcgtatc 480

gaaaaccgca gcgataccga cgtgcggatc gatcaggccg aggcgggcgc gctcaccctg 540

cccgtcgcgc acgattaccg gctgcactat ctcaccggcc gctgggccgc cgagtggacg 600

ctgcaggatc gcccgctgac cccgggcgcg accgtcctcg aaagccgccg cggctcgacc 660

ggctcggaaa acaacccctg gttcgcgatc acccgcgatc acgatgccgg cgaggagtac 720

gggcccgtct ggttcggcgc gctggcgtgg agcggatcgt ggcggatcac ggtcgaccag 780

gatccggccg gcgaggtccg cgtcgtcggc gggttcaacc cgttcgactt cgcctatcgc 840

ctcaagcccg gcgaatcgct cgacacgccg accttctacg ccggctattc ggatcacggc 900

atgggcggcg cctcgcggct gctccaccgc ttcgagcgcg acacgatcct gccccacgat 960

gccgacggca agctgccgct gcgccccgtc ctctacaaca gctgggaagc gaccgggttc 1020

gatgtcgacg aggccggcca gatcgcgctt gccgaaaagg cggcgaagat tggcgtcgag 1080

cgcttcgtga tggacgacgg ctggttcggc gcgcgcaacg acgatcatgc cgggctcggc 1140

gactggaccg tcaaccgcac caaattcccc aacggcctca aaccgctgat cgacaaggtc 1200

cacggcctcg gcatgcagtt cgggctgtgg gtcgagcccg agatgaccaa tcccgacagc 1260

gatctctatc gcgcgcatcc cgattgggtg atgaactata ccggccgccc gcgcaccgag 1320

gggcgtaacc agctcgtcct caatctcgcg cgaaccgacg tgcgcgatta catcttcaag 1380

gtgctcgacg acctgctcga cgagaacgac atccagttcc tcaaatggga ttacaaccgc 1440

aactggagcg agcccggctg gcccgaggcc gatgtcgccg accagcagca gatctacgtc 1500

aaatacgtcc gcaacctcta ttggatcatc gacaagctgc gcgccaggca tcccaagctc 1560

gagatcgaat cgtgctcggg cggcggcggc cgcgtcgatc tcggcattat gagccgcacc 1620

gacgaggtgt ggccgtcgga caataccgat ccgttcgatc ggctgacgat ccagaacggc 1680

tttacttacg cctatccgcc ggccgcgatg atggcgtggg tgacggcgtc gcccaattgg 1740

gtcaataatc gcgctacctc gctcgattat cgcttcctgt cggcgatgca aggcgggctc 1800

ggtattggcg ccgacctcaa taaatggagc gatgcagaat ttgcggaggc gagtcgcatg 1860

gtggcggcct ataagcgtgt ccgagcgacg gtgcagcaag gcgacctgta tcggttgatt 1920

atcccgaacg gaatcgatcg tgacgaccgc gtcgccaatc tctcggtatc tccagacaag 1980

cagcaggcgg tgctgttcgc gtttctgcac agcagccagg agctcgatcg gctttctgct 2040

atccgactgc gcgggctcgc tcctaagaag aactaccgcg tcgcccggat cgatggccgc 2100

ccgctggccg acgacacccc agctaaggcg agcggcgctt attggatggc gcgtggcatc 2160

gacgttccat taatcggcga cttcgacgcc gctggctata tctttcaggc catctag 2217

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 5

atggtgatga ggcgatgggg ggcagccctt gcggccgcga cgatgctggc ggcggcgccg 60

gcgcatgcg 69

<210> 6

<211> 2145

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌（Sphingobium sp.）

<400> 6

tcggcgggct acgacgcgaa gacccgcatg ttccggctcg acggcggcgg caccacctac 60

gcgttcgggg tgaccgacga cggctatctc caggccgcct attggggcgg gcgactcggc 120

gccgacgacc cgatccggct gaccaaggcg caagggctga gcggcttcga tctggtcaac 180

tcgatcctgc cgcaggaatt tcccgggcaa ggcgccggcc tctataccga gccggcgctc 240

aaggtcgcct ggcccgacgg caaccgcgat ctcgtgctca aatacgtctc gcacaagatg 300

tccagggacc atgttgagat cgtgctcaag gatatcgagc gaccgttgtt cgtcacgctc 360

gactacagca tcgatcccga taccggcgtg gtcggccgct cggcgcgtat cgaaaaccgc 420

agcgataccg acgtgcggat cgatcaggcc gaggcgggcg cgctcaccct gcccgtcgcg 480

cacgattacc ggctgcacta tctcaccggc cgctgggccg ccgagtggac gctgcaggat 540

cgcccgctga ccccgggcgc gaccgtcctc gaaagccgcc gcggctcgac cggctcggaa 600

aacaacccct ggttcgcgat cacccgcgat cacgatgccg gcgaggagta cgggcccgtc 660

tggttcggcg cgctggcgtg gagcggatcg tggcggatca cggtcgacca ggatccggcc 720

ggcgaggtcc gcgtcgtcgg cgggttcaac ccgttcgact tcgcctatcg cctcaagccc 780

ggcgaatcgc tcgacacgcc gaccttctac gccggctatt cggatcacgg catgggcggc 840

gcctcgcggc tgctccaccg cttcgagcgc gacacgatcc tgccccacga tgccgacggc 900

aagctgccgc tgcgccccgt cctctacaac agctgggaag cgaccgggtt cgatgtcgac 960

gaggccggcc agatcgcgct tgccgaaaag gcggcgaaga ttggcgtcga gcgcttcgtg 1020

atggacgacg gctggttcgg cgcgcgcaac gacgatcatg ccgggctcgg cgactggacc 1080

gtcaaccgca ccaaattccc caacggcctc aaaccgctga tcgacaaggt ccacggcctc 1140

ggcatgcagt tcgggctgtg ggtcgagccc gagatgacca atcccgacag cgatctctat 1200

cgcgcgcatc ccgattgggt gatgaactat accggccgcc cgcgcaccga ggggcgtaac 1260

cagctcgtcc tcaatctcgc gcgaaccgac gtgcgcgatt acatcttcaa ggtgctcgac 1320

gacctgctcg acgagaacga catccagttc ctcaaatggg attacaaccg caactggagc 1380

gagcccggct ggcccgaggc cgatgtcgcc gaccagcagc agatctacgt caaatacgtc 1440

cgcaacctct attggatcat cgacaagctg cgcgccaggc atcccaagct cgagatcgaa 1500

tcgtgctcgg gcggcggcgg ccgcgtcgat ctcggcatta tgagccgcac cgacgaggtg 1560

tggccgtcgg acaataccga tccgttcgat cggctgacga tccagaacgg ctttacttac 1620

gcctatccgc cggccgcgat gatggcgtgg gtgacggcgt cgcccaattg ggtcaataat 1680

cgcgctacct cgctcgatta tcgcttcctg tcggcgatgc aaggcgggct cggtattggc 1740

gccgacctca ataaatggag cgatgcagaa tttgcggagg cgagtcgcat ggtggcggcc 1800

tataagcgtg tccgagcgac ggtgcagcaa ggcgacctgt atcggttgat tatcccgaac 1860

ggaatcgatc gtgacgaccg cgtcgccaat ctctcggtat ctccagacaa gcagcaggcg 1920

gtgctgttcg cgtttctgca cagcagccag gagctcgatc ggctttctgc tatccgactg 1980

cgcgggctcg ctcctaagaa gaactaccgc gtcgcccgga tcgatggccg cccgctggcc 2040

gacgacaccc cagctaaggc gagcggcgct tattggatgg cgcgtggcat cgacgttcca 2100

ttaatcggcg acttcgacgc cgctggctat atctttcagg ccatc 2145

Claims

1.一种耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.如权利要求1所述的耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13的信号肽序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.如权利要求1所述的耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶AgaAJB13的成熟肽序列如SEQ ID NO. 3所示。

4.一种编码权利要求1所述的耐碱性低温α-半乳糖苷酶AgaAJB13的α-半乳糖苷酶基因agaAJB13，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。

5.如权利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因agaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶基因agaAJB13编码信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

6.如权利要求4所述的α-半乳糖苷酶基因agaAJB13，其特征在于所述α-半乳糖苷酶基因agaAJB13编码成熟肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。

7.一种包含权利要求4所述α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组载体。

8.一种包含权利要求4所述α-半乳糖苷酶基因agaAJB13的重组菌株。